Integration of physical, chemical and biological tactics against insect pests and virus diseases in horticultural crops

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID. ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS. INTEGRATION OF PHYSICAL, CHEMICAL AND BIOLOGICAL TACTICS AGAINST INSECT PESTS AND VIRUS DISEASES IN HORTICULTURAL CROPS. TESIS DOCTORAL. BEATRIZ DÁDER ALONSO Ingeniera Agrónoma 2015.

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(3) DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN VEGETAL: BOTÁNICA Y PROTECCIÓN VEGETAL. ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS. INTEGRATION OF PHYSICAL, CHEMICAL AND BIOLOGICAL TACTICS AGAINST INSECT PESTS AND VIRUS DISEASES IN HORTICULTURAL CROPS. Autora: BEATRIZ DÁDER ALONSO Ingeniera Agrónoma. Directores: ALBERTO FERERES CASTIEL Dr. Ingeniero Agrónomo ARÁNZAZU MORENO LOZANO Dra. en Ciencias. 2015.

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(5) Tribunal nombrado por el Magfco. Y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid, el día de de 2015. Presidente: Secretario: Vocal: Vocal: Vocal: Suplente: Suplente:. Realizado el acto de defensa y lectura de Tesis el día de de 2015 en el Instituto de Ciencias Agrarias del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. EL PRESIDENTE. EL SECRETARIO. Fdo.:. Fdo.:. LOS VOCALES. Fdo.:. Fdo.:. Fdo.:.

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(7) AGRADECIMIENTOS. Alberto Fereres y Aránzazu Moreno, mis directores de Tesis, que confiaron en mí al terminar la carrera, me dieron un hueco en su grupo de investigación y la oportunidad de hacer dos estancias en el extranjero. Gracias por vuestra orientación, ayuda y oportunidades profesionales durante estos años. Aprendo de vosotros cada día. Elisa Viñuela, mi tutora en la ETSIA, por su inestimable ayuda desde cuando había que realizar trámites burocráticos hasta en los ensayos de campo en La Poveda. My supervisors abroad during the two research internships, Dylan Gwynn-Jones in Wales and Piotr Trebicki in Australia, thank you for receiving me in your labs and letting me do my work using your facilities. Thank you Piotr for taking me to the Canberra conference. I learnt a lot from both of you. María, por echarme mil manos en todos los ensayos y tu organización. Elisa, por tener las instalaciones tan cuidadas, apoyarme en el montaje de UV y tu ayuda cuando tengo dudas. Arantxa, y nuestras conversaciones sobre celebrities y trapos, porque no todo es ciencia. Michele, mi “aberrojo” brasileiro, hemos crecido juntas, te voy a echar tanto de menos. Sara, por ser tan buena compañera y ayudarme en los muestreos. Casimiro y el Servicio de Ambientes controlados del ICA, por cuidar mis plantas y tenernos fichados desde tu posición estratégica, sé que nunca me querrás tanto como a Michele. Andrés y Jaime, os deseo lo mejor en los próximos años. Todas las personas con las que trabajé en el ICA durante mi Tesis: Poti -gracias por los másteres en estadística-, Saioa -gracias por tu ayuda al principio de todo y que ha continuado con los años-, Marta, Rocco, Víctor, Carmen, Tina, Antonio, Raquel, Vera, Pilar, el lobby brasileño Lia, Natalie, Mauricelia y Lilian, Alex, Camino, Karla, Sabrina, Laura, Natalia, Raquel. A todo el personal de La Poveda y al Grupo de Entomología de la ETSIA (Nacho, Agustín, Fermín, Mar, Flor, Pilar, Andrea, Pedro, Elisa, Ángeles -gracias por tu ayuda cuando empezábamos el máster TAPAS-), por su ayuda en los ensayos de campo. Silvia Rondon and Phyllis Weintraub, my external reviewers, besides reading my Thesis as part of the paperwork, you took the time to point out valuable suggestions that contributed to improve it..

(8) Dylan, Sara, Ana and Alan, thank you for your hospitality during my first international and rainy experience. Piotr & family, Audrey, Lucy, Helena, Simone and Isaac, thank you so much for making me so welcome in Australia. Coping with distance was easier although I was in the other side of the world. Inés y Guti, Lorena y Alber, que no saben de qué va esto, pero precisamente eso es lo que los hace geniales. María, hermana con la que comparto vidas paralelas y las decepciones investigadoras. Mi centro: tío, abuela, tía, papá y mamá, Rodri, Javi, nunca podré devolveros todo lo que me dais cada día, os quiero. Susana, cada día más..

(9) INDEX. ACRONYMS AND ABBREVIATIONS. i. RESUMEN. v. 1. INTRODUCCIÓN. v. 2. METODOLOGÍA. vii. 3. RESULTADOS. xi. 4. DISCUSIÓN. xviii. SUMMARY. xxiii. CHAPTER 1. INTRODUCTION. 1. 1.1. VEGETABLE PRODUCTION IN PROTECTED ENVIRONMENTS. 1. 1.2. INSECT PESTS. 2. 1.3. PLANT VIRUSES. 5. 1.4. INTEGRATED PEST MANAGEMENT. 7. 1.4.1. BIOLOGICAL CONTROL. 8. 1.4.2. PHYSICAL CONTROL. 9. 1.4.2.1. INSECTICIDE-TREATED NETS. 9. 1.4.2.2. UV-ABSORBING PLASTIC COVERS. 10. 1.5. EFFECTS OF UV RADIATION ON PLANTS. 10. 1.6. EFFECTS OF UV RADIATION ON PESTS, VIRUSES AND BENEFICIALS. 11. CHAPTER 2. OBJECTIVES. 13. CHAPTER 3. MATERIALS AND METHODS. 15. 3.1. EXPERIMENTAL SITES. 15. 3.2. PLANT DEVELOPMENT. 15. 3.3. INSECT REARING. 16. 3.4. GLASSHOUSE FACILITIES. 19. 3.5. VIRUS INOCULATION AND DETECTION. 19. 3.6. PHOTOSELECTIVE COVERS. 21. 3.7. LONG LASTING INSECTICIDE-TREATED NETS (LLITNs). 22. 3.8. SPATIAL ANALYSIS. 23. 3.9. GENERAL STATISTICS. 25.

(10) CHAPTER 4. SPATIO-TEMPORAL DYNAMICS OF VIRUSES ARE DIFFERENTIALLY AFFECTED BY PARASITOIDS DEPENDING ON THE MODE OF TRANSMISSION. 27. ABSTRACT. 27. 4.1. INTRODUCTION. 27. 4.2. OBJECTIVE. 29. 4.3. MATERIALS AND METHODS. 29. 4.3.1. EXPERIMENTAL DESIGN. 29. 4.3.2. STATISTICAL METHODS. 32. 4.3.3. SPATIAL ANALYSIS. 32. 4.4. RESULTS. 33. 4.4.1. EFFECT OF Aphidius colemani ON APHID DISPERSAL AND THE SPREAD OF Cucumber mosaic virus. 33. 4.4.2. EFFECT OF Aphidius colemani ON APHID DISPERSAL AND THE SPREAD OF Cucumber aphid-borne yellows virus. 39. 4.5. DISCUSSION CHAPTER 5. FLIGHT BEHAVIOUR OF VEGETABLE PESTS AND THEIR NATURAL ENEMIES UNDER DIFFERENT UV-BLOCKING ENCLOSURES. 44 49. ABSTRACT. 49. 5.1. INTRODUCTION. 50. 5.2. OBJECTIVE. 51. 5.3. MATERIALS AND METHODS. 51. 5.3.1. EXPERIMENTAL DESIGN. 51. 5.3.2. STATISTICAL METHODS. 53. 5.4. RESULTS. 54. 5.4.1. PHOTOSELECTIVE COVERS. 54. 5.4.2. ABILITY TO LEAVE THE RELEASE PLATFORM. 54. 5.4.3. SHORT TUNNELS – DISPERSAL OF PESTS. 56. 5.4.4. SHORT TUNNELS – DISPERSAL OF NATURAL ENEMIES. 58. 5.4.5. LONG TUNNELS – DISPERSAL OF PESTS. 59. 5.4.6. LONG TUNNELS – DISPERSAL OF NATURAL ENEMIES. 61. 5.5. DISCUSSION. 61.

(11) CHAPTER 6. IMPACT OF UV-A RADIATION ON THE PERFORMANCE OF APHIDS AND WHITEFLIES AND ON THE LEAF CHEMISTRY OF THEIR HOST PLANTS. 67. ABSTRACT. 67. 6.1. INTRODUCTION. 68. 6.2. OBJECTIVE. 70. 6.3. MATERIALS AND METHODS. 70. 6.3.1. EXPERIMENTAL DESIGN. 70. 6.3.2. PLANT BIOCHEMICAL ANALYSIS. 74. 6.3.2.1. SECONDARY METABOLITES. 74. 6.3.2.2. SOLUBLE SUGARS. 75. 6.3.2.3. FREE AMINO ACID AND PROTEINS. 75. 6.3.2.4. PHOTOSYNTHETIC PIGMENTS. 76. 6.3.3. STATISTICAL METHODS 6.4. RESULTS. 76 76. 6.4.1. PLANT GROWTH. 76. 6.4.2. INSECT RESPONSES. 77. 6.4.3. PLANT BIOCHEMICAL RESPONSES. 79. 6.4.3.1. SECONDARY METABOLITES. 79. 6.4.3.2. SOLUBLE SUGARS. 82. 6.4.3.3. FREE AMINO ACID AND PROTEINS. 83. 6.4.3.4. PHOTOSYNTHETIC PIGMENTS. 84. 6.5. DISCUSSION. 86. CHAPTER 7. CONTROL OF INSECT VECTORS AND PLANT VIRUSES IN PROTECTED CROPS BY NOVEL PYRETHROID-TREATED NETS 91 ABSTRACT. 91. 7.1. INTRODUCTION. 92. 7.2. OBJECTIVE. 93. 7.3. MATERIALS AND METHODS. 94. 7.3.1. LABORATORY EXPERIMENTS. 94. 7.3.2. DETERMINATION OF THE INSECTICIDE CONCENTRATION OF LLITNs. 95. 7.3.3. EFFICACY OF LLITNs IN FIELD CONDITIONS AGAINST APHIDS AND WHITEFLIES. 96.

(12) 7.3.4. EFFECT OF BIFENTHRIN-TREATED NETS ON THE APHID PARASITOID Aphidius colemani. 97. 7.3.5. STATISTICAL METHODS. 98. 7.3.6. SPATIAL ANALYSIS. 98. 7.4. RESULTS 7.4.1. EFFICACY OF LLITNs AGAINST APHIDS IN LABORATORY TRIALS. 98 98. 7.4.2. EFFICACY OF LLITNs AGAINST WHITEFLIES IN LABORATORY TRIALS 99 7.4.3. EFFICACY OF LLITNs IN FIELD CONDITIONS AGAINST APHIDS AND WHITEFLIES 102 7.4.4. EFFECT OF BIFENTHRIN-TREATED NETS ON THE APHID PARASITOID Aphidius colemani 7.5. DISCUSSION. 107 107. CHAPTER 8. GENERAL DISCUSSION. 111. CONCLUSIONS. 119. REFERENCES. 121.

(13) ACRONYMS AND ABBREVIATIONS. C: Distance to crowding CABYV: Cucumber aphid-borne yellows virus CIPAC: Collaborative International Pesticides Analytical Council cm: Centimeters CMV: Cucumber mosaic virus CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Spanish National Research Council) cv.: Cultivar D: Distance to regularity DAS-ELISA: Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay df: Degrees of freedom Dr.: Doctor ETSIA: Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos (College of Agricultural Engineering) g: Grams HPLC: High Pressure Liquid Chromatography Ia: Index of aggregation IBERS: Institute of Biological, Environmental & Rural Sciences ICA: Instituto de Ciencias Agrarias (Institute of Agricultural Sciences) IPM: Integrated Pest Management ITNs: Insecticide Treated Nets kb: Kilobase kg: Kilograms. i.

(14) KJ: Kilojoules LC-MS: Liquid Chromatography-Mass Spectrometry m: Meters mg: Miligrams min: Minutes MIP: Manejo Integrado de Plagas MJ: Megajoules mM: Micromolar mm: Milimeters nm: Nanometers PAR: Photosynthetically Active Radiation (400-700 nm) rpm: Revolutions per minute s: Seconds SADIE: Spatial Analysis by Distance IndicEs t: Metric ton UPM: Universidad Politécnica de Madrid (Polytechnic University of Madrid) UV: Ultraviolet radiation (200-400 nm) UV-A: Ultraviolet-A radiation (315-400 nm) UV-B: Ultraviolet-B radiation (280-315nm) UV-C: Ultraviolet-C radiation (100-280 nm) µL: Microliters µm: Micrometers µmol: Micromol vi: Index of clustering in patches vj: Index of clustering in gaps X: Index of spatial association ii.

(15) W: Watts. iii.

(16) iv.

(17) RESUMEN. 1. INTRODUCCIÓN Actualmente, la gestión de sistemas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) en cultivos hortícolas tiene por objetivo priorizar los métodos de control no químicos en detrimento del consumo de plaguicidas, según recoge la directiva europea 2009/128/CE ‘Uso Sostenible de Plaguicidas’ (OJEC, 2009). El uso de agentes de biocontrol como alternativa a la aplicación de insecticidas es un elemento clave de los sistemas MIP por sus innegables ventajas ambientales que se utiliza ampliamente en nuestro país (Jacas y Urbaneja, 2008). En la región de Almería, donde se concentra el 65% de cultivo en invernadero de nuestro país (47.367 ha), MIP es la principal estrategia en pimiento (MAGRAMA, 2014), y comienza a serlo en otros cultivos como tomate o pepino. El cultivo de pepino, con 8.902 ha (MAGRAMA, 2013), tiene un protocolo semejante al pimiento (Robledo et al., 2009), donde la única especie de pulgón importante es Aphis gossypii Glover.. Sin embargo, pese al continuo incremento de la superficie de cultivo agrícola bajo sistemas MIP, los daños originados por virosis siguen siendo notables. Algunos de los insectos presentes en los cultivos de hortícolas son importantes vectores de virus, como los pulgones, las moscas blancas o los trips, cuyo control resulta problemático debido a su elevada capacidad para transmitir virus vegetales incluso a una baja densidad de plaga (Holt et al., 2008; Jacas y Urbaneja, 2008).. Las relaciones que se establecen entre los distintos agentes de un ecosistema son complejas y muy específicas. Se ha comprobado que, pese a que los enemigos naturales reducen de manera beneficiosa los niveles de plaga, su incorporación en los sistemas planta-insecto-virus puede desencadenar complicadas interacciones con efectos no deseables (Dicke y van Loon, 2000; Jeger et al., 2011). Así, los agentes de biocontrol también pueden inducir a que los insectos vectores modifiquen su comportamiento como respuesta al ataque y, con ello, el grado de dispersión y los patrones de distribución de las virosis que transmiten (Bailey et al., 1995; Weber et al., 1996; Hodge y Powell, 2008a; Hodge et al., 2011).. Además, en ocasiones el control biológico por sí solo no es suficiente para controlar determinadas plagas (Medina et al., 2008). Entre los métodos que se pueden aplicar bajo. v.

(18) sistemas MIP están las barreras físicas que limitan la entrada de plagas al interior de los invernaderos o interfieren con su movimiento, como pueden ser las mallas anti-insecto (Álvarez et al., 2014), las mallas fotoselectivas (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub y Berlinger, 2004; Díaz y Fereres, 2007) y las mallas impregnadas en insecticida (Licciardi et al., 2008; Martin et al., 2014). Las mallas fotoselectivas reducen o bloquean casi por completo la transmisión de radiación UV, lo que interfiere con la visión de los insectos y dificulta o impide la localización del cultivo y su establecimiento en el mismo (Raviv y Antignus, 2004; Weintraub, 2009). Se ha comprobado cómo su uso puede controlar los pulgones y las virosis en cultivo de lechuga (Díaz et al., 2006; Legarrea et al., 2012a), así como la mosca blanca, los trips y los ácaros, y los virus que estos transmiten en otros cultivos (Costa y Robb, 1999; Antignus et al., 2001; Kumar y Poehling, 2006; Doukas y Payne, 2007a; Legarrea et al., 2010). Sin embargo, no se conoce perfectamente el modo de acción de estas barreras, puesto que existe un efecto directo sobre la plaga y otro indirecto mediado por la planta, cuya fisiología cambia al desarrollarse en ambientes con falta de radiación UV, y que podría afectar al ciclo biológico de los insectos fitófagos (Vänninen et al., 2010; Johansen et al., 2011). Del mismo modo, es necesario estudiar la compatibilidad de esta estrategia con los enemigos naturales de las plagas. Hasta la fecha, los estudios han evidenciado que los agentes de biocontrol pueden realizar su actividad bajo ambientes pobres en radiación UV (Chyzik et al., 2003; Chiel et al., 2006; Doukas y Payne, 2007b; Legarrea et al., 2012c). Otro método basado en barreras físicas son las mallas impregnadas con insecticidas, que se han usado tradicionalmente en la prevención de enfermedades humanas transmitidas por mosquitos (Martin et al., 2006). Su aplicación se ha ensayado en agricultura en ciertos cultivos al aire libre (Martin et al., 2010; Díaz et al., 2004), pero su utilidad en cultivos protegidos para prevenir la entrada de insectos vectores en invernadero todavía no ha sido investigada. Los aditivos se incorporan al tejido durante el proceso de extrusión de la fibra y se liberan lentamente actuando por contacto en el momento en que el insecto aterriza sobre la malla, con lo cual el riesgo medioambiental y para la salud humana es muy limitado. Los plaguicidas que se emplean habitualmente suelen ser piretroides (deltametrina o bifentrín), aunque también se ha ensayado dicofol (Martin et al., 2010) y alfa-cipermetrina (Martin et al., 2014). Un factor que resulta de vital importancia en este tipo de mallas es el tamaño del poro para facilitar una buena ventilación del cultivo, al tiempo que se evita la entrada de insectos de pequeño tamaño como las moscas blancas (Bethke y Paine, 1991; Muñoz et al., 1999). Asimismo, se plantea la necesidad de estudiar la compatibilidad de estas mallas con los enemigos naturales. Es por ello que en esta vi.

(19) Resumen. Tesis Doctoral se plantea la necesidad de evaluar nuevas mallas impregnadas que impidan el paso de insectos de pequeño tamaño al interior de los invernaderos, pero que a su vez mantengan un buen intercambio y circulación de aire a través del poro de la malla. Así, en la presente Tesis Doctoral, se han planteado los siguientes objetivos generales a desarrollar: 1. Estudiar el impacto de la presencia de parasitoides sobre el grado de dispersión y los patrones de distribución de pulgones y las virosis que éstos transmiten. 2. Conocer el efecto directo de ambientes pobres en radiación UV sobre el comportamiento de vuelo de plagas clave de hortícolas y sus enemigos naturales. 3. Evaluar el efecto directo de la radiación UV-A sobre el crecimiento poblacional de pulgones y mosca blanca, y sobre la fisiología de sus plantas hospederas, así como el efecto indirecto de la radiación UV-A en ambas plagas mediado por el crecimiento de dichas planta hospederas. 4. Caracterización de diversas mallas impregnadas en deltametrina y bifentrín con diferentes propiedades y selección de las óptimas para el control de pulgones, mosca blanca y sus virosis asociadas en condiciones de campo. Estudio de su compatibilidad con parasitoides. 2. METODOLOGÍA Los experimentos de la presente Tesis Doctoral se llevaron a cabo en el Instituto de Ciencias Agrarias (ICA) (Madrid, España), en la estación experimental de La Poveda-CSIC (Madrid, España), y en los campos de prácticas de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid (ETSIA-UPM). Parte de los ensayos correspondientes al Capítulo 6 se desarrollaron en la Universidad de Aberystwyth (IBERS, Reino Unido), en colaboración con el Dr. Dylan Gwynn-Jones, en el marco de una Estancia Breve financiada por el Ministerio de Economía y Competitividad. Para ello, se realizaron ensayos en condiciones controladas de laboratorio, invernadero y campo utilizando especies vegetales y poblaciones de insectos criados en las instalaciones del ICA según los protocolos del Grupo de Investigación Insectos Vectores de Patógenos de Plantas (IVPP). Las especies vegetales utilizadas en esta Tesis Doctoral fueron cinco especies hortícolas de gran valor económico en el área mediterránea: pepino (Cucumis sativum L.), pimiento (Capsicum annuum L.), berenjena (Solanum melongena L.), tomate (Solanum lycopersicum L.) y. vii.

(20) melón (Cucumis melo L.). Se criaron cuatro especies de insectos plaga de cultivos hortícolas y dos enemigos naturales ampliamente comercializados para el control biológico en invernaderos. En concreto, se trabajó con los pulgones Myzus persicae (Sulzer) y Aphis gossypii Glover, la mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) y la polilla Tuta absoluta (Meyrick). En cuanto a los enemigos naturales, se utilizaron el parasitoide Aphidius colemani Viereck y el sírfido depredador Sphaerophoria rueppellii (Weidemann). El primer objetivo de la Tesis Doctoral tuvo como finalidad estudiar el efecto de un parasitoide sobre dispersión y distribución del pulgón A. gossypii, y la incidencia y distribución espacial de dos virus, el Virus del mosaico del pepino (CMV, Cucumovirus) y el Virus del amarilleo de las cucurbitáceas (CABYV, Polerovirus), transmitidos de manera no persistente y persistente, respectivamente, por el pulgón A. gossypii. Para ello, se realizaron ensayos en jaulones de 1 m3 en los invernaderos del ICA. Se liberaron 100 pulgones y 5 parasitoides hembra sobre una planta de pepino infectada con virus colocada en el centro del jaulón, y se evaluó su posición y densidad en las 48 plantas colindantes a la planta fuente, así como la infección viral a corto y a largo plazo (2 y 7 días para CMV, y 7 y 14 días para CABYV, respectivamente). El análisis espacial de los datos se realizó mediante el procedimiento SADIE, estudiando los patrones de distribución del vector y las virosis así como la asociación entre ambos agentes. Como segundo objetivo, se estudió el comportamiento de vuelo de tres plagas clave de cultivos hortícolas, el pulgón M. persicae, la mosca blanca B. tabaci y la polilla del tomate T. absoluta, y dos enemigos naturales, el parasitoide A. colemani y el sírfido S. rueppellii, dentro de jaulones de 1 metro de longitud revestidos con un amplio espectro de mallas fotoselectivas con distintos niveles de absorción de radiación UV (2-83%) y PAR (54-85%) (O, G, A y P) (Figura 1.a). Además se incluyeron dos testigos, una malla sin propiedades fotoselectivas (T) y un film de plástico (PL) que bloqueaba el 98% de la radiación UV y permitía la difusión del 85% de luz visible. Los ensayos se llevaron a cabo las primaveras de 2011 y 2012 al aire libre en dos localizaciones, los campos de prácticas de la ETSIA y la estación experimental de La PovedaCSIC, respectivamente. Los insectos se liberaron en tubos desde una plataforma suspendida en el aire con el fin de que tuvieran que iniciar el vuelo para poder desplazarse por el interior de los jaulones. Se colocaron dianas a diferentes distancias de la plataforma de vuelo de acuerdo a cada insecto: trampas amarillas para evaluar las capturas de pulgón y mosca blanca, plantas de tomate para la oviposición de la polilla, plantas de pepino infestadas con A. gossypii para el parasitismo de A. colemani, y plantas de pimiento infestadas con M. persicae para la oviposición del sírfido (Figura 1.b). El segundo año se mejoró el diseño experimental en base a los resultados obtenidos viii.

(21) Resumen. durante el primer año, aumentando la longitud del jaulón a 2 metros (Figura 1.c). Las dianas se colocaron más separadas entre sí y a mayor distancia de la plataforma de vuelo (Figura 1.d). Figura 1. Diseño experimental de los ensayos sobre la capacidad de vuelo de insectos en el interior de jaulones revestidos con materiales de distintas propiedades ópticas durante los años 2011 (a, b) y 2012 (c, d). Las letras T, P, A, O, G y PL corresponden a las abreviaturas de los distintos materiales testados (a, c). Se muestra una vista cenital de los jaulones con la disposición de la plataforma de liberación y las dianas (b, d; números 1 a 4).. En el tercer objetivo se investigó el efecto directo de la radiación UV-A sobre la eficacia biológica (“fitness”) del pulgón M. persicae y la mosca blanca B. tabaci, y el efecto indirecto mediado por sus plantas hospederas, pimiento y berenjena, crecidas con diferentes niveles de radiación UV-A. Además, se investigó la respuesta directa de dichas plantas hospederas. Para ello, las plantas crecieron en el interior de jaulones en los invernaderos del ICA, uno de ellos cubierto con un film de plástico que bloqueaba la radiación UV-A, y el otro con un film testigo transparente que permitía la transmisión de dicha radiación. Las plantas se cultivaron desde su germinación hasta el final del ensayo bajo los dos tipos de ambiente lumínico, denominados UVA- y UVA+ (Figura 2). Tras esta primera exposición a la radiación UV-A, y cuando las plantas alcanzaron un estado fenológico de 10 hojas verdaderas en pimiento y 4 hojas en berenjena, la mitad de las plantas crecidas bajo cada régimen lumínico se intercambió al régimen contrario. Además, parte de las plantas se infestaron con formas inmaduras de los insectos fitófagos objeto de estudio, el pulgón M. persicae y la mosca blanca B. tabaci, con el fin de seguir su desarrollo y evolución. Al mismo tiempo, se tomaron muestras foliares para estimar los parámetros fisiológicos de las plantas. A continuación, las plantas fueron sometidas a un nuevo periodo de exposición a radiación UV-A empleando los mismos jaulones descritos anteriormente (Figura 2). Se determinaron los parámetros de ciclo de vida del insecto (tiempo de desarrollo, fertilidad, fecundidad y tasas de crecimiento), al tiempo que se volvió a tomar muestras foliares. ix.

(22) para determinar los parámetros fisiológicos de las plantas al término del ensayo. La longitud total del tallo y la superficie foliar se midieron semanalmente durante todo el ciclo del cultivo. Se analizó el contenido en fenoles, azúcares, aminoácidos, proteínas y pigmentos fotosintéticos (clorofilas y carotenoides) de las hojas recogidas. Figura 2. Diagrama temporal de los ensayos sobre el efecto directo e indirecto de la radiación UV-A en insectos fitófagos y sus plantas hospederas. Se muestran los cuatro tratamientos (T1: UVA+/UVA+, plantas crecidas con UV-A durante todo el ciclo; T2: UVA+/UVA-, plantas crecidas con UV-A antes de la introducción de los insectos y sin UV-A tras dicha introducción; T3: UVA-/UVA+, plantas crecidas sin UV-A antes de la introducción de los insectos y con UVA tras dicha introducción y T4: UVA-/UVA-, plantas crecidas sin UV-A durante todo el ciclo), la fecha de introducción de los insectos para el estudio de su eficacia biológica y las dos tomas de muestra de material vegetal. Las flechas que parten desde los tratamientos UVA+ y UVA- se refieren al momento en el que la mitad de las plantas crecidas bajo cada régimen lumínico se intercambió al régimen contrario.. UVA+. UVA+. T1. UVA-. T2. UVA+. T3. UVA-. T4. UVA-. Siembra. Primera toma de Introducción muestras foliares de insectos. Tiempo 0. 53. 0. 34. (días). Segunda toma de muestras foliares Pimiento 68. 104. Berenjena. Finalmente, en el cuarto objetivo de la Tesis Doctoral se realizó una selección de las mallas impregnadas en los insecticidas piretroides deltametrina y bifentrín más eficaces para controlar los insectos plaga M. persicae, A. gossypii y B. tabaci y sus virosis asociadas en base a ensayos de laboratorio destinados a evaluar diferentes tamaños de poro y dosis de plaguicidas incorporados a la malla. Se emplearon tubos de vidrio de 4 cm de diámetro donde se intercaló la malla problema. En la parte inferior del tubo se liberaron los insectos y en la parte superior se colocó una hoja diana con el fin de que los insectos atravesaran la malla. Se evaluó el número de insectos capaces de atravesar la malla y asentarse sobre la hoja diana y el número de insectos muertos en el tubo, a las 6 horas en pulgones y 24 horas en mosca blanca. La eficacia de dos mallas impregnadas en bifentrín con poros de 0.46 y 0.29 mm2 que presentaron buenos resultados en condiciones de laboratorio se evaluó en sendos ensayos de campo en los invernaderos dobles tipo túnel (8 x 6.5 x 2.6 metros) de la estación experimental de La Povedax.

(23) Resumen. CSIC durante el otoño de 2011 y 2013. En ellos, se colocaron unas secciones laterales de 4.3 x 3.5 metros con la malla impregnada o sin tratar, según tratamiento. El resto del túnel estuvo cubierto de malla estándar que impedía el paso de insectos. En el interior de los túneles se dispuso un cultivo de pepino y en el espacio entre el túnel interior y el exterior se plantaron pimientos infectados con los virus CMV y CABYV sobre los que se liberaron las plagas A. gossypii y B. tabaci. Los muestreos de las plagas se realizaron semanalmente, efectuando un muestreo de presencia/ausencia en todas las plantas de cada módulo y conteos de densidad de insecto en 11 plantas marcadas de cada módulo. Al final del ciclo, se analizó el porcentaje de infección de ambos virus. El análisis espacial de los datos se realizó mediante el procedimiento SADIE. La compatibilidad de una malla impregnada en bifentrín con el parasitoide A. colemani se probó en ensayos de campo paralelos en módulos similares. 3. RESULTADOS Los resultados del primer objetivo indicaron que, a corto plazo (2 días), la presencia del parasitoide A. colemani favoreció la dispersión de A. gossypii, tal y como se confirmó con el patrón no asociado entre virus y vector en presencia de los parasitoides (Figura 3). Esto ocasionó una mayor incidencia de CMV en las plantas adyacentes a la planta fuente de virus (Figura 4). Sin embargo, a largo plazo (7 días) no existieron diferencias en la incidencia viral de CMV en presencia y ausencia de parasitoides. La tasa de transmisión de CMV en presencia de parasitoides se mantuvo en un nivel similar al obtenido a corto plazo, mientras que el incremento de la transmisión en el caso del tratamiento control puede ser explicado por la propia capacidad colonizante del pulgón (Figura 4). En cuanto a CABYV, a corto plazo (7 días), no se detectaron diferencias en la transmisión viral entre tratamientos (Figura 4), aunque el número de ninfas de A. gossypii en presencia de parasitoides fue significativamente menor. A largo plazo (14 días), la momificación de los pulgones pudo haber reducido su vida activa como vectores, limitando con ello la incidencia viral de CABYV en presencia del parasitoide respecto al tratamiento control (Figura 4). Además, en ausencia del enemigo natural, el virus se distribuyó ampliamente por toda la superficie experimental, mientras que en su presencia el movimiento de virus estuvo restringido a un gran foco central (Figura 5).. xi.

(24) Figura 3. Mapas de distribución espacial de la población de Aphis gossypii y la infección viral de CMV a corto plazo (2 días), así como la asociación entre los dos agentes, virus y vector. Cada punto indica una planta receptora individual. Los puntos pequeños rellenos representan a índices de agrupación con valores de 0 a ±0.99, los círculos huecos a valores de ±1 a ±1.49 y los puntos grandes rellenos a valores >1.5 o <1.5. Las líneas rojas encierran focos de población con valor v=1.5 y las líneas azules a huecos sin población con valor v=-1.5. Las líneas negras muestran contornos de valor v=0, es decir, regiones intermedias entre zonas con focos y huecos. El índice de agregación, Ia, el índice positivo de agrupación en focos, vi, el índice negativo de agrupación en huecos, vj, y el índice de asociación espacial, X, se muestran encerrados por una línea naranja si son estadísticamente significativos. La letra N y la flecha se refieren al norte geográfico. A. gossypii. Asociación. N. Control. CMV. "$""!"($((#(" "$'&"!"($((((" "$'("!"($((#-". !"#!"#$--, %&"!"#$.+& %("!"*#$-&'. "$""!"($(((&" "$'&"!"($((&+" "$'("!"($(((-". !"#!"($+(( %&"!"($)+% %("!"*($+(.. )#!"($#'&+. "$""!"($-###" "$'&"!"($-#-." "$'("!"($%+%,". "$"!"($,.-'". "". A. colemani. !"#!"#$%&' %&"!"#$)(( %("!"*#$&+,. Foco Hueco. V. -1.5. -1. !"#!"#$'), %&"!"#$'-. %("!"*#$')#. 0. 1. "$""!"($(,,%" "$'&"!"($(,,#" "$'("!"($(,('". )#!"*($,%''. Asociación Disociación. 1.5. xii. "$"!"($+.+#". "" p. 0.025 0.05 0. 0.95 0.975.

(25) Resumen. !"#$%&'%'($)*'"#+),-.). Figura 4. Tasa de transmisión viral de los virus CMV y CABYV (%) en plantas de pepino dentro de jaulones control sin parasitoides y con parasitoides. Los asteriscos se refieren a diferencias estadísticamente significativas de acuerdo al test Chi-cuadrado (p≤0.05). #!!" +!" *!" )!" (!" '!" &!" %!" $!" #!" !". * *. 067896:". *. !"#$%&'()*+#. $",-./". )",-./". )",-./". 012". #&",-./". 03452". Figura 5. Mapas de distribución espacial de la población de Aphis gossypii y la infección viral de CABYV a largo plazo (14 días), así como la asociación entre los dos agentes, virus y vector. Los símbolos y contornos son los mismos que para la Figura 3. CABYV. Asociación. N. Control. A. gossypii. "$""!"($(()(" "$'&"!"($(#+'" "$'("!"($(#-&". !"#!"($')+ %&"!"($')( %("!",($')(. "$""!"($%-)-" "$'&"!"($%'#&" "$'("!"($%&&.". )#!"($()-+. "$"!"($.+()". !"#!"#$*(& %&"!"#$+*& %("!",#$*+&. "$""!"($)'.(" "$'&"!"($(.%(" "$'("!"($(*.'". !"#!"#$*)) %&"!"#$*## %("!",#$*.+. "$""!"($(+&&" "$'&"!"($()#+" "$'("!"($(+%(". )#!"($#.&+. "$"!"($#%##". A. colemani. !"#!"#$%&' %&"!"#$*'& %("!",#$))+. Foco Hueco. V. -1.5. -1. 0. 1. Asociación Disociación. 1.5. xiii. p. 0.025 0.05 0. 0.95 0.975.

(26) Los resultados del segundo objetivo mostraron diferencias en el comportamiento de vuelo entre las distintas especies de insectos y los materiales que recubrían los jaulones donde se realizaron las sueltas. El film de plástico absorbente PL afectó a los pulgones y las moscas blancas y las condiciones pobres en radiación UV no permitieron iniciar el vuelo de estos insectos desde la plataforma de liberación, mientras que los materiales fotoselectivos no tuvieron efecto en la polilla del tomate, parasitoides y sírfidos. El film absorbente PL también redujo la capacidad de M. persicae para localizar las trampas amarillas dentro de los jaulones. Así, una menor proporción de pulgones alcanzó las trampas más alejadas de estos jaulones, mientras que los insectos pudieron volar hasta el final de los jaulones revestidos con materiales transparentes, como las mallas P y T (Figura 6.c y d). En cuanto a B. tabaci, el primer año de ensayos se obtuvieron más capturas en las dianas cercanas a la plataforma de liberación independientemente del material utilizado en los jaulones, y fueron disminuyendo con la distancia al punto de suelta. Por el contrario, durante el segundo año, las capturas de mosca blanca sólo fueron significativamente menores en las trampas más alejadas (T2 y T3) bajo los materiales más absorbentes de radiación UV, el film PL y la malla O (Figura 6.a y b). Durante el primer año de ensayos, la orientación de la polilla del tomate T. absoluta no estuvo afectada por la ausencia de radiación UV. Sin embargo, cuando la jaula se amplió de tamaño en el segundo año, la oviposición en la planta de tomate más cercana al punto de liberación fue significativamente inferior bajo el film PL. En relación a los enemigos naturales, durante el primer año de ensayos la tasa de parasitismo de A. colemani fue muy baja y significativamente menor en jaulones con film PL frente a las mallas G y A. Tras mejorar el diseño experimental en el segundo año, la absorción de radiación UV no afectó negativamente al parasitoide y no se encontraron diferencias entre los tratamientos. De manera semejante, la tasa de oviposición del sírfido S. rueppellii fue similar dentro de todos los jaulones.. xiv.

(27) Resumen. Figura 6. Capturas de Myzus persicae y Bemisia tabaci (%) en trampas amarillas situadas a 1 (T1), 1.4 (T2) y 1.8 (T3) metros de distancia de la plataforma de liberación en jaulones de 2 metros cubiertos por diferentes materiales fotoselectivos: film PL (a), malla O (b), malla P (c) y malla T (d). Los asteriscos se refieren a diferencias estadísticamente significativas de acuerdo al test ANOVA (p≤0.05).. a). ,-(. &#". b). (%)"*+,-./0.01-"234". !"#$%&"'()*+(. !"#$%&"'()*+(. &!" %#" %!" $#" $!". a. #". b. b. '%". '&". ,(. %#". +"#,*-*)(#. %!". b. $#" $!". b. '%". '&". /(. &#". (6&)"*+,-./0.01-"234". &!". B. %#" %!" $#" $!". A. A. !"#$%&"'()*+(. !"#$%&"'()*+(. !"#$%&'()*%#. '$". d). (5#)"*+,-./0.01-"234". &!". #". &!". !". '$". &#". &#". #". !". c). .(. (&6)"*+,-./0.01-"234"" a. %#" %!" $#" $!" #" !". !". '$". '%". '$". '&". '%". '&". Los resultados del tercer objetivo evidenciaron que la radiación UV-A regula de manera directa la fisiología vegetal con implicaciones para algunos insectos fitófagos. Ambas especies vegetales, pimiento y berenjena, respondieron al estrés lumínico con una reducción del tallo, de manera significativa en pimiento. En cambio, no se encontraron diferencias en el área foliar entre tratamientos. Las plantas de pimiento sometidas a radiación UV-A tuvieron mayor contenido de compuestos fenólicos, azúcares, aminoácidos libres y proteínas. El descenso del contenido en aminoácidos en ausencia de radiación UV pudo modificar de manera indirecta la eficacia biológica del pulgón M. persicae, ya que se observó un retraso en las tasas de crecimiento y un descenso de la fecundidad cuando el pulgón se desarrolló en plantas crecidas sin radiación UV-A independientemente del régimen lumínico al que se expuso a la plaga con posterioridad (tratamientos UVA-/UVA- y UVA-/UVA+) (Figura 7). No existió un efecto directo de la luz sobre el crecimiento del pulgón. Por el contrario, los niveles de clorofilas y carotenoides de las hojas de berenjena disminuyeron con la radiación UV-A, y no se encontraron diferencias en el resto de compuestos analizados. Respecto a B. tabaci, se observó un efecto directo negativo de la. xv.

(28) radiación UV-A que se tradujo en mayor duración del desarrollo larvario y menor fertilidad de los huevos de mosca blanca (tratamientos UVA+/UVA+ y UVA-/UVA+). No existió un efecto indirecto de las condiciones lumínicas en las que la planta fue crecida previamente a la infestación del insecto (Figura 7). Figura 7. Fecundidad de Myzus persicae en plantas de pimiento y Bemisia tabaci en plantas de berenjena sometidas a cuatro regímenes lumínicos de radiación UV-A. Las letras se refieren a diferencias estadísticamente significativas de acuerdo al test ANOVA (p≤0.05). !"#$%&'&(&) *%+)%'%,(-).)/$"0.-)1.2)/"342(5). '$!" '#!" '!!" &!" %!" $!". a. ()*+,()*+". ab. ()*-,()*-". b. ()*+,()*-" ()*-,()*+". ab. c. c. a. bc. #!" !" !"#$%&'()*%#. +"#,*-*)(#. En el cuarto objetivo, se comprobó que todas las mallas impregnadas en deltametrina y bifentrín evitaban el paso de M. persicae y A. gossypii en condiciones de laboratorio (<16% pulgones en la hoja diana), teniendo las dos mejores mallas impregnadas en bifentrín un poro de 0.71 y 0.44 mm2. La persistencia de bifentrín fue buena tras un mes de exposición en condiciones de campo durante el otoño, sin embargo su eficacia disminuyó tras dos meses expuestas en el exterior. En cuanto al control de B. tabaci, fue necesario disminuir el tamaño del poro hasta 0.29 mm2 para evitar su paso a través de la malla (6.77±2.46%). Asimismo, se produjo una disminución de la eficacia de las mallas desde el primer mes de exposición a la luz solar. En cuanto a los ensayos de campo, los resultados de 2011 indicaron que la malla con insecticida de 0.46 mm2 redujo de manera significativa la densidad de población y la tasa de ocupación de plantas con pulgones dentro de los módulos (Figura 8.a), si bien no fue eficaz en el control de la mosca blanca, a pesar de que dicha malla fue efectiva en condiciones de laboratorio. La incidencia de las virosis CMV y CABYV, así como el número de infecciones mixtas, fue significativamente inferior dentro los módulos con malla insecticida (Figura 8.b). En el año 2013, los resultados observados siguieron la misma tendencia, con una menor tasa de ocupación de pulgones y menor incidencia viral bajo la malla tratada de 0.29 mm2. El estudio espacial con SADIE mostró que los pulgones colonizaron todo el módulo interior en el tratamiento control, xvi.

(29) Resumen. mientras que estuvieron limitados a los bordes con malla impregnada. La infección de CMV tuvo una distribución regular en el tratamiento control y una distribución agregada bajo malla impregnada. Además, se observó asociación significativa de ambos agentes en un módulo control. La distribución de CABYV fue agregada en las líneas de plantas cercanas a las fuentes de virus exteriores en los módulos control. Por el contrario, la infección en el tratamiento con malla impregnada fue muy escasa e incluso inexistente en uno de los módulos, por lo que el uso de estas barreras se perfila como una alternativa prometedora a los insecticidas de aplicación foliar. La tasa de pulgones parasitados por A. colemani fue similar en módulos control y tratados a lo largo del ciclo de cultivo, por lo que la malla impregnada en bifentrín fue compatible con la actividad del parasitoide. Figura 8. Densidad de Aphis gossipii alados (a) medidos con escala 0-5: 0 (0 pulgones), 1 (1-4 pulgones), 2 (5-19 pulgones), 3 (20-49 pulgones), 4 (50-149 pulgones), 5 (>150 pulgones), y tasa de transmisión viral de los virus CMV y CABYV (b) en plantas de pepino dentro de módulos control y módulos con malla impregnada en bifentrín. Los asteriscos se refieren a diferencias estadísticamente significativas de acuerdo al test de Student (a) y test Chi-cuadrado (b) (p≤0.05). /0$%'1#1)10)#+#12%),0%3#+#)456.). a &6!" (./01.2". %6#". 314045.". %6!". * *. $6#". *. *. *. $6!". *. !6#" !6!" 7". $&". $8". %#". &$". &7". '&". '8". ##". /7#%)10%10)+#)+'80"#3'($)10)'$%0392%). b. #!". *. (./01.2". !"#$%&'%'($)*'"#+),-.). '#". 314045.". '!" &#". *. &!" %#" %!" $#" $!" #" !". ()*". (+,-*". xvii. 9$".

(30) 4. DISCUSIÓN La aplicación de estrategias alternativas al control químico, como el uso de enemigos naturales y barreras físicas, ha permitido avanzar en el control de insectos vectores de hortícolas de una forma más respetuosa con el medio ambiente (Jacas y Urbaneja, 2008; Robledo et al., 2009; Colomer et al., 2011). Los resultados obtenidos en la primera sección de este trabajo muestran cómo la presencia de A. colemani ocasionó una rápida dispersión de A. gossypii desde la planta fuente, probablemente debido a la emisión de feromonas de alarma (Losey y Denno, 1998; Day et al., 2006; Jeger et al., 2011). Este escape se tradujo en un incremento de la transmisión de CMV en las plantas colindantes (Roitberg y Myers, 1978; Weber et al., 1996; Belliure et al., 2011; Hodge et al., 2011). Este resultado se explica debido al modo de transmisión no persistente de CMV, durante breves periodos de adquisición e inoculación y sin periodo de latencia (Fereres y Moreno, 2009). La incidencia de CMV fue similar a corto y largo plazo debido a que los pulgones perdieron movilidad conforme fueron parasitados, mientras que se incrementó en las jaulas control por la propia acción colonizante del vector. Como se comprobó en el análisis espacial mediante SADIE, el pulgón mostró la distribución típica de un vector colonizante (Jeger et al., 2011). A corto plazo, la infeccion por CMV se limitó a plantas aisladas en el tratamiento control, mientras que la distribución fue agregada en las jaulas con parasitoides debido al movimiento del vector desde la planta fuente a las plantas colindantes como consecuencia de la presión de A. colemani (Jeger et al., 2011). Estudios previos han demostrado que los enemigos naturales también pueden promover la dispersión de virus persistentes, aunque la respuesta del vector está muy influenciada por los hábitos del enemigo natural (Bailey et al., 1995; Smyrnioudis et al., 2001; Hodge y Powell, 2008a). No se encontraron diferencias entre tratamientos en la tasa de transmisión de CABYV a corto plazo, sin embargo la infección fue menor en las jaulas con parasitoides a largo plazo (Smyrnioudis et al., 2001), debido a la menor esperanza de vida y movilidad de los pulgones virulíferos tras ser parasitados (Calvo y Fereres, 2011). Dentro de las jaulas se observaron momias y parasitoides adultos tras dos semanas desde su liberación, lo que demuestra que A. colemani fue capaz de establecerse en el medio (Zamani et al., 2007). Por lo tanto, la reducción de la población de pulgones virulíferos limitó la dispersión de CABYV, tal y como se observó en el patrón espacial de la enfermedad, corroborando el efecto beneficioso de los enemigos naturales en el control de vectores de virus transmitidos de modo persistente.. xviii.

(31) Resumen. El uso de revestimientos plásticos fotoselectivos se ha implementado de manera satisfactoria en el control de plagas y enfermedades de cultivos protegidos (Antignus et al., 1998; Chyzik et al., 2003; Díaz et al., 2006; Weintraub, 2009; Ben-Yakir et al., 2012; Legarrea et al., 2012a, b). Los resultados obtenidos con anterioridad sugieren que el modo de acción de estas barreras es doble. Por un lado, se bloquea el acceso de los insectos al interior de los invernaderos porque estos exhiben una preferencia positiva por el ambiente exterior rico en radiación UV, y por otro lado las condiciones creadas dentro del invernadero alteran el comportamiento de las plagas y limitan su capacidad de dispersión una vez establecidas dentro del cultivo (Raviv y Antignus, 2004). En los estudios del segundo objetivo se observó cómo el plástico absorbente PL impidió la salida de pulgones y mosca blanca desde los tubos de liberación, lo que sugiere que el movimiento de dichas plagas podría limitarse dentro de los invernaderos (Chyzik et al., 2003; Raviv y Antignus, 2004; Döring y Chittka, 2007), mientras que se observó un efecto neutral en los enemigos naturales (Chyzik et al., 2003; Chiel et al., 2006; Doukas y Payne, 2007a, b). Respecto a la capacidad de orientación de los insectos dentro de las jaulas, el plástico absorbente PL interfirió con el vuelo de M. persicae, ya que redujo su capacidad de localizar las trampas amarillas (Chyzik et al., 2003; Díaz et al., 2006; Ben-Yakir et al., 2012; Legarrea et al., 2012a). Bajo ambientes con radiación UV, una mayor cantidad de pulgones recorrieron todo el jaulón llegando hasta la última trampa de manera significativa y evidenciando un efecto rebote al caer en la cara trasera de esta (Kring, 1972; Döring y Chittka, 2007). La actividad de vuelo fue muy distinta entre pulgones y moscas blancas. En B. tabaci, las diferencias más acusadas se obtuvieron en los plásticos más absorbentes en radiación UV (film PL y malla O), estando las moscas restringidas a la trampa más cercana al punto de liberación, corroborando el menor movimiento de B. tabaci en ambientes deficientes en luz UV (Costa y Robb, 1999; Antignus et al., 2001; Mutwiwa et al., 2005; Legarrea et al., 2012c). La ausencia de luz UV bajo el plástico absorbente PL afectó negativamente a la puesta de huevos de T. absoluta, aunque no se observaron diferencias entre plantas colocadas a diferentes distancias, probablemente porque este insecto localiza la planta por medio de estímulos olfativos y no visuales (Proffit et al., 2011). En cuanto a los insectos beneficiosos, los revestimientos absorbentes de radiación UV fueron compatibles con el vuelo de parasitoides y sírfidos y no mermaron su actividad, posiblemente debido a que dichos insectos también se orientan hacia el complejo planta-plaga por señales complementarias a las visuales, como las pistas olfativas (Du et al., 1996; Storeck et al., 2000; Chiel et al., 2006; Boivin et al., 2012).. xix.

(32) Como ya se ha mencionado con anterioridad, la radiación UV también afecta a los insectos de manera indirecta por los cambios que se producen en las plantas como respuesta a dicha exposición (Vänninen et al., 2010; Johansen et al., 2011). Para intentar dilucidar el papel de los efectos directo e indirecto en la eficacia biológica de las plagas, se estudiaron dos complejos planta-insecto: el pulgón M. persicae en planta de pimiento y la mosca B. tabaci en planta de berenjena. Se constató un efecto negativo de la ausencia de radiación UV-A en el crecimiento poblacional del pulgón M. persicae, tal y como se ha visto previamente en otras especies de pulgones (Antignus et al., 1996; Chyzik et al., 2003; Díaz et al., 2006; Kuhlmann and Müller, 2009a; Paul et al., 2011; Legarrea et al., 2012a). Este efecto fue indirecto mediado por el menor contenido en azúcares y aminoácidos de las hojas de pimiento (Roberts y Paul, 2006; Comont et al., 2012), compuestos involucrados en la nutrición de los pulgones (Dadd y Krieger, 1968; Mittler et al., 1970; Srivastava y Auclair, 1971, 1975; Weibull, 1987). Por el contrario, la exposición de las moscas blancas a la radiación UV-A no tuvo un efecto indirecto negativo en su eficacia biológica. Además, la fisiología y crecimiento de la berenjena no se vio alterada en respuesta a los distintos régimenes lumínicos aplicados, mostrando cierta tolerancia a la radiación UV-A (González et al., 2009; Kulhmann y Müller, 2009a, 2010), por lo que presumiblemente el efecto observado en B. tabaci fue directo y no estuvo mediado por la planta. La fisiología y crecimiento de la planta de pimiento estuvo condicionada por la exposición a UV-A. La altura de los pimientos fue menor como consecuencia del estrés lumínico, respuesta encontrada en otras especies vegetales (Kuhlmann y Müller, 2010; Comont et al., 2012). También se indujo la síntesis rápida de compuestos fenólicos (Gaberšcik et al., 2002, Izaguirre et al., 2007; Mahdavian et al., 2008; Kulhmann y Müller, 2009a, 2009b, 2010), que actúan como fotoprotectores frente a la radiación UV (Middleton y Teramura, 1993; Harborne y Williams, 2000). Los resultados obtenidos en el cuarto objetivo sugieren que las mallas impregnadas con bifentrín son una alternativa prometedora para evitar el paso de pulgones al interior de los cultivos protegidos mientras se mantiene una buena aireación de los invernaderos (Bethke y Paine, 1991; Muñóz et al., 1999). Todas las mallas impregnadas ensayadas frenaron el paso de M. persicae y A. gossypii en condiciones de laboratorio frente a las mallas control, por lo que se puso de manifiesto su beneficio adicional a las propiedades físicas de estos materiales (Martin et al., 2006, 2007, 2010; Díaz et al., 2004). Con respecto a B. tabaci, fue necesario disminuir el tamaño. xx.

(33) Resumen. del poro hasta 0.29 mm2 para conseguir una exclusión efectiva en condiciones de laboratorio. En una segunda fase de la investigación se ensayaron dos mallas impregnadas en bifentrín de 0.46 y 0.29 mm2 en sendos ensayos de campo, liberando los insectos en plantas fuente de virus CMV y CABYV colocadas en el exterior del cultivo protegido, para evaluar su asentamiento y transmisión viral. Aunque en condiciones de laboratorio la eficacia de estas mallas decreció con la exposición solar, la cantidad remanente fue suficiente para el control eficaz de pulgones en los ensayos de campo. De hecho, el insecticida bifentrín posee un alto efecto de “knockdown” o muerte rápida por contacto, y mejor estabilidad química que otros piretroides (FAO, 2010). Así, la densidad poblacional de pulgones y la incidencia de los virus CMV y CABYV fue significativamente inferior en los módulos con malla tratada en ambos ensayos de campo (Martin et al., 2006; Licciardi et al., 2008). Esto fue debido a la menor densidad de vectores durante las primeras semanas del ensayo, ya que cuando intentaron atravesar la malla se impregnaron con bifentrín y murieron antes de alcanzar el cultivo protegido. El estudio con la metodología SADIE mostró diferencias espaciales en la distribución de los virus dependiendo de su naturaleza no persistente o persistente. El virus no persistente CMV se distribuyó de manera regular o aleatoria en los modulos control, mientras que estuvo agregado bajo malla tratada. Por el contrario, se observó una agregación significativa del virus persistente CABYV en los bordes de los modulos control, lo que sugiere que el foco inicial se originó cerca de las plantas fuentes y se extendió a plantas colindantes. Además, la población de pulgones estaba asociada a las plantas infectadas con CABYV en los módulos tratados, propio de virus transmitidos de manera persistente (Irwin y Thersh, 1990). Ninguna de las dos mallas fue eficaz en el control de la mosca blanca, posiblemente debido al tamaño del insecto y su resistencia a insecticidas piretroides (Byrne y Bellows, 1991; Whalon et al., 2008). Estos resultados contrastan con los obtenidos con mallas impregnadas en alfacipermetrina, donde se consiguió controlar la mosca blanca con una malla de 0.9 mm de diámetro (Martin et al., 2014). Por último, la malla impregnada en bifentrín ensayada en campo fue compatible con la actividad del parasitoide A. colemani, comprobando que dichas mallas pueden ser implementadas junto con el control biológico. En este trabajo se ha puesto de manifiesto el importante papel de los enemigos naturales en la distribución espacio-temporal de los insectos vectores, factor a tener en cuenta en la dispersión de las virosis vegetales. Asimismo, tanto las mallas fotoselectivas de luz UV como las. xxi.

(34) impregnadas con insecticidas presentaron características beneficiosas adicionales al control físico de insectos vectores, y constituyen herramientas que deben ser consideradas en los programas de Manejo Integrado de Plagas en cultivos hortícolas de invernadero como alternativas al uso de insecticidas.. xxii.

(35) SUMMARY. Insect vectors of plant viruses are the main agents causing major economic losses in vegetable crops grown under protected environments. This Thesis focuses on the implementation of new alternatives to chemical control of insect vectors under Integrated Pest Management programs. In Spain, biological control is the main pest control strategy used in a large part of greenhouses where horticultural crops are grown. The first study aimed to increase our knowledge on how the presence of natural enemies such as Aphidius colemani Viereck may alter the dispersal of the aphid vector Aphis gossypii Glover (Chapter 4). In addition, it was investigated if the presence of this parasitoid affected the spread of aphid-transmitted viruses Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) and Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, Polerovirus) infecting cucumber (Cucumis sativus L). SADIE methodology was used to study the distribution patterns of both the virus and its vector, and their degree of association. Results suggested that parasitoids promoted aphid dispersal in the short term, which enhanced CMV spread, though consequences of parasitism suggested potential benefits for disease control in the long term. Furthermore, A. colemani significantly limited the spread and incidence of the persistent virus CABYV in the long term. The flight activity of pests Myzus persicae (Sulzer), Bemisia tabaci (Gennadius) and Tuta absoluta (Meyrick), and natural enemies A. colemani and Sphaerophoria rueppellii (Weidemann) under UV-deficient environments was studied under field conditions (Chapter 5). One-chamber tunnels were covered with cladding materials with different UV transmittance properties. Inside each tunnel, insects were released from tubes placed in a platform suspended from the ceiling. Specific targets were located at different distances from the platform. The ability of aphids and whiteflies to reach their targets was diminished under UV-absorbing barriers, suggesting a reduction of vector activity under this type of nets. Fewer aphids reached distant traps under UV-absorbing nets, and significantly more aphids could fly to the end of the tunnels covered with non-UV blocking materials. Unlike aphids, differences in B. tabaci captures were mainly found in the closest targets. The oviposition of lepidopteran T. absoluta was also negatively affected by a UV-absorbing cover. The photoselective barriers were compatible with parasitism and oviposition of biocontrol agents.. xxiii.

(36) Apart from the direct response of insects to UV radiation, plant-mediated effects influencing insect performance were investigated (Chapter 6). The impact of UV-A radiation on the performance of aphid M. persicae and whitefly B. tabaci, and growth and leaf physiology of host plants pepper and eggplant was studied under glasshouse conditions. Plants were grown inside cages covered by transparent and UV-A-opaque plastic films. Plant growth and insect fitness were monitored. Leaves were harvested for chemical analysis. Pepper plants responded directly to UV-A by producing shorter stems whilst UV-A did not affect the leaf area of either species. UV-A-treated peppers had higher content of secondary metabolites, soluble carbohydrates, free amino acids and proteins. Such changes in tissue chemistry indirectly promoted aphid performance. For eggplants, chlorophyll and carotenoid levels decreased with supplemental UVA but phenolics were not affected. Exposure to supplemental UV-A had a detrimental effect on whitefly development, fecundity and fertility presumably not mediated by plant cues, as compounds implied in pest nutrition were unaltered. Lastly, the efficacy of a wide range of Long Lasting Insecticide Treated Nets (LLITNs) was studied under laboratory and field conditions. This strategy aimed to prevent aphids and whiteflies to enter the greenhouse by determining the optimum mesh size (Chapter 7). This new approach is based on slow release deltamethrin- and bifenthrin-treated nets with large hole sizes that allow improved ventilation of greenhouses. All LLITNs produced high mortality of M. persicae and A. gossypii although their efficacy decreased over time with sun exposure. It was necessary a net with hole size of 0.29 mm2 to exclude B. tabaci under laboratory conditions. The feasibility of two selected nets was studied in the field under a high insect infestation pressure in the presence of CMV- and CABYV-infected cucumber plants. Besides, the compatibility of parasitoid A. colemani with bifenthrin-treated nets was studied in parallel field experiments. Both nets effectively blocked the invasion of aphids and reduced the incidence of both viruses, however they failed to exclude whiteflies. We found that our LLITNs were compatible with parasitoid A. colemani. As shown, the role of natural enemies has to be taken into account regarding the dispersal of insect vectors and subsequent spread of plant viruses. The additional benefits of novel physicochemical barriers, such as photoselective and insecticide-impregnated nets, need to be considered in Integrated Pest Management programs of vegetable crops grown under protected environments.. xxiv.

(37) CHAPTER 1. INTRODUCTION. 1.1. VEGETABLE PRODUCTION IN PROTECTED ENVIRONMENTS Vegetable production plays a major role in Spanish agriculture, with 9,941,200 t and ranks first in Europe in greenhouse production area (65,055 ha) (EUROSTAT, 2009; MAGRAMA, 2014). Andalucía holds approximately 70% of the Spanish greenhouse area with 47,367 ha (MAGRAMA, 2014). Spanish cucumber, pepper and eggplant productions are in the top 10 worldwide ranking (FAOSTAT, 2012) (Table 1.1). Table 1.1. Crop production in the world, year 2012. Cucumber and gherkin. Chilli and pepper. Eggplant. Country. Yield (t). Country. Country. 1. China. 48,000,000 China. 16,000,000 China. 28,800,000. 2. Turkey. 1,741,878. Mexico. 2,379,736. India. 12,200,000. 3. Iran. 1,600,000. Turkey. 2,072,132. Iran. 1,300,000. 4. Russia. 1,281,788. Indonesia. 1,656,615. Egypt. 1,193,854. 5. Ukraine. 1,020,600. USA. 1,064,800. Turkey. 799,285. 6. USA. 901,060. Spain. 1,023,700. Indonesia. 518,827. 7. Spain. 713,200. Egypt. 650,054. Iraq. 460,000. 8. Mexico. 640,508. Nigeria. 500,000. Japan. 327,400. 9. Egypt. 613,880. Algeria. 426,566. Spain. 246,600. 10. Japan. 586,500. Ethiopia. 402,109. Italy. 217,690. Rank. Yield (t). Yield (t). Cucumber (Cucumis sativum L.) is an annual warm-season cucurbit native to Southern Asia with a rough, tender vine, trailing stems and hairy leaves. Cucumber is one of the main vegetables grown in Southern Spain and comprises 8,902 ha yielding 753,941 t (MAGRAMA, 2013). It is mainly grown inside greenhouses (90%) and under biological control, being the cotton aphid Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) the main key pest (Robledo et al., 2009; MAGRAMA, 2013). Sweet pepper (Capsicum annuum L.) is an herbaceous solanaceae native to Central and South America and is of high agricultural importance (Arranz-Arranz, 2008). The crop cycle starts. 1.

(38) from summer to autumn in warm and dry climates (optimal conditions: 20-25 ºC during the day and 16-18 ºC at night), although it can be also cultivated in temperate climates or off-season inside protected environments (Arranz-Arranz, 2008). In the Mediterranean area, pepper is one of the main vegetable crops produced under covered structures (65%), with 18,108 ha yielding 1,016,811 t (MAGRAMA, 2013). Eggplant (Solanum melongena L.) is a tropical perennial solanaceae that is mainly cultivated as an annual in temperate climates. It is native to Indian subcontinent and was domesticated in Bangladesh and India. It has spiny stems, large and coarse leaves, and an egg-shaped purple fruit. Eggplant requires higher temperature and irradiance than tomato or pepper (23-25 ºC during the day and 16-18 ºC at night. The Spanish production is 206,333 t in 3,665 ha (MAGRAMA, 2013). 1.2. INSECT PESTS Arthropods are probably the most successful and diverse animal phylum. Insecta is the largest class of this phylum, and it is the ecological guild that has most species-richness members. Within this class, the order Hemiptera comprises small sap-sucking insects with a needle-like stylet bundle consisting of two mandibular and two maxillary stylets, such as aphids (Hemiptera: Aphididae) and whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae). In the order Thysanoptera, thrips, or cellcontent feeders, have mouthparts composed of two maxillary stylets and one mandibular stylet (Hogenhout et al., 2008). About 450 of the 4700 species of the family Aphididae in the world have been recorded from crop plants, being 100 of them of major economic importance that feed on herbaceous plants (Blackman & Eastop, 2000). Most agriculturally important species are in the subfamily Aphidinae, with life cycles tied to temperate seasonality and the phenology of their hosts (Blackman & Eastop, 2007). Aphids are considered one of the most important pests worldwide not only because of the direct damage they cause, but also because their alimentary habits involve indirect damage. They excrete honeydew and the development of sooty molds eventually reduces the quality of production. Most importantly, they are the major group of vectors of plant viruses. The family Aphididae includes the greater proportion of insect vectors. They are thought to transmit almost half of the plant viruses and be the most efficient vectors of approximately 275 virus species within 19 virus genera (Nault, 1997; Hull, 2014; Ng & Perry, 2004).. 2.

(39) Introduction. The life cycle of most aphids alternates one sexual generation in the autumn to produce overwintering eggs -with short photoperiod inducing sexual morphs-, and a succession of female telescopic parthenogenetic generations during spring and summer, reducing the generation time and enabling the exploitation of periods of rapid plant growth (holocyclic life cycle) (Dixon, 1973). Thus, they are potentially harmful insects as their populations increase in a very short period of time by means of telescopic generations (Blackman & Eastop, 2000). They share some morphological characteristics such as the secretory organ known as siphunculi, two-segmented tarsi, five- or six-segmented antennae and the cauda. Moreover, aphids exhibit dimorphism with apterae and winged morphs. Crowding, poor nutrition or low temperature may produce alate individuals, responsible for long distance dispersal (Blackman & Eastop, 2007). The cotton aphid A. gossypii and the green peach aphid Myzus persicae (Sulzer) are among the 14 aphid species of most agricultural importance (Blackman & Eastop, 2007). Aphis gossypii is a highly polyphagous cosmopolitan pest that colonizes more than 100 crop plants, widely distributed in crops such as cotton, zucchini, melon, cucumber or citrus, belonging to the families Cucurbitaceae, Malvaceae and Rutaceae (Blackman & Eastop, 2000). During unfavorable environmental periods, A. gossypii can complete the sexual cycle in species of genuses Catalpa or Hibiscus acting as primary hosts. However, with optimal climate conditions, aphids may produce quick offspring with about fifty generations a year. Besides, A. gossypii is able to efficiently transmit more than 50 plant viruses (Blackman & Eastop, 2000) (Figure 1.1). Myzus persicae is another cosmopolitan, very polyphagous pest and highly efficient as a virus vector of more then 100 plant viruses (Blackman & Eastop, 2007). Its sexual phase occurs in Prunus persica Batsch or Prunus nigra Aiton, where spring populations may become very dense and curl the leaves. In contrast, the secondary hosts belong to more than 40 plant families, some of them economically important crops such as pepper or turnip (Blackman & Eastop, 2007) (Figure 1.2).. 3.

(40) Figure 1.1. The cotton aphid, Aphis gossypii: nymph (left), apterae adult (center), alate adult (right).. Figure 1.2. The green peach aphid, Myzus persicae: nymph (left), apterae adult (center), alate adult (right).. Around 1200 whitefly species are known within the family Aleyrodidae. Whiteflies are small sized-tropical pests of equal importance as aphids, in the sense that its feeding involves sooty mold fungi development and virus transmission (Byrne & Bellows, 1991). Many whiteflies that feed on woody angiosperms are usually monophagous or oligophagous but polyphagy is found on whiteflies of herbaceous plants (Mound & Halsey, 1978). Their life cycle consists of four nymphal instars, the first having functional walking legs (“crawler”). The fourth nymphal stage is commonly referred as pupa, and is flattened and translucent in the early phase. As the pupa develops, the eyes and body of the adult become visible. At this point, apolysis is complete and the adult emerges, showing typical dimorphism with males smaller than females. Then, mating and oviposition takes place. They produce wax in all life stages except the egg (Byrne & Bellows, 1991). One of the most important whitefly pests in agriculture is Bemisia tabaci (Gennadius) (Gerling et al., 2001). Its body is 0.80-0.95 mm long and 0.5 mm wide. Its wings are held tent-like above the body and slightly apart (measurement with wing expanse ranges between 1.75 and 2.19 mm). Bemisia tabaci has a wide range of host plants including crops, vegetables and ornamental plants in tropics and subtropics such as cotton, soybean, melon, tomato, eggplants or poinsettia (Byrne 4.

(41) Introduction. & Bellows, 1991; Ellsworth & Martínez-Carrillo, 2001; Berlinger et al., 2002). It is a major vector of more than 110 plant viruses, some of them in a persistent manner and as devastating as Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV, Begomovirus) (Berlinger et al., 2002; Glick et al., 2009) (Figure 1.3). Nowadays, B. tabaci is considered a complex of more than morphologically indistiguishable 28 cryptic species that differ in host range and virus transmission ability among other biological properties (Barro et al., 2011). Figure 1.3. The silverleaf whitefly, Bemisia tabaci: nymph and larvae (left), adult (right).. 1.3. PLANT VIRUSES Plant viruses cause devastating diseases in a wide host range, some of which are of enonomic importance. Viruses reduce production and quality producing significant economic losses in vegetable production worldwide (Hull, 2014). It has been estimated that viruses are responsible for the loss of 10% of global food production, behind losses produced by phytopathogenic fungi (Strange & Scott, 2005). Transmission from plant to plant by vectors is one of the most useful virus strategies of dispersal, as they are obliged parasites (Hull, 2014). Virus transmission entitles a direct interaction between host, virus and vector. Four phases can be distinguished in this process: •. Acquisition phase: time in which the vector feeds on an infected plant so that it acquires the viral particles.. 5.

(42) •. Latent period: time between the virus acquisition by the vector and its ability to transmit the virus.. •. Retention period: time in which the vector remains competent for virus transmission subsequent to acquisition.. •. Inoculation phase: process in which the virus is inoculated by the vector to the plant.. Viruses can be classified into two categories differing by the time that the vector is able to transmit the disease: non-circulative or cuticula-borne viruses (with two different categories: non-persistent and semipersistent) and circulative or foregut-borne viruses (Nault, 1997; Hull, 2014; Ng & Perry, 2004; Fereres & Moreno, 2009; Bragard et al., 2013; Blanc et al., 2014). Non-persistent viruses are efficiently acquired and inoculated during very brief (5-10 seconds) intracellular probes on the epidermal plant tissues without a latent period. Non-persistent viruses have very short retention times up to 12 hours (Ng & Falk, 2006) and they are unable to cross the insect’s gut, thus viruses can be retained in the cuticula at the tip of the stylets (Fereres & Moreno, 2009). For semipersistent viruses, the vector remains viruliferous from hours to days (Bragard et al., 2013). Depending on the capacity of the virus to replicate in vector cells, circulative viruses can be classified as propagative or non-propagative. Most circulative viruses require aphids to feed from the phloem of an infected plant during a sustained and/or long period of time (phloemrestricted virus). Circulative viruses exhibit a delay called latent period, which is defined as the time elapsed beween the moment in which the vector feeds on the infected plant and its ability to transmit the virus. The latent period ranges from days to weeks. The virus circulates through the vector body and the vector is viruliferous even after molting (Hogenhout et al., 2008). These viruses have a very specific relationship with their vectors. Viral particles must encounter a series of selective barriers to finally reach the accessory salivary glands from which they will be inoculated together with watery saliva (Moreno et al., 2011; Gray et al., 2014). Aphids are major vectors of plant viruses. Two good examples are Cucumber mosaic virus (CMV) and Cucumber aphid-borne yellows virus (CABYV), both transmitted by A. gossypii that cause severe yield loss in cucurbits. Both viruses have different transmission modes. CMV is one of the most important plant viruses, with a very broad host range, infecting more than 1200 plant species in 100 families, including ornamentals, woody plants and important crops such as pepper, lettuce, beans or cucurbits (Scholthof et al., 2011). CMV is the type member of the. 6.

(43) Introduction. genus Cucumovirus in the family Bromoviridae. It is an isometric virus with a tripartite genome of messenger-sense, single stranded RNA. CMV is transmitted in a cuticula-borne, nonpersistent manner by more than 80 aphid species in 33 genera. Besides, CMV may be transmitted by mechanical contact, seed and pollen (Palukaitis & García-Arenal, 2003). CMVinfected plants show yellowish patches, green and yellow mottling on leaves, and reduced plant growth (Figure 1.4). CABYV is a circulative, non-propagative virus that belongs to the Polerovirus genus in the Luteoviridae family, and was first described by Lecoq et al. (1992). CABYV causes serious losses on field-grown cucurbits in Spain (Juárez et al., 2013; Kassem et al., 2013). It is a 2.5 nm in diameter, isometric virus with a single stranded positive-sense RNA 5.7 kb in length (Guilley et al., 1994). Typical symptoms of CABYV-infected plants are interveinal yellowing of the basal leaves and stunting that later turn into a general yellowing and necrosis at the end of the cycle (Figure 1.4). Figure 1.4. Symptoms of Cucumber mosaic virus (left) and Cucumber aphid-borne yellows virus (right) in cucumber leaves.. 1.4. INTEGRATED PEST MANAGEMENT Integrated Pest Management (IPM) is defined as “a decision support system for the selection and use of pest control tactics, singly or harmoniously coordinated into a management strategy, based on cost/benefit analyses that take into account the interests of and impacts on producers, society and the environment” (Kogan, 1998). IPM programs are designed around four basic components: action thresholds, pest monitoring, preventive cultural practices and control. They were implemented to minimize insecticide hazards to crops, humans and environment, and to adopt non-chemical measures. Nowadays, existing European and Spanish regulations aim to. 7.