GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº3

Universidad Nacional de Tucumán

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº3

Hemograma-Hemoglobina-Hematocrito- Índices hematimétricos- Morfología de

los eritrocitos-Velocidad de

sedimentación globular- Control de

calidad en hematología.

HEMOGLOBINA

DEFINICION

La hemoglobina (Hb), componente principal de los glóbulos rojos, es una proteína conjugada, formada por una parte proteica: la globina (96%) y una parte prostética: el grupo hemo (Figura Nº1).

La globina es una proteína básica del grupo de las histonas, consta de dos pares de cadenas polipeptídicas, cada cadena está asociada a un grupo hemo, de modo que cada molécula de hemoglobina está formada por 4 grupos hemo y 4 cadenas polipeptídicas.

El hemo está formado por un grupo tetrapirrólico (protoporfirina) asociado al hierro (Fe) en forma ferrosa (Fe++). El hemo es la parte coloreada de la molécula y el que actúa fijando el O2 y el CO2 en forma reversible; se localiza cerca de la superficie de la molécula en una bolsita hidrófoba de una cadena polipeptídica.

El grupo hemo es igual en todas las hemoglobinas; las mismas se diferencian en sus cadenas polipeptídicas, por ejemplo la Hb A está formada por 4 grupos hemo + 2 cadenas alfa + 2 cadenas beta; la Hb F está formada por 4 grupos hemo + 2 cadenas alfa + 2 cadenas gamma.

FIGURA Nº1: Representación de la molécula de hemoglobina

Los átomos de Fe tienen 6 enlaces de coordinación, 4 para los núcleos pirrólicos del hemo, 1 para el N de la cadena polipeptídica, y 1 que se une reversiblemente al O2. A medida que aumenta la presión de O2, los 4 grupos hemo se unen respectivamente a 1 molécula de oxígeno. Cada gramo de hemoglobina fija 1,36 ml de O2: es la capacidad de O2 de la hemoglobina.

En su síntesis debemos considerar la síntesis del hemo y de la globina.

Síntesis del grupo hemo: se realiza en todas las células de la serie eritroide, excepto los eritrocitos maduros.

Síntesis de la globina: se produce en el citoplasma de los eritroblastos y de los reticulocitos.

Destrucción de los eritrocitos y degradación de la hemoglobina: desde el momento en que un eritrocito entra en la circulación y pierde su ARN, sufre de forma gradual cambios metabólicos a lo largo de sus 120 días de vida. La célula

menos viable, que empieza a envejecer, es retirada de circulación por las células del sistema mononuclear fagocítico, allí se desintegra en sus tres constituyentes:

Fe-Protoporfirina-Globinas. El hierro queda depositado y puede ser utilizado nuevamente; en la protoporfirina el anillo se desdobla, se convierte en bilirrubina (se excreta como urobilinógeno fecal) más CO; y con respecto a las globinas, las cadenas polipeptídicas son degradadas y devueltas al pool de aminoácidos.

La Hb debe ser el único parámetro a emplear para definir si hay o no anemia; es decir, sólo si las cifras de Hb son inferiores a los valores normales puede asegurarse que existe anemia.

FUNCIÒN DE LA HEMOGLOBINA

La función de la Hb es el transporte de O2 desde lugares donde la presión del mismo es elevada (pulmones) hacia los tejidos donde es baja.

El Fe de la hemoglobina se mantiene en forma ferrosa, si se oxida a su estado férrico, como en la hemiglobina o metahemoglobina, pierde su capacidad de combinación con el O2 y el dióxido de carbono.

La hemoglobina con el Fe sin asociar con el O2 es Hb reducida, oxigenada es Hb oxidada.

Hb + O2  HbO2 Fijación reversible del oxígeno

A una tensión de O2 de 100 mm Hg (capilares pulmonares) el 95-98% de la Hb se combina con el O2, mientras que a una tensión de 20 mm Hg (tejidos) el O2 se disocia fácilmente.

DERIVADOS DE LA HEMOGLOBINA

Las dos Hb fisiológicas, oxiHb y Hb reducida, se convierten con facilidad en una serie de compuestos derivados por la acción de sustancias oxidantes y reductoras, el calor y otros agentes. Su presencia en altas concentraciones se puede distinguir en el espectrofotómetro, pero para pequeñas concentraciones deben realizarse además pruebas gasométricas y colorimétricas.

* Metahemoglobina (Hi): en condiciones normales se forma continuamente pero es reducida inmediatamente por enzimas eritrocitarias, por lo que su concentración es un 1,5% a 2% de la Hb total. El Fe ++ se oxida a Fe +++ por lo que es incapaz de unirse al oxígeno. En condiciones patológicas su aumento se debe a deficiencias de enzimas como la glutatión Hb reductasa, metahemoglobina reductasa (enzimas de la glucólisis), presencia de sustancias oxidantes de la sangre, o en tratamientos con sulfonas, utilizados en dermatología.

* Sulfohemoglobina (SHb): es otro pigmento hemoglobínico, su concentración es menor al 1%. En presencia de O2, la Hb reacciona con SH2 (sulfuro de H) para formar un derivado verdoso de SHb, sustancia estable e irreversible, incapaz de transportar O2, pero sí CO. Puede formarse en respuesta a un stress oxidativo;

luego se produce la desnaturalización de la Hb en forma de cuerpos de Heinz.

* Carboxihemoglobina (COHb): no fija el O2 por lo tanto no puede transportarlo. El CO producido en la degradación del hemo a bilirrubina produce un 0,5 % del COHb de la sangre y se incrementa en la anemia hemolítica. La afinidad de la Hb por el CO es 250 veces mayor que por el O2.

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA (Hemoglobinometría)

La determinación de la concentración de Hb en sangre es fundamental para el diagnóstico de anemia, por ello se deben emplear metodologías fiables y basadas en las propiedades físicoquímicas de la Hb. La concentración de Hb de una solución puede calcularse por medición de su color, de su poder de combinación con el oxígeno o con el monóxido de carbono o por su contenido en hierro.

Existen métodos colorimétricos, gasométricos, densimétricos y químicos. Desde 1.967, el Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH) recomienda el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina basado en el cálculo de la absorbancia (A) lumínica de una solución de Hb transformada previamente en un derivado coloreado.

Método colorimétrico de la cianmetahemoglobina o cianhemiglobina (CNHi):

De elección en la práctica diaria, presenta las siguientes ventajas:

 Testigo estable: que es una solución de CNHi cuyas propiedades fisicoquímicas han sido definidas por el ISCH y reconocidas por la OMS.

Se procesa como la muestra y permite el control de las condiciones de trabajo, reactivo, operador y aparato.

 La reacción es rápida, la banda de absorción a 540 nm es amplia y plana lo que permite una buena lectura empleando fotocolorímetro o espectrofotómetro.

 El producto cianmetahemoglobina (CNHi) es un pigmento estable.

 El pH de la reacción permite el dosaje de todos los hemocromógenos excepto la SHb.

 Con el agregado de NaHCO3 el pH de 9 bajó a 7,2, desarrollándose la reacción en sólo 3 minutos.

 La incorporación de un tensioactivo no iónico elimina la turbidez producida por las proteínas y lisa los eritrocitos.

Los inconvenientes son:

 Inestabilidad del reactivo: las preparaciones comerciales mantienen separados el cianuro del ferricianuro y la mezclan en el momento de preparar el reactivo de trabajo, que dura 6 meses (el cianuro es oxidado por el ferricianuro a cianato reduciéndose a su vez a ferrocianuro).

 El uso de sales de cianuro, pero las concentraciones usadas son mucho menor a la dosis letal para una persona de 70 kg.

Fundamento del método: la sangre se diluye con una solución de ferricianuro de potasio y cianuro de potasio (CNK). El primero oxida las Hb (excepto la SHb) a metahemoglobina o hemiglobina (Hi, el Fe++ pasa a Fe+++) que a su vez reacciona con el CNK para dar el cianuro de hemiglobina o cianmetahemoglobina (CNHi), pigmento estable, que se lee a 540 nm.

Hemoglobina + ferricianuro de K → metahemoglobina (Hi) Hi + cianuro de K → cianmetahemoglobina (HiCN)

pigmento estable que se lee a 540 nm

Muestra: sangre capilar o venosa recogida con anticoagulante (K2EDTA).

Conservación de la muestra: a 4°C (2°-10°C) en refrigerador es estable varios días. Es importante llevar a temperatura ambiente en el momento de la prueba.

No se debe congelar.

Reactivo: se lo debe conservar al abrigo de la luz, dura 6 meses. No se debe congelar.

Interferencias y causas de error: proteínas plasmáticas anormales, hiperlipemias, grandes leucocitosis, éxtasis prolongado en las extracciones de sangre venosa, exceso de presión en muestras capilares, errores de pipeteo o dilución, exposición de reactivos y muestras a la luz.

Técnica

Blanco Estándar Desconocido Reactivo de Hb 5 mL 5 mL 5 mL HO2 dest 20 μL

Estándar de Hb 20 μL

Muestra 20 μL

Mezclar los tubos y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm, llevando el aparato a 0 con HO2 destilada. El color es estable por 24 hs.

Cálculo de los resultados:

Hemoglobina g/L = Absorbancia x factor factor = Estándar g/L Absorbancia

Estándar g/L: contenido de Hb correspondiente al lote en uso.

El uso del cianuro de potasio se ha considerado como un riesgo potencial; por eso, se han propuesto reactivos alternativos inocuos como la azida sódica y el lauril sulfato sódico, que convierten la hemoglobina en azidahemoglobina y en sulfato de hemoglobina respectivamente. Se utilizan en algunos sistemas automatizados, pero no hay patrones estables disponibles y son también sustancias tóxicas que deben manejarse con cuidado.

VALORES DE REFERENCIA: dependen de la edad, sexo, altitud sobre nivel del mar, régimen alimenticio y otros factores individuales. A 2.000 metros puede aumentar 10 g/L, a 3.000 metros 20 g/L, dependiendo siempre de la duración y continuidad del grado de hipoxia. También está relacionado con el ejercicio físico, con el que puede aumentar hasta un 15 g/L. En el embarazo puede disminuir por la hemodilución.

EDAD HEMOGLOBINA

(g/L)

sangre de cordón 1 - 3 días

1 semana 2 meses 6 meses 1 año 5 años

137 - 201 145 - 225 125 - 205 110 - 140 100 - 150 90 - 146 100 - 155

8 - 13 años 107 - 155

adultos mujeres varones

120 - 160 140 - 180

HEMATOCRITO

Resulta de la relación entre el volumen de eritrocitos y el volumen de sangre total.

Existen los métodos manuales donde este volumen se obtiene centrifugando la sangre en determinadas condiciones y en tubos especiales, como veremos más adelante, y los métodos electrónicos donde se obtiene por cálculo. Los primeros se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total anticoagulada se somete a la acción de una fuerza centrífuga.

 Método por centrifugación

Muestra: sangre entera obtenida con anticoagulante K2EDTA.

Microhematocrito: Se utilizan tubos capilares (microhematocrito) de 7 cm de largo y 1 mm de diámetro que vienen con anticoagulante (heparina 1-2 UI/tubo, marca roja), con los que se puede trabajar directamente con sangre capilar, y tubos sin anticoagulante (marca azul). Se llenan por atracción capilar hasta no menos de 2 cm del otro extremo y se cierran a la llama. Se colocan en la centrífuga especial para microhematocrito, que produce campos de 8.000 a 12.000 rpm lo que reduce el tiempo de centrifugación a 5 minutos. Cuando el hematocrito (Hto) es mayor de 0,5 puede ser necesario centrifugar durante otros 5 minutos. Los tubos no están graduados, se emplea un ábaco o lector de Hto; se regula el 0 con el comienzo de la columna de GR y el 100% con el nivel superior del plasma. Si no disponemos del ábaco podemos usar una regla milimetrada y una lupa (Figura Nº2). Constituye el método de referencia si se realiza en las condiciones recomendadas por el ICSH.

 Métodos electrónicos

Con los instrumentos automatizados la derivación del recuento de glóbulos rojos (GR), Hto y volumen corpuscular medio (VCM) están estrechamente relacionados.

El pasaje de una célula a través de la apertura de un contador de impedancia o a través del rayo de luz en los instrumentos de dispersión lumínica, genera un pulso eléctrico cuya altura es proporcional al volumen celular. El número de pulsos generado determina el recuento de GR. El análisis de la altura del pulso permite la determinación del VCM o del Hto. Si se computa el promedio de la altura del pulso, este indica el VCM y el Hto puede ser derivado multiplicando el VCM estimado por el recuento de GR. Similarmente, si las alturas de los pulsos son sumadas, esta figura indica el Hto y el VCM se calcula, en cambio, por división del Hto en el número de GR.

Cuando el Hto se obtiene por cálculo presenta una diferencia de 1 o 2 unidades menos (1,5%-3% menor que el valor del microhematocrito centrifugado). Algunos autores lo denominan Hto real, porque no existe el factor de dilución del plasma atrapado entre los GR.

Causas de error en la determinación del Hto:

 La muestra con EDTA se puede conservar hasta 24 hs a 4ºC, si la dejamos a temperatura ambiente los GR se hinchan y entre las 6 hs y 24 hs el Hto aumenta.

 Se recomienda el uso del K2-EDTA, porque el K3-EDTA produce la contracción de los eritrocitos, reduciendo el Hto en cerca de un 2%.

 Relación sangre/anticoagulante incorrecta. Un exceso de EDTA produce contracción celular y por lo tanto disminuye el Hto.

 Extracción defectuosa de la muestra (hemoconcentración, hemodilución, hemólisis).

 Homogenización defectuosa de la sangre antes de llenar los tubos.

 Fuerza centrífuga inadecuada o temperatura de centrifugación excesiva (mayor de 40ºC).

 Existencia de alteraciones electrolíticas o proteicas del plasma, leucocitosis intensa o alteraciones del equipo electrónico.

 Variaciones inherentes el material de vidrio (variaciones en los diámetros interiores de los tubos).

FIGURA Nº2: Ábaco utilizado en la lectura del microhematocrito

VALORES DE REFERENCIA DEL HEMATOCRITO

EDAD HEMATOCRITO(L/L)

Sangre de cordón 0,46- 0,60

1-3 días 1 semana 2 meses 6 meses 1 año 5 años 8-13 años

0,48 -0,68 0,44- 0,60 0,31 -0,45 0,31 -0,41 0,30 -0,40 0,32 -0,42 0,34 -0,44

Adultos mujeres varones

0,37 -0,47 0,42 -0,52

VALORES DE REFERENCIA DE ERITROCITOS

EDAD

ERITROCITOS ( x10¹² / L ) RANGO MEDIA Sangre de cordón 4,2-6,1 5,2 1-3 días 4,7-7,0 5,6 1 semana 4,4-6,0 5,2 2 meses 3,8-5,8 4,5 6 meses 3,9-5,3 4,6 1 año 4,0-5,5 4,6 2 - 5 años 3,9-5,3 4,6 6 -12 años 3,8-5,4 4,8 Adultos

-Mujeres -Hombres

4,0-5,2 4,6 4,6-6,0 5,2

INDICES HEMATIMETRICOS

Los índices hematimétricos son valores absolutos que resultan de la relación entre el número de GR, el Hto y la concentración de Hb. Son útiles en la clasificación morfológica de las anemias, en su diagnóstico y tratamiento.

Volumen corpuscular medio (VCM): es el volumen medio de cada GR expresado en femtolitros. (1fL = 10^-15 litros)

VCM = Hematocrito(L/L) / N° de GR (x10¹²/L)

Ejemplo: Si el Hto es 0,45, quiere decir que 1 L de sangre posee 0,45 L de eritrocitos. Si el recuento de GR es de 5 x 10/L, el volumen ocupado por cada uno de ellos será:

VCM = 0,45L/L = 90 x 10^-15 L = 90 fL 5 x 10 ¹²/L

Si el VCM es menor o igual a 80 fL se considera microcitosis, si el VCM es mayor o igual a 100 fL macrocitosis y mayores a 110 fL se considera megalocitosis; si está comprendido entre 82 y 95 la población es normocítica.

Hemoglobina corpuscular media (HCM): es la Hb contenida en cada GR expresada en picogramos (1 pg = 10^-12 gramos)

HCM = Hemoglobina (g/L) / N° de GR (x10¹²/L)

Ejemplo: Si la muestra contiene 150 g/L de Hb y 5 x 10¹²/L de GR, la hemoglobina de cada GR será:

HCM = 150g/L = 30 x 10^-12 g = 30 pg 5 x 10¹² /L

Se hablará de hipocromía y normocromía cuando el valor de la HCM sea subnormal o normal, respectivamente.

Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM): es la concentración media de Hb por cada L de eritrocitos (sin considerar el plasma, no confundir con L de sangre)

CCMH = Hemoglobina (g/L) / Hematocrito (L/L)

Ejemplo: Si la concentración de Hb es 150 g/L y el Hto es 0,45 L/L, la CHCM será:

CHCM = 150 g/L = 333 g/L 0,45 L/L

VALORES DE REFERENCIA DE LOS ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS SEGÚN LA EDAD

EDAD VCM HCM CHCM

Recién nacido 95-125 fL 30-42 pg 300-400 g/L 1 semana 95-115 fL 30-42 pg 300-340 g/L 1-2 meses 83-107 fL 27-37 pg 310-360 g/L 1-7 años 76-92 fL 23-31 pg 320-360 g/L 8-13 años 80-94 fL 27-32 pg 320-360 g/L adultos 80-95 fL 27-32 pg 320-360 g/L

En las técnicas manuales los índices son calculados, en el recuento automático se miden simultáneamente con el recuento de hematíes.

La CHCM es la constante globular más confiable cuando se usa método manual, por que relaciona dos determinaciones precisas, la Hb y el Hto. Disminuye en las anemias microcíticas hipocrómicas y es normal en las macrocíticas. La CHCM es independiente del tamaño de los GR, en la esferocitosis por ejemplo está

aumentada pues los GR pierden superficie para un mismo volumen, sin un descenso proporcional de Hb. En las anemias megaloblásticas es normal, lo que aumenta en este caso es la HCM.

Amplitud de Distribución Eritrocitaria (ADE) (en inglés, Red blood cell Distribution Width, RDW): el contador hematológico realiza una curva de distribución del tamaño (VCM) de los GR (histograma), donde grafica en las abscisas el VCM medido en femtolitros (fL) y en las ordenadas la frecuencia relativa de los volúmenes, expresada en porcentaje (%). Es un índice de anisocitosis, ya que mide la variación de volumen celular.

Se puede expresar como coeficiente de variación (ADE-CV ó RDW-CV) ó como desvío estándar (ADE-DE ó RDW-DE).

-El ADE-CV se calcula directamente a partir del histograma como el coeficiente de variación (CV) de la distribución del volumen eritrocitario, con valores de referencia de 11,5-14,8 % (Figura N°3).

ADE-CV ó RDW-CV = DE x 100 DE: desviación estándar

VCM

FIGURA Nº 3: ADE-CV o RDW-CV en el histograma de GR

-El ADE-DE ó RDW-SD es el ancho de la distribución de aritmética de eritrocitos medida en el 20% de la altura de la curva eritrocitaria, informado en fL con un intervalo de referencia de 37-54 fL (Figura Nº4).

FIGURA Nº 4: ADE-CV o RDW-CV y ADE-DE o RDW-SD en el histograma de GR

ADE expresado como CV tiene cierto valor para distinguir entre la deficiencia de hierro (ADE usualmente aumentado) y el rasgo talasémico (ADE usualmente normal); y entre la anemia megaloblástica (ADE frecuentemente aumentado) y otras causas de macrocitosis (ADE más frecuentemente normal).

MORFOLOGÍA ERITROCITARIA

La observación microscópica de un extendido de sangre bien realizado y teñido es imprescindible en el estudio etiológico de toda anemia. En ciertas anemias constituye un procedimiento de muchísimo valor diagnóstico (esferocitosis hereditaria, eliptocitocis congénita, anemia hemolítica microangiopática o mecánica). Ante una anemia de origen desconocido, resulta útil valorar la intensidad de la policromatofilia (índice de reticulocitosis), anisopoiquilocitosis con dacriocitos y presencia de algunos eritroblastos (metaplasia mieloide), punteado basófilo (saturnismo, talasemia), y anillos de Cabot y cuerpos de Howel-Jolly (diseritropoyesis, postesplenectomía).

Las alteraciones morfológicas eritrocitarias se clasifican en 4 grupos:

 Alteraciones del tamaño

 Alteraciones del color

 Alteraciones de la forma

 Presencia de inclusiones

VARIACIONES DE TAMAÑO DE LOS ERITROCITOS

El diámetro promedio de un GR es de 7,5 μm, y el espesor de 2 μm en los bordes y 1,2 μm en el centro. Las diferencias de tamaño se perciben directamente en el frotis con una observación atenta del diámetro de los eritrocitos en el mismo.

Como guía, el tamaño de un GR normal (GR normocítico) parece ser el mismo que el del núcleo de un linfocito pequeño en el extendido.

Actualmente las variaciones del tamaño se basan en los datos cuantitativos de VCM, obtenidos en el contador hematológico. Los términos utilizados en su informe son:

Anisocitosis: hay una variación del tamaño de los GR, que se traduce en el extendido por la coexistencia simultánea de eritrocitos de diámetros desiguales.

En el contador hematológico se indica por un aumento de ADE.

Microcitos: hay una disminución del volumen. Se observan en las anemias ferropénicas, en las talasemias y en la anemia de trastornos crónicos. VCM< 80 fL

Macrocitos: hay un aumento de volumen, persiste la zona clara central. Se observan en hepatopatías y alcoholismo. VCM 100 fL a 109 fL.

Megalocitos: hay un aumento de volumen, son ovalados, sin zona clara central.

Se observan en las anemias megaloblásticas. VCM> 110 fL.

VARIACIONES EN LA COLORACION DE LOS GLOBULOS ROJOS

Los hematíes normales presentan un color rosado más intenso en los bordes que en el centro, poniendo de relieve la distribución y el contenido de Hb. En general las variaciones del color se deben a trastornos en el contenido de hemoglobina.

Los términos utilizados para su descripción son:

Normocromos: hematíes con tinción normal, centro más claro que la periferia.

Hipocromos: es consecuencia de la disminución del contenido de Hb, con la coloración convencional, se tiñen débilmente, la parte central aparece más grande y más pálida. La HCM y CHCM están generalmente disminuidas, se ven en anemias ferropénicas (defecto en la síntesis del Hemo por déficit de Fe) y en las talasemias (defecto en la síntesis de globina)

Hipercromos (seudohipercromía): los GR pierden su palidez central y se tiñen más profundamente (esferocitos y megalocitos).

Isocromia: coloración uniforme, todo el extendido presenta el mismo aspecto.

Anisocromia (o doble población): presencia de células normocromas e hipocromas en la misma extensión de sangre (luego de transfusiones o de tratamiento con Fe).

Discromía: distribución irregular de la Hb en el eritrocito (leptocitos, células en diana o target cells).

Policromatofilia: tinción gris azulada en eritrocitos de mayor tamaño y sin la palidez central. Esto se debe a la presencia de RNA residual, lo que indica células jóvenes. Con la coloración vital de azul brillante de cresilo se pone en evidencia la existencia de reticulocitos (Anemias regenerativas: anemias hemolíticas y hemorrágicas agudas).

VARIACIONES DE LA FORMA DE LOS ERITROCITOS

Un examen minucioso del extendido sanguíneo sigue siendo el mejor método para estudiar la morfología del GR. La forma normal y necesaria para sus funciones es la de disco bicóncavo; éste puede adoptar otras formas ya sea por alteraciones de la composición de la membrana, de la Hb, del medio ambiente, etc. La variación de la forma del eritrocito se denomina poiquilocitosis (Figura N°6).

Estos cambios de forma se pueden producir:

a) por un defecto en la eritropoyesis, hereditario o adquirido: diseritropoyesis b) por un defecto en el eritrocito, hereditario o adquirido: eritropatía.

Entre las alteraciones de las formas mas frecuentes podemos citar:

Esferocito: eritrocito esférico sin palidez central, hay una disminución de la superficie manteniendo el volumen (aquí el defecto se presenta en el citoesqueleto del GR). Conservan el VCM y la HCM, la CHCM está aumentada.

Se presentan en la Esferocitosis hereditaria, o en procesos en que hubo lesión

celular de origen físico o químico, y en la anemia hemolítica del recién nacido por incompatibilidad ABO.

Codocitos (dianocitos o target cells): estas células tienen un exceso de membrana, es decir hay ganancia de superficie con respecto al volumen, y en la región central aparece un área con mayor contenido de Hb. Se observan en las hemoglobinopatías (talasemias, hemoglobinopatía C), anemias ferropénicas y en ciertas hepatopatías, que cursan con aumento de colesterol y fosfolípidos de membrana del eritrocito.

Acantocitos: son eritrocitos esferoidales con prominencias superficiales alargadas, de distribución irregular, también presentan exceso de membrana, es decir hay un aumento en la relación Sup/Vol. Esto ocurre en casos de deficiencia de la enzima lecitin colesterol acil transferasa (LCAT), que al no esterificar el colesterol, éste no puede salir y se acumula. En el extendido se observan acantocitos en la Acantocitosis hereditaria, en la insuficiencia hepatocelular grave, y también en la post esplenectomía, ya que al no existir el bazo no se remueven los pedazos de membranas excedentes.

Estomatocitos: eritrocitos que en su región clara central posee una hendidura en forma de boca. En el frotis se observan en la enfermedad conocida como Estomatocitosis congénita, que cursa con una alteración de la bomba Na/K (con aumento de entrada de agua, que produce un aumento en el volumen del eritrocito). También se observan en cirrosis y en alcoholismo, y en algunas eritroenzimopatías.

Equinocitos (crenocitos o glóbulos rojos espiculados): son eritrocitos cuya superficie se encuentra repleta de prominencias superficiales cortas, distribuidas regularmente. Se observan como artefactos de la coloración, o por la hiperosmolaridad de la misma; por envejecimiento del GR in vitro, por descenso de ATP. También se pueden presentar debido a un defecto en la membrana (predominio exagerado de los complejos de espectrina polimerizada), a deficiencia de piruvatokinasa y en casos de insuficiencia renal.

Esquizocitos o esquistocitos: son fragmentos celulares de diversas formas (triangulares, alargadas, en casco) y de diámetro muy pequeño. Se producen por daños en la microcirculación (en las microangiopatías), en las anemias hemolíticas de origen mecánico (prótesis valvulares), y en todo proceso en que se produzca un impacto del GR.

Eliptocitos (u ovalocitos): son eritrocitos alargados u ovales, se producen por defectos hereditarios en la composición de la membrana. Se encuentran en la Eliptocitosis hereditaria, aunque pueden observarse de forma adquirida en el curso de una talasemia, en deficiencia de Fe, en anemia megaloblástica y en la mielofibrosis medular. Presentan discromía: hay acúmulo de Hb en las puntas de los GR.

Drepanocitos (o eritrocitos falciformes): su aparición es propia de la presencia de hemoglobina S, que en ausencia de oxígeno, produce una polimerización de la

Hb, que precipita en forma de cristales, dando la forma de célula en forma de hoz o media luna.

Dacriocitos (o célula en lágrima): son eritrocitos en forma de lágrima o raqueta.

Indican sufrimiento medular, se observan en trastornos de la eritropoyesis (anemia ferropénica, megaloblástica, talasemia), y fundamentalmente en la mielofibrosis medular.

Excentrocitos: eritrocitos con distribución anormal de la Hb, esta aparece como desplegada de la parte interna de la membrana y concentrada en uno de los extremos. Suele aparecer en anemias hemolíticas inducidas por agentes oxidantes (medicamentos o sustancias químicas) y en el déficit de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa.

Leptocitos o anulocitos: son hematíes de espesor muy disminuido, que se presentan en la deficiencia severa de hierro o en las talasemias. Los eritrocitos podrían colorearse como anillos de Hb con una gran zona central casi incolora.

Células mordidas (bite cells): son eritrocitos que han perdido una parte de la membrana celular. Varias mordidas acaban produciendo fragmentos de hematíes.

Se observan en la deficiencia de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, donde se produce la formación de cuerpos de Heinz, los que son rápidamente eliminados por el bazo dando lugar a la aparición de las “bite cells”.

INCLUSIONES ERITROCITARIAS

Punteado Basófilo: es la presencia de agregados basófilos abundantes que varían desde puntos hasta gránulos, que con la coloración convencional se colorean de azul oscuro. Se debe a la precipitación de RNA persistente en los eritrocitos. Se trata de una patología madurativa. Se observan cuando existe un defecto en la degradación del ARN (déficit de pirimidina-5-nucleotidasa eritrocitaria). En el saturnismo (intoxicación con plomo) existe un déficit adquirido de esta enzima, que puede ser la causa del punteado basófilo. También se ve en las diseritropoyesis, anemias megaloblásticas y talasemias.

Cuerpos de Howell Jolly: gránulos azurófilos de ADN residual, son lisos y redondeados, desde pequeños a grandes. Se observan en las anemias megaloblásticas, como signo periférico de eritropoyesis ineficaz.

Anillos de Cabot: estructuras en forma de anillo, ocho o asa formadas por restos de los microtúbulos del huso acromático, que quedan luego de una mitosis anormal. Se observan en anemias por trastornos de la eritropoyesis.

Siderocitos: presencia de granulaciones de Fe inorgánico, hay un trastorno en la síntesis de la Hb pero no por déficit de Fe, sino por una alteración en la síntesis del grupo Hemo. Se encuentran en la Anemia sideroblástica. Se observan usando la coloración de Perls.

Eritrocitos nucleados: son eritroblastos circulantes y su presencia constituye un signo de intensa regeneración eritroblástica, se observan en anemias hemolíticas agudas.

Granulaciones por parásitos: la parasitosis intraeritrocitaria mas característica es el paludismo o malaria, en la que durante los procesos febriles pueden observarse a los parásitos, en las formas anulares con un pequeño núcleo central.

También pueden encontrarse las babesias en forma intraeritrocitaria.

Otras inclusiones: la Hb desnaturalizada precipita dentro del GR. Puede aparecer como un cuerpo único de inclusión adherido a la membrana eritrocitaria, en este caso toma el nombre de Cuerpos de Heinz, típicos de las Hb inestables y del déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenada; o como inclusiones múltiples redondas y pequeñas azul-verdosas, distribuidas por todo el citoplasma, éstas se pueden observar típicamente en las alfa talasemias, representan la hemoglobina H (tetrámero de cadenas de globinas beta β4), también se los denomina eritrocitos en forma de pelota de golf. Ambas inclusiones se observan con coloraciones supravitales como el azul brillante de cresilo.

FIGURA N°6: Variaciones de color, tamaño y forma del GR e inclusiones eritrocitarias

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

La VSG es equivalente a la longitud del recorrido descendente de los glóbulos rojos (desde la parte superior del tubo o pipeta) en un intervalo de tiempo.

La VSG forma parte de las pruebas de respuesta de la fase aguda y de la fase activa de las afecciones crónicas junto a la Proteína C reactiva, fibrinógeno y viscosidad del plasma.

La velocidad de caída se halla influenciada por una serie de factores que interaccionan. Básicamente depende de la diferencia de gravedad específica entre los hematíes y el plasma, y la capacidad de los hematíes para formar rouleaux (pila de moneda), que sedimentan más rápido que los hematíes solos.

La formación de rouleaux está controlada principalmente por la concentración de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda.

Por lo tanto, la VSG está influenciada tanto por factores plasmáticos como eritrocitarios, siendo los primeros más importantes.

*Factores plasmáticos: niveles elevados de fibrinógeno y en menor medida de alfa, beta y gamma globulinas favorecen la aceleración de la VSG. Estas proteínas de asimetría molecular disminuyen la carga negativa de los eritrocitos (potencial Z) que tiende a separarlos, y promueve el apilamiento o formación de pila de moneda que sedimentan más rápido que las células aisladas. La presencia de albúmina disminuye la VSG.

*Factores eritrocitarios: tamaño y forma de los GR, la VSG es directamente proporcional al peso del agregado celular e inversamente proporcional al área superficial. El apilamiento de GR acelera la VSG, pues tenemos unidades de mayor tamaño y peso, pero con superficie disminuida. Los GR de forma anormal dificultan la formación de rouleaux, por lo tanto disminuye la VSG, de la misma forma los microcitos que presentan una menor superficie con relación al volumen.

*Factores técnicos:

1) Anticoagulantes: usamos citrato u oxalato que no alteran el potencial Z, a diferencia de la heparina y el EDTA.

2) Hemólisis o indicios de coagulación: son inadecuados para la prueba.

3) Tiempo de extracción y realización de la prueba: antes de 2hs, pues con el tiempo los GR tienden a adoptar forma esférica con menos posibilidades de formar apilamiento, lo que retrasaría la VSG.

4) Temperatura ambiente: entre 22° y 27°C; menores retardan, mayores aceleran. No exponer a la luz solar.

5) Tubos de eritrosedimentación: se debe eliminar todo indicio de alcohol y éter, también de sangre para evitar aglutinaciones con sangre compatible. Deben estar perfectamente calibrados (entre 2-5 mm), limpios y al llenarlos evitar la formación de burbujas.

6) Verticalidad del tubo, éste no debe estar inclinado, basta una inclinación de 7°

para duplicar un resultado.

FASES DE LA VSG:

1) Período inicial de agregación, aquí los GR se apilan y la sedimentación es lenta. Dura 10 minutos.

2) Período de sedimentación, caída rápida y constante de los GR. Dura 40 minutos.

3) Período final, de apilamiento de GR en el fondo del tubo. Dura 10 minutos.

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LA VSG

 Método de Westergreen: es el más usado y el más exacto. El equipo mínimo necesario consta de pipetas y soporte para pipetas. Las pipetas tienen las siguientes características: 2,5 mm de diámetro, capacidad de 1 mL, y una graduación de 0-200 en mm.

REACTIVO: Citrato de Na al 3,8 % (solución isotónica para realizar dilución de la sangre).

MUESTRA: sangre venosa anticoagulada directamente con el reactivo.

TECNICA: en un tubo con 0,5 ml de anticoagulante, se agrega 2 mL de sangre (dilución 1/5), es decir 1 parte de citrato por 4 de sangre, y se mezcla. Antes de las 2 hs se debe cargar la pipeta hasta la marca 0, se coloca en el soporte en forma vertical, sin espuma, apretada en la base de goma y el extremo superior introducido en el resorte que la sostiene. Se anota el tiempo y se lee los mm que sedimentan los GR al cabo de 1 hora (h).

VALORES DE REFERENCIA: expresado en mm/h Niños: 0-10 Varones: < 50 años 0-15 > 50 años 0-20 Mujeres: < 50 años 0-20 > 50 años 0-30

 Micrométodo de Chattás: es el de elección en bebés y niños, o en pacientes adultos con venas difíciles. El equipo consta de pipetas [diámetro: 1 mm, largo: 13 cm] y soporte para pipetas.

REACTIVO: citrato de Na al 3,8%

MUESTRA: sangre venosa o sangre capilar obtenida por punción del talón o dedo de la mano, con todas las precauciones para favorecer la circulación sanguínea fluida.

TÉCNICA: se carga citrato de Na hasta la letra C, luego se aspira la muestra hasta S, se deposita en un portaobjeto el contenido de la pipeta, se mezcla y se llena hasta 0. Se coloca en el soporte y se lee a los 60 minutos.

Los valores de este método no son análogos a los de Westergren, por lo tanto, para su conversión se recurre a la siguiente tabla:

TABLA DE CONVERSIÓN DEL MÉTODO DE CHATTÁS AL DE WESTERGREEN (deducido del nomograma de Chattás)

Chattás (mm/h) Westergren (mm/h) Chattás (mm/h) Westergren (mm/h)

1 1 21 31

2 2 22 34

3 3 23 38

4 4 24 42

5 5 25 47

6 6 26 53

7 7 27 59

8 8 28 65

9 9 29 71

10 10 30 77

11 12 31 84

12 13 32 95

13 14 33 106

14 16 34 120

15 18 35

Más de 120

16 20 36

17 22 37

18 24 38

19 26 39

20 28 40

 VSG descartable: En la actualidad hay equipos comerciales descartables, que presentan tapones de seguridad para las pipetas, y que permiten que la sangre alcance la marca 0 con exactitud, eliminando el error del llenado manual hasta la marca 0. Además, transforma las pipetas en un sistema cerrado, minimizando la contaminación con las muestras (Figura Nº5).

FIGURA Nº5: Sistema descartable para VSG

 VSG automatizada: Existen en el mercado, nuevos sistemas que consiguen una completa automatización del proceso. Entre los más empleados se destacan: Ves-Matis 60 (Menarini), Sediscan (Becton-Dickinson) y Sedimatic 100 (Ral). Los tres realizan un mezclado automático de la muestra con el anticoagulante y finalizan el proceso a los 30 min de su inicio. Tienen capacidad para 50 a 100 tubos, los volúmenes de muestra oscilan entre 1 y 5 mL, y la expresión de los resultados es en mm/h. Todos ellos permiten además de reducir el tiempo, eliminar la contaminación biológica del personal técnico, disminuir el número de errores y mejorar la reproducibilidad.

El sistema Ves-Matic, es un analizador de mesa, diseñado para determinar la VSG, mediante un sensor optoelectrónico que mide el cambio de opacidad de una columna de sangre a medida que sedimentan los GR. Los tubos se colocan en el aparato, la aceleración de la sedimentación se logra al colocar los tubos en un ángulo de 18º con respecto al eje vertical, y los resultados que se obtienen a los 20 minutos son compatibles con el método de Westergren en 1 h.

SITUACIONES QUE MODIFICAN LA VSG:

A) Aumento de la VSG:

1) Fisiológicas: embarazo, puerperio, crecimiento, envejecimiento, estado del ciclo menstrual, consumo de drogas (anticonceptivos, corticoides)

2) Patológicas: infecciones agudas o crónicas, procesos inflamatorios crónicos (sífilis, TBC, AR, LES), donde se utiliza como índice de progreso de la enfermedad; anemias intensas, presencia de crioaglutininas, enfermedades neoplásicas, infarto de miocardio, insuficiencia renal, gammapatías monoclonales (mieloma, enfermedad de Waldestron)

B) Disminución de la VSG:

1) Policitemia vera

2) Alteraciones congénitas eritrocitarias (poiquilocitosis, esferocitosis, células falciformes)

3) Hipofibrinogenemia

4) Insuficiencia cardíaca congestiva 5) Mecanismo desconocido

GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMATOLOGIA

La garantía de calidad comprende a todas aquellas acciones planificadas y sistemáticas necesarias para proporcionar adecuada confianza de que un producto, proceso o servicio cumple determinados requerimientos para la calidad.

El control de calidad (CC) nos asegura que cada resultado informado por el laboratorio sea válido y confiable. El objetivo del CC es alcanzar precisión y exactitud. Para ello se basa en 4 pilares fundamentales:

1. Control de calidad interno 2. Evaluación externa de calidad 3. Estándares y estandarización 4. Vigilancia de la calidad

Conceptos básicos:

Error aleatorio: error que afecta la reproducibilidad de un método (precisión) Error sistemático: error no aleatorio que afecta la media de una población de datos.

Exactitud: se refiere a la capacidad de un método analítico de obtener el resultado verdadero.

Precisión: se refiere a la reproducibilidad de un resultado, ya sea exacto o inexacto. La inexactitud y la imprecisión ocurren como resultado de estándares y reactivos inadecuados, calibración incorrecta de los instrumentos, o técnica pobre, o el uso de un método que da una reacción incompleta o inespecífica para la prueba.

La precisión puede ser controlada por pruebas replicadas, chequeos de especímenes previamente medidos y evaluación estadística de los resultados.

La exactitud puede ser controlada sólo con el uso de materiales de referencia que han sido ensayados por métodos independientes de precisión conocida.

Un programa de control de calidad incluye el control de calidad interno y una evaluación de calidad externa.

El control de calidad interno está basado en el monitoreo de las pruebas hematológicas que se realizan en el laboratorio. Incluye medidas de materiales especialmente preparados y medidas repetidas de los especímenes de rutina, también como análisis estadísticos, día a día, de los datos obtenidos. Este control chequea la precisión o reproducibilidad pero no necesariamente la exactitud.

La evaluación externa de calidad es la evaluación objetiva de una agencia externa del desempeño de un número de laboratorios sobre un material que es suministrado especialmente para este propósito. Usualmente es organizado por entidades nacionales o regionales. El objetivo es equiparar los resultados, pero nuevamente no necesariamente se logra exactitud a menos que los especímenes hayan sido ensayados por un laboratorio de referencia, usando métodos de precisión conocida, con una preparación de referencia de valor conocido.

Un material estándar o preparación de referencia se define como un material o sustancia con una o más características lo suficientemente homogéneas y perfectamente establecidas. Es usado para calibrar instrumentos analíticos y para asignar un valor cuantitativo a los calibradores.

Un material de control se define como una sustancia usada de forma rutinaria en el laboratorio para monitorear el desempeño de un proceso analítico.

Un método de referencia es una técnica exactamente definida la cual provee suficiente seguridad y datos precisos para ser usado en la evaluación de la validez de otros métodos. Las principales autoridades internacionales sobre los estándares en hematología es la Organización Mundial de la Salud y el International Council for Standartization in Haematology (ICSH).

CONTROL DE CALIDAD INTERNO (CCI)

El CCI es el conjunto de procesos que proveen una vigilancia continua de los procedimientos analíticos que se llevan a cabo en el laboratorio y de la evaluación de los resultados, con el objeto de decidir si son lo suficientemente confiables para ser emitidos. Incluye:

1. Medición de materiales de control

2. Mediciones repetidas sobre muestras de pacientes

3. Análisis estadístico, día a día, de los datos obtenidos en las pruebas de rutina 1) Análisis de material comercial preservado: son provistos por los fabricantes y se usan tres niveles de control diferentes: bajo, medio y alto. Se analizan por lo menos una vez al día. Al principio se trabaja con los valores provistos por el fabricante, y luego de un número de determinaciones que permitan aplicar métodos estadísticos, se obtienen los valores de dispersión de los materiales de control, medidos en el propio aparato. Es conveniente hacer gráficos de control para visualizar las tendencias. Estos materiales tienen sus inconvenientes:

 Son estables por sólo 30-90 días

 Son específicos para cada tecnología empleada

 Son costosos

2) Exámenes repetidos de muestras conservadas de los pacientes: los resultados deben haber sido obtenidos con la certeza que el sistema estaba bajo control. Tienen la ventaja de que se utiliza sangre fresca y el uso de dicho material aporta información sobre la imprecisión pero no sobre la exactitud. Sirven como controles en el mismo día, aunque algunos extienden su uso hasta 24 horas. Tienen como desventaja la falta de estabilidad de algunos parámetros como el VCM, el recuento total y diferencial de leucocitos y el recuento de plaquetas. La Hb y el recuento de GR son estables durante 24 horas. Este procedimiento sirve para detectar deterioro del aparato y reactivos que podría haberse desarrollado entre las pruebas, si los especímenes fueron bien conservados durante el almacenamiento.

3) Análisis estadístico: al correr los controles, si todos los valores directamente medidos se encuentran dentro de las 2 DE de la media, es factible que el análisis esté bajo control. Si cualquier resultado de control se encuentra a más de 3 DE de la media tomar acciones correctivas. Si 2 de 3 resultados de control están a más de 2 DE de la media, tomar acciones correctivas.

En los laboratorios que usan métodos manuales se usa la CHCM, para el CCI. Se establecen las medias diarias de 11 días de trabajo consecutivos de trabajo y se determina la DE. Luego la media de CHCM se calcula al final de cada día. Si no varía en más de 2 DE se considera que el resultado es satisfactorio, ya que no hay un error simultáneo en la misma dirección en hemoglobina y hematocrito.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO (CCE)

A pesar de tener implementado un programa de control de calidad interno hay errores que sólo pueden ser detectados con una evaluación externa. Centros regionales o nacionales envían el mismo material a un gran número de laboratorios. Luego todos los laboratorios envían sus resultados al centro donde serán analizados e interpretados.

Con los resultados enviados se calcula la media y la DE. Un laboratorio individual puede comparar su desempeño en la encuesta con los otros laboratorios que usan analizadores iguales o similares.

Los datos del CCE pueden emplearse para:

1) Establecer el error sistemático característico de un método

2) Establecer una clasificación de los métodos existentes en función de su nivel de calidad

3) Escoger un método entre varios o descartar un método por su nivel de calidad 4) Averiguar cuáles son los métodos más utilizados

5) En relación a la evaluación del laboratorio participante, permite el análisis continuo y a largo plazo del error sistemático de las mediciones

BIBLIOGRAFÍA

 Diagnóstico citológico de las hemopatías. Grignaschi. Ed. Médica Panamericana. 1991.

 Diagnóstico y tratamiento clínico. John Bernard Henry. 9ª edición. Ed. Masson.

1993

 Dacie y Lewis Hematología Práctica. S. M. Lewis, B. Bain, I. Bates. 10^a edición. Churchill y Livingstone. 2008.

 Manual de técnicas de laboratorio en hematología. Vives J y Aguilar J. 2ª edición. Ed. Masson. 2006.

 Hematología. Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Rodak B. 2ª edición. Ed.

Médica Panamericana. 2005.

 Fundamentos de Hematología. G.J. Ruiz Argüelles. 4ª edición. Ed. Médica Panamericana. 2009

 Informe automatización del hemograma: Entre la ayuda, la confusión y la controversia. Carbía C, Fink N y Lazarowski A. XIX Congreso de Hematología.

2009