UNIVERSIDAD AUTONOMA GABRIEL RENE MORENO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“EVALUACI ON DEL METODO REACCION EN CADENA DE LA POLIMERAS A (PCR) PARA EL DI AGNOSTI CO DE LA TRI P ANOSOMI ASIS BOVI NA” (Prov. Y acuma Dpto. Beni).
Borr ador de T esis de G rado pr esentada po r : G iovan a L andív ar Chávez Par a o bten er el T í tulo de: MÉ DICO V E TE RINA RIO ZOOTE CNIS TA AS E S ORES : Dr. J os é Luis Go nzales Dr. Hu go Riv e ra C.
Dr. W a lter Asc arrunz
Santa Cr uz de la Si erra – Boli via
2005
DEDICATORIA
A mis padres Paúl Landívar y Sara Chávez , por su infinito amor y el incentivo a formarme profesionalmente.
A mi hermano Miguel Ángel, por todo el cariño y la compresión que me ha ofrecido.
A mi esposo Luis Alberto Banegas, por el amor que me ha brindado y su apoyo incondicional en mi formación profesional.
A mi pequeña hija Bella Gione, por ser el aliciente a superarme.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por sembrar en mí el espíritu de valentía, para superar todos los problemas y situaciones difíciles en la vida.
A mis suegros Humberto Banegas y Elva Rosales por el apoyo para concluir este trabajo y continuar superándome.
A la Dra. Marinely Rosales, por sus buenos consejos que me ayudaron a continuar luchando.
A la Universidad Autónoma Gabriel René Moreno, por que en ella pude prepararme profesionalmente.
A los docentes de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, por ser la guía en mi formación profesional y al personal administrativo por la colaboración recibida.
A mis asesores Dr. José Luis Gonzales, Dr. Hugo Ribera, Dr.
Walter Ascarrunz, por haberme guiado con mucha paciencia en la realización de éste trabajo de tesis.
A mis tribunales Dr. José Luis Vaca, Dr. Sergio Santa Cruz G.y Dr. Emilio Arce T., por la atención prestada y la guía para la realización del presente trabajo.
INDICE
TITULO ... i
DEDICATORIA ... ii
AGRADECIMIENTOS ... iii
INDICE DE CONTENIDO ... iv
INDICE DE GRAFICO ... vi
I. RESUMEN ... 1
II. INTRODUCCION ... 2
III. REVISION BIBLIOGRAFIA ... 4
3.1 PROTOZOOS ... 4
3.2 TRIOPANOSOMIASIS ... 4
3.2.1 CONCEPTO ... 4
3.2.2 TAXONOMIA ... 5
3.2.3 TRIPANOSOMAS QUE ATACAN A LOS BOVINOS ... 8
3.3 GENERALIDADES DE LOS TRIPANOSOMAS ... 9
3.3.1 ESTADIOS DEL CICLO BIOLOGICOS ... 10
3.3.2 CICLO BIOLOGICO DE LOS TRIPANOSOMIASIS ... ... 11
3.4 TRIPANOSOMIASIS POR T.vivax ... 12
3.4.1 DEFINICIÓN ... 12
3.4.2 HOSPEDEROS ... 12
3.4.3 MORFOLOGIA ... 13
3.4.4 DISTRIBUCION ... 13
3.4.5 EPIZOOTIOLOGIA Y TRANSMISION ... 14
3.4.6 SIGNOS CLINICOS ... 15
3.4.7 PATOGENIA ... 16
3.4.8 LESIONES ... 17
3.5 TRIPANOSOMIASIS POR T.evansi ... 18
3.5.1 DEFINICION ... 18
3.5.2 MORFOLOGIA ... 18
3.5.3 TRANSMISION ... 18
3.5.4 PATOGENIA ... 19
3.5.5 SINTOMAS Y LESIONES ... 19
3.6 DIAGNOSTICO ... 19
3.6.1 METODO DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO ... 20
3.6.2 METODO DE DIAGNOSTICO SEROLOGICO ... 20
3.6.3 METODO DE DIAGNOSTICO MOLECULAR(PCR) ... 21
3.7 INMUNIDAD ... 24
3.8 MEDIDAS DE CONTROL DE LA TRIPANOSOMIASIS ... 25
3.9 TRATAMIENTO ... 26
IV RESULTADOS ... 28
4.1 MATERIAL ... 28
4.1.1 LOCALIZACION DEL AREA ... 28
4.1.2 UNIDAD DE MUESTREO ... 28
4.2 METODOS ... 29
4.2.1 METODOS DE CAMPO ... 29
4.2.2 METODOS DE LABORATORIO ... 29
4.2.2.1 METODO DE DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO ... 29
4.2.2.2 METODO DE DIAGNOSTICO DE PCR ... 30
4.2.2.3 EXTRACCION DE ADN DE LAS GOTAS DE SANGRE EN PAPEL FILTRO ... 30
4.2.2.4 AMPLIFICACION DEL ADN ... 30
4.2.2.5 ELECTROFORESIS ... 32
4.3 METODOS ESTADISTICOS ... 32 V. RESULTADOS ... 33
5.1 EVALUACION DE LOS PRIMERS Y CONTROLES DEL MÉTODO DE PCR ... 33
5.2 DIAGNOSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS ... 33
5.3 CONCORDANCIA ENTRE LOS METODOS PARASITOLOGICOS Y EL PCR ... 34
5.4 PREVALENCIA DE LA TRIPANOSOMIASIS BOVINA ... 34
5.5 FACTORES DE RIESGOS DE LA TRIPANOSOMIASIS ... 34
VI. DISCUSION ... 40
VII. CONCLUSION ... 42
VIII BIBLIOGRAFIA ... 43
INDICE DE GRAFICOS
Nº 1. PROPORCIÓN DE POSITIVOS ENCONTRADOS EN LOS DIFERENTES PRUEBAS ...
36
Nº 2. PROPORCIÓN DE ANIMALES POSITIVOS
TRIPANOSOMIASIS POR SEXO ...
37
Nº 3. PROPORCIÓN DE ANIMALES POSITIVOS
TRIPANOSOMIASIS POR RAZA ...
38
Nº 4. PROPORCIÓN DE ANIMALES POSITIVOS
TRIPANOSOMIASIS POR EDAD ...
39
E V ALUACIÓN DE L MÉ TODO DE REACC IÓN E N C ADE NA DE L A P OL IME RAS A (P CR ) P A RA E L DIAGNÓS TICO DE LA TRIP ANOS OMIAS IS BOV INA.( E n la P rovincia de Santa Ana de Y acuma, Depar tamento del Ben i)1
Landívar Ch. G2., Gonzales J. L3., Ribera H. C4., Ascarrunz W5.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.A.G.R.M.
I. RESUMEN
El obje tiv o del pr ese nte tr abajo, fue ev aluar el método de PCR ap lic ado en mues tra s de ca mp o to ma das en la p rov inc ia de Santa Ana de Yac uma, pa ra el diagnós tic o de la Tripan os omias is b ov ina (T . e van si y T . vivax ) y c on los resulta dos deter minar la p rev a len c ia d e la
enfe rmeda d en la r egión. Se r ec olec taro n 150 mues tras al azar , las c uales fuer on proc es adas en LIDIVET me dia nte lo s métodos para s itológic os de frotis s angu íneo , méto do de c entrifugac ión en mic r ohematoc r ito (MCMHT ) , y ta mb i én el método de diagn ós tic o mo lec ula r ( PCR) . Los r es ultad os obte nid os en es tas pr uebas fuer on; en el mé todo de PCR para T . viv ax , s iete mues tras pos itiv a s c o n una prev ale nc ia d e 4,66% , par a PCR T . evan si , dos p os itiv as (1 ,33 %) ; en el fr otis T . vivax fue ron negativ as y en el mé todo de c entrifug ac ión de mic r ohematoc r ito no s e o bs erv ar on mues tr as po s itiv as . El méto do de PCR de mo s tr ó u na may or s ens ibilidad y es pec ific idad c ompa rado c on los mé todos par as ito lóg ic o s .
1 Tesis de Grado presentada por Landívar Ch. Giovana, para obtener el título de Médico Veterinario y Zootecnista
2 Villa Warnes; Calle Rubén Terrazas # 173 Santa Cruz Bolivia
3 Médico Veterinario, Titular de Laboratorio de Investigación Veterinaria y Diagnóstico LIDIVET, Santa Cruz Bolivia
4 Médico Veterinario, Titular de Laboratorio de Investigación Veterinaria y Diagnóstico LIDIVET, Santa Cruz Bolivia
5 Médico Veterinario, Docente Titular de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Santa Cruz Bolivia
II.INTR ODUC C IÓN
La ec onomía mund ia l y de l país e s tá s us tentada en g ran pa rte po r la prod uc c ión agropec u aria, s ie ndo la c rianz a de l ganad o bov ino un área mu y impo rtante y po r lo tanto to do lo que afec te negat iv amente a s u produc c ión re pe rc u tirá en pérd ida s ec o nómic as qu e afec tará n no s olo a los p roduc tores s in o a la reg ión.
E s s abid o qu e las para s itos is afec tan e n el d es arro llo de la pec u aria, y s i c o ns idera mos que un bu en diagnó s tic o es fundamental pa ra un buen tra ta miento nos o c upamos en es te c ometido de la tr ipan os omias is bov ina rea li zan do la e v aluac ión de l método d e P CR.
La tripanosomiasis bovina es una enfermedad parasitaria producida por los hemoprotozoarios de género Trypanosoma, en Sudamérica la enfermedad es causada principalmente por el T. vivax y el T. evansi pertenecientes a la sección salivaria, en nuestro continente la transmisión es totalmente mecánica por medio del tábano, debido a la ausencia de la mosca Tsetsé donde se llevan a cabo los diferentes cambios biológicos del parásito (Hall y col., 1993).
La Tripanosomiasis en América del Sur, fue reportada por primera vez por Leger y Vienne (1919), en la Guayana Francesa, desde entonces la enfermedad se diseminó en el continente, llegando al Brasil por el Pantanal y a Bolivia por las Tierras bajas. Se cree que el T. vivax hubiese llegado al departamento de Santa Cruz, a través de los bovinos infectados provenientes del Norte del Brasil (Silva y col.,1998). Posteriormente otros brotes de ésta enfermedad fueron registrados en la región del Beni (Cuellar y Carrique, 1998).
Estudios realizados en el departamento de Santa Cruz, demuestran que las épocas lluviosas representan el período de mayor abundancia de tábanos que son los vectores mecánicos de la enfermedad (Hall y col.,1993; 2001).
El diagnóstico de la tripanosomiasis es basado principalmente en métodos parasitológicos ( centrifugación de microhematocrito a realizarse en situ, y observación de frotis de sangre teñidos con coloración Giemsa), los cuales tienen una baja sensibilidad, de modo que no detectan animales infectados con niveles bajos de parasitemia. Alternativamente métodos serológicos (inmunoinfluorescencia indirecta, test de aglutinación directa, Elisa, CATT, también son empleados en el diagnóstico de la tripanosomiasis, pero éstos también reportaron problemas en cuanto a su especificidad (Masake, 1998).
En recientes investigaciones el método de diagnóstico molecular, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) trae aparentemente las respuestas a los problemas de sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de la tripanosomiasis, observados con pruebas serológicas y parasitológicas (Gonzales,2002). Además con la técnica del PCR se buscará obtener datos más satisfactorios sobre la presencia de los tripanosomas en bovinos, datos que son necesarios para el desarrollo de estrategias eficaces de control contra los tripanosomas.
Los objetivos del presente trabajo fueron: a) Evaluar a campo el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa, para el diagnóstico de la tripanosomiasis bovina en la provincia de Yacuma departamento del Beni. b)Determinar la prevaleencia de ADN de T. vivax y T. evansi mediante la prueba de PCR. c) Determinar la prevalencia de tripanosomiasis bovina en la Prov. Yacuma-Beni. d) Comparar los resultados obtenidos mediante la técnica de PCR y la parasitológica.
III. RE V IS IO N B IBL IOGR ÁFICA
3.1. - P ROTOZOOS
Los p rotozoos s on anima les unic elu la res , en los qu e las a c tiv idades div ers a s del organ is mo s e lle v an a cabo por orgánu los d e la c élu la.
P os een un n úc leo b ien defin ido y no pres e ntan pared c e lu la r ríg ida, lo que pe rmite, a l mis mo t ie mpo una v ariac ión ma rc ada de tama ño y for ma ( No rman, 19 83 ).
Des de qu e A ntoni V an Leeu wenhoec k des c ubrió los proto zoos , s e han de s c rito unas 45.000 es pec ies . La ma yo ría s on de v ida libre y habitan e n me d ios terres tres y ac uá tic os . A unque los protozoos pará s itos s on menos numero s os , tie nen un pap el impo rtante c o mo prod uc to res de enfermed ad en e l s entido a mp lio de la pa lab ra, ya que, aparte de oc as ionar mue rte y de for ma c ió n, agota n la en e rgía y la in ic iat iv a (S ouls b y, 198 7).
3.2. - TR IP ANOS OMIAS IS
3.2.1. - CONCE P TO
E l n o mb re d e tr ip anos omias is s e aplic a a l g rup o de e nfe r medades infec c ios a s a gudas o c rónic as del hombre y de los an ima les domés tic o s y s ilv e s tres , produc id os por proto zoos flagelados pertenec ientes a l géne ro Tr ipanos oma , trans mitidos , por mos c as c hupad oras de s angre, tábanos y v inc huc as (Norman , 1983 ).
3.2.2. - TAX ONOM IA
P hylu m: S arc omas tigop hora S ubphylu m: Mas tigop hora
C las e: Zoomas tig opho rea Orden: K in etop las tida Familia : Trypanos o mat idae Género : Trypa nosom a
P hylum S ar comastigophor a .- Con f la gelos , s eudópo dos o amb os , núc leo ú nic o, genera lmente n o forman es poras , repro duc c ión s exual, s i ex is ten, bás ic amen te s inga mia .
S ubphylum Mastigop hora .- Trofo zoitos c on uno o más flagelos , rep roduc c ión as e xual, fus ión b ina r ia, en muc hos gru pos , s e desc on oc en mec anis mos de reproduc c ión s ex ua l.
Clase Zoomastigophor ea .- S on protozoos flage lado s , c on uno o más flage los en fo rma de lát igo; e l núc leo es de tipo v es ic ula r; c a rec e n de c romatófo ros ; el apa rato neu ro moto r es tá c on s tit u ido po r un ble fa rob las to granu la r, o g ránu lo ba s a l, del que e me rg e e l axone ma.
Or den k inetopla stida .- P os ee un o o c uatro flage los ; el k inetop las to c ontien e A DN, y for ma parte de la mit oc ond ria qu e, en e l c as o de los Trypano soma s , rec orre la long itud tot al de l c uerp o.
Familia Trypa nosomatidae .- Con for ma de hoja, pu eden s er redo ndeadas .
Gé nero Trypanos oma .- S on p arás ito s de la s ang re, linfa, te jidos o c av idades de toda c las e de v erte brad o s y artróp odos . S u d es arro llo puede inc lu ir las etapas de tripo mas tig o te, ep imas tigote, pro mas tigote y a mas tigote . E n muc h as es pec ies en el hos ped ador v ertebrado s olo aparec en tr ip o ma s tig ote, que s e c a rac teriza n por s u
es pec ia l apt itud patóg ena pa ra e l h o mb re y lo s anima le s (S ou ls by, 1987).
Los tripano s omas de es te gén ero es t án ub ic ado s den tro de una de dos s ecc iones de ac u erdo a la loc aliz ac ión en el v ec tor y en el ma mífe ro . La s ecc ión S terc ora ria c ontien e género en e l c ual el pará s ito c omp le ta es te c ic lo ev olutiv o e n la ”s ec c ió n pos terio r”, aparec ie ndo e l es ta dío infec tiv o el c ual s e e limina po r las he c es del v ec tor. La rep rodu c c ión en el ma mífe ro es dis c ontinua y us ualmente toma luga r en e l es tadío A ma s tigot a y E p imas tigota.La s ecc ión S aliv ar ia c ont iene géne ro que s u c ic lo ev olutiv o en e l v ec tor es c ompletada en la “s ec c ió n anterio r ”, es d ec ir en la pa rte med ia y/o partes buc ales y la rep roduc c ión en el ho s pedero oc urre en e l es tadío tr ipo mas tigota (Hoa re, 1964; S tephen, 1 986).
Una c las ific ac ión prác t ic a d e los Trypanosoma d e impo rtan c ia mé d ic a y v eterina r ia, e s c o mo s i gue, y es tá b as ada princ ipa lmente en c rite rios mo rfo lóg ic os y b io lóg ic o s .
GÉ NE RO S ALIV AR IA S ubgéner o Dutto ne lla
E specie: Tr ypanosoma v ivax S ubgéner o Nan nomonas
E species: Tr ypanoso ma congolense, T. sim ia e . S ubgéner o Trypan ozoon
E species: Trypa nosom a br ucei, T. rhodesien se, T.
gam biens e, T. evans i y T. Eq uiper dum . S ubgéner o P yc nomonas
E specie: Trypanos oma suis
GÉNERO STERCORARIA
S ubgéner o S c hiz otr ipa nu m
E species: Tr ypanoso ma cruz i (Los os , 198 6)
S egún s e pud o obs erv a r du rante e l d e s arro llo de l p re s ente es tudio, los pa rá s itos q ue c onc iernen a es te es tudio s on T . vivax y T.
evansi , q ue mues tra n línea s mo rfo lógic as , bio lóg ic as y ge nétic as s imila res entre e llas y las ot ras es p ec ie s qu e pe rtenec en a la s ec c ión S aliv ar ia . E s as s imilitu des p ueden c omp lic a r e l intento de detec tar la pres enc ia de es os parás itos en es tudio s ep idemio lóg ic os .( Go nza les , c omunic ac ión pers ona l)
3.2.3. - TRY P ANOS OMAS QUE ATACAN A LOS BOV INOS
S E CCIÓN S TE RCORAR IA
Esp ecie Hués ped de fin it iv o
Huéspe d in ter m ed./ Ve
ctor
Dis tr ibuc ión
ge ográfica Enfe rm edad
T. theileri
B ov inos Tában os Cos mopolita N inguna
T .
m e l o p h a g i u m
Ov inos , bov inos
Melophagus ov inus
Zonas te mp lada s
N inguna
T . c r uz i Homb re ,
gatos , perros , c erdos , etc .
V inc huc a (T riatoma s pp.)
A méric a de l S ur
E nfermedad de Chagas
(Hoa re, 1964 ; S tephe n, 1986)
SECCIÓN SALIVARIA
Esp ecie Hués ped de fin it iv o
Huéspe d in ter m ed./ Ve
ctor
Dis tr ibuc ión
ge ográfica Enfe rm edad
T. vivax
B ov inos , ov inos , c aprinos , equinos y c amello.
Mosc a ts ets é
(G los s ina,s p p.) S tomo x is c alc itrans y tá banos .
Á fr ic a trop ic al, A méric a c entra l y de S ur.
Tripan os omi as is
T . c a p rae Caballos ,
ov inos .
Mosc a ts ets é
Tanz ania , Malaw i.
Tripan os omi as is
T .
c o ng o le n se
B ov inos , ov inos , c aprinos , equinos , c erdos ,
per ros y c amello s .
Mosc a ts ets é
Á fr ic a trop ic al
Tripan os omi as is
T . b r uc e i Homb re , ru miantes domés tic os y s alv ajes .
Mosc a ts ets é
Á fr ic a trop ic al
Nagana
T . e v a n s i E quinos , c aprinos , ov inos y bov inos (s on re s erv orios )
Tában os y S to mo x ys c alc itrans .
Cos mopo lita S urra y ma l de c adera.
(Hoa re, 1964 ; S tephe n, 1986)
3.3. - GE NE RAL IDADE S DE LOS TRIP ANOS OMAS
Los tripan os omas es tá n entre los más pr imitiv os entre los euc ario tas y, deb ido a s us líne as a nc es trales no es s orprendente que p res e nten
prop ieda des bio lóg ic as no us uales . E llos es tán entre los prime ros euc arion tes que tie nen mitoc ondria y una d e s us ma s rema rc ab les c ara c terís tic as es d e s u DNA mito c ontria l, c ono c ido c omo DNA kin etop lás tic o (k DNA ). Contrario a c ualqu ie r otro DNA en la natu ra leza, e l k DNA es t a organizado dentro de una re d c onteniendo v arios millo nes de c írc u los d e DNA ínt er ligad os topológ ic a mente. Los c írc ulos s on de dos tipos . Hay v arios milla res de pe queños min ic írc u los en unas poc as dec enas de max ic írc u los . Cada c élu la c ontien e una ún ic a r ed de ntro de la matr iz de s u únic a mitoc ondr ia (E ng lund y c ol, 1996 ).
Los tripano s omas e xhíb en c o ns iderab le d iv e rs idad genét ic a de int ra es pec ies y v aria c ió n de la c u al tien en c o mp lic ada s u c las ific ac ión taxo nómic a (My le r, 1993 ).
E s ta div ers idad y v ariac ió n p uede s er defin ida e n ambos n iv e les de genoma y gene s ind iv idua les . E l genoma nu c le a r mues tra una c ons iderab le p las tic idad d e inte r e in tra es pec ies en té rminos de núme ros de c romos o ma s y ta maño . E l gen o ma mitoc on dria l (K DNA ) tamb ién v a ria c ons ide rab le me nte ent re es pec ies , es p ec ia lmente en tér minos de tamañ o de min i y max ic írc u los y orga n iza c ió n. Ha y tamb ién u na c on s id erab le d iv e rs idad d e s ec uenc ias intra es pec ífic a en los min i c írc u los y den tro de la reg ió n v ariab le de lo s max ic í rc u los (A gu ila r, 199 8).
3.3.1. -E S TADÍOS DE L CICLO B IOL ÓGICO
Trymas t igote (p rev ia mente , es t ado tripan os óm ic o). - T iene f or ma lan c eo lada c on un o kin etop las to s itua do detrás de l núc leo y genera lmente, p róx imo a l ex tre mo pos terio r. P res enta una me mbrana o ndu lante b ien des arro lla da y un flage lo lib re. Con frec uenc ia es ta fas e s e enc uen tra e n e l h os pedad or v erteb rado, pero ta mb ién s e pued e loc a liz a r los art róp odos , c omo la fo r ma infec tante de l hos ped ador v erteb rado .
E pimas t igote (p rev ia ment e, f o rma c rit h id ia l) t ant o e l k inet op la s to c omo el axo ne ma yac e n por de lante de l núc leo y la me mb rana ondulante es c orta . E n un as p oc as es pec ies es ta etap a ap arec e en el v erte brado c o mo pa rte d e l c ic lo d e d es arro llo en d ic ho hos ped ador, pero p r inc ipa lmen te s e trata de u n es tado de los art rópo dos .
P romas t ig ote (p rev ia ment e, fo r ma lept o mo nad ic a) e l qu inet op las to y e l axo nema es tán e n el ext re mo a nter io r de l c uerp o, n o tiene me mbrana ondu lante . S e pres enta n en artrópodos o planta s .
A ma s tigot e (prev ia mente, fo rma l eis hman ia ) e l c uerpo es redo ndeado, e l f la ge lo no s e pres enta o s e enc uen tra re duc ido a una c o rta fib r illa. F orma típ ic a de ar trópodo s y v erteb rados , c on kin etop las to (S ouls b y, 1987) .
3.3.2. - C ICLO B IOLÓGICO DE LOS TRIP ANOS OMAS
E n el in s ec to v ec tor e l c ic lo b io lóg ic o d e lo s tr ip anos omas s e ha obs erv ado p roc e s o s ex ual en algun as es pec ies , tales c omo el T.
brucei (Gibs on y S tev ens , 1999).
E xc eptuando a unas poc as es pecies , c omo e l T . evansi y exc epc ion a lmente e l T. viv ax, la ma yo ría de los tr ip anos omas exper imentan des a rro llo c íc lic o en un a rt rópodo v ec tor, mos c a Ts ets é. Cuando oc urre una trans mis ió n mec án ic a , frec uentemente s e llev a a c abo p or la inte rv en c ió n de mos c as pic adoras tales c o mo S tom oxys y Ta banus. La mos c a pic adora s e in fec ta in med iata mente des pués de alimenta rs e, pero pe rman ec e en es te e s tad o s o lo du rante un c orto p eriodo de tie mpo, y tienen que s er ráp ida mente trans mit idos . (A gu ila r, 1996 ).
E n el h os pedad or toda la rep ro duc c ió n trans c urre po r f is ión b in a ria o mú lt ip le, la d iv is ión c omienza e n e l k ine top las to, s eguida por e l núc leo y a c o ntinuac ión el c itop las ma. Donde s e forma dos c élu las hijas a part ir de una c élu la mad re (S ouls b y, 1987)
3.4. - TR IP ANOS OMIAS IS P OR T. viva x
3.4.1. - DE FIN ICIÓN
E s un a enferme dad p aras ita ria, c aus ada por e l T. vivax. E n Á fr ic a es trans mit ida po r las mos c as Ts ets é (Glossina sp p .), e n A mé ric a de l S ur tra ns mit ida po r v ec tores mec ánicos h ematófagos ( Tab anus). E s una enfermed ad pro g res iv amen te ane mis ante y de b ilitante, dis minu ye ndo s ev eramen te la produc c ión tanto de lec h e c omo de c arn e, pudiendo llev a r a la mue rte ( Ha ll y c ol., 1993; 20 01 ).
3.4.2. - HOS P E DE ROS
E l T. vivax infec ta predomin ante men te a bov inos , ov inos , e quin os , c aprinos , b úfa los y c a me llos . E n S ud A méric a e l p a rás ito es ta mu y exte ndida en ga nado v a c uno (B eta nc ourt, 1978), búfa los (S haw y Lains on, 1 972), ov ejas (Ga rd ine r y Ma hmo ud, 199 2; LIDIV E T, c omunic ac ión pe rs ona l), c a bras (K ubes , 19 44), y c ierv os s a lv a jes (Dav ila et a l, 1998) ta mb ién fue ron e nc ontra dos infec tados . A p es ar de la mu y extend ida d is t ribuc ión d e la infe c c ión en ganad o v ac uno, los b rotes s e v eros de la en fe r medad e n e l c ont ine nte s on es po rád ic os (B etanc ou rt, 1 978; S ILV A et al, 1 998) . L os pe rro s s o n re frac ta rios a la in fec c ión (S haw y La ins on , 1972).
3.4.3. - MORFOLOGÍA
E l T . vivax es un a es pec ie mono mó rfic a, de 20 a 27 mic ras p or 3 mic ras de es pes o r. S u porc ión pos ter io r mas an c ha y bu lb os a, e l kin etop las to e s grande y te rmina l y p res en ta un flag e lo lib re, c orto, de 3 a 6 mic ras d e lon g itud. La me mb rana o ndu lante es poc o des arro llada. E l núc leo es ov a l y s e orienta long itu d in a lmente.
(S ou ls by, 1987; Hoa re, 197 2 )
E l T. viva x en A mé ric a es mo rfo lóg ic amente s imila r a l de Á fric a; en donde s e han desc rito dos tipos dife rentes en s us facc iones mo rfo lóg ic as y b io lóg ic as : E n el oes te de Á fric a la forma ma s c orta mide ent re 21,4 a 24,6 mic ras y e n e l e s te de Á fric a la forma es más la rga mid iendo ent re 23,6 a 2,6 mic ras (Fa irba in, 1953 ).
E s tud ios morfo lóg ic os rea liza dos e n S ud A mér ic a s ob re el T. v ivax s ugieren que la fo rma de es te p arás ito es s imila r que a la del oe s te de A fric a (S ha w y La ins on , 1 972; W ells , 19 84; Dav ila et a l, 1998 ).
E s tos es tudios re po rta ro n me d id as que o s c ilan e ntre 15,86 a 23 mic ras e n bov ino s de B oliv ia y la Gua yana franc es a re s pec tiv amente (Dav ila et a l, 199 7 ).
3.4.4. - D IS TR IBU C IÓN
La Tr ipa nos omias is po r T. vivax en el c ont inente a me ric an o a s ido repo rta do des de 19 19, cu ando c as os de la e nfer medad fu eron desc ritos po r p rime ra v ez en la Gua ya na fran c es a (Lege r y V ie nne, 1919). Que de a c uerdo a Cu ras s on fue int rodu c ida a La tinoa mé r ic a en 18 30 por un a emba rc ac ión q ue importa ba ganado c ebu ino des de el Oes te de Á fric a.
A paren temente an tic ue rpos c ontra e l T. vivax fueron reportad os en anima les de : E l s alv ador, Cos ta Ric a, Co lomb ia, E c uador, P erú, B ras il y P arag ua y (W ell e t a l, 197 7). E n 1996 la enfe rmeda d c ruzó e l A ma zonas y e l T. viv ax fue iden tific ado en el pantana l bras ile ro y en las tier ras bajas de B oliv ia c o n brote s s ev e ros de la en ferme dad y mu e rte (S ilv a et a l, 19 98 ), y s egún este mis mo a uto r has ta la fe c ha, el T. vivax ha s ido c onfirmad o en: Gua yana f ran c es a, S urina m, V enezue la, Co lo mb ia, B ras il y B o liv ia.
3.4.5. - E P IZOOT IOLOGIA Y TRANS MIS IÓN
E l T. vivax es trans mit ido c lín ic amente por las mos c a s Ts ets é y me c ánic amente por ot ras mo s cas hematófagas . La s mosc as de los es ta blo s y ot ros tábanos s on v ec tores s olamente en A mé r ic a (Lev ine, 1973). LA trans mis ión ta mb ién pu ede lle v ars e a c abo durante v ac unac io nes mas iv as , c uando s e inyec tan d ife rente s anima le s c on agujas pos ib lemente c ontaminad as (W ells y c ol., 1 982; J ones y Dav ila, 20 01 ).
P or ex perienc ia e n e l traba jo de c a mp o s e s a be que la e s tac ión lluv ios a y de c a lor repres enta el p eriodo de ma yo r ries go de trans mis ión de t ripanos omias is , deb id o a que lo s tá banos s on más nume ros os p or es tos mes es .
Todos los tripan os omatidos pres entan un kinetop la s to el c ual c ontien e el A DN mit oc ondr ia l de es tos parás itos . Dic ho A DN e s ta for mado por max i y min i c írc u los ( B ors t y c ol., 1987 ). Lo s max i c írc ulos s on nec es arios e n los tri panos oma s s aliv a res para la ev oluc ión de una mitoc ond ria func ion al, pa ra e l des a rro llo c íc lic o de es tos pa rás itos en s us v ec tores tra nsmis ores , e n es te c as o la mos c a Ts ets é. B ajo es tas c ondic iones los pr otoz oarios s on tra ns mit id os de for ma c íc lic a , lo c ual mant iene la d is tribuc ión de los tripanos omas y además da luga r a l in te rc amb io gen étic o entre los d ife rentes es pe c ies de género Tripanos oma (S te v ens Y Gib s on, 1 999), no s e han rea lizado es tudios para exp lic a r los mec a nis mo s por e l que e l T.
viva x s e adapto a s er trans mitido en forma no c íc lic a. S e c o ns idera que los trans mis ores mec ánic os d el T. viv ax s on mos c as c hupa do ras de s ang re, princ ipa lmen te mo s c as del g éne ro Tabanidae, que s e c ara c terizan por re a liza r a limentac io nes inte rru mp id as antes d e la plé to ra, llev ando en s us partes buc ales s angre infec tada c on
tr ipan os omas e ntre los an ima les de l h ato (W oo, 1977; Dirie y c ol., 1989).
E s tud ios realizad os e n el d epa rtament o d e S anta Cruz en la p ro v in c ia de Gua ra yos y S ara pe rmit ie ron obs er v ar la p res enc ia de T. viva x en las partes buc ale s de s iete es pec ies de tában os , s iendo la es p ec ie de tába nos mas abunda nte y c on mayo r n umero de v ec to res portando tr ipan os omas , e l Tabanus occidenta les (Ha lls y c o l., 2 001 ). Tamb ién s e puede inc rimina r c omo potenc ia l tra ns mis or de Tr ip anos omas s aliv a res a la mo s c a brav a (S to moxis ca lcitr ans ) (S er ra F re ire y Rezende, 1988).
3.4.6. - S IGNOS CL ÍN ICOS
E n los b rotes d e T. vivax repo rta dos e n Mato Gro s s o del s ur, B ras il S anta Cruz, B oliv ia, los bov ino s afec tados pres entaron las tres for mas c línic as , la h ipe raguda c a rac teriza da po r he mor rag ias y mu e rte, la c lín ic a donde los s ign os princ ipa le s s o n p erdida d e pes o y anemia , y la fo rma s ubc línic a que puede des apa rec er s in nec es idad de tra ta miento . Tamb ién s e re g is tro la oc urrenc ia de ab o rto y c ua dros dia r re ic os . (S ilv a y c ol., 1998 ).
La diná mic a de l c ompo rta mie nto de l a en fer me dad fue u n repent ino inc re mento de c as os ante la int roduc c ión de la infes tac ión, s egu ida de un dec remento c uand o el parásito s e es tablec ió de ma nera endémic a e n la pob lac ión a n ima l. (Mo is es , 1 998).
3.4.7. - P ATOGE NIA
E l T. vivax p os ee u n perio do de inc u bac ión v a riab le ent re 4 a 4 0 días . L os tripanos omas s e mult ip lic a n, pr ime ra mente , en los te jidos de la p ue rta de ent rada , y mas tarde pa s an a l to rre nte c irc ulato rio.
Con es te proc ed imiento s e or ig ina u na infec c ión he má tic a, y c o mo c ons ec uenc ia, la tu mefac c ión de l ba zo y de los gan g lios linfátic os .Los gérmene s s on lis ados en s u ma yor p arte en la s angre po r los antic ue rpos , qu e ent retanto ha for mado e l o rgan is mo. Las endotoxinas libe ra das c on ello p roduc e n un es ta do febril. P o r tanto, los tripanos oma s d es aparec en de la s angre , pero v u e lv e n a reap a rec e r a l c abo d e algún tie mpo. Cuando s e h an multip lic a do en dete rmin ados órgan os , princ ipa lmente en el bazo, ga ng lios lin fátic os y médu la ós ea, pero s e des truyen as imis mo po r nuev os antic uerp os . Las inv as ione s per iód ic a s de los t ripano s omas s e repiten en e s te s is tema, y las endotox inas libe radas no s o lo des tru yen los g lóbu los ro jos s ino que o rig inan les ione s en la s paredes v as c ula res . (Hutyra - Ma rek, 1 973 ).
Los anima les infec tado s por e l Trypanos oma , pres entan c a mb ios drás tic os en el s is tema lin fát ic o. E n es ta p aras itos is el s índrome de anemia es e l qu e do mina e l c uad ro c línic o. Des a rro llándos e c uando la para s ite mia e s ta e n s u niv el mas elev ado y ten iendo un efe c to hemo lític o g rav e , c omo res u lta do d e la des tru c c ión de una g ran c antida d de g lób u los ro jos med iante la fag oc itos is , los fac tore s que pueden es tar inv oluc rados en es te proc e s o s on la hemó lis is prod uc id a po r e l Trypa nosom a , p roce s os inmuno lóg ic os , la fiebre, c oagulac ión intra v asc ular d is emin ada y una exp ans ión ac tiv a mo nonuc lea r de l s is tema fag oc ít ic o. Se ha c onc luido q ue la mue rte de
los bov inos afec tados s e debe a las c o mb inac ione s de anemia, alte ra c io nes mic ro c irc ulato r ia s y daño s c ardíac os (Mois es , 1998).
S egún es tu dio s realizad os de ntro de l LIDIV E T a la s emana s igu iente de la infec c ión c on los T ripa nosom as h emá tic os , hay gene ra lmente un des c enso ma rc ad o de los n iv eles de he ma toc r ito, hemog lob ina, eritroc itos y g lóbu los blanc os , que pueden llega r al 50 % de los niv e les pre infec c ió n en dos mes es .
3.4.8. - LE S IONE S
Los hallazgos d e la a u top s ia , en ca s os de tripano s omias is , s on v ariab les , y no s on es pec ífic os para la e nfe rmedad. E n c as os de anima les mue rtos en la fo rma aguda, ha y petequ ias extens as en las me mbranas s ero s as , es pec ia lmente en la c av idad p eriton ea l. Los ganglio s linfát ic o s y e l bazo ta mb ién s uelen e s tar h inc ha dos . E n los c as os c rónic os hay gang lio s lin fát ic os hinc h ados , atro fia s e ros a de la gras a y ev idenc ia de ane mia (Me rc k, 2 000).
3.5. - TR IP ANOS OMIAS IS P OR T. evansi
3.5.1. - DE FIN ICIÓN
E s una enfermeda d paras ita r ia , c ausada por el flage lado T. evansi , s e enc uen tra pr inc ip a lmente en c aballos , bu r ro, c abra , ov ino, c amello, c e rdo, b u rro, e le fante, c ap iba ra y v enado. Es trans mitido po r la p ic adura de mos c as hematófa gas . C lín ic amente s e c arac teriza po r
fieb re inte rmiten te, anemia , edema, perd ida de pes o, pro gres iv o dec aimien to, c on jun tiv it is y abo rtos . E s c a us a d e una enfermed ad de alta mo rta lid ad, c onoc ido c on e l no mb re de s ur ra o e l ma l d e la c adera e n los equ inos . (Me rc k , 2000).
3.5.2. -MORFOLOGÍA
Miden de 1 5-34 mc de lo ng itud y s on típic amente mono mó rfic os . S e enc uen tran en la s a ngre, tiene fo rma típ ic a de trip o mas tigote, c ompre nde fo rmas de lgada s inte rmed ias . Las fo rmas delgadas tienen un la rg o flage lo lib re y e l e xtre mo po s terio r es trec ho, e l que puede s er re dondead o o trunc a do (Qu iro z, 19 89).
3.5.3. - TRANS M IS IÓ N
E l T. evansi es trans mit ido mec án ic amente por mos c as pic adoras , no hay n ing ún d es arro llo en es tas mos c as , que ac túan únic amente c o mo v ec tores mec ánic os , lo mis mo e l mu r c ié lag o hematófa go Desm odus rotu ndus, ac túan c omo hos p edero y ag ente trans mis or en c entro y S ud A mér ic a (Hoa re , 1965 ).
3.5.4. - P ATOGE NIA
La ac c ió n patógena de l T. eva nsi de pende de v arios fac tores , ta les c omo s usc eptib ilidad d e l hués p ed, gra do d e patogen ic idad de la c epa del pa rás ito que v ar ia de ac uerd o c on h ués ped es y loc alid ades . E L T.
evansi tie ne e n p r inc ip io una ac c ión tóxic a s obre e l hués p ed, dad por los produc tos d e s ec rec ión y ex c rec ió n, en s egu ndo lugar un efe c to
antigén ic o, y en te rc er lugar un a ac c ió n mec án ic a s ign ific at iv a a n iv el c apilar (M e rc k , 2000).
3.5.5. - S ÍNTOMAS Y LES IONE S
E n los eq u in os pres enta fieb re inter mite nte, urtic a r ia, ed e ma en las pata s y par tes ba jas de l c uerpo , perd id a de pes o , dec a imiento prog res iv o, pérd ida de la c ondic ión genera l, inapetenc ia, a bo rto, ic ter ic ia, p ro b le mas nerv io s os , inc oor din ac ió n c on pará lis is de l t ren pos terio r (Qu iro z, 1989 ).
3.6.-DIAGNÓSTICO
Los métodos comúnmente utilizados para diagnosis de tripanosomiasis son los parasitológicos , los serológicos y recientemente se está aplicando métodos de diagnóstico moleculares.( Gonzales, 2002).
3.6.1.-MÉTODO DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
Estos métodos están basados en la identificación de los tripanosomas durante su fase en el torrente sanguíneo, sin embargo el problema es que tiene una baja sensibilidad, con un elevado número de animales infectados sin detectar ( Nantulya, 1990).
La prueba de centrifugación de microhematocrito parece que tiene la mayor sensibilidad de los métodos parasitológicos, así lo demuestra Desquesnes en 1997, examinando animales infectados de laboratorio, reportó una sensibilidad del 68% para la prueba de microhemarocrito y 59% para la prueba de Buffy coat y recientemente Masake, 2000, reportó una sensibilidad para el Buffy coat de 63%
también en animales artificialmente infectados.
Bajo las condiciones en América del Sur y refiriéndonos a Bolivia, con la dificultad de obtener reactivos para utilizar métodos sofisticados de diagnóstico, el método parasitológico resulta muy práctico y económico.( Gonzales, 2002)
3.6.2.-MÉTODO DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICOS
La mayor parte de las pruebas serológicas detectan la presencia de anticuerpos, mientras que otros detectan la presencia de antígenos. El diagnóstico serológico del T. vivax en América del Sur es complicado porque se debe diferenciar de la infección con otros dos tripanosomas que también infectan bovinos como el T.
evansi y T. theileri , los cuales tienen componentes en común con el T. vivax y pueden dar falsos positivos como resultados. Los métodos serológicos que detectan antídoto, ya fueron descartados para el diagnóstico de la tripanosomiasis, debido a su baja sensibilidad y especificidad (Desquesnes, 1997; Eisler y Col, 1998).
Las técnicas basadas en la detección de anticuerpos, se ven limitadas principalmente por su pobre especificidad, debido a frecuentes problemas de reacciones cruzadas entre las diferentes especies de tripanosomas, dificultando la diferenciación entre estas especies durante el diagnóstico. Además estos métodos no distinguen anticuerpos persistentes, los cuales fueron comprobados que persisten por seis meses en el animal, después que se recuperan (Luckins, 1977).
3.6.3.-MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR (PCR)
El método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) está siendo considerado como el método que resuelve los problemas de sensibilidad y especificidad de los métodos parasitológicos y serológicos, porque esta basado en la destrucción del ADN del parásito. El PCR consiste en la aplicación del material genético (ADN de virus, bacterias, parásitos, etc.), con la ayuda de reactivos específicos (Primers), para cada uno de los patógenos, está basado en la reacción de la polimerasa, que es la enzima que dirige la síntesis de ADN (Masake y Col,1997).
Las ventajas mas significativas del PCR son: - especificidad, donde se establecen condiciones de la reacción muy estrictas, de manera que solo se pueda amplificar el microorganismo que estamos buscando detectar; -sensibilidad, donde permite la detección de cantidades muy pequeñas de material genético buscado, siendo esta una gran ventaja sobre otros métodos (Masake y Col, 1997). El método de PCR también ha presentado problemas en las pruebas, por ejemplo, casos en que el método parasitológico fue positivo y resultaron PCR negativos, las probabilidades por los cuales el método de PCR puede fracasar o producir falsos negativos, son:
Cuando el ADN se ha degradado debido a malas condiciones de conservación.
Bajas concentraciones de ADN insuficientes para que sean visibles(Morlais y col.,1998;2001).
Deficiente proceso de extracción del ADN, o presencia de componentes inhibidores en la reacción de PCR(Desquesnes, 1997).
Presencia de cepas del parásito con diferentes secuencias del genoma(Masiga y col.,1992;Morlais y col.,1998;2001).
E l méto do de P CR p ara el d iag n ós tic o d el T. v ivax ha s ido des arro llado us and o c omo blan c o s ec ue nc ias s atélite s de A DN es pec ífic os para e l T. vivax ( Mas iga y c o l.,19 92;1 996), s ec uenc ias de A DN c odific adas (CA DN ) que es la s ec uenc ia que s e e xpre s a en un antígen o de T. vivax qu e es rec onoc ido por un ant ic u erpo mo noc lona l TV 27 aplic adas en la dete cc ión de antígeno s en la p rueba E LIS A . S egú n es tudios realiz ados han d emos trado que la s ec uenc ia CA DN es tá p res en te en todo s los s to cks de T . viva x, prov eniente s de Á fr ic a y A mé r ic a de l Su r y no es tá pr es en te e n otras es pec ie s c o mo el T. bru cei y T. congolense (Mas ak e y c o l.,1994 ).
De acuerdo a Masake y col., 1997 con la detección de la secuencia de TV27 CADN, diseñaron los primers TWJ1 y TWJ2, los cuales demostraron ser capaces de amplificar segmentos de ADN de stocks Colombianos y Africanos de T. vivax , adicionalmente éstos primers no produjeron ningún producto de PCR cuando se probaron con otros protozoos como el T. brucei, T. congolense y T. evansi los autores reportaron un 75% de sensibilidad parar el método de PCR, comparado con un 42% para la prueba de Buffy coat y 55% para ELISA.
Recientemente Masake y col.,2002, reportaron una sensibilidad del 93% para PCR , comparado con un 55% para la prueba de Buffy coat.
La prueba de PCR puede detectar la presencia de parásitos con 5 días de infección y además detecta la infección en fases finales de la enfermedad y en estados crónicos, cuando los niveles antigénicos y de parasitemia son indetectables en los métodos parasitológicos y serológicos (Masake y col.,1994).
Estudios realizados en América del Sur llevaron al desarrollo de primers, que son reactivos específicos para cada agente infeccioso en este caso para T. vivax (Ventura y col.,1994).
Estudios basados en las secuencias de cepas brasileras donde las secuencias blanco de ciertos primers, fueron demostrados que estan presentes en cepas de todo el mundo, además de ser específicos, éstos primers fueron evaluados con muestras tomadas a campo durante la presentación de un foco de tripanosomiasis en el pantanal de Brasil en 1997. Los resultados de este estudio con el T. vivax nos demuestra que de las 45 muestras, 8 fueron positivas a microscopia, mientras que PCR se detectó un 75% de los animales, es decir, 33 muestras positivas(Ventura y col.,2001).
En los resultados del estudio para la identificación del T. evansi de las 41 muestras procesadas con el método de PCR se detectaron 12 muestras positivas, mientras que el parasitológico solo logró detectar 2 muestras positivas (Ventura y col.,2002).
3.7.-INMUNIDAD
Los tripanosomas tienen la capacidad de hacer variaciones antigénicas, donde cada período de parasitemia máxima corresponde al desarrollo de una población de tripanosomas de un nuevo tipo antigénico. Cuando ocurre la eliminación de una población de un único tipo antigénico provoca una caída en los niveles sanguíneos de parásitos. No obstante una cierta proporción del grupo de sobrevivientes desarrolla nuevos antígenos de superficie, y se origina una población nueva. Esta fluctuación cíclica en los niveles de parásitos, donde cada valor máximo refleja en la aparición de una población que tiene una nueva variante antigénica, que puede proseguir durante varios meses (Tizard, 1995).
Los antígenos variantes que se producen en la primeras etapas de la infección tienden a desarrollarse en una secuencia, la cual se pude predecir con facilidad.
No obstante a medida que la infección progresa, los antígenos variantes empiezan a producirse de una manera más aleatoria. Los tripanosomas que se producen en
el cultivo de tejidos también muestran variaciones antigénicas espontáneas, lo cual demuestra que la variación no es necesariamente inducida por el anticuerpo (Tizard, 1995).
Puede demostrarse con microscopía electrónica que las formas variantes de los antígenos producen una cubierta muy espesa de glucoproteínas sobre la superficie del tripanosoma. Cuando se produce el cambio antigénico las glucoproteínas de la cubierta antigua se desprenden y se reemplazan por una proteína diferente desde el punto de vista antigénico. El análisis de la genética de este proceso indica que los tripanosomas tienen gran cantidad de genes para la proteína de la cubierta, y que la variación antigénica se produce como resultado de un nuevo arreglo y selección de genes producidos al azar (Tizard, 1995).
Teniendo los tripanosomas esta capacidad de variación antigénica, se producen en el animal infectado niveles bajos y altos de parasitemia, y cuando los niveles están bajos no pueden ser detectados por métodos parasitológicos ni serológicos.
Por eso es importante el empleo de un método molecular como el PCR.(
Gonzales, 2002).
3.8. - ME D IDAS DE CONTROL DE LA TRIP ANOS OM IAS IS
P or e l mo mento no s e d is pone de v ac unas o algún ot ro mé todo in muno lóg ic o c apa z de prev enir la enf ermed ad, deb ido a la c apac idad del p atóg eno de de s arro lla r nuev os antígeno s de s up erfic ie. S in emba rgo s e rec omien da, ut iliza r me d ic a me ntos prev e ntiv os (is ometa mid iu m), en los an ima les qu e s e int roduc en en las zonas enzoótic as para c on tro lar la infec c ión a tie mpo (Qu iroz, 19 89 ).
La luc h a c o ntra la tr ipan os omia s is es difíc il pues no s ólo los anima les enfe rmos , s ino que también los aparentemente s an os , s on portad ores
de pa rás itos dis eminando la infec c ió n por los v ec tores hematófag os , s ie ndo los tában os los más impo rtante s . S e pued en c ons id e ra r que los méto dos p rinc ipa le s pa ra ev itar la d is eminac ión de la pa ras ito s is en la reg ión puede n s e r los s igu ientes :
D iagn ós tic o c lín ic o y de labo rat o rio p rec is o.
S e rec omien da la aplic a c ió n de f ármac o s c on u n período pro longa do ( is o meta mid ium, homid iu m,e tc .)en an ima les que s e v an a mov iliza r de á reas s os pec hos as d e es tar in fec ta das .
V ig ilanc ia ep ide m io lóg ic a c o ns ta nte de los foc os e ndémic os , inc entiv an do al us o de in muno es timu lante s en an ima les s usc e ptib les .
Contro l de lo s v ec tores mec ánic os (t ábano s ) c on ins ec t ic idas c omo las de lta met rinas en s u pres entac ió n “P ou r On”.
E s nec es ario des tac a r que ante la au s enc ia de la mo s c a Ts ets é, en el c ontine nte ame ric ano , las med idas p a ra ev ita r la d is eminac ión de l T.
viva x y T. evansi s e enfoc an s ólo a la s mos c as pic adoras que trans miten e l hemopa rás ito en for ma mec án ic a y en los anima les que padec e n la infec c ión y p ueden trans mi tirla a los an ima les s ano s en s u zona de orig en o d is tante c u ando s e mov ilizan o s o n trans portados por e l ho mb re (A gu ila r, 1996 ).
3.9. - TRATAM IE NTO
La ac tual qu imioterap ia para la t ripanos omias is y los anima les domés tic o s dep enden de s eis c o mp ues tos , algunos de los c ua les s on químic amente re lac io nados : d imin azene, h omid iu m y e l is o me ta mid ium s o n us ado pa ra e l trata miento y p rofila x is de la tr ipan os omis is e n bov inos , ov inos y c a prinos . La qu inap ira mina, s ura min y la men a rs o min s on us ados c omo agentes terapéutic os para infec c ione s c o n T. eva nsi, s in emba rg o la q u ina p ira mina s ea tamb ién
us ada para tratamiento p rof ilác t ic o . S ie ndo es tos tre s ú lt imos c ompues tos s olo para e qu in os , c amello s y búfa los (A guila r, 199 6).
E n 19 97 la E mp res a B ras ile ña d e Inv es tigac ión A gro pec uar ia (E MB RA PA ), y e l P rogra ma de Modern iza c ión Téc n ic a A gro pec uar ia de la re g ión c e ntra l de l B ras il ( P ROMA GRO), rea liz a ron una es timac ión e c onómic a s obre el c ontro l d e la tripanos omias is bov ina, emp lea ndo is o metamid iu m qu e de ac uerdo a la s obs erv ac iones obte nida s , parec e s e r el med ic amen to de ele c c ión para las á reas infec tadas del P an tanal de B ras il y Sa nta Cruz -B o liv ia, d ic ho fármac o tiene e l no mb re c omerc ia l d e Tr ypa midiu m y ta mb ién ha demos trado s er efec tiv a p ara es ta blec er e s trate gia s de p rev e nc ión c on tra el T.
viva x e n reg io nes c on alto y me d ian o r ies go de in fes tac ión, s iendo as í s e debe proc eder al tra ta miento prof ilác tic o s ob re e s trateg ias donde s e pres enten una prev a lenc ia d e 0 o igu a l a l 20% donde e l trata miento c o ns is tirá en tres aplic a c io n es d el tr ip anoc ida.
E n es tudios rea lizados por A gu ilar, 1 996, la pr ime ra d os is s e aplic ará al in ic io de la époc a de lluv ias , la s egunda en e l med io y la te rc era a l fina l de la époc a de lluv ias . Obteniendo as í un a gra n protecc ión c ontra la enfe rmedad en el pe ríod o de g ran c onc entrac ión de tába nos , d is minu ye ndo e l ries g o de pro lifera c ió n de la tr ipan os omias is entre los anima les .
E s timac iones ec o nómic as efec tuadas en e l P an tana l de B ras il y B oliv ia, s obre e l c ontro l de la tripanos omias is bov ina, han demos trado q ue c uand o s e hac e el t rata mie nto en an ima les de reg iones de ries go o c onta minada s , hay un c os to o pérdida es timada del 4% de u na v ac a, y e n lug ares donde los c as os de enfe rmedad trans c urre s in trata miento, la t ripano s omias is e s timada s u be a un 17% del v alo r de u na v ac a (S eid l y c o l.,1999).
IV. MATERIAL Y METODOS
4.1.- MATERIAL
4.1.1. LOCALIZACIÓN DEL ÁREA
El presente trabajo de investigación se realizó en propiedades ganaderas en la provincia de Yacuma del departamento del Beni, Bolivia.
La provincia de Yacuma está situada geográficamente entre los 17°47’ de latitud Sur y los meridianos 63°09’ de longitud Oeste y tiene una altitud de 155 msnm.
Tiene un clima cálido, tropical, húmedo cuya temperatura media anual es de 27,9
°C, y la humedad relativa del 90% y una precipitación pluvial de 1200mm. Posee una superficie territorial de 20.897 km2. Y tiene los siguientes límites:
Al Norte con la provincia Vaca Diez
Al Sur con la provincia Moxos
Al Este con las provincias Mamoré y Moxos
Al Oeste con la provincia Ballivián
La provincia de Yacuma se divide en dos secciones territoriales:La primera tiene por capital a Santa Ana de Yacuma, que al mismo tiempo es capital de la provincia. La segunda sección es Exaltación.
4.1.2.- UNIDAD DE MUESTREO
Se tomaron 150 muestras de la localidad de Yacuma, la cual se dividió en cuatro estratos geográficos, para cubrir de manera completa y homogénea el área de muestreo.
Las propiedades a muestrearse fueron seleccionadas al azar, basados en la lista de socios manejada en la asociación de ganaderos de la provincia. Finalmente los animales a muestrearse se tomaron al azar.
4.2. MÉTODOS
4.2.1.- MÉTODOS DE CAMPO
Los tipos de muestras fueron: - sangre completa; obtenida directamente de la oreja del animal, para la preparación de frotis y para los tubos capilares que se utilizan para las pruebas de centrifugación de microhematocrito, para el diagnóstico de tripanosomiasis in situ, - sangre completa con anticoagulante obtenida de la vena coxígea del animal, en tubos Vacutainer; que se utilizan para la preparación de gotas de sangre en papel filtro y fueron embebidos en acetona para su fijación, para luego hacer el diagnóstico mediante el método de PCR.
4.2.2.- MÉTODOS DE LABORATORIO
4.2.2.1. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
Los métodos que se emplearon para el diagnóstico e identificación de especies de tripanosomas fueron, el método de centrifugación de microhematocrito a realizarse in situ, y observación de frotis de sangre, teñidos con coloración Giemsa.
4.2.2.2. MÉTODO DE DIAGNOSTICO DE PCR
4.2.2.2.1. EXTRACCIÓN DEL ADN DE LAS GOTAS DE SANGRE EN PAPEL FILTRO
La extra c c ión de l A DN pa ra e l pos terio r p roc es o de amp lific ac ión me d ian te la p ru eba de P CR s e re a liz ó bas ada en el métod o des c rito por B o id y c ol.(1999 ), e l p roc ed imie nto es el s igu iente: S e c o lo c an las mu es tras del pape l filt ro de 6 mm de d iá met ro en los tu bos e ppendo rf y s e ad ic iona 200 mic ro lit ros d e agua des tilada. S e in c uban los tubos en el te rmoc ic lador a 37° C, duran te 30 minutos .L uego s e lle v ó a la c entrífuga durante 10 minu tos y s e extra jo e l s obre nadante.S e c oloc ó los tubos nuev amente 100 mic ro litros d e agu a des tila da y s e llev ó a l ter moc ic lad o r a 99 ,9 ° C, durante 30 minu tos .S e c entrífugo durante 10 minutos , s e extra jo e l s obren adante, y s e lo trans firió a otros tubos eppendo rf.
4.2.2.2.2. AMPLIFICACIÓN DEL ADN
Para la amplificación del ADN específico de T. vivax y/o T. evansi se utilizaron los siguientes primers. Primers específicos para T. vivax producto amplificado de 400bp (Masake y col., 1997).
TWJ1 5`CAG CTC GGC GAA GGC CAC TTG GCT GGG
TWJ2 5`TCG CTA CCA CAG TCG CAA TCG TCG TCT CAA GG
Para T. evansi se utilizarán Primers de T. brucei.- Producto amplificado de 177 bp (Artama y Col, 1992).
TBR1 5`CGA ATG AAT AAT AAA CAA TGC GCA GT TBR2 5`AGA ACC ATT TAT TAG CTT TGT TGC
Las c ondic io nes p ara la e lab orac ión del méto do de P CR fue ron las c ondic iones utiliza das e n e l LI DIV E T, emp leand o los P r imers T WJ ½ a una c onc en trac ión de 2 mic ro mo la r y lo s P rime rs TB R1/2 a una c onc en trac ión f in a l de 0,4 um de v olu me n. S e prepa ró la s o luc ió n de P CR, ad ic ionan do a los rea d y To Go -bea ds , agua, los P r ime rs y la mu es tra e xtraíd a d e A DN y s e ad ic iona ro n las m ues tras a tempe ratu ra de 4 ° C. S e llev aron los tubos de P CR al te rmoc ic lador c on los res pec tiv os prog ra mas :
Para el T. vivax
T° Tiempo(min.)
94 °C 3 Incubación inicial
94 °C 1 Desnaturalización
55 °C 2 Hibridación
72 °C 2 Extensión
72 °C 5 Incubación final
Para el T. evansi
T° Tiempo(min.)
94 °C 3 Incubación inicial
94 °C 1 Desnaturalización
55 °C 1 Hibridación
72 °C 1 Extensión
72 °C 5 Incubación final
4.2.2.2.3. ELECTROFORESIS Procedimientos:
Se prepago gel agarosa al 1.5%, con Tris Acetate EDTA (TAE 10x)
Se cargo las muestras en el gel, con Loading Buffer y se tiño el gel con bromuro de etidio.
Luego se procedió a realizar la electroforesis durante 30 minutos y se hizo la lectura en luz ultravioleta.
4.3. ANÁLISIS DE DATOS
Los análisis de datos se realizaron basados en los resultados obtenidos mediante los métodos parasitológicos y de PCR. El cálculo de prevalencias y la respectiva comparación de proporciones se llevó a cabo mediante el análisis estadístico de Chi Cuadrado y prueba exacta de Fisher usando el programa de computadora Epi Info 6.
V . RE S ULTADOS
5.1. EVALUACIÓN DE LOS PRIMERS Y CONTROLES DEL MÉTODO DE PCR
Al emplear los primers TWJ1/2 y TBR1/2 en controles de ADN para T. vivax y T.
evansi se pudo observar productos de PCR, los cuales certificaron la validez de la prueba. Cuando se utilizó set de primers de TWJ1/2 con controles ADN de T.
vivax y T. evansi, solo se observó una banda de 400pb, con el control ADN T.
vivax no se encontraron productos de PCR con el control de T. evansi. Mientras que al utilizar el set de primers TBR1/2 tan solo se observó una escalera de 170pb. Con el control ADN T. evansi y no observaron productos de PCR con el control de T. vivax.
5.2. DIAGNÓSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS MEDIANTE MÉTODOS PCR Y PARASITOLÓGICOS
En el presente trabajo se pudieron identificar animales positivos a la tripanosomiasis con el método de PCR, mientras que todas las muestras resultaron negativas con los métodos parasitológicos (centrifugación de microhematocrito y frotis sanguíneo). De un total de 150 muestras obtenidas a campo y procesadas por los diferentes métodos de diagnóstico, se obtuvieron los siguientes resultados: por el método de PCR resultaron 7 muestras positivas a T.
vivax (4,66%), con la misma técnica, 2 muestras positivas para T. evansi (1,33%)(Gráfico#1).
5.3. CONCORDANCIA ENTRE LOS MÉTODOS PARASITOLÓGICOS Y EL PCR
No se logró realizar evaluaciones de concordancia mediante análisis kappa, entre los métodos de diagnóstico empleados en este estudio, debido a que no se identificó ninguna muestra positiva con los métodos parasitológicos (centrifugación de microhematocrito y frotis sanguíneo).
5.4. PREVALENCIA DE LA TRIPANOSOMIASIS BOVINA
A través del presente estudio se determinó la presencia de tripanosomiasis bovina en la provincia de Yacuma. Las especies detectadas mediante la prueba de PCR fueron T. vivax y T. evansi.
Considerando que la identificación del parásito por métodos parasitológicos tanto como su ADN (PCR), son indicativos que existe una infección activa, se reporta la prevalencia en base a los resultados positivos obtenidos solo por PCR.
De acuerdo al siguiente cuadro, se pueden observar las prevalencias obtenidas en las diferentes pruebas; mediante el método de PCR T. vivax se determinó una prevalencia de 4,66%(I.C. 1,89-9,37), para PCR T. evansi 133%(I.C. 0,16-4,73), no habiéndose observado diferencia significativa (P>0,05), en las prevalencias obtenidas con las diferentes pruebas.
5.5. FACTORES DE RIESGO DE LA TRIPANOSOMIASIS
Tomando en cuenta la raza, por la prueba de PCR T. vivax, de los 128 animales mestizos el 3,91% resultó positivo (5/128), mientras que en los criollos el 9,10%
resultó positivo (2/22). En la prueba de PCR T. evansi los mestizos tuvieron positivos el 1,56% (2/128), y en los criollos todos negativos (0/22). Según los resultados obtenidos en las distintas pruebas no se encontró diferencia significativa entre las razas (P>0,05) (Gráfico #2).
Buscando evaluar el sexo como un factor de riesgo para la tripanosomiasis se observó que por el método de PCR T. vivax del total de 145 hembras resultó el 4,83% positivo (7/138) y ningún macho positivo (0/5), mediante PCR T. evansi el 1,38% de las hembras fueron positivas (2/143). No se observó diferencia significativa entre las prevalencias por sexo (P>0,05)(gráfico #3).
Finalmente se evaluó la proporción de animales positivos y negativos a tripanosomiasis en distintos estratos basados en la edad de los animales buscando identificar al factor edad como un factor de riesgo. Mediante la prueba PCR T. vivax se obtuvieron los siguientes resultados; en el grupo de animales menores de 24 meses no hubieron positivos (0/11), de 25 a 48 meses el 4,55%
fue positivo ( 1/21), mayores de 48 meses el 5,13% resultó positivo (6/111), no se observó diferencia significativa entre los positivos de las diferentes edades (P>0,05).Para la prueba de PCR T. evansi en los animales de 24 meses no hubieron positivos (0/11), en los de 25 a 48 meses el 4,55% fue positivo (1/21) y en los mayores de 48 meses el 0,85% resultó positivo (1/116), no habiendo diferencia significativa entre las prevalencias de T.evansi por edad (P>0,05).(Gráfico # 4)
GRÁFICO N° 1
PROPORCIÓN DE POSITIVOS ENCONTRADOS
EN LAS DIFERENTES PRUEBAS
0 0
4.66
1.33
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
% P O S IT IV O S
Frotis MHMT Tv PCR Te PCR
PRUEBAS
GRÁFICO N° 2
PROPORCIÓN DE ANIMALES POSITIVOS A TRIPANOSIOMASIS
POR SEXO
4,83
0
1,35
0 0
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
%POSITIVOS
PCR T.vivax PCR T.evansi
PRUEBAS
Hembra Macho
P>0,05
GRAFICO N° 3
PROPORCION DE ANIMALES POSITIVOS A TRIPANOSIOMIASIS
POR RAZA
3.91
9.09
1.56
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
%POSITIVOS
PCR T.vivax PCR T. Evansi PRUEBAS
Mestizo Criollo
GRAFICO N°4
PROPORCION DE ANIMALES POSITIVOS A TRIPANOSOMIASIS
POR EDAD
0 0
4,554,55
5,13
0,85
0 1 2 3 4 5 6
%POSITIVOS
< 24 25 -48 >48
EDAD
PCR T.vivax PCR T. Evansi
VI. DISCUSIÓN
En el presente trabajo se evaluó la especificidad del PCR, en la identificación y diferenciación de las especies T. vivax y T. evansi. Se utilizaron dos sets de primers TWJ1/2 y TBR1/2, para la amplificación de ADN de T. vivax y T. evansi respectivamente. Cuando se emplearon los primers TWJ1/2 en controles ADN
para T. vivax, éstos lograron amplificar una banda de 400pb, los que no produjeron ningún producto de PCR cuando se los usó en T. evansi.
Esta elevada especificidad para la identificación del T. vivax con los primers TWJ1/2 fue reportado por Masake y col.,(1999) empleando cepas de T. vivax Colombianas y Africanas solo logró amplificar el ADN de éstas cepas y no se obtuvieron productos de PCR cuando aplicó éstos primers en ADN de otras especies de tripanosomas.
Los primers TBR ½ utilizados en controles de ADN para T. evansi lograron amplificar una banda de 177pb, que no produjeron ningún producto de PCR cuando se usaron con controles de T. vivax, los primers TBR1/2 empleados a partir de ADN nuclear de T. brucei amplifica tanto ADN de éste tripanosoma como de T. evansi por lo tanto no se puede diferenciar entre éstos dos parásitos como fue reportado por Artama y col.,(1992).
Debido a la ausencia de T. brucei en América del Sur se utilizaron éstos primers como control para T. evansi, si hubiera estado presente el T. brucei en nuestro continente se tendría que utilizar los primers que detectan el KADN (ADNkinetoplástico), del parásito, los cuales son específicos para cada tripanosoma, pero éstos primers kinetoplásticos tienen que ser evaluados en las cepas de Bolivia, ya que no se tiene información si éstas cepas poseen kinetoplasto o son akinetoplásticas. Ventura y col. (2000) empleó primers kinetoplásticos en cepas de T. evansi brasileñas, el mismo reportó el fracaso de éstos primers en la amplificación de ADN de la cepa, demostrando junto a otros estudios morfológicos el estado akinetoplástico de la cepas de T. evansi en Brasil.
Los resultados obtenidos en el diagnóstico de la tripanosomiasis bovina con el método parasitológico y con el método de PCR, nos demuestran la mayor sensibilidad para éste último ya que se detectaron positivos a T. evansi y positivos a T. vivax, mientras que con el frotis sanguíneo y el microhematocrito todas las muestras dieron negativas. También Masake (2002), reportaron una sensibilidad
