A MIS PADRES Y HERMANA, POR ESTAR A MI LADO SIEMPRE
"Pelea por lo que quieres y no desesperes si algo no anda bien, hoy puede ser un gran día…y mañana también" (Serrat & Sabina)
"Fight for what you want and don´t despair if something goes wrong, today can be a great day and so can tomorrow"
dex
INDEX
"La ciencia es el conocimiento organizado." Spencer
"Science is organized knowledge"
dex
GENERAL INDEX
1. INDEX (pages 1-20)
a. GENERAL INDEX ( pages 2-9) b. INDEX OF FIGURES (pages 10-15) c. INDEX OF TABLES (page 16)
d. INDEX OF GRAPHS (pages 17-20) 2. ACKNOWLEDGEMENTS (pages 21-40) 3. ABREVIATIONS (pages 41-48)
4. ABSTRACT/ RESUMEN (pages 49-56) 5. INTRODUCTION (pages 57-148)
CHAPTER 1: NEURAL STEM CELLS (pages 58-79) 1.1 DEFINITION AND TYPES (pages 58-62)
1.2. NEURAL STEM CELLS CULTURE FOR STUDYING NEUROGENESIS (pages 62-64)
1.3. INTRINSIC GENETIC AND EPIGENETIC PROGRAM OF ADULT NSC (pages 64-66)
1.4. THE NEURAL STEM CELL NICHE (pages 67-71) 1.4.A. EXTRACELLULAR MATRIX (ECM) (pages 68-70)
1.4.B. CELL-CELL CONTACT AND COMMUNICATION (pages 70-71)
1.5. NEURAL STEM CELLS FROM DEVELOPMENT TO ADULT (pages 71- 77)
1.6. MODELS FOR NEURAL STEM CELLS BEHAVIOR IN ADULT HIPPOCAMPUS (pages 78-79)
dex
CHAPTER 2: ADULT NEUROGENESIS (pages 80-107)
2.1. POINTS OF VIEW OF NEUROGENESIS THROUGH TIME (pages 80- 82)
2.2. ADULT NEUROGENESIS IN MAMMALS (pages 82-87) 2.2.A. INTRODUCTION (pages 82-83)
2.2.B. SUBVENTRICULAR ZONE AND OLFACTORY BULB NEUROGENESIS (pages 84-87)
2.3 ADULT HIPPOCAMPAL NEUROGENESIS (pages 87-95)
2.3.A. THE HIPPOCAMPAL FORMATION: ANATOMY AND CONNECTIVITY (pages 87-89)
2.3.B. HIPPOCAMPAL DENTATE GYRUS: THE SUBGRANULAR ZONE (pages 90-92) 2.3.C. DEVELOPMENT OF NEWBORN NEURONS IN THE ADULT HIPPOCAMPUS (Adapted from Deng et al, 201072) (pages 93-95)
2.4. FUNCTION OF ADULT HIPPOCAMPAL NEUROGENESIS (pages 95- 100)
2.4.A. LEARNING AND MEMORY, ‘COGNITIVE FUNCTIONS’ (pages 95-97)
2.4.B. STRESS, DEPRESSION AND ANXIETY, ‘EMOTIONAL FUNCTIONS’ (pages 97- 98)
2. 4. C. PATTERN SEPARATION (pages 99-100)
2.6. REGULATION OF NEUROGENESIS (pages 100-103)
2.7. NEUROGENESIS IN THE AGING HIPPOCAMPUS (page 104)
2.8. ALZHEIMER’S DISEASE (AD) AND NEUROGENESIS. (Adapted from Mu et al, 2011271) (pages 104-107)
CHAPTER 3: NEURAL STEM CELLS AND CANCER STEM CELLS (pages 108-122)
3.1. THE CANCER STEM CELL THEORY (pages 108-111)
3.2. PROPERTIES OF NEURAL STEM CELLS AND NEURAL CANCER CELLS (pages 111-113)
3.2.1. TRANSFORMATION OF NEURAL STEM CELLS (pages 111-113) 3.3. DEVELOPMENTAL PATTERNS (pages 113-116)
3.3.1. SONIC HEDGEHOG PATHWAY AND TRANSCRIPTION FACTORS INVOLVED (pages 113-114)
3.3.2. OTHER ONCOGENIC MUTATIONS (pages 115-116)
dex 3.4. OTHER PATHWAYS INVOLVED IN CANCER STEM CELLS (pages 116-122)
3.4.1. ROLE OF CREB TRANSCRIPTION FACTOR FAMILY (adapted from Mantamadiotis et al, 2012245) (pages 116-117)
3.4.2. MICROENVIRONMENT (Adapted from Lathia et al, 2011199) (pages 118- 119)
3.4.3. MICRORNAS (Adapted from Gonzalez-Gomez et al, 2011115) (pages 119- 122)
CHAPTER 4: THE DNA DAMAGE RESPONSE (DDR) (pages 123- 148)
4.1. INTRODUCTION (pages 123-124) 4.2. DNA DAMAGE SENSORS (page 125) 4.3. DNA DAMAGE MEDIATORS (page 125)
4.4. DNA DAMAGE TRANSDUCERS (ATM, ATR, DNA-PKS AND CHECKPOINTS) (pages 126-129)
4.5. DAMAGE EFFECTORS (pages 129-134)
4.5.1 DNA DAMAGE CHECKPOINT CONTROL (pages 129-132) 4.5.2.DNA DAMAGE REPAIR (page 133)
4.6. DNA DOUBLE STRAND BREAK (DSBs) REPAIR PATHWAYS (pages 133-138)
4.6.1 HOMOLOGOUS RECOMBINATION (pages 134-136) 4.6.2. NON-HOMOLOGOUS END JOINING (pages 136-138)
4.7. CELL DEATH (pages 139-141)
4.8.THE FOCI ASSAYS (γH2AX, 53BP1, etc) (pages 141-144) 4.9. GLUCOCORTICOIDS AND CANCER (pages 144-148)
6. MATERIALS AND METHODS (pages 149-178)
CHAPTER 1: GENERATION OF NEURAL STEM CELLS DURING POSTNATAL DEVELOPMENT AND SURVIVAL IN ADULTS BRAIN (pages 150-161)
dex EXPERIMENTS (page 150)
ANIMALS (pages 150-151)
EXPERIMENTAL DESIGNS AND INJECTION OF THYMIDINE ANALOGUES (pages 151-153)
SACRIFICE BY INTRACARDIAC PERFUSION (pages 153-155) HISTOLOGY (pages 155-156)
CONFOCAL MICROSCOPY AND CELL COUNTING (pages 156-157) PERFORMED ANALYSES (page 157)
BEHAVIORAL TASK (pages 158-159)
Step-through Passive Avoidance Test (page 158) Elevated plus-maze test (page 159)
DETECTION OF APOPTOSIS BY TUNEL ASSAY (page 160) STATISTICAL ANALYSIS (page 161)
CHAPTER 2: EFFECTS OF GLUCOCORTICOIDS ON ASTROCYTOMAS CONTROL AND FROM APP-PS1 MODEL: ROLE OF DNA DAMAGE RESPONSE (pages 162-169)
ASTROCYTOMAS CELL CULTURE (page 162) DEXAMETHASONE TREATMENT (pages 162-163) IONIZING RADIATION (page 163)
KINETIC EXPERIMENT (page 163) CELL CHARACTERIZATION (page 164)
IRRADIATION+DEXAMETHASONE EXPERIMENTS (page 165)
IRRADIATION+DEXAMETHASONE+ASCORBIC ACID EXPERIMENTS (page 165) DEXAMETHASONE+IRRADIATION EXPERIMENTS (pages 165-166)
IMMUNOFLUORESCENCE (page 166) COMET ASSAY (pages 166-167) TIME-LAPSE EXPERIMENTS (page 167) SURVIVAL EXPERIMENTS (page 167)
CELL CYCLE EXPERIMENTS (pages 167-168) WESTERN BLOT EXPERIMENTS (page 168)
dex HOMOLOGY-DIRECTED DNA REPAIR AND DR-GFP SYSTEM (page 169)
STATISTICAL ANALYSIS (page 170)
CHAPTER 3: EFFECTS OF GLUCOCORTICOIDS ON NEURAL STEM CELLS CONTROL AND FROM APP-PS1 MODEL: ROLE OF DNA DAMAGE RESPONSE (pages 171-178)
ISOLATION OF NEURAL STEM CELLS FROM HIPPOCAMPUS OF MICE P3, P6 OR P9 (pages 171-173)
NEUROSPHERES CELL CULTURE (page 173) DEXAMETHASONE TREATMENT (page 174) IONIZING RADIATION (page 174)
KINETIC EXPERIMENT (page 174)
NEUROSPHERES CHARACTERIZATION (page 175)
IRRADIATION+DEXAMETHASONE EXPERIMENTS (page 175) IMMUNOFLUORESCENCE (pages 175-176)
COMET ASSAY (page 176)
STATISTICAL ANALYSIS (pages 176-177)
7. OBJECTIVES (pages 179-184) 8. RESULTS (pages 185-262)
CHAPTER 1: GENERATION OF NEURAL STEM CELLS DURING POSTNATAL DEVELOPMENT AND SURVIVAL IN ADULT BRAINS (pages 186-227)
dex A) TO EVALUATE A POSSIBLE TARGET TIME WINDOW IN THE GENERATION
AND SURVIVAL OF NEURAL STEM CELLS DURING POSTNATAL DEVELOPMENT OF THE DENTATE GYRUS. (pages 186-197)
1.1. Analysis of the CldU population depending on CldU Administration Day (pages 186-187)
1.2. Analysis of the IdU population depending on IdU Administration Day (pages 188-189)
1.3. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population by Day of administration of the thymidine analog (pages 189-191)
1.4. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population by CldU administration day (pages 192-193)
1.5. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population depending on IdU administration day (pages 193-194)
1.6. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population depending on Rostro- Caudal position in Dentate Gyrus of Hippocampus (pages 194-195)
1.7. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population depending on Infra- Suprapyramidal position in DG of Hippocampus (pages 195-196)
1.8. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population depending on animal gender (pages 193-197)
B) TO GENERATE A DAMAGE IN THE TARGET DAY AND EVALUATE ITS CONSEQUENCES IN ADULT BRAIN (pages 198-227)
1.9. Weight control (pages 198-199)
1.10. Analysis of the (CldU+/IdU+) cell population by Treatment (pages 199- 201)
1.11. Analysis of the each cell population CldU+ and IdU+ depending on treatment (pages 201-205)
1.11.A. CldU density depending on treatment (pages 201-203) 1.11.B. IdU density depending on treatment (pages 203-205)
dex 1.12. Characterization of (CldU+/IdU+) cell population depending on treatment (pages 205-208)
1.13. Density of total Sox2+/GFAP+ cell population by treatment (pages 208- 210)
1.14. Density of [CldU+/IdU+/Sox2+/GFAP+] cell population by treatment (pages 210-212)
1.15. Density of [CldU+/IdU+/Sox2+/GFAP+] / (Sox2+/GFAP+) by treatment (pages 213-214)
1.16. Learning and Memory Behavior at the Passive Avoidance test analyzed by treatment (pages 214-215)
1.17. Learning and Memory Behavior at the Passive Avoidance test by gender (page 216)
1.18. Learning and Memory Behavior at the Passive Avoidance test.
Interaction between gender and treatment (pages 216-217)
1.19. Anxiety Behavior at the Elevated Plus Maze analyzed by treatment (pages 217-218)
1.20. Anxiety Behavior at the Elevated Plus Maze analyzed by gender (page 219)
1.21. Anxiety Behavior at the Elevated Plus Maze. Interaction between gender and treatment (pages 219-220)
1.22. Evaluation of Apoptosis by TUNEL assay (pages 220-222)
1.23. Evaluation of Proliferation by phospho-histone 3 (PH3) (pages 222- 224)
1.24. Evaluation of DNA damage by γ-H2AX foci (pages 224-226) 1.25. Evaluation of DNA damage by 53BP1 foci (pages 226-227)
CHAPTER 2: EFFECTS OF GLUCOCORTICOIDS ON ASTROCYTOMAS CONTROL AND FROM APP-PS1 MODEL: ROLE OF DNA DAMAGE RESPONSE (pages 228-250)
dex 2.1. Characterizing the different cell lines using twenty-seven different markers, such as GFAP, Nestin, Sox2, DCX, Prominin, among others (pages 228-230)
2.2. Evaluating the kinetics of the formation and disappearance of γ-H2AX and 53BP1 foci, in different lines after irradiation (IR) (pages 231-232) 2.3. Evaluating the kinetics of the formation and disappearance of foci, gamma-H2AX and 53BP1, in different lines after IR and subsequent addition or not of a glucocorticoid (Dexamethasone, 50µM) (pages 232- 234)
2.4. Potential of Ascorbic Acid (by remitting free radicals) to reverse the Dexamethasone/IR-induced γ-H2AX foci (pages 235-239)
2.5. Analyzing the DNA damage repair kinetic in control conditions and with addition of dexamethasone, in these 3 cell lines using the Neutral Comet Assay technique (pages 239-240)
2.6. Analyzing cell survival in control and dexamethasone conditions by an Incucyte microscope (pages 241-242)
2.7. Determining the existence or not of cell death with the addition of dexamethasone compared to control conditions, in the different cell lines by a Time-Lapse Microscopy (pages 242-243)
2.8. Analyzing Dexamethasone effects in Cell Cycle profile of these three cell lines (pages 243-244)
2.9. Analyzing dexamethasone effects on different proteins involved in DDR, in these three cell lines (pages 244-245)
2.10. Analyzing the effect of Dexamethasone added to the cell culture different times before irradiation (pages 246-248)
2.11. Analyzing the Homologous Recombination Pathway in the three different cell lines through DR-GFP assay (pages 249-250)
CHAPTER 3: EFFECTS OF GLUCOCORTICOIDS ON NEURAL STEM CELLS CONTROL AND FROM APP-PS1 MODEL: ROLE OF DNA DAMAGE RESPONSE (pages 251-260)
dex 3.1. Characterizing neurospheres labeled with different markers, such as GFAP, Nestin, Sox2, DCX, Prominin, between others (pages 251-252)
3.2. Evaluating the kinetics of the formation and disappearance of foci, gamma-H2AX and 53BP1, in NSC control and NSC APP-PS1 after IR and subsequent addition or not of a glucocorticoid (dexamethasone) (pages 252-257)
3.3. Analyzing the DNA damage repair kinetic in control conditions and with addition of dexamethasone, in NSC control and NSC APP-PS1 using Neutral Comet Assay technique (pages 258-260)
9. DISCUSSION (pages 261-294)
10. CONCLUSIONS/ CONCLUSIONES (pages 295-302)
11. BIBLIOGRAPHY (pages 303-326)
dex
INDEX OF FIGURES
INTRODUCTION
Fig. 1: Scheme of progenitor types and lineages in the developing and adult brain dentate gyrus in the hippocampus (page 59)
Fig. 2: Radial Glia-like Cell (RGL) model and neural lineages according to it (page 60)
Fig 3. Scheme of Neural Stem Cells (NSCs) and their progeny in the developing forebrain (page 61)
Fig.4. Different stages in neurospheres culture, obtained from hippocampus of postnatal mice P6 at lab. Figure obtained of experiments in our lab (page 63) Fig. 5. Active expression in NSCs and IPCs and its role for their maintenance before the formation of neurons (page 65)
Fig 6. miRNAs regulate multiple steps of neurogenesis (page 66) Fig. 7: Scheme of adult stem cell differentiation (page 67) Fig. 8. Adult neurogenesis (page 68)
Fig. 9. The lecticans anchor the cell surface to the matrix scaffold (page 69) Fig. 10. Hemichannels and gap junction channels formed by connexins (page 70)
Fig. 11. (A-F3) Stages of development of the dentate neurogenic zones, which are revealed by Nestin-GFP transgene and Tbr2. (G1-G4) A simplified model of the two stages involved in neurogenic zone relocation during the development of the dentate gyrus (page 73)
Fig. 12. Neural stem/progenitor cells and their differentiation (page 74) Fig. 13: Neural stem cells throughout development (page 75)
Fig. 14. Simplified scheme of model of age-related decline in adult hippocampal neurogenesis named as Neural stem cell “deforestation” (page 76) Fig.15. Model through time of the changes that Quiescent Neural Precursor cells (QNP) undergo when becoming an astrocyte, with gradual appearance of the apical, basal, and somatic processes (page 77)
dex Fig. 16: Regional specification of NSC in the embryo and the adult brain (page 77)
Fig. 17: Models for neural stem cell (NSC) behavior in the adult hippocampus (page 78)
Fig. 18. A unified NSC model in the adult hippocampus under basal conditions (page 79)
Fig. 19. Giulio Bizzozero and Santiago Ramon y Cajal were the most relevant scientists in the establishment of the “central dogma” of neurobiology (page 80) Fig. 20. Changes in the point of view of adult neurogenesis over the past 15 years represented in the diagram of an adult rat's brain (page 82)
Fig. 21. Stages of adult hippocampal neurogenesis (page 83) Fig.22. Scheme of SVZ neurogenesis (page 84)
Fig 23: Scheme that represents the five developmental stages during Adult SVZ neurogenesis of the lateral ventricle and the olfactory bulb. The expression of stage-specific markers is also represented as well as the sequential process of synaptic integration, and critical periods regulating survival and plasticity of newborn neurons (page 86)
Fig. 24. Picture of hippocampus by Santiago Ramon y Cajal (1911) (page 88) Fig. 25. The neural circuitry in the rodent hippocampus (page 89)
Fig. 26: Architecture of the subgranular zone (SGZ) in mouse brain (page 90) Fig.27: Summary of five developmental stages during Adult neurogenesis in the dentate gyrus of the hippocampus. The expression of stage-specific markers is also represented as well as the sequential process of synaptic integration, and critical periods regulating survival and plasticity (page 92)
Fig.28: Maturation of new-born dentate granule cells (DGCs) (DGC) (DGC) in mice (page 93)
Fig. 29. Adult hippocampal neurogenesis and the neurogenesis hypothesis of depression (page 98)
Fig. 30. Is the efficacy of antidepressants reliant on intact adult hippocampal neurogenesis? (page 98)
Fig. 31. Neurogenesis and pattern separation in the dentate gyrus and the olfactory bulb (page 100)
Fig. 32. The neurogenic interactome (page 103)
dex Fig.33. Role of several pathways of Alzheimer's Disease (AD) when interacting with neurogenesis in the adult hippocampus (page 105)
Fig. 34: Maturation-Arrest Theory (page 112)
Fig. 35. Representation of GLI transcription factors (page 114)
Fig.36: Glioma behavior determined by origin cell and oncogenic mutations (page 115)
Fig. 37. Several pathways lead to CREB phosphorylation/activation to promote cell survival, proliferation and differentiation (page 117)
Fig. 38. Microenvironmental factors modulate intrinsic cancer stem cell pathways. Cancer stem cells (CSC) in neural tumors (page 119)
Fig. 39. Regulation of GBM cancer stem cells and normal neural stem cells by miRNAs (page 120)
Fig.40: General stages of DNA damage response signaling (page 124) Fig.41: ATM/ATR and its role as damage transducers in the DDR (page 126) Fig.42. Schematic representation of ATM, ATR and DNA-PK signaling pathways (page 128)
Fig.43: Cell Cycle Control by different processes: G1/S Checkpoint (page 130) Fig.44: Representation of the molecular components of the G2 cell cycle arrest (page 132)
Fig. 45: Schematic model of the molecular components of the S/G2 cell cycle arrest (page 132)
Fig.46: Schematic model of the multiple repair pathways (page 133)
Fig.47. Homologous Recombination (HR) pathway in DNA double-strand break repair (DSBR) (page 135)
Fig.48: The two major mammalian pathways for double-strand break repair:
Homologous Recombination (HR) and Non-Homologous End Joining (NHEJ) (page 138)
Fig.49: A schematic representation of the γH2AX foci formation (page 142) Fig.50: H2AX release from IR-irradiated cells (page 144)
MATERIALS AND METHODS
Fig.51. Experimental Design A (page 152)
dex Fig.52. Experimental Design B (page 153)
Fig. 53. Tissue fixation by perfusion (page 153) Fig 54. Vibratome Leica VT100S used (page 155)
Fig 55: Diagram used to determine dentate gyrus position (page 157) Fig. 56. Escheme of passive avoidance test (page 158)
Fig. 57. Elevated Plus Maze (page 159) Fig 58. Principles of TUNEL assay (page 160) Fig 59. Astrocytoma cell lines used (page 162)
Fig 60. Plasmid containing the DR-GFP cassette used (page 169)
RESULTS
Fig. R1. Example of the immunohistochemistry showing the CldU cell population depending on CldU administration day (page 187)
Fig. R2.Example of immunohistochemistry showing the IdU cell population depending on IdU administration day (page 188)
Fig. R3. A) Immunohistochemistry CldU/IdU/DCX that shows CldU in green, IdU in blue and DCX in red. B) Representation in white of the double cells CldU+/IdU+, CldU in green and IdU in red. C) Representation of CldU+/IdU+ in white (page 191)
Fig. R4. Immunohistochemistry CldU/IdU depending on CldU administration day that shows CldU+ in green, IdU+ in red and CldU+/IdU+ in white (page 192) Fig. R5. Immunohistochemistry of CldU/IdU/DCX/CLR in Rostro or Caudal position within Dentate Gyrus (page 194)
Fig. R6. Immunohistochemistry of CldU/IdU/DCX/CLR depending on Infra- Suprapyramidal position within Dentate Gyrus (page 195)
Fig. R7. Immunohistochemistry of CldU/IdU depending on animal gender (page 196)
Fig. R8. A) Control and Etoposide animals at P12. B) Etoposide animal at P25 (page 199)
Fig. R9. Immunohistochemistry CldU/IdU/Sox2/GFAP depending on treatment (page 200)
dex Fig. R10. CldU density by treatment (page 202)
Fig. R11. IdU density depending on treatment (page 204)
Fig. R12. Immunohistochemistry IdU/CldU/MCM2 depending on treatment.
Arrows show CldU+/IdU+/MCM2+ cells (page 207)
Fig. R13. Immunohistochemistry IdU/CldU/Nestin depending on treatment.
Arrows show CldU+/IdU+/Nestin+ cells. A zoom of this cellular type is also shown (page 207)
Fig. R14. Immunohistochemistry IdU/CldU/DCX/CLR depending on treatment.
Zoom of the cells obtained with these markers (page 207)
Fig. R15. Immunohistochemistry IdU/CldU/Sox2/GFAP depending on treatment (page 208)
Fig. R16. Density of Sox2+/GFAP+ by treatment. Arrows show some of these Sox2+/GFAP+ cells (page 209)
Fig. R17. Density of CldU+/IdU+/ Sox2+/GFAP+ by treatment. Arrows show some of these quadruple-labeled cells (page 211)
Fig. R18. Immunohistochemistry DAPI/TUNEL. Arrows show TUNEL+ cells (page 221)
Fig. R19. Immunohistochemistry PH3 depending on treatment. Arrows show these PH3+ cells (page 223)
Fig. R20. Immunohistochemistry of DAPI/γH2AX in the Dexamethasone treatment. Inserts showing the staining at greater detail (page 225)
Fig. R21. Immunohistochemistry DAPI/γH2AX depending on treatment. Arrow shows γH2AX positive cells (page 225)
Fig. R22. Immunohistochemistry DAPI/53BP1/DCX in control treatment. Zoom detail of cells (page 227)
Fig R23. Immunocitochemistry of AchRα7, GFAP and 8OHdG in the cell lines.
Arrows show positive cells by each marker (page 229)
Figure R24. Scheme of different Immunofluorescences obtained using different markers (page 229)
Figure R25. Immunofluorescence of kinetic experiment to evaluate formation and disappearance of γ-H2AX and 53BP1 foci. Red arrows show some of the positive cells and white arrows show some of the negative cells (page 232)
dex Figure R26. Immunofluorescence of ´Irradiation + Dexamethasone Experiment´
analyzing the formation and disappearance of γ-H2AX and 53BP1 foci. Arrows show foci+ cells (page 234)
Figure R27. Immunofluorescence of ´Acid Ascorbic Experiment´ analyzing the formation and disappearance of γ-H2AX and 53BP1 foci (page 239)
Figure R28. A, B, C. Neutral Comet Assay Graph obtained of each cell line (A:
CT2A, B: APP.PS1 L.1, C: APP.PS1 L.3). D. Example of cell obtained with this assay in CT2A cell line over time (page 240)
Figure R29. Evolution of APP.PS1 cell line in Control and Dexamethasone condition over time analyzed by an Incucyte microscope (page 242)
Figure R30. Time lapse of the different cell lines at time 0 and after 24 hours (page 243)
Figure R31. Cell Cycle profile of the different cell lines in Control and Dexamethasone conditions. Arrows show the possible arrest in G2/M phase (page 244)
Figure R32. Western blots of different proteins involved at DNA Damage Response (page 245)
Figure R33. FACS results of DR-GFP experiment (page 250)
Figure R34. Different stages of neurospheres differentiation (page 251) Figure R35. Neurospheres characterization with different markers (page 252) Figure R36. The major differences founded in the emergence of foci between the two types of neurospheres studied (page 255)
Figure R37. Neutral Comet Assay in NSC WT and NSC APP.PS1 (page 259)
DISCUSSION
Fig D1. The diagram represents the proposed mechanism of ascorbic acid (AA) in attenuating reactive oxygen species (ROS) production when DAHP inhibited BH4 and caused eNOS uncoupling (page 287)
dex
INDEX OF TABLES
MATERIALS AND METHODS
Table 1. Preparation of the two types of Cerebro Spinal Fluids used for the isolation of neural stem cell (page 173)
Table 2. Composition of Neurosphere Growth medium (page 173)
RESULTS
Table R1. Experimental Design to analyze the consequences in the adult hippocampus of a specific lesion in our target day (page 198)
Table R2: Weight mean of different litters (page 199)
Table R3: Characterization of double cells by litter (page 206)
Table R4. Summary of antibodies used for the characterization of cell lines.¿?
Represents immunostaining didn´t reveal a good enough labeling to conclude reliably any finding (page 230)
Table R5. Percentage of cells in each phase of cell cycle (page 244)
Table R6. Percentage of 53BP1 and γH2AX cells in each experimental condition in CT2A cell line (page 246)
Table R7. Percentage of 53BP1 and γH2AX cells in each experimental condition in APP.PS1 L.1 cell line (page 247)
Table R8. Percentage of 53BP1 and γH2AX cells in each experimental condition in APP.PS1 L.3 cell line (page 248)
Table R9. Percentage of GFP cells in each experimental condition in the three cell lines (page 249)
dex
INDEX OF GRAPHICS
RESULTS
Graph R1. Density of the CldU cell population depending on CldU Administration Day (page 187)
Graph R2. Density of the IdU cell population depending on IdU Administration Day (page 188)
Graph R3. Density of (CldU+/IdU+) cell population by day of administration of thymidine analog (page 190)
Graph R4. Density of (CldU+/IdU+) cell population depending on CldU administration day (page 193)
Graph R5. Density of (CldU+/IdU+) cell population depending on IdU administration day (page 194)
Graph R6. Density of (CldU+/IdU+) cell population depending on Rostro-Caudal position within Dentate Gyrus (page 195)
Graph R7. Density of (CldU+/IdU+) cells by Infra-Suprapyramidal position within Dentate Gyrus (page 195)
Graph R8. Density of (CldU+/IdU+) cell population depending on animal gender (page 197)
Graph R9. Evolution of the weight of the animals through time (page 199) Graph R10. Density of (CldU+/IdU+) cell population by treatment (page 200) Graph R11. Density of CldU cells by treatment (page 203)
Graph R12. Graph showing the Confidence Intervals (page 203)
Graph R13. Density of IdU cell population depending on treatment (page 205) Graph R14. Graph showing the Confidence Intervals (page 205)
Graph R15. Characterization of CldU+/IdU+ cell population with different markers such as Nestin, MCM2, DCX, CLR, Sox2 and GFAP (page 206)
Graph R16. Percentage of Sox2+/GFAP+ total within dentate gyrus by treatment (page 209)
Graph R17. Graph showing the Confidence Intervals (page 210)
Graph R18. Density of [CldU+/IdU+/Sox2+/GFAP+] cells by treatment (page 212)
dex Graph R19. Graph showing the Confidence Intervals (page 212)
Graph R20. Density of [CldU+/IdU+/Sox2+/GFAP+] / (Sox2+/GFAP+) cells by treatment (page 213)
Graph R21. Graph showing the Confidence Intervals (page 214) Graph R22. Passive avoidance depending on treatment (page 215) Graph R23. Graph showing the Confidence Intervals (page 215) Graph R24. Passive Avoidance by animal sex (page 216)
Graph R25. Passive Avoidance results depending on animal gender and treatment (page 217)
Graph R26. Elevated Plus Maze depending on treatment (page 218) Graph R27. Graph showing the Confidence Intervals (page 218)
Graph R28. Elevated Plus Maze test results depending on animal gender (page 219)
Graph R29. Elevated Plus Maze Test results depending on animal gender and treatment (page 220)
Graph R30. TUNEL+ cells depending on treatment (page 221) Graph R31. Graph showing the Confidence Intervals (page 222) Graph R32. PH3+ cells by treatment (page 223)
Graph R33. Graph showing the Confidence Intervals (page 224) Graph R34. γH2AX+ cells depending on treatment (page 225) Graph R35. Graph showing the Confidence Intervals (page 226)
Graph R36. Formation and disappearance of γH2AX foci and 53BP1 foci in the different cell lines (page 231)
Graph R37. Evaluation of γH2AX foci and 53BP1 foci by cell lines in the experiment Irradiation + Dexamethasone (page 233)
Graph R38. Graph showing the Confidence Intervals (page 236) Graph R39. Ascorbic Acid Experiment in CT2A cell line (page 236) Graph R40. Graph showing the Confidence Intervals (page 237)
Graph R41. Ascorbic Acid Experiment in APP.PS1 L.1 cell line (page 237) Graph R42. Graph showing the Confidence Intervals (page 238)
Graph R43. Ascorbic Acid Experiment in APP.PS1 L.3 cell line (page 238)
dex Graph R44. Graph showing the confluence of cells over time with the Incucyte microscope (page 241)
Graph R45. Proteins levels in each cell line and condition (page 245)
Graph R46. Dexamethasone + Irradiation experiment in CT2A cell line (page 246)
Graph R47. Dexamethasone + Irradiation experiment in APP.PS1 L.1 cell line (page 247)
Graph R48. Dexamethasone + Irradiation experiment in APP.PS1 L.3 cell line (page 248)
Graph R49. Results of DR-GFP experiment (page 249)
Graph R50. Evaluation of 53BP1 foci and γH2AX foci in the NSC WT in the experiment Irradiation + Dexamethasone (page 253)
Graph R51. Evaluation of 53BP1 foci and γH2AX foci in the NSC APP.PS1 in the experiment Irradiation + Dexamethasone (page 254)
Graph R52. Evaluation of 53BP1 foci in the NSC WT versus NSC APP.PS1 in the experiment Irradiation + Dexamethasone (page 256)
Graph R53. Evaluation of γH2AX foci in the NSC WT versus NSC APP.PS1 in the experiment Irradiation + Dexamethasone (page 257)
knowledgements
ACKNOWLEDGEMENTS
"Agradece a la llama su luz, pero no olvides el pie del candil que, constante y paciente, la sostiene en la sombra", Rabindranath
Tagore
"Thank the flame for its light, but don't forget the base of the
candle that, constantly and patiently, holds it in the shadows".
knowledgements
AGRADECIMIENTOS TESIS/
ACKNOWLEDGEMENTS
Sin lugar a dudas esta es la sección que más me emociona escribir…y quizás la más difícil. Me resulta muy complicado hacer una lista de personas y momentos que me han acompañado durante los últimos 5 años, porque es difícil ordenar el grado de agradecimiento que tienes hacia ellos. Desde la mayor de las humildades solo puedo decir que esto no corresponde a ningún orden lógico, y que estoy eternamente agradecida a todos cuantos nombre aquí y seguramente a muchos otros que mi memoria deja en el tintero.
Mis primeras líneas irán dedicadas a mi familia. Podría escribir una propia tesis acerca de ellos, pero por resumir diré que les agradezco de manera sobrehumana su capacidad de respeto, de tolerancia, la libertad que siempre me brindaron para hacer el camino que yo quería, sus noches en vela, sus angustias, en resumen TODO. Sin ellos no habría podido desarrollar estos últimos 5 años del modo que lo hice.
En particular no puedo olvidarme hoy de ti, abuelo. Sé que en algún lugar tú sabes que estoy a punto de conseguir mi sueño, y sé que probablemente eres quien está más orgulloso de mi andadura profesional. Tú guiaste mis caminos de la infancia, me abriste los ojos para ver el mundo desde otra perspectiva, me llenaste de vitalidad, y sobretodo me enseñaste a ser una luchadora, casi tan grande como lo fuiste tú en su día. Contigo aprendí muchísimos valores; sin duda nuestro vínculo sobrepaso cualquier tipo de distancia y tiempo y por eso sé que hoy sigues unido a mí. Las adversidades que la vida me puso en el camino no habría podido solventarlas si no fuera porque siempre, he sabido que te tenía a ti cuidándome para salir adelante y que jamás podría rendirme. Por todo, gracias abuelo.
A mi hermana, agradecerla por ser mi parte complementaria. Es difícil resumir todo lo que para mí significas. Sé que no puedo hacerlo porque solo los mejores sentimientos son aquellos incapaces de describirse. Te daría las gracias por tantas cosas que
knowledgements probablemente lo mejor que pueda decirte es que eres imprescindible en mí vida. Has estado a mi lado en todas las etapas de mi camino, en TODOS los golpes y alegrías que se han ido presentando. Estuvimos juntas en el 11M, en Madrid, en Francia, en Cádiz, en Estados Unidos, en Alemania, en Oxford. Hicimos mil y un viajes, conversamos a todas horas y como te dije antes complementas mí vida. Porque, qué sería de mi locura sin tu calma, qué sería de mi estrés sin tu tranquilidad, qué sería de mi preocupación sin tu alegría. Que eres la mejor hermana del mundo no hace falta ponerlo en ningún sitio, para mi simplemente eres única. Gracias por todo lo que hemos pasado juntas hermana, y sobre todo gracias por adelantado por todo lo que te queda de sufrir conmigo.
De ti Mamá, es que de ti casi ni puedo hablar. Desde que nací te llevo dando preocupaciones, y llegados a este punto no sé cómo agradecerte que me hayas dado TODO. Persona ejemplar donde las haya, tu humildad, tu inteligencia extrema, tu dedicación, tu modestia, tú forma de pasar desapercibida, todas tus cualidades han sido imprescindibles para ser lo que soy hoy. Y sin embargo, somos tan iguales que no podemos estar más de una semana juntas sin discutir. Que te quiero es algo que sabes, que te valoro, te admiro y te tengo en un altar, es algo que me cuesta decirte pero que sin duda debes saber. Mamá estoy a punto de conseguir un sueño, a pesar de las veces que te dije por el camino que no podía más, de las dificultades que el destino ha querido ponerme, de las barreras que hemos ido superando. Sin lugar a dudas, eres y serás mi gran apoyo, mi gran ejemplo a seguir, el modelo del más alto grado de amor que alguien puede darte. Tú has sufrido más que nadie mis problemas de salud, de inquietudes, sé que estos últimos meses están siendo terribles para ti, y que lo ocultas bajo tú capa de ´superwoman´… y no imaginas lo culpable que me siento por ello, porque más duro que una enfermedad es ver que tu gente sufre por ti. Por eso en estas líneas que permanecerán para siempre en nuestros recuerdos quiero decirte que SALDREMOS DE TODO, que mi vida es enormemente positiva y feliz, que soy enormemente afortunada de tener lo que tengo y de haber vivido tantas y tantas cosas, gracias a vosotros. Mamá, nuestros problemas son anécdotas comparadas con la gente que sabes que realmente me preocupa y me quita el sueño, así que se fuerte por mí, juntos todo es más fácil. Gracias por ser como eres, gracias por cuidarme y por hacer
knowledgements de mi vida un cuento de princesas… porque no hay nadie en el mundo que haya estado más mimada y consentida que yo por vosotros. Gracias por ser mi mamá.
A ti papá…primero, no te pongas celoso de mama, sabes que una madre siempre es lo más grande que podemos tener y debes asumirlo, y no por eso tú dejas de ser menos importante en mi vida, sin duda los dos sois junto a la hermana, mis grandes apoyos.
Papa sabes que me enerva tu forma de hacer las cosas, que me molesta que cuentes todo, que te guste saber de todo, meterte en todo…pero, como voy a seguir por ahí, si eso ya lo sabes. Lo que se te olvida a menudo es que te quiero con locura. Te sigo queriendo igual o más que cuando era pequeña y me ponía en tus piernas a preguntarte cosas y era tan zalamera. Tu amor incondicional conmigo ha creado un vínculo muy difícil de explicar. La libertad que me has dado, la confianza que me supone tener un padre al que veo como un igual…me has aportado millones de valores. Tu sensibilidad, tu amor con los demás, tus ganas constantes de ayudar a la gente, me has dado el ejemplo para intentar siempre ser mejor persona con los demás, me has hecho creer en la utopía de ´poder cambiar el mundo´, sin duda la ilusión más bella que me aportaste para vivir. Papa no cambies nunca, porque la gente que estamos alrededor de ti te necesitamos así. Quizás puedas dejar a un lado tu temperamento y tu carácter…pero eso también te hace tener un encanto especial.
Gracias por todo papa. Gracias por cumplir muchos de mis sueños, hace poco uno de los que más deseaba, gracias por llevarme al congreso de la SFN, por viajar conmigo a Nueva Orleans, y por demostrarme que las barreras que el mundo científico en forma de limitaciones económicas nos pone, no son barreras si tienes a tu familia incondicionalmente apoyándote, y por eso por encima de ese mundo, os debo agradecer a vosotros todo lo que tengo, porque sin vuestra ayuda no tendría la andadura profesional que hoy tengo. Gracias por todo papa.
A mi cuñado Ángel, porque jamás podré agradecerle con palabras la felicidad que da día a día a mi hermana. Por ser tan tremendamente generoso y bueno con todo. Por sonreírme cuando tengo problemas. Por ayudarme mil y una vez con el coche o las mudanzas. Por ser uno de los mejores ejemplos que conozco de persona trabajadora.
Porque su alto grado de competencia me da ese buen rollo que te aporta la gente que sabes que hace todo lo mejor que puede. Y por aguantarme en su casa millones de días, contenta y triste. Porque desde el principio entró en mi familia por la puerta
knowledgements grande y se quedó en ella. Hoy quiero agradecerte todo cuñado! Sabes que soy muy temosa, pero te quiero de corazón. También dar las gracias a tus padres y toda tu familia, por ser también ya nuestra familia.
A mis abuelos, porque ellos me han dado las mejores lecciones de la vida. A mi abuelo Domingo, porque sigue siendo mi otro guardián. Por hacer que valore el silencio, el sacrificio, la sencillez, la humildad de una vida dedicado a los suyos, a su campo.
Porque siempre me dio las mejores sonrisas y porque desde sus ojos se podía ver el amor que desprendía hacia todos nosotros. A mi abuela Boni, gracias por enseñarme el fuerte carácter y la superación. Ella me enseño la fortaleza en su más alto grado, me enseño a ver que la juventud no reside en el cuerpo sino en la mente, me enseño la ilusión que aportan las cenas familiares, el calor de la brasa, el olor a cocido recién hecho. A mi abuela Francisca, por ser tan particular. Porque desde sus reivindicaciones contra mi forma de vestir o mi locura constante, me estaba dando en realidad una lección sobre la vida. Es mi abuela del ´ni contigo ni sin ti´, aquella que me hizo llorar de pequeña al saber que no era su favorita (menuda tontería!), y que me emociona al verla ahora llorando de preocupación por mí. Porque mi vida sin ellos, los 4, no habría sido tan plena como la recuerdo. Porque para mis abuelos solo tendré siempre palabras de orgullo y admiración. Porque mi generación no habría sido nada sin el sacrifico de la suya, y porque nos olvidamos que para tener lo que tenemos hoy día hubo antes varias ´generaciones olvidadas´ que hicieron de sus penurias nuestros excesos. Gracias por todo abuelos.
A mi tío Juan, por estar siempre ahí. Por darme desde pequeña una visión loca del mundo que me encantaba ver, y por haber permanecido en el tiempo en contacto con nosotros. A mi tía Inma, por haberme dado lecciones que jamás olvidaré. Por ser una gran persona y mejor mujer. Por estar ahí. A mis primas, Julia y Candela, porque las quiero con locura, y me encanta pasar horas con ellas y sentirme de nuevo una adolescente. Porque durante estos años he pasado momentos muy bonitos con ellas.
Porque espero que cuando tengan mi edad vuelvan a leer esto y sepan que aquí siempre tendrán una prima y sobretodo una amiga para lo que necesiten.
Al resto de mi familia porque todos me han aportado valores de una u otra forma que me han hecho ser lo que soy hoy.
knowledgements A los incondicionales de mi vida:
-A Sofía, mi mejor amiga, mi gran apoyo. Por estar siempre a mi lado pese a la distancia. Por ser como eres. Gracias por darme tantas historias que contar a mis futuros nietos. Gracias por el 2 de marzo pasado, por compartir conmigo ´El Secreto´ y por haber podido por fin llorar tranquila con alguien hablándole de mi enfermedad.
Gracias porque necesitaba mucho de ti, y sé que ahora volvemos a estar cerca. Gracias por todo, porque sabes que nuestra amistad es de la difícil de encontrar pero fácil de mantener. Me demuestras siempre que eres más que una amiga, casi una hermana.
Allá donde estemos en el futuro sabes que podremos contar siempre la una con la otra.
Gracias por venir a casa cuando estaba hundida, por compartir conversaciones y por animarme. No sé qué habría sido sin tus preciados consejos y tu ayuda. Te quiero mucho mi niña.
-A Rafa. Porque debería escribir un libro diciendo TODO lo que has hecho por mi durante este tiempo. Porque solo tú viviste mis mejores y peores días. Porque fuiste tú quien sufrió conmigo la angustia de recibir una beca, la desesperación de las adversidades, las mudanzas, los cambios, los mil y un disgustos que me traje a casa del trabajo. Porque tú sufriste mi manera de vivir la ciencia, viviste mis fines de semana pegada al ordenador y me ayudaste en definitiva a sobrevivir en este camino.
Aguantaste mis ideas experimentales a las 5 de la mañana, me aportaste la calma para aguantar las adversidades, me hiciste creer que podría lograrlo aun cuando mis fuerzas estaban rotas. Me ayudaste a afrontar mis problemas de salud con el brazo, y ahora, en la distancia, con mi enfermedad sigues estando en mi vida. Porque sé que nadie me querrá más que tú y porque te mereces ocupar este lugar. Sin duda serás siempre el más incondicional de mi vida, porque hay cosas que permanecen presentes a pesar del tiempo o la distancia. Gracias por todo. Tú y tu familia siempre ocuparéis un lugar privilegiado de mi corazón. Os quiero.
-Al más estiloso y fiel de mis amigos, a mi queridísimo Dani. Gracias por mantener esta relación tan difícil de conseguir hoy día. Gracias por seguir ahí cada vez que te necesito, por animarme siempre que estoy mal, por darme siempre una sonrisa. Por ser la persona más positiva del mundo y por hacerme sentir siempre especial. Porque aunque yo sea ´Willy Fog´, como tú me llamas, y tú no te muevas de Guadalajara,
knowledgements siempre nos tenemos presente. Porque soy muy afortunada al saber que eres un incondicional de mi vida.
-A Matilde, por enseñarme grandes valores de la vida. Por haber forjado juntas una amistad casi surrealista a través de cartas desde España a Guinea Ecuatorial cuando éramos unas niñas. Y por haber continuado en mi vida. Porque conocerla en persona fue un sueño, y porque su familia también es la mía. Gracias por seguir ahí.
-A Luismi, mi gran amigo del instituto. Ese que me hizo pasar tantos buenos y preocupados momentos. Porque ha pasado el tiempo y sigues estando ahí. Por saber que puedo contar contigo. Perdón, perdón, perdón por los últimos meses…sé que estás preocupado por mí, sabes que te tengo presente. Gracias nene!
-A Mari Ángeles y David. Por ser la pareja que estuvo más presente en mi vida. Por nuestras salidas, las barbacoas, los viajes. Porque aunque llevamos tiempo sin vernos seguimos estando unidos y eso es lo que más cuenta. Gracias por haberme apoyado en los momentos más duros. Porque jamás olvidaré lo que te necesitaba Flor cuando se fue mi abuelo y lo bien que nos cuidaste a mí y a toda mi familia. Gracias por brindarme tu apoyo y darme ´ese regalo hace unas semanas´, porque aunque nos cueste creer sabes que me siento mucho mejor, y que te estoy eternamente agradecida por la ayuda. Gracias por estar ahí.
A médicos, amigos y gente especial que ha compartido este proyecto, y me ha ayudado de uno u otro modo, porque sin ellos nada hubiese sido posible:
-a mis médicos el Dr. A. Iglesias Justo y el Dr. A. Melchor Galán, por TODO. Agradecer en especial al Dr. Iglesias por haberme operado de urgencia cuando ni siquiera me conocía, por ser el mejor médico que conozco, de calidad profesional y humana. Por tratarme con tanto cariño, por darme ánimo, y por hacerme sentir que todo saldrá bien. Por amar su trabajo, y aplicar en la medicina la humanidad que te da un médico que se preocupa por sus pacientes. Es imposible decir con palabras la admiración, respeto y agradecimiento que le tengo. Por todo, de corazón, GRACIAS. También agradecer a Nieves, por brindarme siempre su sonrisa, por tratarme de forma exquisita y por darme una parte de su fe para que me protegiera. A todos los
knowledgements enfermeros, auxiliares, y todos los que me acompañan en las operaciones y en el hospital, gracias.
-a mi médica la Dra. Wojcikiewicz, por haberme dado un ´remedio´ para el dolor, por su apoyo, su comprensión, por darme una esperanza. A tod@s y cada uno de los que me trataron en fisioterapia, porque son sesiones duras y siempre me pusieron una sonrisa. Por ayudarme a recuperar sensibilidad, fuerza, y ganas de seguir adelante.
Gracias.
-a Marco, por ser mi italiano preferido. Porque me encanta su visión del mundo, su sentido del humor, su forma de pensar, su manera de vivir el día a día. Por ser un ejemplo de superación y ambición en el trabajo, y una persona tremendamente culta.
Por enseñarme multitud de cosas nuevas, por poder hablar contigo de Cajal, Dalí o la Copa América. Por estar incondicionalmente apoyándome durante mi enfermedad, preocupándote de mi salud (aunque a veces me desespere tu grado de preocupación), por obligarme a cuidarme día a día. Por abrirme las puertas de tu casa en Valencia y haberlo podido compartir y conocer juntos. Por enseñarme fotos de TAC y resonancia, y darme el conocimiento que me falta en tantas y tantas cosas. Porque eres como una caja de sorpresas, cada día me descubres algo nuevo y más bonito que el anterior. Por todas las risas y los buenos momentos que hemos compartido y por los que nos quedan juntos. Un bacio.
-A Óscar. Porque nos conocimos en circunstancias ´adversas´, pero nuestra amistad ha durado y se ha mantenido en el tiempo. Gracias por sufrir conmigo algunas de mis angustias, por creerte la historia del príncipe rana que vivía en mi apartamento, por aguantar mis ausencias por los problemas que conoces. Nuestra amistad seguirá siempre ahí. Gracias por todo.
-A Ángel. Porque desde que te conozco nunca has dejado de sorprenderme. Quiero agradecerte muchas cosas, fundamentalmente gracias por lo que hiciste por mí hace unos meses. Por venir a Manchester y por estar ahí cuando estaba más pérdida. Por darme nuevos amigos (Gracias a todos ellos también por el tiempo tan bueno que estamos pasando juntos: Laura, Peewee, Sole, Carmen, Rocío, JuanRa, Yoli,…), nuevas vivencias, por las películas,…, y sobretodo, gracias por haberme sacado de quicio antes de entrar en el quirófano. Sabías que solo así conseguirías cambiar mis nervios por un
knowledgements estado de mala leche transitorio que me permitiría bajar más relajada…Gracias por ser mi polo más opuesto y a la vez por sentirme afortunada de contar contigo. Gracias por ser mi amigo.
-a Sandra, por haberme ayudado con el inglés, porque sin duda sin su ayuda esto me habría sido imposible. Gracias por dedicar tu tiempo en mi tesis, por apoyarme cuando estuve mal y por hacerme el trabajo más fácil. Jamás podré agradecerte todo lo que has hecho por mí durante este tiempo. Una parte de mi trabajo se debe a ti. Gracias de corazón. Sabes que aquí me tendrás para lo que necesites.
-a Agustín Puig, por ser sencillamente magnífico en su trabajo y por ayudarme durante mi carrera, mi tesis, por estar siempre brindándome su ayuda. Espero algún día poderte agradecer todo lo que has hecho por mí.
-a Juan Ballesteros, por haber aguantado mil y una llamada de mi padre. Por ayudarme siempre con mis enfermedades varias, y por hacerme más fácil todo.
Gracias primo!
-a Ángel José Cervantes Martín y Juan Jiménez del Prado, por ser los mejores abogados que puedo tener y por constituir siempre un gran apoyo para mi familia, porque siempre nos han ayudado con todo. Porque estos si son amigos de verdad. Gracias de corazón.
-A mis amigas de la carrera, todas las reinonas, por estar ahí, aun en la distancia, con el paso del tiempo. En especial, gracias a Yesenia por haber compartido conmigo muchísimos momentos a lo largo de estos años.
-Gracias a Mónica por darme su apoyo y experiencia con mi enfermedad. Porque siempre me haces sentir que las cosas saldrán bien y me das ese punto de optimismo que a veces se pierde por el camino. Por demostrarme la gran persona que eres.
Gracias.
Agradecer por supuesto a todo el ambiente científico que he conocido durante las diferentes etapas de mi tesis, porque sin ellos mi trabajo no habría sido posible, y porque con ellos he complementado las largas horas de experimentación:
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*En Madrid
Gracias a mi jefe, el Dr. José Luis Trejo, por darme la oportunidad de cambiarme a su laboratorio en un momento en el que lo necesitaba. Por haber confiado en mí entonces y a posteriori. Por haberme enseñado a perfundir animales y por haberme ayudado en el quirófano cuando había mucho trabajo. Porque además de atender a sus múltiples responsabilidades de jefe, también estuvo compartiendo momentos de experimentación conmigo y eso es algo de agradecer y considerar como científico ejemplar. Pero fundamentalmente quiero agradecerle por darme la oportunidad de hacer ciencia de una forma más independiente, por haber confiado en mis diseños experimentales, y por haberme permitido desarrollar experimentos en otros laboratorios de prestigio internacional, cuando en Madrid las cosas eran difíciles, para poder obtener más resultados. Por tolerar mis críticas cuando estaba en desacuerdo con alguna de las formas de proceder, ya que me demostraba que era realmente un ejemplo de científico que busca siempre el mejorar, aunque yo estuviera equivocándome en la percepción de las cosas. Por dejarme asistir a congresos que para mí eran importantes. Por entender mis problemas de salud, y por ser antes que jefe, buena persona. Porque valoro muchísimo su alto grado de implicación. Por las lecciones de asertividad, por los consejos que me diste tanto de ciencia como de vida, y por preocuparte por mi cuando he estado mal por mi salud o en el laboratorio. Por todo, Gracias JL!.
A las compañeras que tuve en el laboratorio durante mi tiempo en Madrid. A Simona Gradari, Paloma Pérez, Paula Martínez y Sandra, porque de una u otra forma me ayudaron en mi etapa en Madrid, y pasé con ellas gran parte de mi tiempo allí. En especial a Simona, porque fue con quien más congenié durante todo este tiempo y con quien pase más buenos momentos juntas. Porque además de buena científica es una gran persona, siempre dispuesta a ayudar. Millones de gracias por haberme ayudado siempre con experimentos y por haber escuchado mis problemas. Sabes que siempre podrás contar conmigo.
A nuestras compañeras de espacio, la Dra. María de Ceballos y Silvia. En especial agradecer a María por haberme ayudado en multitud de ocasiones para desarrollar algunos de mis experimentos, prestándome por ejemplo las cubetas de electroforesis y
knowledgements las fuentes de alimentación para hacer los Comet Assay. Por enseñarme y dejarme usar su maravilloso microscopio Incucyte para poder hacer algunas de mis pruebas, y no menos importante, por su espíritu optimista. Porque sus charlas sobre diferentes aspectos de la ciencia o la vida daban un aire más distendido al laboratorio. Por ser el ejemplo de científica cooperativa que falta en muchos lugares de trabajo, porque siempre ha estado dejándonos material a nuestro grupo y ayudándonos en todo lo que necesitábamos, algo muy de agradecer. Por todo, gracias. Con Silvia no he tenido la ocasión de pasar demasiado tiempo, pero sin duda la agradezco sus sonrisas en el laboratorio, porque la gente positiva siempre te da fuerzas para desarrollar mejor tu trabajo.
A mi mejor apoyo en el Cajal, a mi queridísima amiga Ainhoa Arias, por haberme ayudado en tantas y tantas cosas. No solo porque a ella la deba mis experimentos de conducta, sino también porque a ella la debo todo lo que hice en Alemania y en Oxford. Sin ella no habría podido tener las células para trabajar. Gracias por estar siempre dispuesta a ayudarme en todo. Por escuchar algunos de mis problemas y por darme apoyo científico y emocional. Sin duda solo puedo decirte que gracias, que sé que me llevo ante todo una amiga. Porque cuando supe que te ibas se me cayó el mundo a los pies… todos los que te conocemos sabemos de tu alto grado de competencia y responsabilidad con las cosas, tú has hecho el trabajo más fácil a mucha gente del Cajal. Estoy segura que el camino te brindará nuevas y mejores oportunidad, porque te lo mereces guapa! Sabes que siempre tendrás aquí una amiga.
A mi amiga Silvia Fernández, porque admiro su labor en el servicio de Biología Molecular. Por haberme ayudado cuando tenía que hacer un overbooking en el vibratomo para sacar el trabajo adelante, por haberme tendido siempre la mano en cualquier problema que se me planteara, por las comidas que compartimos juntas, las conversaciones sobre ciencia y su visión sobre el trabajo y la importancia del descanso.
Porque has sido y eres alguien a quien admiraré de allí. Gracias Silvia.
A mis compañeros y a la vez amigos del servicio de Confocal: a Belén, Carmen, José y Concha, porque me han ayudado muchísimo y han permitido que siempre llegara a tiempo con mis deadlines. Porque con Belén compartí muchísimo de mi trabajo en AGNA durante las mañanas, ella fue quien me ayudo para poner a punto mis inmunos
knowledgements primero triples y luego cuádruples, quien me aconsejaba sobre cómo usar los filtros, y con quien pasé la mayor parte del tiempo del Confocal y el time-lapse. Con José compartí sobre todo las primeras horas del día cuando no había nadie y podía aprovechar al máximo el servicio y fue quien me ayudó con los Softwares de videos y reconstrucciones tridimensionales. Con Carmen pasé tardes muy buenas hablando de todo un poco mientras acababa el trabajo. Además ella me ayudó diseñándome macros para facilitarme la vida, y fue quien me enseñó la mayor parte del curso del Confocal.
A Concha gracias por haberme permitido hacer el curso para poder usar el servicio de forma independiente y haberme dado tantas facilidades a la hora de llegar a tiempo con mis objetivos. Todos ellos han compartido la mayoría de mis días en el Cajal, y les tengo muchísimo cariño y admiración. Por todo ello, gracias.
A la gente de cultivos, Concha, Sonia y Fide, porque ellas en un momento u otro me ayudaron en ese servicio y me dieron facilidad para hacer uso del irradiador que tanto necesitaba. En especial quiero dar las gracias a Fide por tener siempre una sonrisa conmigo, por contarme cosas fuera de la ciencia y por dar alegría a las instalaciones.
A la gente de animalario. A todos ellos les agradezco su tiempo y su cuidado con los animales. Dar las gracias a Laude por la gestión que hace de los recursos y por haberme ayudado cuando lo he necesitado. En particular, no podría olvidarme de Emy, porque ella era quien siempre estaba pendiente de mis camadas y quien me ayudó con las inyecciones cuando no podía contar con nadie. Millones de gracias.
A la gente de administración, porque todos ellos me han echado una mano a lo largo de este tiempo. En particular quiero agradecer a Mari José por hacerme la vida más fácil en cuanto a la burocracia de mis estancias y congresos, y a Ana por haberme facilitado los pagos que tan necesarios me eran cuando todo tenía que ser por adelantado de mi bolsillo. Gracias chicas.
A toda la gente que trabaja en recepción porque todos ellos me han puesto una sonrisa. En especial agradecer a Aurelio, porque sin duda es una gran persona. Con el tuve muchas conversaciones el último año durante los fines de semana, y siempre me regalaba una sonrisa. Porque este tipo de gente es la que con pequeñas cosas hace sentirte feliz.
knowledgements A la gente que he ido conociendo en el Instituto, con los que compartí tiempo en cultivos, en animalario, en Confocal o en el comedor, porque con ellos tuve buenas conversaciones y se fue pasando el tiempo haciendo ciencia. Aquí incluir a mi amiga Carmen Ovejero con quien compartí la angustia de mi primera estancia, y los tan temidos trámites administrativos, además de horas en el microscopio óptico. También a Dolores Guinea por ser de las mejores técnico que conozco y por brindarme siempre su ayuda y apoyo con todo.
Al grupo del Dr. Ricardo Martínez Murillo, especialmente a él mismo, a Julia Serrano, Ana Patricia Fernández y a Raquel, por haberme ayudado tanto. Por dejarme sus líneas celulares para trabajar y por haberme tratado siempre con amabilidad y con una sonrisa.
A los grupos de la Dra. Laura López-Mascaraque y el Dr. Juan A. de Carlos. Gracias a Laura por brindarme su apoyo y colaboración y por haber podido realizar mi estancia en St. Louis al ponerme en contacto con la Dra. Susana Gonzalo. Además agradecer a María Pedraza, Jorge García y María Figueres por ayudarme y dejarme el material para tratar de poner a punto la electroporación en postnatales.
A la gente de pedidos, informática, mantenimiento, limpieza, UATI, biblioteca, porque sin ellos el centro sería algo distinto. Porque siempre he sentido el buen trato y el buen hacer de todos.
*En Cádiz
A la Dra. Carmen Castro, porque fue quien primero apostó por mí como científica. Por darme un lugar en su laboratorio durante 2 años y por enseñarme cosas que me siguen siendo útiles en la actualidad. Junto con ella debo agradecer al resto de mi grupo de entonces, al Dr. Manuel Carrasco Viñuela, por haberme enseñado la cirugía en animales y el microscopio Confocal. Porque con él pasé muchos días poniendo mini-bombas osmóticas a ratones, de 10 de la mañana a 11 o 12 de la noche, y mientras tanto me contaba sus experiencias en ciencia y sus vivencias en multitud de sitios. Porque siempre admiraré a los doctores que conservan el ´mono´ de ponerse a hacer experimentos. A la Dra. Carmen Estrada Cerquera, por haber tenido la
knowledgements oportunidad de conocerla impartiendo clases, y por ser una persona con una calidad humana increíble. Por último y no menos importante, a mi queridísima amiga la Dra.
María Isabel Murillo Carretero, porque además de una gran científica la tendré siempre como una gran amiga, por haber compartido con ella muchas experiencias inolvidables en mi querida Cádiz, y por compartir con ella las ganas incansables de vivir intensamente.
Al resto de profesores del Departamento, porque a todos ellos les tengo un gran aprecio, porque desde el principio me hicieron sentir una más y me hicieron partícipe de todo lo referente al mismo, porque en Cádiz me sentí como en mi casa, y porque el buen rollo andaluz es difícil de encontrar en otros laboratorios. Aquí debo incluir a gente de tanto calado científico como el Dr. Bernardo Moreno López, del que destacaría su alto grado de competencia, persona incansable en su afán investigador y con un toque de humor diferente que siempre valoré y admiré de él. El Dr. Federico Portillo Pacheco, por su parte, del que solo tengo palabras de agradecimiento, por su alta calidad humana, por desearme siempre lo mejor, por ser un gran científico y mejor persona, por apuntarse a nuestras salidas de becarios, porque es bonito ver que en algunos sitios los jefes no hacen distinción y tratan a todos como iguales. El Dr. José Juan Vallo de Castro, por haberme felicitado en mi decisión en un momento difícil. El Dr. David González-Forero, por enseñarme la humildad de la ciencia, porque pasaba desapercibido haciendo como nadie su labor investigadora, porque era a quien siempre me encontraba los sábados cuando iba a las 8 de la mañana a trabajar. Y por supuesto a la Dra. Mónica García Alloza, por haber llevado a Cádiz el espíritu de mayor superación. Porque su grado de competencia me dejaba siempre alucinada, porque me encanta ver a gente tan entusiasta con su trabajo y me da motivos para seguir creyendo en la Ciencia. Además porque jamás olvidaré aquellas chocolatinas en aquel día tan duro.
Allí además forjé grandísimas amistades y conocí a gente increíble que aun forman parte de mi vida. Debo empezar por el Dr. Fernando Montero Gutiérrez, porque me acompañó desde el principio en todas mis angustias, mis preocupaciones…porque jamás olvidaré los cafés en el Ducal, ni las danzas del vientre en la tetería, ni su famosa TORTILLA DE PATATAS. Porque es un gran amigo, mejor persona y científico.
Simplemente porque es una de las joyas que me traje de Cádiz. Porque sé que ante todo
knowledgements es un amigo, y que siempre podré contar con él. Gracias nene, sabes que te quiero muchísimo y te aprecio y valoro sobremanera. A mi queridísima la Dra. Laura Gómez Pérez, porque todo lo que diga de ella será poco. Porque juntas compartimos muchos paseos por la playa, muchas confidencias, y muchos recuerdos inolvidables. Porque ella junto con su chico Raúl, fueron otros dos de mis grandes amigos de la tacita, y sobretodo porque conservo su amistad en el tiempo. A mi querido Dr. Germán Domínguez Vías, porque el primer año de Cádiz fue increíble a su lado. Porque me reí muchísimo con su humor diferente, y porque compartimos muchos momentos en la pecera que siempre se quedarán en mi memoria. Él junto con la Dra. Carmen Sunico, hicieron que mi primer cumpleaños allí fuera una auténtica sorpresa. Y de Carmen, solo puedo decir que te admiro y te quiero como el primer día. Gracias por haberme dado tantas fuerzas, y por ser un ejemplo de superación constante. A Guillermo, por estar tan loco como siempre, por dar tanta alegría desde que llegó, porque con él descubrí el flamenco y porque los cafelitos en el 8, cuando ya me quedaba poco de estar allí, me daban la seguridad de estar en un ambiente de gente querida. A Noura por haberme dado tanto optimismo y por ser una gran amiga a la que conservo en el tiempo. A Mar Pacheco, por ser esa niña cordobesa con ganas de comerse el mundo…porque cuando llegó el laboratorio se llenó de aire fresco que mucha falta nos hacía. A Juan José Ramos porque aunque llegó casi cuando yo me iba desde el principio congeniamos muy bien y aún sigo teniendo noticias suyas. Además me emocionó muchísimo su llamada para pedirme consejo a mi…A Noelia Geribaldi porque aunque pasamos poco tiempo juntas, me mostró su apoyo durante el congreso de la SENC. Me sentí muy aliviada al saber que, el tiempo había dejado a cada uno en su lugar, y que sin tener mi versión pudo comprobar que si me iba de Cádiz se debía a algo. A María de la O Guillen, por haber compartido ese verano junto a nosotros. A todas las niñas de Farma, porque eran todas un encanto, y en particular a mi querida Sonia, por haberme dado fuerzas y ánimos. A todos los del curso de doctorado, Laura, Eloísa, Verónica, David, etc…a todos, porque fuimos un gran grupo.
I wasn't going to forget my beloved Slovak friends, Veronika Cermakova and Miroslava Hurnakova (and also Milan Majernik), because it was one of the best summers of my life, and the best one that I spent in Cadiz. Because flamenco classes together, and our parties in the salsa bar were incredible. Because we cried as little
knowledgements girls the day we said goodbye and because we still keep in touch despite the distance and age. I owe you a trip to Bratislava, promised girls!
Gracias a los técnicos de laboratorio. A Antonio Torres Valencia, porque desde el primer día que le conocí supe que sería un gran apoyo para mí allí. Porque gracias a él hoy día soy una fan incondicional de los Carnavales y de Cádiz en general, porque me animaba tantísimo que mis visitas a la pecera estuvieran llenas de la música del ´Selu´, del ´Canijo´…gracias Antonio, porque no sabes las ganas que tengo de verte y darte un abrazo. Porque sin duda tú me animaste más que nadie y me apoyaste en todo, porque te quiero y te llevo siempre en el recuerdo. Tampoco puedo olvidarme de José Ramón Aracama, porque su cultura sobrepasaba los muros de la facultad de medicina. Me resultaba increíble escucharle hablar de cualquier tema, porque es una de esas personas eruditas que te dan conocimientos con cada palabra. Eso y su forma de vivir la vida suponían una admiración que conservo hoy día.
Gracias a los chicos de la cafetería, porque con ellos forje una amistad del día a día que aún sigo recordando. Porque siempre me acordaré de que yo era para ellos la
´súper becaria´, y porque esas tostadas llenas de humor las he echado muchísimo de menos después durante mi tesis… Porque Cádiz es Cádiz, y ese arte de la gente no se puede aguantar!
Sin lugar a dudas, agradezco a toda otra gente que conocí en Cádiz por hacerme amar la vida, porque su forma de ver las cosas dista mucho de la realidad de Madrid, y porque me hicieron enamorarme de una tierra y una cultura que siempre estará presente en mi vida diaria. Sois un auténtico bastinazo!. Porque siempre que puedo tengo un lugar amado que visitar para olvidar cualquier problema.
*En St.Louis
Jamás podre tener suficientes palabras de agradecimiento para la Dra. Susana Gonzalo Heras, y por haberme conseguido su contacto a la Dra. Laura López Mascaraque.
Susana fue para mí más que una jefa, una amiga. Ella hizo que mi estancia en St.Louis fuera simplemente perfecta. Ella me dio todas las comodidades, me buscó piso, me dejó cosas para la vida diaria, me enseñó junto con su marido, Mark, la ciudad, los restaurantes…TODO. Además me dio una visión de la ciencia muy apasionada. Me
