1 1.- Título del proyecto
Diseño para implementar en el ANLIS-Malbrán la producción de venenos de arañas del rincón, Loxosceles, con el objetivo de obtener sueros específicos y desarrollar investigación inmuno citogenomica.
2.- Introducción
En el ANLIS-Malbrán y en el Instituto Biológico de la Provincia de Buenos Aires son los responsables estales de la producción de sueros anti-Loxoceles a nivel nacional.
La obtención de venenos se hace a partir de glándulas de ejemplares capturados in situ en distintas zonas de nuestro país a lo largo del año (Provincias de Mendoza y de Buenos).
Los accidentes por Loxosceles ocupan el segundo lugar entre los producidos por arácnidos en la Argentina, siguiendo a los escorpiones; por lo que resulta la araña de mayor peligrosidad en el país, representan 4% del total de accidentes por animales ponzoñosos según el Instituto Nacional de Producción de Biológicos. Su picadura
accidental, puede dar lugar a una necrosis local muy extensa con formación de úlceras de difícil cicatrización y, en ocasiones, produce lesiones deformantes que requieren
reparación quirúrgica.
Un porcentaje de los accidentes se presenta en forma de Loxoscelismo cutáneo, es la forma más frecuente y oscila entre 84-97% según distintos autores (Zavaleta Martínez Vargas, 1987; Barbaro & Costa Cardoso 2003; Schenone et al. 1989).
La otra forma clínica grave, que aumenta la morbimortalidad 17% se presenta con hemólisis intravascular, coagulación intravascular diseminada e insuficiencia renal, que pueden conducir a la muerte.
La mayoría de los accidentes de Loxosceles tienen una letalidad que oscila entre 2,4 y 4%, aumentando en personas añosas y niños de corta edad y disminuyendo en forma importante cuando hay una acción médica adecuada (Ministerio de Salud Pública de Mendoza, en Boletín Epidemiológico Periódico (BEP) 39). En otras regiones donde se tienen datos de Loxoscelismo indican que en Perú la incidencia es semejante a la nuestra, con un índice de mortalidad un poco superior, en tanto que en Chile la letalidad alcanza 22.2% de los casos (Schenone 2001). En Brasil, el Loxoscelismo constituye un problema de interés sanitario nacional.
A pesar de los numerosos estudios sobre el veneno de estas arañas, el cuadro
fisiopatológico provocado por cada uno de los componentes del veneno no está del todo dilucidado ni existen criterios unánimes respecto a los mejores esquemas terapéuticos para tratar los cuadros de envenenamiento (De Roodt et al, 2007).
En 2005 se notificaron en el país 3,48 casos de aracnidismo por cada 100.000 habitantes, en 2006, ese valor subió a 4,10, este incremento significó 17%, en tanto que según el informe del Boletín Epidemiologico Periódico de 2007 ese valor disminuyo a 3,1 ese año.
(Roques et al. 2007).
Hasta el momento, el método más eficaz para neutralizar la acción del veneno y su acción patógena es la aplicación rápida y precisa del antiveneno específico. Para efectuar esta medida terapéutica es de extrema necesidad contar con suficientes volúmenes de suero anti Loxosceles. A nivel mundial, son pocos los productores de estos antivenenos y su provisión, aun en esos países, es limitada, lo que en parte se debe a la difícil obtención de estas arañas y su veneno. Si bien no están disponibles aún para uso terapéutico, se han desarrollado antivenenos con esfingomielinasas recombinantes, lo que podría ayudar sanitariamente en lo referente a la provisión de estos biológicos (Olvera et al. 2006, De Almeida et al. 2008).
Todo lo descripto anteriormente nos motiva a querer implementar un bioterio de crianza y mantenimiento de Loxosceles, que permita incrementar la disponibilidad de glándulas con el fin de aumentar la producción de sueros específicos y el desarrollo de investigación de los mismos en nuestra institución (ANLIS-Malbrán), con enfoque inmunológico y
citogenético por estudio de cromosomas y del ADN de los ejemplares.
En el Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” (MACN) existe un bioterio en el que se crían los arácnidos que se utilizan en todas las líneas de
investigación citogenómica, taxonomía y filogenia de arácnidos, la experiencia adquirida
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por los responsables de ese espacio será transferida a la ANLIS-Malbrán para el desarrollo del presente proyecto, con el compromiso de formar recursos humanos calificados en el área y compartir las investigaciones.
3.- Justificación y alcances (Impacto y Pertinencia social)
La instalación de un bioterio con fines de producción e investigación redundará en un beneficio social ya que en un lapso estimado de 3 años se podrá incrementar la
producción de sueros de manera considerable. Esta disponibilidad de sueros beneficiará a los argentinos picados por Loxosceles en las diferentes provincias de nuestro país.
Además ésto disminuiría el costo médico y laboral ocasionado en personas picadas, por las formas clínicas generales y sus secuelas.
En lo que refiere a investigaciones se propone adicionar el presente proyecto a los que ya han sido presentados a la Agencia de Promoción Científica para el análisis bioquímico de los venenos y el análisis inmucitogenómico de las diferentes especies presentes en nuestro país.
4.- Hipótesis
La cría de Loxosceles en nuestra institución, en forma programada, para ofrecer disponibilidad de ejemplares, permitirá un aumento de la existencia de veneno para la producción de sueros específicos.
La mayor disponibilidad de ejemplares permitirá, también, realizar un estudio más
profundo de las diferentes características inmunocitogenómicas de las especies presentes en el país.
5.- Objetivo:
a) Organizar un bioterio de cría y mantenimiento de Loxosceles.
b) Proveer de importantes volúmenes de venenos para la producción de sueros específicos.
c) Proveer de material biológico para estudios inmunocitogenómicos.
d) Caracterizar las proteínas que forman los venenos de las especies argentinas de Loxosceles, utilizando técnicas bioquímicas convencionales de determinación de proteínas, de cada una de las diferentes poblaciones de las especies a analizar.
e) Caracterizar mediante citogenética clásica las especies del género Loxosceles utilizando técnicas con tinciones convencionales para describir los complementos cromosómicos de cada una de las diferentes poblaciones de las especies a analizar.
6.- Materiales y Métodos
Para el espacio del bioterio se dispone de una habitación de 3 metros por 4 metros, azulejada con posibilidades de climatizar, humidificar y controlar fotoperiodo en forma estable a lo largo del año. La iluminación será realizada con luz cálida fluorescente en periodo de 12 horas de luz y 12 de horas oscuridad.
Este espacio edilicio que fue ofrecido por el ANLIS-Malbrán, no fue contemplado en ninguna parte del presupuesto, sino que se han presupuestado materiales para incorporar al espacio.
En primera instancia se amurarán las estanterías adecuadas. Una vez que la instalación esté en condiciones de recibir los ejemplares se iniciará el criadero de los diferentes tipos de moscas necesarias a ser utilizadas. Cada una de las especies tiene un ciclo de vida diferente y es necesario acondicionar los requerimientos y los distintos medios de cultivos para criarlas. En una primera etapa los ejemplares que se vayan colectando serán
mantenidos en el Bioterio del MACN hasta el acondicionamiento final del Bioterio de ANLIS-Malbrán.
Los ejemplares se colocarán de manera individual en frascos. En cada frasco se ofrecerá suficiente agua y alimento para brindar una hotelería adecuada, respondiendo a los reglamentos internacionales de bienestar de animales de laboratorio.
6.A.- Población y muestra
Para iniciar el criadero se capurarán ejemplares en las provincias donde habitualmente se colectan a lo largo del año (Provincias de Mendoza, de Buenos Aires y Ciudad Autónoma de Buenos Aires), como también las que lleguen a los centros de investigación asociados
3 al presente proyecto.
6.B.- Variables
Se analizarán las mejores condiciones óptimas de hábitat para el crecimiento y
reproducción de los especímenes (temperatura, humedad y luminosidad), a partir de las condiciones standard que se proponen en materiales y métodos.
Se aplicarán distintos métodos de crianza de juveniles que optimicen la producción.
Se analizará la época reproductiva para favorecer los apareamientos.
Analizar si la temperatura de conservación modifica la antigenicidad de los veneno para la óptima producción de sueros.
6.C.- Análisis estadísticos
Se correlacionaran los diferentes tipos de venenos con los orígenes de los ejemplares y las características genéticas mediante los programa de computación adecuados para tal fin.
7.- Plan de trabajo
Se colectarán ejemplares en las localidades mencionadas. Los ejemplares serán acondicionados para brindarles una hotelería confortable con el fin de obtener buenos productos biológicos. Para tal fin será necesario mantener, en simultáneo, una serie de criaderos de alimentos para los arácnidos, tales como moscas de diferentes tamaños (mosca común, y diferentes especies de Drosophila) que serán necesarias para los diferentes estadios de crecimiento de las arañas. Una vez obtenidos los adultos, se procederá a extraer las glándulas de los ejemplares o extraer el veneno.
7.A.- Diseño experimental
- Traslado de los arácnidos vivos al bioterio para su acondicionamiento.
- Cría de tres clases de moscas de diferentes tamaños (Musca domestica, Drosophila melanogaster, Drosophila sp.) y larvas de otros insectos (como Tenebrio molitor), que se utilizan como alimento de los arácnidos.
- Determinación del sexo de los ejemplares adultos con el fin de decidir los análisis a realizar con cada ejemplar.
- Análisis de venenos: En el Instituto Nacional de Producción de Biológicos (INPB) además de los venenos provenientes de los arácnidos que se obtengan en las capturas realizadas por los participantes del proyecto se estudiarán los traídos espontáneamente a la Institución. Una vez extraídos los venenos, éstos se conservaran a -20°C. En la
investigación se realizarán pruebas biológicas y estudios inmunoquímicos de los mismos.
Estos datos se relacionarán con los resultados de los estudios genéticos para estudiar qué diferencias podrían detectarse entre las mismas especies, en distintas regiones y si esto tienen que ser tenido en cuenta para optimizar los antisueros. Esta metodología se realiza con la participación de otros subsidios pedidos en simultáneo con el presente a la Agencia de Promoción Científico Tecnológica.
- Análisis citogenómicos: Análisis del cariotipo y del desarrollo meiótico en machos y hembras y machos subadultos de las arañas. Los ejemplares a disectar serán adormecidos en refrigerador y después llevados a freezer. Se emplearán distintas técnicas de rutina para el procesamiento del material a partir de gónadas de individuos vivos (Rodríguez Gil 2006).
7.B.- Cronograma
Durante los primeros tres meses se acondicionará la sala para optimizar las condiciones de habitabilidad del bioterio.
Durante ese periodo se realizarán colectas de ejemplares de Loxosceles y se iniciarán los criaderos de los diferentes tipos de moscas. Se entrenará a una persona responsable del bioterio en el correcto manejo de los ejemplares, la alimentación y mantenimiento de los individuos.
Durante los seis meses posteriores, una vez ajustadas las condiciones de funcionamiento del bioterio se procederá a promover cópulas de arañas con el fin de ajustar los
procedimientos de reproducción en laboratorio.
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Los meses posteriores, se procederá al sacrificio de los ejemplares, con la consiguiente obtención de glándulas al servicio de producción de sueros y almacenamiento para nuestros estudios inmunoquímicos, los testículos al grupo de citogenómica, patas de todos los ejemplares a la extracción y posterior análisis del ADN y el resto del ejemplar se guardará como voucher en la Colección Nacional de Aracnología del MACN (MACN-Ar).
7.C.- Justificación del presupuesto solicitado
Es necesario que la Institución ANLIS-Malbrán que se encarga de la producción de sueros para todo el país tenga un centro de colección y producción de arácnidos de importancia sanitaria. Con este fin es necesario iniciar un bioterio para la cría y mantenimiento de Loxosceles, como primera instancia.
Para poder llevar a cabo el proyecto es necesario contar con un espacio que es el que se propone equipar con el presente proyecto. Para tener animales en cautiverio se debe disponer, la erogación destinada a viajes de campaña, desarrollar las metodologías descriptas y publicaciones y/o difusión de resultados. Resulta indispensable la adquisición de drogas y otros elementos químicos específicos. El presente proyecto está basado principalmente en tareas de laboratorio pero resulta dependiente de la colecta de los especímenes en sus áreas de distribución ya que es necesario tener a los ejemplares vivos para su reproducción en bioterio. Como los ejemplares vivos en el bioterio deben estar individualizados, se necesitan tubos y frascos que permitan el acondicionamiento de los especímenes para evitar el canibalismo. A su vez también una vez procesados los ejemplares es necesario su almacenado en los fijadores adecuados, hasta el depósito definitivo en el MACN. El mantenimiento de los ejemplares vivos requiere la cría de otros artrópodos que se utilizan como alimento y por lo tanto se necesitan los insumos para este tipo de cultivos. La heladera/freezer solicitada se utilizará en el INPB-ANLIS para la conservación de venenos. La tablet solicitada será para el almacenamiento de datos a campo, durante los viajes de recolección. Las pinzas de acero inoxidable para captura y disección y la lupa estereoscópica se utilizarán en el procesamiento del material, y quedará inventariado en el INPB-ANLIS. El microscopio de epifluorescencia con cámara digital necesaria para el proyecto se propone también para el INPB-ANLIS con el fin de proveer a la institución con un equipo inexistente en este área Investigación. Las jaulas para la cría de moscas domésticas se deberán mandar a construir.
8.- Productos esperados:
Se espera obtener un aumento en la cantidad de ejemplares de Loxosceles disponibles en el ANLIS Malbrán para la obtención de venenos con el fin de posibilitar un aumento en
la producción de sueros. La obtención de venenos es imprescindible para el ANLISMalbrán, como así es importante proveernos de estos de las distintas regiones, con el fin de realizar las caracterizaciones regionales, y describir particularidades en caso que ellas existieran.
Eventualmente se podrá transferir la experiencia de cría de Loxosceles a otras instituciones nacionales y/o provinciales para que puedan poner a punto sus criaderos destinados a proyectos conjuntos y/o aportes de material con fines productivos y científicos.
9.- Bibliografía
Barbaro KC, Costa Cardoso JL. Mecanismo de Açao do veneno de Loxosceles e aspectos clínicos do Loxoscelismo. Sarvier. 2003.16. 160-172.
Costa Cardoso JL, de Siquiera Franca O, et al. Animais peçonhentos no Brasil. Biología, clínica e terapéutica dos accidentes. San Pablo; Sarvier.2003 16:160-172.
De Almeida DM, Fernandes-Pedrosa M de F, de Andrade RM, et al. A new anti-loxoscelic serum produced against recombinant sphigomyelinase D: results of preclinical trials. Am J Trop Med Hyg 2008. 463-470.
Dragulev B, Bao Y, Ramos Cerrillo B, et al. Upregulation of cytoquine expression in fibroblasts exposed to Loxosceles Sphingomyelinase D: That is the Trigger? Investig Dermatol 2007. 127
de Roodt AR, Estévez J, Magaña P,. Toxicity of Two North American Loxoscels ("brown spider") venoms and its neutralization by antivenoms. Clin Toxicol 2007. 45(6):678-687.
Cabrerizo S, Docampo PC, Cari C, Ortiz de Rozas M, Díaz M, de Roodt A, Curci O.
Loxoscelismo: epidemiology and clinical aspects of an endemic pathology in the country.
5 Arch Argent Pediatr 2009. 107(2):152-159
Olvera A, Ramos-Cerrillo B, Estévez J. North and South American Loxosceles spiders:
Development of a polyvalent antivenom with recombinant sphingomyelinases D as antigens. Toxicon 2006. 48(1):64-74.
Rodríguez Gil, SG. 2006. “Citogenética de Arañas Sinantrópicas de la Argentina
(Araneae: Araneomorphae)” Dpto. de Ecología Genética y Evolución, FCEN. UBA.150 pp.
Directoras Dra: LM Mola - Dra. CL Scioscia
Roques LF, Abriata G, Martinez DD. Envenenamiento por animales ponzoñosos. En Boletín Epidemiológico Periódico. Ministerio de Salud Argentina. 2007. 39: 9-19 Schenone H, Rubio S, Saavedra T, Rojas A. Loxoscelismo en pediatría. Región Metropolitana, Chile. Rev Chil Pediatr. 2001. 72: 100-9.
Schenone H, Saavedra T, Rojas A, Villarroel F. Loxoscelism in Chile. Epidemiologic, clinical and experimental studies. Rev Inst Med Trop São Paulo. 1989. 31:403-415.
Sanabria H, Zavaleta A. Panorama epidemiológico del loxoscelismo en el Perú. Rev Med Exp 1997. 14:33-40.
Zavaleta Martínez Vargas A. Loxoscelismo, un problema de salud en el Perú. Bol Of Sanit Panam 1987. 103:378-86.
10.- Director responsable del proyecto:
11. Integrantes del equipo 13. Es un proyecto nuevo
14.- Por ser un proyecto nuevo: No corresponde 15.- Consideraciones bioéticas: No corresponde
16.- Protocolo de experimentación en animales (de ser pertinente): No corresponde 17.- Consentimiento informado (de ser pertinente): No corresponde
18.- Normativa vigente, en temas de ética/bioética, de aplicación al presente proyecto: No corresponde
19.- Bibliografía (consideraciones bioética): No corresponde
20.- Declaración jurada de cumplimiento de normas de Bioseguridad:
21.- Normativa vigente de temas de bioseguridad, de aplicación al presente proyecto:
22.- Bibliografía (Bioseguridad): No corresponde 23- Presupuesto
25. Aval Institucional:
