UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID Facultad de Medicina
Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia
Tesis Doctoral
MIREIA MORENO ESTELLÉS Madrid, 2012
CÉLULAS MADRE NEURALES BULBO OLFATORIO
NICHO ASTROGLIAL
Y SU REGULACIÓN POR EL
ESTUDIO DE LAS
DEL
Mireia Moreno Estellés
Licenciaturas en Ciencias Biológicas y Bioquímica
Directora: Doctora Helena Mira Aparicio Tutora: Catedrática Pilar Gómez Ramos MADRID
Departamento de Anatomía, Histología y Neurociencia Facultad de Medicina
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
Memoria presentada por MIREIA MORENO ESTELLÉS para optar al grado de DOCTORA POR LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID en el PROGRAMA DE DOCTORADO EN
NEUROCIENCIAS.
Helena Mira Aparicio, Doctora en Biología y científica titular del ISCIII,
AUTORIZA la presentación de la Tesis Doctoral titulada “Estudio de las células madre neurales del bulbo olfatorio y su regulación por el nicho astroglial”, de la que es autora Mireia Moreno Estellés, Licenciada en Biología y en Bioquímica, y que ha sido realizada bajo mi dirección en el Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo el presente certificado en Majadahonda, el día 11 de junio de 2012.
Fdo. Helena Mira Aparicio Instituto de Salud Carlos III Majadahonda (Madrid)
Summary
Adult neural stem cells (NSCs) are not confined to the forebrain subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus of hippocampus, the two major brain stem cell niches. Recent research suggests that the olfactory bulb (OB) is also a source of NSCs that remains largely unexplored. Here, we extend evidence for the presence of NSCs in the adult OB, and go on to investigate their regulation.
We first employ a single-labelling procedure based on the use of the halogenated thymidine analog BrdU to mark proliferative cells in the SVZ and OB. By combining BrdU detection with inmunofluorescence for neural stem cell markers, we identify a small fraction of cycling cells in the olfactory bulb core region. Double-labelling procedures using two different halogenated thymidine analogs, CldU and IdU, shows that the OB neural stem candidate population are slowly cycling cells that can undergo several rounds of cell division. Comparative analysis in vivo denotes that OB-NSCs are more quiescent that their SVZ-NSCs counterparts, but lineage tracing experiments with lentiviral vectors suggest that they both have neurogenic properties. In vitro isolation of neurospheres based on separation of the epitope GLAST points to a common lineage of origin for the colony forming cells of the OB and SVZ primary cultures. Despite the initial differences found in the OB and SVZ primary neurospheres, after passages, the two cultures behave similarly.
It is known that astroglial cells are an active component of adult stem cell niches. However, little is known about how OB-NSCs are regulated by astroglial niche cells. We analyse the self-renewal and proliferation of OB-NSCs in co- culture with astrocytes derived from the OB and SVZ. In accordance with the in vivo differences in OB- and SVZ-NSC activity, we found that astroglia from the SVZ niche promotes NSCs activity, whereas glia from OB has the opposite effect.
Wnt7a, a WNT ligand, is overexpressed by SVZ astrocytes and Sfrp4 (a WNT antagonist) by OB astrocytes. This gene expression profile points to WNT signalling as a key pathway that could explain the different in vitro co-culture observations. Functional studies demonstrate that non-canonical WNT7A signalling enhances NSC symmetric divisions, thereby improving the in vitro propagation of stem cell cultures. Thus, we propose that WNT7A as a specific glia-derived niche signal that could account for the in vivo differences between OB- and SVZ-NSC quiescence. Also, we suggest that it could be used as an in vitro tool for manipulating NSCs before grafting for therapeutic applications.
Resumen
Las células madre neurales del cerebro adulto (NSCs) no están confinadas en la zona subventricular (SVZ) y el giro dentado del hipocampo, que son los nichos más importantes de células madre. Recientes investigaciones proponen al bulbo olfatorio (OB), como una fuente de NSCs que aún permanece inexplorada. En este trabajo, ampliamos la evidencia de la existencia de la recientemente sugerida población de NSCs del OB, e investigamos cómo ésta es regulada.
Primero empleamos un procedimiento de marcaje simple, basado en la incorporación del análogo halogenado de la timidina BrdU, para marcar células proliferantes de la SVZ y del OB. Combinando la detección de BrdU con inmuno-fluorescencias para marcadores de células madre neurales, identificamos la existencia de una pequeña población de células en división en el centro del bulbo olfatorio. El doble marcaje con dos análogos halogenados de la timidina, CldU e IdU, muestra que la población candidata de células madre neurales del OB son células de lenta division que pueden dividirse varias veces. El análisis comparativo in vivo, revela que las células madre neurales del OB son más quiescentes que las de la SVZ; sin embargo, el marcaje con vectores lentivirales sugiere que ambas tienen propiedades neurogénicas. El aislamiento in vitro de neuroesferas basado en la separación del epítopo GLAST, indica un linaje común de las células con capacidad esferogénica tanto de los cultivos primarios del OB y como de la SVZ. A pesar de las diferencias encontradas inicialmente en las neuroesferas primarias de OB y SVZ, después de cierto número de pases, ambos cultivos se comportan de forma similar.
Se sabe que las células astrogiales son un componente activo en los nichos de células madre del adulto. Sin embargo, se conoce poco acerca del papel regulador que el nicho astroglial ejerce sobre las OB-NSCs. Analizamos la auto-renovación y proliferación de OB-NSCs en co-cultivo con astrocitos provenientes de OB y SVZ. De acuerdo con las diferencias observadas in vivo en la actividad de OB-NSCs y SVZ-NSCs, encontramos que la astroglía del nicho de SVZ promueve la actividad de las NSCs, mientras que la glía de OB produce el efecto contrario. Wnt7a, un ligando de la vía de las WNTs, se sobrexpresa en astrocitos de la SVZ y, Sfrp4 (un antagonista de la vía de las WNT) en astrocitos del OB. Esta expresión diferencial entre glías, apunta a la señalización por WNTs como una vía que podría explicar las diferencias observadas en los co-cultivos in vitro. Los ensayos funcionales demuestran que la vía de señalización no canónica de WNT7A, aumenta las divisiones simétricas de las NSCs, mejorando así la proliferación in vitro de las células madre en cultivo. De esta forma, proponemos a WNT7A como una señal glial específica de nicho, que podría estar detrás de las diferencias encontradas in vivo de la quiescencia de OB-NSCs y SVZ-NSC. Además, sugerimos su uso como herramienta para manipular las NSCs in vitro, antes de ser trasplantadas con fines terapéuticos.
1
ÍNDICE
CLAVE DE ABREVIATURAS 5
INTRODUCCIÓN 7
1. Descubrimiento de la neurogénesis del cerebro adulto 9
2. Nichos neurogénicos en el adulto 9
3. Neurogénesis en el bulbo olfatorio 10
3.1. Origen y organización de la zona subventricular 11
3.1.1. Transición neuroepitelioglía radialcélulas B astrocitarias 11 3.1.2. Citoarquitectura y marcadores de identidad celular de la SVZ adulta 11 3.2. Migración de los progenitores neuronales desde la SVZ al OB 13
3.3. El bulbo olfatorio: zona neurogénica 14
3.4. Maduración de las interneuronas de nueva generación 17
3.5. Función de la neurogénesis adulta en el OB 18
3.6. Neurogénesis adulta del OB en el humano: un tema polémico 19
3.7. Extensión del nicho germinal de la SVZ 19
4. Metodologías empleadas en la investigación de la neurogénesis adulta 20
4.1. Análisis in vivo de la neurogénesis adulta 20
4.1.1 Análisis basado en la incorporación de análogos de la timidina 20
4.1.2 Análisis basado en el marcado genético 21
4.2. Análisis in vitro de la neurogénesis adulta 22
4.2.1. Definición funcional de célula madre in vitro 22
4.2.2. Descubrimiento de las células madre neurales in vitro: las neuroesferas 22
4.2.3. Expansión de los cultivos de neuroesferas 22
4.2.4. Relación in vivo e in vitro: células madre y neuroesferas 23
5. El nicho de las NSCs como unidad funcional 24
5.1. Células del epéndimo 24
5.2. Células endoteliales 25
5.3. Células astrogliales 25
6. Las proteínas Wingless-type MMTV integration type site (WNT) 26
6.1. Descubrimiento de las WNTs 26
6.2. Filogenia, estructura y procesamiento de las WNTs 26
6.3. Rutas de transducción de la señal de las WNTs 27
6.4. Inhibidores extracelulares 29
6.5. Regulación de la actividad de las células madre neurales por las WNT 29
OBJETIVOS 31
MATERIALES Y MÉTODOS 35
1. Materiales 37
1.1. Animales 37
1.2. Reactivos 37
2. Métodos in vivo 41
2.1. Marcaje con análogos timidina 41
2.1.1. Determinación de la actividad de las NSCs en animales Crl:CD1 42 2.1.2. Determinación de la existencia de células madre de lenta división (LRCs) 42
y su tasa de división en animales Crl:CD1
2.1.3. Caracterización de las poblaciones celulares del OB en animales C57/BL6 42 inyectados con lentivirus.
2
2.2. Marcaje con lentivirus 42
2.3. Técnicas histológicas 43
2.3.1. Fijación 43
2.3.2. Postfijación del tejido 43
2.3.3. Procesamiento del tejido 43
2.3.4. Técnicas inmuhistoquímicas 44
2.3.5. Análisis Inmunohistoquímico 45
3. Métodos in vitro 45
3.1. Aislamiento de OB-NSCs y SVZ-NSCs de ratón 45
3.2. Aislamiento magnético de poblaciones celulares específicas: células GLAST+ 46 3.3. Subcultivo: expansión y mantenimiento de los cultivos 47 3.4. Criopreservación y descongelación de cultivos de NSCs 47 3.5. Determinación de la capacidad de auto-renovación de un cultivo mediante 48
ensayos de formación de esferas
3.6. Determinación de la capacidad de proliferación de un cultivo de NSCs 48
3.6.1. Generación de curvas de crecimiento acumulado 48
3.6.2. Medida del diámetro de las neuroesferas 48
3.6.3. Tasa de incorporación de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) 48
3.7. Nucleofección de NSCs 49
3.8. Aislamiento y cultivo de glía posnatal: Cultivo primario 49 3.9. Enriquecimiento del cultivo y preparación de la glía para los ensayos ex vivo 50
3.10. Lipofección de astrocitos 50
3.11. Ensayos ex vivo de proliferación en co-cultivo 51
3.12. Ensayos ex vivo de proliferación con medios condicionados por la glía 51 3.13. Ensayos de ganancia de función: titulación y ensayo de formación de esferas 52
en presencia de WNT7A y LiCl
3.14. Ensayos de pérdida de función: ensayo de formación esferas con glía silenciada 52
3.15. Ensayos de lectura de la actividad luciferasa 52
3.16. Técnicas inmunocitoquímicas 52
3.17. Análisis Inmunocitoquímico 53
4. Estudios de expresión génica de la glía y las NSCs 53
4.1. Extracción de RNA y preparación de la muestra 53
4.2. Preparación de la sonda, hibridación a los chips y detección de la señal 54
4.3. Validación por RT-PCR y Q- PCR 55
5. Inmunodetección de proteínas por Western blot 55
5.1. Extracción de la proteína total 55
5.2. Cuantificación de la proteína total 56
5.3. Preparación de las muestras para Western Blot 56
5.4. Preparación de geles. Electroforesis. Transferencia a membrana 56
5.5. Incubación de las membranas con los anticuerpos 57
6. Análisis estadístico 57
RESULTADOS 59
Capítulo 1: Estudio de las células madre neurales del bulbo olfatorio adulto 61 1.1. En el bulbo olfatorio existe una población de células en división que expresan 61
marcadores de célula madre
1.2. En la región central del OB reside una población de células madre de división lenta 63 1.3. Las células madre del OB se localizan en nichos espacialmente restringidos y 67
contribuyen a la neurogénesis del OB
3
Capítulo 2: Caracterización de los cultivos de neuroesferas aisladas del bulbo olfatorio adulto 70 2.1. Aislamiento de las neuroesferas primarias del OB in vitro 70 2.2. Las células formadoras de neuroesferas in vitro residen en la región interna del OB 71 2.3. Los cultivos de neuroesferas del OB no derivan de la SVZ 73 2.4. Los cultivos de neuroesferas del OB se pueden expandir a largo plazo 74 2.5. Las células GLAST positivas del OB son las células formadoras de neuroesferas in vitro 75 Capítulo 3: Regulación de la actividad de las células madre neurales por el componente 77 astroglial del nicho
3.1. Caracterización de los cultivos gliales de la SVZ y del OB 77 3.2. Los astrocitos del OB y de la SVZ producen moléculas de secreción que regulan de 79
forma opuesta la actividad de las células madre
3.2.1. Ensayo de formación de neuroesferas en co-cultivo con la glía 79 3.2.2. Ensayo de formación de neuroesferas en medio condicionado por la glía 81 3.3. Análisis del perfil de la expresión génica de los cultivos astrogliales 82 3.3.1. Análisis global de la expresión génica de la glía de la SVZ, OB y VM 83 3.3.2. Selección de los mejores genes candidatos sobrexpresados en la glía 83 3.3.3. Identificación de los genes que codifican para señales secretadas 84 3.3.4. Validación por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) de los genes 87
que codifican para señales secretadas por la glía de la SVZ
Capítulo 4: Estudio del papel de la molécula astroglial WNT7A en la regulación de las 89 células madre neurales:
4.1. Verificación de la expresión diferencial de Wnt7a y de su antagonista 89 Sfrp4 en los cultivos astrogliales
4.2. Las NSCs del OB expresan toda la maquinaria necesaria para responder a las Wnts 90 4.3. La WNT7A producida por los astrocitos de la SVZ regula la formación de neuroesferas 92 4.3.1. El silenciamiento de la expresión de Wnt7a en la glía de la SVZ reduce 92
la formación de neuroesferas
4.3.2. La adición de WNT7A aumenta la formación de neuroesferas 93 4.4. WNT7A promueve la auto-renovación de las NSCs del OB 95 4.5. WNT7A señaliza por la vía no canónica en las NSCs del OB 96 4.6. WNT7A favorece la expansión de los cultivos de OB-NSCs 99
DISCUSIÓN 101
1. En la región central centro del OB existen células madre organizadas en nichos 103 espacialmente restringidos, que posiblemente contribuyen a la neurogénesis del OB
2. Los cultivos de neuroesferas del OB derivan de células que pertenecen al linaje astroglial 105 3. La tasa de autorenovación de los cultivos del OB aumenta con los pases 106 4. El tamaño de las neuroesferas primarias refleja la actividad proliferativa de las NSCs in vivo 107 5. La regulación de las NSCs adultas por el componente astroglial de nicho 108 6. Posibles moléculas implicadas en el efecto negativo inducido por la glía del OB 109 7. Posibles moléculas implicadas en el efecto positivo inducido por la glía de la SVZ 111 8. WNT7A molécula candidata del efecto positivo producido por los astrocitos dela SVZ 111 9. WNT7A señaliza por la vía no canónica y promueve la auto-renovación in vitro 112
BIBLIOGRAFÍA 119
ANEXOS 141
1.1 Anexo I: GE Array S Series Mouse Stem Cell
1.2 Anexo II: Receptores de membrana de cultivos de NSCs del OB 1.3 Anexo III: Publicaciones
4
5
CLAVE ABREVIATURAS
APC, Adenomatous Polyposis Coli protein Axin, Axin Inhibition
BDNF, Brain Derived Neurotrophic Factor BrdU, 5-bromo-2’-desoxiuridina
CDR, Cystein Rich Domain
CELSR, Cadherin EGF LAG Seven-pass G-type Receptor CldU, 5-Cloro-2´-desoxiuridina
DG, Dentate Gyrus Dvl, Dishevelled
EGF, Epidermal Growth Factor
EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor Eph-A2/A3, Ephrin A2/A3
EPL, External Plexiform Layer FGF2, Fibroblast Growth Factor2 Fzd, Frizzled
GCL, Granular Cell Layer
GFAP, Glial Fibrillary Acidic Proteín GL, Glomerular Layer
GLAST, GLutamate ASpartate Transporter GPCR, Protein Coupled Receptor
GSK-3β, Glycogen Synthase Kinase 3 beta IdU, 5-Iodo-2´-desoxiuridina
iGCL, internal Granular Cell Layer iPS, induced Pluripotent Stem LIF, Leukaemia Inhibitor Factor
6 LRP5/6, Low density lipoprotein receptor-Related Protein
MCs, Medios Condicionados ML, Mitral Layer
NeuN, Neuronal Nuclear antigen NSC, Neural Stem Cell
OB, Olfactory Bulb
oGCL, outer Granular Cell Layer ONS, Olfactory Neuron Sensory PCP, Planar Cell Polarity
PEDF, Pigment Epithelium-Derived Factor)
qRT-PCR quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction RMS, Rostral Migratory Stream
RMS, Rostral Migratory Stream SEL, Subependymal Layer
sFRPs Secreted Frizzled Related Proteins SLR, Signal Log Ratio
SVZ, SubVentricular Zone
TAP, Transitory Amplifying Progenitor
Tcf /Lef-1, T Cell Factor/ Lymphoid Enhancer Factor VANGL, Van Gogh Like
VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor) VM, Ventral Mesencephalon
WNT, Wingless-type MMTV integration type site
INTRODUCCIÓN
8
9 1. Descubrimiento de la neurogénesis del cerebro adulto
El descubrimiento de las células madre neurales (NSC, del inglés Neural Stem Cell) de mamíferos adultos ha revolucionado la comprensión contemporánea de la plasticidad del cerebro adulto.
A principios del siglo XX, influyentes estudios histológicos y anatómicos, ejemplificados entre otros por los trabajos de Cajal (1913), establecieron como dogma central de la neurobiología la idea de que la formación de nuevas neuronas o neurogénesis, ocurría tan solo durante el desarrollo embrionario y que tras el nacimiento ésta cesaba (1). Se pensaba que esta forma estática de entender el cerebro adulto como un órgano sin recambio celular, justificaba la estabilidad necesaria para el almacenamiento de memoria a largo plazo.
Sin embargo, a mediados del siglo XX, el desarrollo y uso de los análogos de la timidina como herramienta de estudio permitió a Altman y a sus colegas contemporáneos demostrar que esta idea era errónea (2). Se observó que después del nacimiento existía un proceso de producción persistente de nuevas neuronas en zonas restringidas del cerebro adulto de mamíferos, denominadas zonas neurogénicas, tales como el hipocampo y el bulbo olfatorio del cerebro adulto de mamíferos. Sin embargo, estos estudios no tuvieron mucha repercusión en el campo. No fue hasta finales del siglo XX, a raíz de la publicación de unos estudios en roedores de caracterización más en detalle de las zonas neurogénicas propuestas (3;4), y de unos trabajos donde se describía el aislamiento de células madre neurales adultas en roedores (5) y en humanos (6;7) cuando el tema de la neurogénesis adulta volvió a cobrar interés. Desde entonces, numerosos grupos tratan de caracterizar y entender mejor cómo funcionan estos reservorios de células madre adultas, para poder aplicar su potencial neurogénico como estrategia de terapia celular en enfermedades neurodegenerativas (8).
2. Nichos neurogénicos en el adulto
La neurogénesis posnatal se ha demostrado concluyentemente en tan sólo dos regiones (Figura I1) del cerebro adulto de mamíferos: en el giro entado (DG, del inglés Dentate Gyrus) del hipocampo, en el cual se forman neuronas granulares (9) importantes para ciertas formas de aprendizaje y memoria; y en el bulbo olfatorio (OB, del inglés Olfactory Bulb), cuyas neuronas de nueva generación proceden en última instancia de la actividad de las células madre residentes en la zona subventricular (SVZ, del inglés SubVentricular Zone)(10) y desarrollan diversas funciones dentro del sistema olfativo. Si bien la función primordial de estas células madre neurales adultas de la SVZ y del DG es generar neuronas (11), también están implicadas en la gliogénesis, generando oligodendrocitos en la SVZ (12) y astrocitos en el DG (13).
10
Figura I1: Neurogénesis en el cerebro adulto de ratón. Esquema de una sección sagital donde se identifican las dos zonas que incorporan nuevas neuronas en rojo, el bulbo olfatorio y el giro dentado del hipocampo.
Alternativamente, algunos investigadores defienden la existencia de otras zonas neurogénicas mostradas en rosa.
Modificado de Gould y cols. 2007.
Aunque menos caracterizadas y algo debatidas, en los últimos años se han descrito otras zonas en el cerebro de mamíferos donde se cree que existe neurogénesis posnatal (14)(Figura I1). En la región dorsal del cerebro, se ha propuesto la corteza cerebral y el estriado. En la región ventral, las otras zonas neurogénicas alternativas sugeridas han sido la corteza piriforme, el tubérculo olfatorio, la amígdala, el hipotálamo, la sustancia negra y el núcleo vago entre otros. Sin embargo, muchos de estos resultados son contradictorios con otros, quedando pendiente aclarar si en estas regiones la neurogénesis funciona en condiciones normales o resulta de una respuesta inducida por una lesión en el animal.
3. Neurogénesis en el bulbo olfatorio
A grandes rasgos, el proceso de neurogénesis comprende una fase proliferativa donde las células madre generarán precursores neurales, una fase migratoria y finalmente una fase diferenciativa donde el progenitor dejará de dividirse y se diferenciará a neurona. A diferencia de la neurogénesis adulta en el giro dentado, en el proceso de neurogénesis del OB, el nicho germinal y la zona neurogénica en la que se integran las nuevas neuronas, se encuentran separados en estructuras cerebrales distintas. La SVZ es la zona germinal donde residen las células madre y de la cual surgirán los progenitores neuronales que proliferarán y migraran a lo largo del camino rostral migratorio (RMS, del inglés Rostral Migratory Stream) hasta el OB, región neurogénico, donde se diferenciarán terminalmente a interneuronas
11 (3;15). En los siguientes apartados, se explicará el origen de estas estructuras y su organización celular.
3.1. Origen y organización de la zona subventricular
3.1.1. Transición neuroepitelioglía radialcélulas B astrocitarias
Todas las células presentes en el cerebro de los mamíferos derivan del neuroepitelio que se forma en la línea media del embrión en desarrollo. Este neuroepitelio temprano consiste en una capa simple pseudoestratificada que al plegarse da lugar al tubo neural a partir del cual se formará todo el sistema nervioso. En la primera capa germinal llamada zona ventricular (VZ, del inglés Ventricular Zone) las células neuroepiteliales del neuroectodermo se dividirán y generarán numerosas neuronas. A continuación, a partir de la VZ, se forma la segunda zona proliferativa llamada zona subventricular (SVZ). La SVZ, compuesta por células con ciclos de división muy cortos, rápidamente empieza a crecer y a expandir en detrimento de la VZ. En este periodo de activa neurogénesis es donde se piensa que las células madre neuroepiteliales pasan ha convertirse en glía radial, tanto con actividad de célula madre como de guía para la migración de las nuevas neuronas. Finalmente en las primeras semanas tras el nacimiento, el cerebro sufrirá los últimos cambios moleculares y estructurales: (1) cese de la actividad germinal de la VZ al transformarse las células de la glía radial (originalmente células neuroepiteliales) en células ependimales; (2) consolidación de la SVZ como el nicho germinal adulto, al convertirse la glía radial en astrocitos con propiedades de célula madre; y (3) tras el colapso del ventrículo olfatorio, ocurrirá la formación del RMS en la región más rostral de la SVZ, al diferenciarse la glía radial en astrocitos que formarán los gliotubos, plataforma necesaria para la migración de los precursores neuronales de la SVZ al OB (16).
3.1.2. Citoarquitectura y marcadores de identidad celular de la SVZ adulta
Atendiendo a parámetro tales como morfología, expresión de marcadores y duración del ciclo celular, el grupo de Alvarez-Buylla ha propuesto una clasificación celular en la SVZ (4), hoy en día muy aceptada, que distingue cuatro tipos celulares distintos dentro de la compleja estructura del nicho (Figura I2A):
*Células B: de naturaleza astrocitaria, son las células madre de la SVZ. Estás células madre presentan un proceso apical que contacta con la luz del ventrículo, a través del cual se cree que reciben diversas señales del líquido céfalo raquídeo (CSF, del inglés Cerebro Spinal Fluid), y un proceso basal que termina en una estructura de pie vascular, que las pone en contacto
12 directo con los vasos sanguíneos (17;18). Son relativamente quiescentes. Con ciclos de división cada 15 días, se identifican como aquellas capaces de incorporar y retener análogos de timidina en su DNA (LRC, del inglés Label Retaining Cell)(19;20). Por su naturaleza astrocitaria expresan la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP, del inglés Glial Fibrillary Acidic Protein), el factor transcripcional de célula madre SOX2, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, del inglés Epidermal Growth Factor Receptor) y dado que proceden de la glía radial, continúan presentando reactividad contra el transportador de glutamato (GLAST, del inglés GLutamate ASpartate Transporter), así como para el filamento intermedio de células indiferenciadas NESTINA (13;21-26). Estas células podrán dividirse simétricamente y auto-renovarse, o bien dividirse asimétricamente y dar lugar a una células de tipo C.
*Células C: son los progenitores de transición entre las células B y A de rápida amplificación (TAP, del inglés Transitory Amplifying Progenitor). Al dividirse frecuentemente, aproximadamente cada 15 horas (19;20), diluyen los análogos de la timidina. Continúan siendo EGFR+, y expresan marcadores relacionados con la adquisición de un destino neuronal y oligodendroglial, como Olig2, Dlx2 y Mash1 (26-29). Estas células se localizan junto a las células B y preferentemente en las proximidades de los vasos sanguíneos, para dar lugar mayoritariamente a las células A.
*Células A: son progenitores neuronales o también conocidos como neuroblastos. Se caracterizan por expresar marcadores de neurona inmadura como β-III- tubulina, doblecortina (DCX, del inglés Doublecortin codificado por el gen DCX) y PSA-NCAM+ (del inglés PolySialylated-Neural Cell Adhesion Molecule) y son capaces de dividirse mientras migran por el RMS organizados en cadenas (30-33). Una vez alcanzan el nicho neurogénico del OB, se diferenciaran terminalmente a interneuronas inhibitorias del tipo granular y periglomerular.
*Células E: son las células ependimales que forman el revestimiento de los ventrículos laterales y presentan inmunorreactividad positiva para la isolectina IB4y la proteína de unión a calcio S-100β. Éstas poseen un cuerpo basal muy complejo y en función del número de cilios que presentan se subdividen en dos tipos, multiciliadas (tipo E1) y biciliadas (tipo E2).
Estudios más recientes muestran que las células E se organizan en roseta, y que las células B proyectan sus procesos apicales hacia el ventrículo por el centro de la roseta (Figura I2B)(34). Destacar que, inicialmente se pensó que estas células ependimales eran las células madre del nicho (35), sin embargo, diversos estudios han mostrado que estas células son
13 quiescentes y no tienen propiedades de NSCs in vitro (4;36;37). Se piensa que regulan la actividad de las células madre a través de la producción de moléculas solubles (apartado 5).
Figura I2: Citoarquitectura del nicho germinal de la SVZ.
(A) Esquema simplificado donde se muestras la sucesión de los distintos tipos celulares que componen el nicho germinal de la SVZ. Las células madre de lenta división o tipo B (en verde) dan lugar a los progenitores de rápida amplificación o tipo C (en azul) los cuales a su vez darán lugar a neuroblastos o células tipo A (en magenta) y a precursores oligodendrogliales (no se muestra). Modificado de Dengke y cols.
2009 (B) Representación tridimensional de la organización en roseta del nicho de la SVZ. Desde la luz del ventrículo lateral, en el centro de la roseta se encuentran los procesos apicales de las células madre (en azul) las cuales se encuentran rodeadas apicalmente por las células ependimales (multiciliadas, en marrón oscuro y biciliadas, en marrón claro) y basalmente por los progenitores de rápida amplificación (en verde). Los procesos basales de las células B envuelven los neuroblastos migratorios (en rojo) formando gliotubos que contactan y corren paralélelos a los vasos sanguíneos (en naranja). Imagen de Mirzadeh y cols. 2008. LV, ventrículo lateral. V, vaso sanguíneo.
3.2. Migración de los progenitores neuronales desde la SVZ al OB.
En el ratón adulto, los neuroblastos generados en la SVZ migran aproximadamente unos 3-5 mm hasta que llegan OB. Para ello, primero migran colectivamente organizados entre sí (migración homotípica) en cadenas de manera tangencial a lo largo del RMS a través de gliotubos (3;16;16;38). Cuando llegan al centro del OB, se desprenden y migran radialmente de forma individual.
Además, recientemente se ha demostrado que los neuroblastos también se asocian a los vasos sanguíneos como soporte para la migración tanto tangencial por el RMS, como radial por el OB (39;40).
Dentro del RMS, aproximadamente el 80 % de los neuroblastos migran rostralmente hacia el OB, aunque éstos pueden detenerse o incluso invertir su dirección (41). Su velocidad de migración no es uniforme, pero en promedio, es del orden de 70-80 µm/h (42).
Los astrocitos del RMS están implicados en la regulación de la velocidad de migración y supervivencia de los neuroblastos. Estos astrocitos al captar el ácido gamma-aminobutírico
14 (GABA, del inglés Gamma AminoButiric Acid) liberado por los neuroblastos permiten que éstos no se paren y continúen su migración (41;43). La liberación de glutamato por los astrocitos es interpretada por los receptores de N-Metil-D-Aspartato (NMDAR) presentes en los neuroblastos como una señal positiva para la regulación del número e integración de nuevas neuronas (44).
Curiosamente, en animales donde se ha eliminado o desconectado el OB, los neuroblastos de la SVZ continúan dividiéndose y migran sin problemas a través del RMS hasta que se acumulan en el punto de la lesión (45-47), descartando así la idea de que el OB sea una fuente de moléculas quimioatrayentes del torrente migrador de células A.
3.3. El bulbo olfatorio: zona neurogénica
Tal y como se muestra en la figura I3A, el OB presenta una organización laminar dispuesta a modo de capas concéntricas. La capa más externa es la glomerular (GL, del inglés Glomerular Layer) destino final de las neuronas periglomerulares procedentes de la SVZ. A continuación, la capa plexiforme externa (EPL, del inglés External Plexiform Layer) por la cual atravesarán los proyecciones dendríticas de las células mitrales alojadas en la capa mitral (ML, del inglés Mitral Layer) y de las neuronas más superficiales de la capa granular (GCL, del inglés Granular Cell Layer), la principal población neuronal generada por los precursores de la SVZ.
Puesto que este apartado se centra en la neurogénesis adulta del OB, se comentará más en detalle las características de cada una de las dos poblaciones generadas por las células madre de la SVZ:
*Interneuronas granulares: el 80 % de los neuroblastos se convierten en este tipo de neurona inhibitoria. Atendiendo a un criterio morfológico, éstas se diferencian en tres subpoblaciones. De dentro a hacia fuera de la capa granular, en primer lugar encontraríamos las granulares profundas, las cuales inervan con las neuronas de proyección de la ML. A continuación vendrían las granulares más superficiales, las cuales establecen sinapsis con las otras neuronas de proyección, las células en penacho (del inglés, Tufted cells) ubicadas entre la ML y la EPL (48-50). La tercera subpoblación descubierta en los últimos años, tiene su soma en la región interna pero presenta una gran proyección dendrítica y arborizada en la EPL (51).
*Interneuronas periglomerulares: son una población de células heterogénea que rodea a los glomérulos y minoritaria en comparación con las granulares representando respecto a ellas una relación de 1:30 (3). En base a su inmunorreactividad, las neuronas periglomerulares se
15 subdividen en tres grupos: las neuronas dopaminérgicas que expresan la enzima tiroxina hidroxilasa (TH+), y las que expresan las proteínas de unión a calcio, las calretinina y las calbindina positivas (52). Estas neuronas establecen sinapsis con las neuronas de proyección, entre ellas mismas y en ocasiones, conectan directamente con las neuronas sensoriales olfativas (ONS, del inglés Olfactory Neuron Sensory) del epitelio olfativo (53;54) (Figura I3B).
Figura I3: Organización celular del OB de ratón adulto. (A) Sección coronal del bulbo olfatorio donde se aprecia la arquitectura celular en multicapas concéntricas. (B) Esquema detallado de la arquitectura celular del OB. ONL, capa de nervio olfatorio. Las neuronas sensoriales olfativas recogen la señal olorosa y trasladan la información inervando específicamente a un glomérulo que exprese el receptor del olor del que portan información, representado por el código de colores rojo, azul y morado. En los glomérulos, la información se trasladará a la célula mitral correspondiente y de ahí a la corteza piriforme. Las neuronas periglomerulares regulan negativamente la sinapsis excitatoria ONS-M y coordinan la información interperiglomerular. Por otra parte, las neuronas granulares conectarán con las neuronas de proyección para trasladar la información procedente de las fibras centrífugas.GL, capa glomerular. Modificado de Whitman y Greer 2009. EPL, capa plexiforme externa, ML, capa mitral. IPL, capa plexiforme interna. GCL, capa granular. SEZ, zona subependimal; OSN, neuronas sensoriales olfativas. Gr, neurona granular M, neurona mitral. Pg, neurona periglomerular.
Hasta hace un par de años, se asumía que las células madre o células B de la SVZ eran una población homogénea capaz de generar los distintos tipos de neuronas granulares y periglomerulares. Sin embargo, en los últimos años se ha visto que esto no es así (Figura I4A).
Las células madre proceden de diferentes regiones del cerebro embrionario y por ello dan lugar específicamente a ciertos tipos poblaciones neuronales (55-57). El origen mixto de los ventrículos laterales, donde el techo procede de la corteza cerebral, y las paredes laterales de la eminencia ganglionar lateral y medial, parece estar detrás de la regionalización del programa de diferenciación de las células madre de la SVZ (Figura I4B). Los progenitores de
16 la región anterior del ventrículo y RMS se diferencian principalmente en neuronas periglomerulares, preferentemente del tipo calretinina positivas, y en menor medida en granulares. Las células madre de región dorsal del ventrículo generan neuronas periglomerulares gabaérgicas TH+, sorprendentemente, glutamatérgicas también (58) y neuronas granulares superficiales. Finalmente, las células B ubicadas en la región ventral formaran las neuronas periglomerulares calbindina positivas y la granulares profundas (Figura I4C).
Figura I4: Regionalización de la SVZ adulta de ratón. (A) A la izquierda, representación del modelo tradicional donde se consideraba al conjunto de células madre (puntos negros) de la SVZ como una población homogénea capaz generar cualquier tipo neurona granular o periglomerular del OB. A la derecha, esquema representativo de la visión actual, donde se indica que los distintos tipos neuronales proceden de una población heterogénea de células madre (puntos en escala de grises). Modificado de Merckle y cols., 2007. (B) Origen embrionario del ventrículo lateral adulto.
Las eminencias ganglionares lateral y medial dan lugar a la SVZ del lado del estriado; la SVZ dorsal y RMS procede del palium; y la SVZ medial procede del septum. Modificado de Alvarez-Buylla y cols., 2008 (C) Esquema resumen de las tres subpoblaciones aceptadas en este momento. La regionalización de las células madre en cuanto a la identidad de su progenie atiende a su distinto origen embrionario. Modificado de Whitman y Greer, 2009. GC, neuronas granulares. LGE, eminencia ganglionar lateral. LV, ventrículo lateral. MGE, eminencia ganglionar medial. PG, neuronas periglomerulares. SVZ, zona subventricular. OB, bulbo olfatorio
17 3.4. Maduración de las interneuronas de nueva generación.
En el 2002, Petreanu y Alvarez-Buylla publican un trabajo detallado acerca de la maduración de las neuronas granulares, ya que la gran mayoría de los neuroblastos generados en la SVZ se diferencian principalmente en este tipo de interneurona (59). Para ello, inyectaron en la SVZ un retrovirus con actividad reportera fosfatasa alcalina y analizaron a diferentes tiempos la presencia de células marcadas en las distintas secciones del eje SVZ-RMS-OB. Tras analizar el material, dividieron el proceso de maduración de las interneuronas en cinco etapas (Figura I5). Etapa 1, estas células se caracterizan por presentar una morfología simple que puede ser redondeada o alargada, un prominente proceso anterior y en ocasiones un pequeño proceso posterior. Éstas migran tangencialmente a través del RMS y estarán presentes entre dos y siete días después de la infección retroviral en la SVZ. Etapa 2, al cabo de una semana las células a migran radialmente a través de la GCL y también presentan morfología simple. Etapa 3, entre los días 9 y 13, parecen que dejan de migrar, su soma se redondea y desarrollan un único proceso apical que se extiende hacia la EPL pero que no atraviesa la capa mitral. Etapa 4, en el intervalo de tiempo que comprende desde el 11 al 22, crece la arborización dendrítica, pero sin espinas, y en la etapa 5, entre el día 21 y 42 después del pinchazo, las células tienen una morfología de células granulares maduras, con dendritas espinosas. Además determinan que de todas las células generadas, tan solo el 50 % de éstas se incorporarán a la circuitería del OB (59;60) y podrán llegar a vivir hasta un año (61).
Paralelamente, el análisis in vivo con microscopia de dos fotones en animales transgénicos con neuronas periglomerulares GFP+ (62) ha permitido conocer que las nuevas células formadas tardan 30 días en alcanzar la capa glomerular, y que tan solo el 3 % logrará establecer sinapsis axonal/ dendrítica y sobrevivirá.
Al cabo de 1 mes, todas las granulares y casi todas las periglomerulares expresarán el marcador de neurona madura NeuN (63), y al cabo de un año, el 50 % habrán sido intercambiadas por otras de nueva generación (64).
18
Figura I5: Neurogénesis del OB en el ratón adulto. Esquema por etapas del desarrollo de nuevas interneuronas en el bulbo olfatorio. Los neuroblastos nacidos en la SVZ migrarán en cadena a través del RMS tangencialmente.
Una vez llegan al OB, los neuroblastos migrarán radialmente por capa granular, todos, y por la capa glomerular, unos pocos, y se diferencian en neuronas granulares y periglomerulares, respectivamente. Más o menos, a partir de la tercera semana, las neuronas granulares atraviesan la capa mitral y gracias a la arborización dendrítica desarrollada establecerán sinapsis con las células mitrales y las tufted. CC, cuerpo calloso. Ctx, corteza cerebral.
DG, giro dentado. SVZ, zona subventricular, RMS, corriente migratoria rostral. OB, bulbo olfatorio. V, vaso sanguíneo. Modificado de Whitman y Greer, 2010.
3.5. Función de la neurogénesis adulta en el OB
Tal y como se comentó en el apartado anterior, las ONS, al transformar las señales químicas en patrones eléctricos, son las células iniciadoras del procesamiento sensorial olfativo. A continuación, puesto que la capacidad de procesar la información sensorial depende de la arquitectura funcional y la conectividad sináptica del OB, se ha descrito (65) que la neurogénesis del OB beneficia el procesamiento de esta información a cuatro niveles:
(1) Papel estructural: se encargarían de mantener la circuitería a punto, sustituyendo las interneuronas que van muriendo a lo largo de la vida.
(2) Optimización del procesamiento de la información: mientras que la discriminación de olores es realizada por células granulares generadas en el periodo embrionario, las generadas en el adulto confieren mayor fuerza a las uniones temporales de las señales procedentes de los receptores odoríferos.
(3) Papel en el aprendizaje: las neuronas nacidas durante el periodo posnatal presentan mayor plasticidad sináptica respecto a las generadas durante el desarrollo embrionario, siendo más apropiadas para codificar nueva información.
19 (4) Papel en la memoria: debido a su gran plasticidad son capaces de mantienen la transmisión de la señal de forma duradera, logrando una potenciación a largo plazo (LTP, del inglés Long-Term Potentiation) mecanismo celular principales que subyace a la memoria.
3.6. Neurogénesis adulta del OB en el humano: un tema polémico
Aunque son muchas las similitudes que comparten el cerebro del ratón y el humano, en torno a la neurogénesis del OB se ha creado un gran debate. En el 2004 se publicaron dos estudios con conclusiones diferentes sobre este tema. Mientras que Bédard y Parent concluyen que, al igual que en el ratón, se forman nuevas neuronas en el OB adulto (66), el grupo de Alvarez-Buylla no encontró ninguna evidencia de que existieran cadenas de neuroblastos que migraran desde la SVZ al OB (67). Un par de años después, el grupo de Eriksson demuestra tanto por resonancia magnética como por microscopía electrónica la existencia de células proliferantes con propiedades migratorias que finalmente maduran en el OB (68).
Recientemente, dos estudios han demostrado que el número de células con perfil de neuroblasto (DCX+ PSA-NCAM+) cae drásticamente después del nacimiento (69;70). Aun así, en ambos estudios encuentran neuroblastos en individuos adultos, pero no organizados en un torrente migrador tipo RMS sino como células individuales y con una frecuencia muchísimo más baja que en el período perinatal (69;70).De acuerdo con esta observación, se acaba de publicar que la tasa de recambio anual de las neuronas en humanos es inferior al 0,01 % (71).
3.7. Extensión del nicho germinal de la SVZ
En los últimos años han surgido varios estudios que sugieren la ampliación de la región germinal más allá de la convencional zona subventricular del lado del estriado (72). Algunos autores han reivindicado la existencia de células madre en la zona subventricular del lado del septum, en el cuerpo calloso (73), a lo largo del camino rostral migratorio e incluso en el propio bulbo olfatorio. Lejos de la visión clásica del RMS como un simple conducto para que los progenitores neurales producidos en la SVZ puedan llegar al OB, en él se han identificado células madre que contribuyen activamente a la neurogénesis del OB (56;74). Además, de la disección del RMS, ha sido posible aislar y establecer cultivos de neuroesferas multipotentes (56;75). Del mismo modo, el bulbo olfatorio ha sido generalmente considerado una región receptora de neuroblastos, sin embargo, un estudio reciente defiende su potencial como región germinal, caracterizando un nicho de células madre singularmente organizado en
20 forma de roseta (76). Asimismo, también se ha podido cultivar y expandir NSCs tanto del OB ratón (75;77;78) como del humano (77;79;80).
4. Metodologías empleadas en la investigación de la neurogénesis adulta
4.1. Análisis in vivo de la neurogénesis adulta
4.1.1. Análisis basado en la incorporación de análogos de la timidina
Tal y como se comentó en el apartado 1, el desarrollo de técnicas de autorradiografía permitió la identificación de células proliferantes en el cerebro adulto. Durante la administración del nucleótido de la timidina marcado con el radioisótopo tritio (timidina-[H3]), las células que se encontraban en la fase S de su ciclo celular, marcaban sus secuencias de DNA neoformadas, y posteriormente se detectaba la energía emitida por el radioisótopo en una película de emulsión fotográfica.
En la práctica, el uso de timidina-[H3] se ha visto sustituida por otro análogo de la timidina, la 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) (Figura I6A). La gran difusión de este segundo análogo se ha debido al desarrollo de anticuerpos frente al mismo (81), confiriendo mayor simplicidad, seguridad y rapidez al proceso de detección de células en fase S para el experimentador.
El marcaje con BrdU no es permanente. La BrdU es una fuente exógena del nucleótido de la timidina limitada a la cantidad administrada diluyéndose su marca en aquellas células que sufren sucesivas rondas de replicación (82). En base a este principio, las células madre de la SVZ al presentar ciclos de división tan largos son susceptibles a retener la marca, y es por este motivo, por lo que en la literatura habitualmente se refieren a ellas con el pseudónimo de LRCs (4).
Actualmente, se han incluido dos análogos más a la lista de nucleótidos de la timidina: la 5-Cloro-2´-desoxiuridina (CldU) y 5-Iodo-2´-desoxiuridina (IdU). La optimización del protocolo de inmunodetección de CldU e IdU, se ha convertido en una estrategia para detectar la incorporación secuencial de estos análogos, permitiendo identificar y cuantificar de forma precisa poblaciones celulares que hayan realizado dos rondas sucesivas de división celular (83- 85).
21
Figura I6: Técnicas empleadas para el estudio de la neurogénesis in vivo. (A) Dibujo ilustrativo del fundamento del marcaje con BrdU (moléculas en amarillo) de las nuevas cadenas de DNA formadas (en verde claro y morado). (B) Dibujo explicativo para el caso concreto del marcado genético con vectores lentivirales. La incorporación de BrdU tan solo ocurre en las células que se encuentran en la fase replicativa, y su marca es susceptible de ser borrada tras sucesivas rondas de replicación; por contra, con el marcado genético con lentivirus se marcan células quiescentes y en división, de forma estable a lo largo del tiempo. Modificado de Ming y Song, 2005. RT, transcriptasa reversa.
4.1.2. Análisis basado en el marcado genético con virus
Gracias a los grandes avances dentro del área de la Ingeniería genética, la incorporación de los vectores virales como herramienta de estudio ha revolucionado el panorama de la neurogénesis adulta. Un vector viral es un virus modificado que se emplea de vehículo para introducir material genético exógeno en el núcleo de una célula. El transgén introducido suele codificar para una proteína con actividad reportera, siendo la proteína verde fluorescente (GFP, del inglés Green Fluorescent Protein), la más habitual ya que permite la visualización directa de las células infectadas así como el seguimiento de su progenie.
A grandes rasgos, los vectores virales más empleados han sido los adenovirus, los retrovirus y los lentivirus, un subtipo de retrovirus. Los vectores adenovirales reciben este nombre porque su material genético es DNA bicatenario, poseen capacidad para infectar todo tipo de células pero no se integran en el genoma de la célula huésped, confiriendo una expresión transgénica a corto plazo. La infección de la SVZ con adenovirus GFAP-GFP se empleó como estrategia para averiguar la identidad de las células formadoras de NSCs in vitro (4). En el caso de los vectores retrovirales, como su material genético es el RNA, portan además la enzima retrotranscriptasa para transformar la información ribonucleica viral a DNA.
Son vectores de expresión a largo plazo porque se integran en el genoma de la célula huésped, pero solo infectan a células se están dividiendo, porque solo pueden entrar al núcleo cuando la membrana nuclear se fragmenta. Por tanto los vectores retrovirales son una herramienta apropiada para estudiar poblaciones celulares que se dividen frecuentemente (86). Por último, los lentivirus, un subtipo de retrovirus, al poseer la maquinaria de importación al
22 núcleo (integrasa), infectan de forma estable y a largo de plazo a cualquier tipo de célula, ya sean células relativamente quiescentes, como por ejemplo las células madre (87), o células posmitóticas, como por ejemplo las neuronas.
4.2. Análisis in vitro de la neurogénesis adulta
4.2.1. Definición funcional de célula madre in vitro
Una célula madre adulta en cultivo se define como tal si es capaz de auto-renovarse y ser multipotente. La revisión del fenómeno de la auto-renovación por Reynolds y Rietze indica que un cultivo posee células madre cuando al menos puede ser pasado 3 veces, y además logra aumentar su progenie en varios órdenes de magnitud respecto a la población de partida (88). A su vez, debe demostrar la capacidad de ser multipotente, es decir, su descendencia debe poder diferenciarse en los principales tipos celulares del tejido de donde han sido extraídas las células.
4.2.2. Descubrimiento de las células madre neurales in vitro: las neuroesferas
El descubrimiento de la existencia de células madre en el cerebro adulto fue unido al desarrollo de un protocolo de cultivo in vitro. Las células madre neurales adultas de la SVZ fueron originalmente aisladas por Reynolds y Weiss en 1992 (5). En este trabajo, los disociados celulares del estriado adulto, que incluían la SVZ, se sembraron en condiciones no adherentes en un medio definido libre de suero y suplementado con el mitógeno EGF (del inglés Epidermal Growth Factor). Aunque la mayoría de las células sembradas inicialmente murieron, al cabo de una semana la pequeña fracción superviviente creció formando agregados clonales flotantes denominados “neuroesferas”. Estas neuroesferas: (1) mostraron reactividad positiva para Nestina, un filamento intermedio presente en las células madre neuroepiteliales del cerebro embrionario, (2) en ausencia de EGF y con un sustrato adhesivo dieron lugar a células gliales y a neuronas y (3) tras disgregarlas mecánicamente y sembrarlas de nuevo en presencia de EGF, generaron de nuevo más clones flotantes. Por primera vez, se lograba aislar in vitro la población de células madre adulta del cerebro adulto de un ratón. Un par de años después, la metodología empleada para generar neuroesferas de ratón se extendía para humanos (89).
4.2.3. Expansión de los cultivos de neuroesferas
En el aislamiento in vitro de NSCs, aunque la disección del nicho germinal comprende una población heterogénea celular, el método de cultivo es una estrategia de selección positiva de
23 células madre a las cuales se fuerza a estar en permanente estado de división, mientras que precursores con destinos más restringidos o células postmitóticas mueren y son eliminados.
Básicamente, se deben cumplir 4 condiciones para que este proceso de selección se lleve a cabo: (1) crecer las células en medio definido libre de suero (ver material y métodos), (2) suplementado con los mitógenos EGF y FGF2 (del inglés Fibroblast Growth Factor2), (3) en sustratos no adhesivos y (4) a baja densidad celular, a ≤ 5 células/µl (90;91).
En estas condiciones, inicialmente los cultivos de neuroesferas se expanden en un estado de indiferenciación a través de divisiones simétricas (tipo auto-renovante), dando lugar a dos nuevas células madre en cada ciclo. Posteriormente, ocurrirán divisiones simétricas diferenciativas, dando lugar a dos progenitores con un fenotipo más restringido o bien divisiones asimétricas diferenciativas que generarán una nueva célula madre y un progenitor más predestinado o a una célula diferenciada.
El receptor del factor de crecimiento EGF (EGFR) durante la mitosis puede distribuirse simétricamente o asimétricamente. Cuando EGFR se distribuye asimétricamente, la célula con niveles altos de EGFR expresa marcadores de célula madre, mientras que la célula que expresa niveles bajos de EGFR carece de ellos (92). Si tras la primera división, las dos células hijas presentan niveles altos de EGFR se asume que proceden de una división simétrica auto- renovante, mientras que si expresan niveles distintos de EGFR, se acepta que proceden de una división asimétrica (93;94). Por tanto, el estudio in vitro de los niveles de expresión del EGFR en los dobletes celulares revela el modo de división del cual proceden.
Por lo tanto, aunque al principio se consideró a las neuroesferas como una población homogénea de células madre, hoy se sabe que más del 90 % de las células que la componen son progenitores neurales (95). Cuando la esfera crece mucho, estos progenitores se diferencian y aparecen neuronas y astrocitos diferenciados entre sus componentes. Por este motivo, las células se subcultivan disgregándolas mecánicamente, y aunque más del 90% de las células mueren en el pase, se generarán nuevas neuroesferas llamadas “esferas secundarias”.
Por último mencionar, que aunque estos cultivos de neuroesferas pueden ser crecidos indefinidamente, no es recomendable trabajar con poblaciones a las que se les haya dado más diez pases porque las células empiezan a experimentar cambios (75;90).
4.2.4. Relación in vivo e in vitro: células madre y neuroesferas
Inicialmente se consideró que tan solo las células madre eran capaces de formar neuroesferas.
Estos experimentos mostraban que una fracción celular relativamente quiescente y GFAP+ formaba neuroesferas in vitro (4;19). Sin embargo, gracias al avance en la identificación de marcadores de linaje específicos y desarrollo de estrategias genéticas de selección poblacional,
24 se ha averiguado que además de las células madre, los progenitores también pueden formar neuroesferas. Entre todas la aproximaciones realizadas, la conclusión más aceptada en cuanto a la identidad de las células con capacidad de formar neuroesferas, es que éstas pertenecen al linaje de células que expresan EGFR y además se encuentran en estado proliferativo, es decir, los progenitores de rápida amplificación EGFR+ (tipo C) y las células madre astrogliales activas GFAP+ EGFR+ CD133+ (tipo B activas)(26;28;96-99). De modo que células madre y progenitores forman neuroesferas que pueden ser pasadas indefinidamente y son multipotentes. Así que el ensayo de formación de esferas hay que entenderlo como un ensayo que permite evaluar el potencial de las células a comportarse como célula madre cuando éstas son sacadas de su nicho in vivo.
5. El nicho de las NSCs como unidad funcional
El fenómeno de la neurogénesis adulta requiere la existencia de un microambiente que proteja el estado de indiferenciación de células madre, para que éstas puedan auto-renovarse, proliferar y dar lugar a nuevas neuronas. En 1978, en el sistema hematopoyético se propuso el término “nicho” para designar el microambiente fisiológicamente limitado que rodea y mantiene a las células madre (100). Este microambiente está definido por la matriz extracelular y por diferentes tipos celulares que secretan factores al medio y que incluso en ocasiones establecen contactos directos célula-célula con las propias células madre (101).
Centrándonos en los componentes celulares, los principales reguladores del comportamiento de las células madre en los nichos germinales de la SVZ y/o del DG son:
5.1. Células del epéndimo
Las células ependimales marcan la interfase entre el CSF y el tejido cerebral. Gracias al movimiento de sus cilios, ayudan a distribuir al gradiente de moléculas del CSF generado por los plexos coroideos, del cual captaran señales que comunicará al tejido que limita. En el caso de la SVZ se ha descrito que las células ependimales están conectadas a los astrocitos a lo largo de toda la SVZ por uniones tipo gap (20) que permiten el intercambio de factores entre ambas poblaciones. Por ejemplo se ha descrito que las células ependimarias secretan NOGGIN, un antagonista de la vía de las BMPs, y que expresan LRP2, un modulador negativo de esta misma vía, inhibiendo la diferenciación glial (102;103). Las células ependimales también expresan EphA7 inhibiendo la proliferación celular (104), y el factor derivado de epitelio pigmentado (PEDF) el cual favorece las divisiones simétricas auto-renovantes de las células madre a través de la vía de Notch (93;105).
25 5.2. Células endoteliales
Los nichos germinales están altamente vascularizados, lo cual sugiere la existencia de una alta interacción entre las células madre y células endoteliales (106;107). En la SVZ, tanto células madre (tipo B) como progenitores (tipo C) se asocian estrechamente a las células endoteliales a través de tipo de unión especializada (17;18). En estudios in vitro, el co-cultivo de células endoteliales con neuroesferas de la SVZ, promueve la auto-renovación y neurogénesis de éstas últimas (107).
Entre la multitud de factores derivados de la células endoteliales cabe destacar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como molécula inductora de la angiogénesis y neurogénesis de la SVZ y SGZ (108-110), la neurotrofina BDNF como inductora de la supervivencia neuronal (111;112), el factor inhibitorio de leucemia (LIF) como promotor de la expansión de la población de NSCs (84;113), el PDGF como activador de las células madre quiescentes para comprometerse con un destino más oligodendroglial (12) y, el PEDF, por su papel inductor en la auto-renovación de las células madre astrogliales (105).
5.3. Células astrogliales
Lejos de su clásico papel de soporte, en los últimos años, las células astrogliales han ido tomando protagonismo como reguladoras de los nichos de NSCs (114). Mientras una pequeña fracción de células con características astrogliales funciona como célula madre (4), otras actúan como elemento regulador de la actividad neurogénica.
Mediante ensayos in vitro se ha demostrado que los astrocitos del parénquima están regionalizados. Al co-cultivar células madre de la SVZ y de la DG con astrocitos de su zona, aumenta la formación de neuronas (115;116), fenómeno que no sucede al co-cultivarlas con astrocitos de regiones no neurogénicas, como por ejemplo de la médula espinal o de la corteza. En estudios posteriores se ha identificado que el aumento de la neurogénesis inducida por los astrocitos del DG se debe, al menos en parte, a que éstos producen WNT3 y Sonic Hedgehog (Shh) (117;118). La manipulación de la señalización de Wnt en el GD in vivo sobreexpresando WNT3 o SFRP3 (un inhibidor de las WNTs), aumenta o disminuye respectivamente la neurogénesis. También se ha descrito que la producción por los astrocitos de interleuquina-1-β (IL1β) e interleuquina 6 (IL6) estimula la neurogénesis (119). Por el contrario, se ha identificado que los astrocitos del nicho de la SVZ secretan proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs, del inglés Bone Morphogenetic Proteins) promoviendo la gliogénesis (102).
26 Sin embargo a nivel de regulación de la proliferación y/o auto-renovación de las NSCs, la regionalización de la glía está poco explorada. Se ha descrito que los astrocitos no pertenecientes al nicho de la SVZ, expresan altos niveles de las efrinas A2 y A3 (Eph-A2 y A3) inhibiendo el crecimiento de NSCs en estas regiones (120). Un estudio reciente acaba de revelar que los astrocitos de la SVZ secretan DLK1, regulando positivamente el número de células madre neurales (121), lo que apoya el interés de desarrollar más estudios que puedan corroborar este tipo de regulación astroglial diferencial sobre las NSCs.
6. Las proteínas Wingless-type MMTV integration type site (WNT)
6.1. Descubrimiento de las WNTs
Inicialmente el primer componente de la familia, Wnt1, fue identificado en ratón como el oncogén Int-1, por ser el sitio de integración para el virus de tumor mamario de ratón (MMTV, del inglés Mouse Mammary Tumour Virus)(122). No fue sino hasta 1987 cuando se encontró que el gen Wingless (Wg), que codificaba para una mutación recesiva que afectaba al desarrollo del ala de Drosophila melanogaster (123), era el ortólogo del gen Int1 de mamífero (124). Desde entonces, se estandariza el nombre de los componentes de los genes de vertebrados a “Wnt” de Wingless-type MMTV integration type site, un híbrido de Wg y de Int-1 (125).
6.2. Filogenia, estructura y procesamiento de las WNTs
Los componentes de la familia de las WNTs, nombre genérico que reciben los ligandos de esta vía, han sido identificados por el grado de homología de secuencia que presentaba con respecto al miembro inicial WNT1A. En la actualidad la familia de las WNTs está compuesta por 19 genes que codifican para glicoproteínas de secreción de entre 350 y 400 aminoácidos, siendo la más pequeña de la familia WNT7A con un peso de 39 KDa y la más grande WNT10A, de 46 kDa. La mayoría de ellos comparten un 35 % de homología de secuencia, si bien los miembros de la misma serie como WNT3 y WNT3A pueden llegar a presentar hasta un 85 % entre ellos (126).
En general las WNTs se caracterizan por presentar una señal de secreción en posición aminoterminal ser una familia de glicoproteínas que presentan, y una distribución característica de 22 a 24 residuos de cisteínas (Cys) altamente conservada en la evolución. Se piensa que el establecimiento de enlaces disulfuro intramoleculares entre las cisteínas es crucial para para el plegamiento de la proteína y para la unión con sus receptores Frizzled (Fzd) (127).
27 Aunque la secuencia primaria de las WNTs sugiere que éstas son muy solubles por presentar un alto porcentaje residuos cargados, numerosos estudios han descartado esta predicción. En la realidad las WNTS son bastante hidrofóbicas y principalmente se encuentran asociadas a la matriz extracelular (128). Cuando pasan por el retículo endoplásmico, son modificadas postraduccionalmente (palmitoilaciones y glicosilaciones) por una acetiltransferasa transmembrana del retículo endoplásmico conocida como Porcupine (Porc).
Luego, en el aparato de Golgi las WNTs modificadas se asociarán a la proteína transmembrana Wntless (Wls) y serán transportadas a la membrana citoplásmica, donde se piensa que se asocian a lipoproteínas que facilitan su movimiento extracelular (129-131).
6.3. Rutas de transducción de la señal de las WNTs
La señalización de las WNTs controla una gran variedad procesos. Durante el periodo del desarrollo, las WNTs regulan la diferenciación, la orientación del axon, la sinaptogenesis la adhesión, el establecimiento de patrones de tejido, la proliferación celular, (132-137);
mientras que en la etapa posnatal, destacan por su papel en el mantenimiento de la homeostasis del tejido adulto (138-141).
Los principales receptores de las WNTs son los que pertenecen a la familia de proteínas Frizzled (Fzd) (142),y pueden ser unidos por varias WNTs con distintos grados de afinidad. Se han descrito 10 tipos de Fzd, y todos comparten un dominio aminoterminal extracelular, seguido de siete dominios transmembrana y un dominio carboxiterminal intracelular. La región amino destaca por presentar un dominio alfa hélice muy conservado, rico en cisteínas, conocido como CDR (del inglés Cystein Rich Domain) a través del cual interaccionará con las WNTs y/o con otros receptores de las WNTs. Los receptores Fzd están acoplados a proteínas GPCR (143), heterotrímero formado por las subunidades α, β y γ. En ausencia de ligando, la subnidad α se encuentra anclada al dímero βγ unida a GDP. Sin embargo, cuando el receptor se activa por la unión de una WNT, la subunidad α se desprenderá del complejo al intercambiarse su GDP por GTP, y el dímero βγ se unirá a Dishevelled (Dvl) iniciándose así la transducción de la señal aguas abajo (144-146).
Atendiendo a qué componentes intracelulares se activan al unirse WNT a un Fzd se han propuesto tres vías de señalización: la que implicaría a la molécula β-catenina (comúnmente conocida como vía canónica), la vía PCP (del inglés Planar Cell Polarity) en la cual se activan las GTPasas Rho y Rac, y la vía Wnt/Ca2+ donde se dispara la liberación de calcio. Estas dos últimas se conocen como no canónicas.
