Caja 1 85 Caja 1 55 Caja 2 75 Caja 2 65 Caja 3 75 Caja 3 85 Caja 4 85 Caja 4 95 Caja 5 85 Caja 5 75 Caja 6 95 Caja 6 75 Caja 7 85 Caja 7 75 Total 83,5714 Total 75 Nota. Fuente Autores
Viabilidad Hibridomas: la viabilidad de los hibridomas fue alta al igual
que la densidad en ambos ratones; siendo más alta en el ratón B. la viabilidad se mantuvo constante en todo el proceso de post-fusión teniendo un promedio en el ratón A de 70% y en el ratón B de 85% (ver Figura 8)
.
Figura 8. Viabilidad hibridomas. Fuente autores
Contaminación: como ya se indicó el ratón P1 se descartó por alto
porcentaje de contaminación (ver Figura 9). En el caso del ratón A, se encuentra contaminación en 2 pozos: pozo H8 de la caja A4 y el pozo A2 de la caja A5. Por su parte, el ratón B, presentó contaminación en tres pozos de la misma caja: pozos H3, G10 y G11 de la caja B6; después de inactivar los pozos por medio de adición de hipoclorito, no se presentaron más casos de contaminación.
Figura 9. Contaminación. Fuente autores
Detección Anticuerpos: Al realizar el ELISA-DOT el día 10 de
diciembre, se obtienen resultados negativos a todos los pozos además del control positivo, así que el día 14 de diciembre se realiza la prueba de ELISA
Indirecto y se encuentran 4 sospechosos a positivo: dos pozuelos en la misma caja del ratón A (caja A3: pozos D8 y H3) y dos pozuelos de diferentes cajas del ratón B: (caja B2: pozo C10 / caja B7: pozo A10); pero el resultado no es concluyente. Al no obtener resultados positivos a la prueba se da por terminada la investigación obteniendo como resultado final la producción de una alta cantidad de hibridomas no secretores de anticuerpos monoclonales específicos para Leptospira pomona y cuatro pozos con hibridomas con resultados no comprobados.
DISCUSIÓN
En este proyecto se obtuvieron excelentes resultados respecto a los antígenos producidos; el crecimiento de la Leptospira fue rápido y constante, la proteína encontrada fue adecuada en los antígenos fue de 3.3 y 4.11mg/ml, lo cual es mayor que el obtenido en estudios como el de Díaz y colaboradores (Díaz C, et al, 2009), en el cual obtuvieron 2mg/ml como máximo de sus experimentos y los anticuerpos en sangre a la quinta inoculación ya superaban los encontrados por el mismo estudio, en los cuales obtuvieron una titulación máxima de 1:250000.
Con respecto a la fusión, se obtuvieron resultados importantes, al obtener un alto nivel de fusión viable y de rápido crecimiento, baja mortalidad y alta densidad.
Con respecto al objetivo principal del presente estudio, no se cumplió a cabalidad ya que los resultados no fueron los esperados; los hibridomas obtenidos no fueron reactivos contra la Leptospira pomona y por ende no se obtuvo un anticuerpo monoclonal efectivo.
Se han descrito algunos pasos críticos en la producción de los Anticuerpos monoclonales; entre los cuales están: preparación del antígeno, selección del adyuvante, protocolo de inoculación (Leenaars M & Hendriksen C, 2005) así como la fusión, medio cultivo para los hibridomas, post-fusión y la prueba de detección del anticuerpo; a continuación se evalúan las posibles causas para llegar a los resultados obtenidos, basándonos en los pasos críticos del proceso.
Preparación de antígeno: La especificidad de la respuesta inmune obtenida
depende de la calidad del antígeno aplicado (Leenaars M & Hendriksen C, 2005); teniendo en cuenta esto, se manejo en todos los procesos un nivel alto de asepsia, todos los materiales utilizados fueron nuevos o correctamente esterilizados; el cultivo de Leptospira no presentaba contaminación, y cada inoculación se realizó con agujas y jeringas diferentes, los viales de las inoculaciones se manejaban unidad/inoculación y se mantenían correctamente refrigerados y aislados del medio ambiente por medio de papel parafilm.
Selección del adyuvante: Los adyuvantes más utilizados en este tipo de
estudios son el adyuvante completo e incompleto de Freund; se ha confirmado que el adyuvante completo de Freund induce una respuesta inmune mucho más alta que el adyuvante incompleto de Freund (Hong T, et
al, 1989); pero también induce con más frecuencia enfermedades y
formación de tumoraciones, por lo cual se optó por la utilización del adyuvante incompleto.
Protocolo de inoculación: En el proceso de inoculación, se deben tener en
cuenta lugar de inoculación y número de refuerzos utilizados; estos aspectos pueden alterar los resultados obtenidos.
Las inoculaciones y los refuerzos fueron aplicados en su totalidad Intraperitonealmente; este procedimiento no se ajusta a los resultados obtenidos en el estudio de Hong; en él se sugiere que la respuesta inmune primaria por la inmunización intraesplenica tiene una respuesta superior que la obtenida por el método convencional de inmunización subcutánea (Hong T, et al, 1989).
Una de las posibles causas para no alcanzar el objetivo principal de este proyecto, es el número de inoculaciones y refuerzos utilizados. Estudios como el realizado por Micheel y Sharte plantean que múltiples inyecciones
disminuyen la cantidad de anticuerpos producidos. ( Micheel B & Sharte G, 1993) Neron y Lemieux obtuvieron los mismos resultados mostrando reducciones de una tercera parte de los anticuerpos producidos y sugirieron la inducción de un estado de tolerancia/supresión causante de la disminución de los anticuerpos (Neron S & Lemieux R, 1992). Esta disminución en la producción de anticuerpos puede ser causada a su vez por un aumento en la afinidad de los anticuerpos y una respuesta inmune más sensible y específica al tener un alto número de inoculaciones y de esta manera disminuir la producción de los linfocitos B específicos para Leptospira (Vass M, et al, 2005).
En el presente estudio se aplicaron de 15 a 16 inoculaciones, lo cual quintuplica el número de inoculaciones que en promedio se recomienda sean 2 a 3 inoculaciones para obtener óptimos resultados, aunque dependiendo de la naturaleza antigénica del antígeno mismo (Chaicumpa W, 2008; Ludtke C, et al, 2003; Micheel B & Sharte G, 1993); este alto número de inoculaciones pudo inducir un fenómeno de depleción en la producción de Anticuerpos; ya que al tener una carga frecuente de Antígeno se puede presentar una “parálisis inmunológica” ( Roitt I, et al, 2001;Rojas W, 2007) la cual es específica y en la cual se ha demostrado no hay producción de Anticuerpos y es más fácil de lograr con Antígenos que posean relativa resistencia a la degradación. (Wesley J & Good R, 1984) como la resistencia otorgada por el coadyuvante incompleto de Freund, con lo que se logra un estímulo persistente (Lañez E, 1999). Este hecho no pudo preveerse en la realización del experimento dado un daño inesperado de la incubadora de CO2, que solo se logró solucionar con la consecución de otro laboratorio seis
semanas después. Sin embargo el ratón P1 presentó cinco inoculaciones, las adecuadas pero los altos índices de contaminación tampoco permitieron obtener los resultados deseados.
Fusión: En esta parte del proceso se utilizó una relación de 10 esplenocitos
por cada célula de mieloma; que es la relación más segura para obtención de anticuerpos monoclonales (Belve A, 1983). El fusógeno utilizado fue el polietilenglicol que presenta un índice de desarrollo de hibridomas positivos alto (Bellve A, 1983); el tiempo de adición del mismo fue 1 minuto, que en promedio es el tiempo más usado para tener un mayor desempeño en la producción de Anticuerpos; un tiempo mayor a este resulta en un detrimento de la eficiencia de la fusión, además de desarrollar efectos citotoxicos (Lane R, 1985).
Medio de cultivo para los hibridomas: Estudios como el realizado por Zeng, sugieren que la producción de los MAbs es limitada por la disponibilidad de nutrientes que tenga el medio (Zeng A, 1996). El medio utilizado es el RPMI suplementado con HAT; este es el medio utilizado para los hibridomas; pero en el presente estudio se sugiere que la disponibilidad de los nutrientes se pudo ver afectada por la densidad celular. El medio fue suplementado con glutamina, este aminoácido estimula no solo el crecimiento celular y la viabilidad de las células, sino también la tasa de producción de los anticuerpos monoclonales (Jeon Y & Wang S, 1995).
Post-fusión: Las condiciones seleccionadas por el investigador para el
mantenimiento de estas células post-fusión pueden ser también críticas en los resultados de los clones celulares que logren crecer y desarrollarse (Varcarcel P, et al, 1997); los cambios de temperatura afectan la viabilidad de los hibridomas (Reuveny S, et al, 1986); las células fueron mantenidas en un ambiente de 5%CO2 y una temperatura de 37°C.
Otra de las variables que pudieron afectar los resultados obtenidos, es el crecimiento de los hibridomas y la densidad de los mismos; por lo cual en algunos estudios se sugiere realizar subclonación de los hibridomas rápidamente debido a que las clonas no productoras se reproducen más fácil
y veloz que las clonas productoras de anticuerpos (Bellve A, 1983). Al hacer uso de los linfocitos provenientes del bazo la mayoría de investigadores obtienen alrededor de 1000 colonias de hibridomas con un proceso de fusión única de las cuales menos de 50 colonias son productoras de anticuerpos estables (Ozturk S & Pallson B, 1990).
Con respecto al efecto de la densidad celular post-fusión, que en este estudio fue alta en todo el proceso post-fusión, los resultados obtenidos por los diversos estudios realizados por otros autores son muy controversiales (Zeng A, 1996). Por un lado, varios estudios indican que la secreción de anticuerpos se ve directamente afectada por la densidad de las células, teniendo que la alta densidad celular conlleva a un bajo rendimiento en la producción de anticuerpos en los pozuelos (Hadas E & Theilen G, 1987) mientras en otros indican que al aumentar la densidad de células, se aumenta la cantidad de Anticuerpos producidos (Banik G & Heath C, 1995).
Se sugiere que una posible causa para la disminución en la secreción de anticuerpos presentada en este estudio por la alta densidad puede ser atribuido al rápido uso de los nutrientes del medio; los cuales afectan la producción de anticuerpos (Zeng A, 1996).
Prueba de detección de los Anticuerpos: Uno de los pasos más críticos en
la elaboración de MAbs, es la técnica utilizada para la detección de los Anticuerpos, ya que problemas como la densidad del cultivo, la contaminación, o la falta de sensibilidad puede dar falsos negativos. (Hadas E & Theilen G, 1987; Leenaars M & Hendriksen C, 2005).
Dentro de las técnicas más utilizadas en la detección de MAbs está el Elisa, el cual es muy usado por su fácil proceso y su alta especificidad (Bianchi A, et al, 1995; Carvalho F, et al, 2008). Se utilizo la técnica de Elisa indirecta debido a su mayor sensibilidad (Cervino C, et al, 2008).
Sin embargo varios factores pueden afectar la sensibilidad de la prueba; en sus estudios Hadas y Theilen encontraron que al tener cultivos con alta densidad de células es necesario incrementar la sensibilidad, ya que con relación a las demás células, las células que segregan el anticuerpo específico son bajas, y su producto puede pasar desapercibido por la prueba utilizada. (Hadas E & Theilen G, 1987).
Por otra parte se observa que la producción de Anticuerpos no es estable ni en los primeros pases celulares ni en el ciclo celular; (Smith C & Wood E, 1998; Hayter P, et al, 1992).
En este caso, no se realizó ningún procedimiento de replicación celular; por lo cual uno de los problemas más importantes a la hora de usar la técnica ELISA consiste en la baja especificidad causada por la alta densidad presentada: células muertas, hibridomas no secretores, o secretores de antígenos no específicos.
La prueba se realizó al día número 14 después de la fusión y entregó resultados negativos en donde 4 pozos fueron sospechosos pero no concluyentes; teniendo en cuenta la inestabilidad en la producción dada por ser la primera clonación y la alta densidad de células presentadas, puede haber disminuido drásticamente la sensibilidad de la prueba; en el estudio realizado por Habas y Theilen, al aplicar la prueba el día 12 en la primera clonación, se encontró que el resultado fue un falso negativo, que se comprobó como positivo al tercer pase del cultivo; por lo tanto se recomendó hacer 2 o 3 pases para tener cultivos más limpios, más estables y una producción detectable de anticuerpos. (Hadas E & Theilen G, 1987).
Y por último, se presenta la opción que el anticuerpo no sea específico para Leptospira Pomona; esto puede deberse a un proceso de reacción cruzada en donde el epitopo de un antígeno A se comparte con un antígeno B, esto puede suceder ya que el anticuerpo producido contra el antígeno en
el caso de la Leptospira spp puede tener afinidad por los segmentos LPS y/o la membrana externa; en el caso de los LPS serian específicos contra la
Leptospira spp utilizada, pero los de las proteínas de la membrana pueden
dar una reactividad cruzada con otras bacterias o con proteínas en el ambiente. (Jost B, et al, 1988; Roitt I, et al, 2001; Dobrina A, et al, 1996; Barone K, et al, 2002).
CONCLUSIONES
Este proyecto tuvo un buen desempeño en la producción de Leptospiras y antígenos, así como una alta respuesta de crecimiento y viabilidad a la fusión celular, lo cual es un punto crítico en este tipo de proyectos.
Como resultado final de este proyecto se encuentra la producción de una alta cantidad de hibridomas, los cuales no son secretores de anticuerpos monoclonales específicos contra Leptospira pomona, posiblemente sean reactivos para otros antígenos u otro tipo de Leptospira spp; pero esto no pudo ser comprobado por motivos externos al proyecto.
Se encontraron varios pasos críticos en la producción de los Anticuerpos monoclonales; entre los cuales están: preparación del antígeno, selección del adyuvante, protocolo de inoculación, fusión, medio cultivo para los hibridomas, post-fusión y la prueba de detección del anticuerpo; en este caso, los pasos que mas afectaron el proyecto fueron el protocolo de inoculación, la metodología post-fusión y la prueba de detección de anticuerpo.
Es necesario realizar más estudios referentes a los protocolos de inoculación y sus repeticiones, para poder evaluar la presencia de “parálisis inmunológica” producida por el alto número de inoculaciones y la producción de anticuerpos con más afinidad al antígeno que disminuyan la producción de Anticuerpos en el tiempo.
Se sugiere que una de las causas para la baja producción de anticuerpos es la alta densidad celular post-fusión; y que hay un uso más acelerado de los nutrientes, que conlleva a que disminuya rápidamente la producción de los anticuerpos, y que la prueba para detección de los mismos resulte negativo o no concluyente.
La otra posible causa que se encuentra relacionada con la anterior es una aplicación no concluyente de la prueba para la detección del antígeno; La técnica de elección en la elaboración de anticuerpos monoclonales es la Elisa indirecta ya que es de alta sensibilidad, alta especificidad y fácil de desarrollar, sin embargo factores como la contaminación, la baja concentración de anticuerpos en los cultivos y las reacciones cruzadas producen falsas lecturas a la hora de evaluar los resultados.
Se debe trabajar por ratificar el interés institucional por la protección de los derechos fundamentales del ser humano, al entrenar a los estudiantes en áreas como la investigación enfocada a la salud humana y animal; además de brindarles oportunamente los materiales, instrumentos y equipos necesitados oportunamente, ya que es muy difícil y conlleva un lapso de tiempo mayor para realizar los procedimientos cuando no se cuenta con los equipos oportunamente o no se encuentran en buenas condiciones.
El conocimiento de las técnicas de elaboración, validación, prueba y desarrollo de anticuerpos monoclonales permite facilitar procedimientos encaminados al desarrollo científico; y de esta manera sirve como herramienta para reconocer diferencias antigénicas y posibles mutaciones de las cepas de campo de la Leptospiras spp. Sin contar con todos los procesos en los cuales actualmente se ven involucrados los Anticuerpos Monoclonales que promulgan por una calidad de vida mejor.
Este proyecto aporta herramientas para el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas y nuevas investigaciones que conlleven a un mejoramiento de la capacidad científica institucional y de esta manera generar un desarrollo en la sociedad nacional al dar pautas para desarrollar nuevos trabajos investigativos referentes al tema y de esta manera aumentar la formación investigativa en favor de la Universidad De La Salle y demás investigadores.
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