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Proyecto realizado en:
Laboratorio de Metabolismo del RNA de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, bajo la dirección de la Dra. Catalina Arenas Huertero
Con financiamiento de:
▪ Fronteras de la Ciencia CONACyT, convenio 2016-01-1538 ▪ Fondo de Apoyo a la Investigación (FAI) – 2018: C18-FAI-0504.04
▪ Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) Beca-Tesis (CVU/Becario 886748/706021)
“El programa de Maestría o Doctorado en Ciencias en Bioprocesos de la Universidad Autónoma de SN Luis Potosí, perteneces al Programa Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC) del CONACyT, registro 000588 (Maestría) 000590 (Doctorado) en el
Nivel Maestría (Consolidado), Doctorado (En Desarrollo). Número de registro de la beca otorgada por CONACyT: 706021”
Agradecimientos académicos
Principalmente quisiera agradecer a la Dra. Catalina Arenas, por permitirme descubrir el mundo de los RNAs no codificantes y la oportunidad de poder trabajar en esta línea. Por ser la primera persona en confiar en mí y ser un ejemplo como una gran profesora a lo largo de la carrera, como asesora en mi tesis de licenciatura y ahora, de maestría y, sobre todo, como una gran persona y ser humano que siempre tendrá un lugar especial en mi corazón.
A la Dra. Margarita Rodríguez y Dominguez Kessler, por todas sus enseñanzas durante la carrera, por enseñarme el significado de dedicación y trabajo duro y por permitirme ser también parte de su vida y compartir momentos tan agradables en estos años.
Al Dr. J. Sergio Casa Flores, por siempre presentarme nuevos retos, nuevas formas de aprender y mejorar como estudiante, bióloga e investigadora. Por ser una inspiración y un modelo a seguir.
A Jaime Aportela, por ser un excelente maestro, mentor y amigo. Por siempre tener tiempo, paciencia y gusto en guiarme y compartir sus experiencias, tips y métodos y dejarme aprender tanto del laboratorio y de la vida.
A Daniel Aportela, excelente técnico y amigo, quien siempre ha estado presente en este camino y ser parte de la familia del laboratorio.
Agradecimientos personales
Las palabras resultan ser insuficientes cuando se trata de agradecer a todas las personas que dejan marca en tu corazón; por eso, principalmente agradezco a Dios, por haberme colocado en una carrera tan maravillosa como prueba de su infinita generosidad y amor por mí.
A mis padres, ¿cómo agradecerles su amor, paciencia y apoyo? Por ser los grandes héroes de mi vida y mi mayor ejemplo a seguir, mi guía y mi refugio.
A mi querido hermano, por ser una persona tan imperfectamente perfecta que me ha enseñado tanto desde que tengo memoria, por su cariño único y darme uno de los motores de mi vida: mi sobrino Gabriel.
A mi abuelo Gabriel, dedico esto con todo mi amor hasta el cielo, agradeciéndole todas sus historias, por siempre creer en mí y quererme de una forma tan bella.
Mil gracias a mis chicas adoradas, Paola y Sandra, por tantos años de amistad, por tantas risas, tantas lágrimas y aventuras juntas; que, si bien, no siempre entendían lo que hacía, jamás se cansaron de escucharme y apoyarme. Gracias por darme una sobrina más, a la preciosa Valentina.
A las personas que sé que ahora y siempre serán un gran tesoro para mí; más que unos compañeros, mi segunda familia. Suchi, Lauraceae, Polito y Chuyencio, que ya desde hace 8 años hemos compartido miles de experiencias, risas (MUCHAS RISAS), buenos y malos momentos. Nacho, Emmanuel y Byanka, por ser grandes ejemplos de diciplina, constancia y profunda generosidad. Karla, Saideth, Misael, Chuy, Paulina, Capuchino, Suric y Carla, próximos grandes biólogos que se quedan en mi corazón de por vida.
A Richie, Lalo, Cynthia, Elí y Liliana, por formar parte de esta familia y compartir tantos momentos de bromas y alegrías.
Finalmente, un agradecimiento especial al cometa más brillante que ilumina mi planeta y no me permite rendirme; con todo mi cariño.
ÍNDICE
I. Introducción ... 10
I.I Mecanismos epigenéticos de regulación de los genes ... 13
I.I.I Metilación del DNA ... 13
I.I.II Modificación de histonas. ... 14
I.I.III. RNAs no codificantes (ncRNAs): Reguladores potenciales de la expresión génica. ... 18
I.II. La respuesta al estrés abiótico en plantas ... 24
I.II.I. Estrés por deficiencia hídrica (sequía) ... 25
I.II.II. Estrés por salinidad ... 26
I.III. Mecanismos de respuesta de las plantas al estrés ... 27
I.III.I. ABA como un regulador clave en condiciones de déficit hídrico. ... 28
I.III.II. ABI5: El regulador crucial del proceso de germinación de semillas. ... 29
II. Antecedentes ... 31
II.I. PLncDB: La base de datos de los RNAs no codificantes. ... 31
II.I.I. Los RNAs largos no codificantes intergénicos (lincRNA: Características y función ... 32
II.II. ABI5-BINDING PROTEIN 1 (AFP1) regula la respuesta al estrés en la germinación de semillas de Arabidopsis. ... 34
II.III NTF2 media el importe de la proteína Ran convirtiéndose en un auxiliar en el tráfico nucleocitoplasmático. ... 37 III. Justificación ... 39 IV. Hipótesis ... 40 V. Objetivos ... 40 V.I. General: ... 40 V.II. Específicos:... 40
VI. Materiales y métodos ... 41
VI.I. Material Vegetal ... 41
VI.I.I Modelo Biológico: Arabidopsis thaliana ... 41
V.I.II. Condiciones de Crecimiento ... 42
VI.II. Análisis moleculares ... 43
VI.II.I. Estandarización de las condiciones de amplificación por PCR punto final. ... 43
VI.II.II. Extracción de RNA ... 43
VI.II.IV. Cuantificación de la expresión génica mediante PCR en tiempo real
(RT-qPCR) ... 45
VI.II.V. Oligonucleótidos ... 46
VI.III. Análisis fenotípicos ... 46
VI.III.I. Ensayo de germinación ... 46
VI.III.II. Análisis de crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana ... 47
VI.IV Localización celular ... 47
VII. Resultados y Discusión ... 49
VII.I. Caracterización de las líneas de inserción ... 49
VII.II. Caracterización fenotípica de las líneas transgénicas de LINCAFP. ... 49
VII.II.I. El RNA intergénico no codificante LINCAFP participa en el proceso de germinación en exposición exógena de ABA. ... 49
VI.II.II. LINCAFP afecta el crecimiento de las plántulas en presencia de ABA. ... 52
VII.III. Caracterización genotípica de las líneas transgénicas de LINCAFP. ... 55
VII.III.I. LINCAFP regula de manera positiva a sus genes aledaños ... 55
VII.III.II. Efectos río abajo de la regulación positiva de AFP1 mediada por LINCAFP.58 VII.IV. Localización celular de LINCAFP ... 60
VIII. Conclusiones ... 63
IX. Perspectivas ... 65
Resumen
Los RNAs no codificantes (ncRNAs) han surgido como productos del transcriptoma eucarionte con importancia en procesos de regulación, participando en múltiples procesos biológicos desde etapas tempranas del desarrollo hasta la senescencia de un organismo. En el caso de las plantas, se expresan a menores niveles que los genes que codifican a proteínas y exhiben patrones de expresión tejido-específico y sensibles al estrés, es por ello que se ha potenciado su estudio para elucidación de su papel en la defensa contra estrés de tipo biótico y abiótico. El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona que se acumula durante la embriogénesis de las plantas, así como en las condiciones ambientales no favorables; juega un papel vital en la inhibición de la germinación de semillas y en establecimiento de plántulas post-germinadas. En la vía de señalización de ABA, el factor de transcripción ABI5 tiene participa dentro de la germinación de semillas, ya que estimula el estado de latencia en las semillas, inhibiendo la germinación hasta encontrar condiciones óptimas. La proteína de ABI5, se localiza en cuerpos nucleares junto con AFP1 (ABI FIVE-BINDING PORTEIN 1) y, esta, tiene la capacidad de atenuar las señales de ABA al inducir la degradación de ABI5 vía proteosoma 26S. Recientemente, se identificó un lncRNA intergénico dentro del locus de AFP1, denominado así, LINCAFP que, se expresa en condiciones de estrés abiótico, sin embargo, su función es desconocida. En este estudio, mostramos que la sobreexpresión y deficiencia de LINCAFP, aumenta y disminuye la expresión de sus genes aledaños (AFP1 y NTF2). Además, las plantas con una deficiencia de este gen mostraron un fenotipo hipersensible con un retraso en la germinación bajo los tratamientos de ABA. Nuestros resultados sugieren que, LINCAFP actúa como un regulador positivo de la expresión de AFP1 y, por lo tanto, estimula la tolerancia al estrés por ABA.
Abstract
Noncoding RNAs (ncRNAs) have emerged as major products of the eukaryotic transcriptome with regulatory importance. In Arabidopsis, lncRNAs are expressed at lower levels than protein-coding genes, but exhibit tissue-specific and stress-responsive expression patterns, therefore, the effort in the characterization of its functions has grown, focused on the elucidation of its participation in the mechanisms developed by the plants, to combat environmental stresses. The phytohormone abscisic acid (ABA) plays a vital role in inhibiting seed germination and in postgermination seedling establishment. In the ABA signaling pathway, ABI5, a basic Leu zipper transcription factor, has important functions in the regulation of seed germination. ABI5 protein localizes in nuclear bodies, along with AFP (ABI Five Binding Protein) and, this protein attenuates ABA signals by targeting ABI5 for ubiquitin-mediated degradation in nuclear bodies. Recently, an intergenic lncRNA has been identified within the AFP1 locus, hence we named as LINCAFP, which it is expressed under abiotic stress conditions; however, its function is unknown. In this study, we show that overexpression and deficiency of LINCAFP, increases and decreases, respectively, the expression of its adjacent genes (AFP1, NTF2). In addition, plants with a deficiency of this gene showed a hypersensitive phenotype with a delay in the germination under the ABA treatments. Meanwhile, the overexpression of the gene result in plants with an insensitive phenotype to ABA treatment. Our results suggest that, LINCAFP acts as a positive regulator of the AFP1 expression and therefore stimulates the tolerance to ABA stress.
I.
Introducción
Durante muchos años, se había descrito la expresión génica de acuerdo al estudio del “dogma central” de la biología molecular, donde el DNA, es la macromolécula encargada de almacenar toda la información genética de un organismo y, donde cabe la replicación de esta y su transmisión a las siguientes generaciones, esto explica bien aquellas características únicas que comparten los organismos, así como entender los cambios fenotípicos y su respuesta al entorno que les rodea, de manera que, el entender la composición y su papel para el proceso de transcripción y traducción, era el principal interés de muchos investigadores. Es decir, la parte crucial para entender cómo es que los genes se expresaban radicaban en el proceso de la síntesis de proteínas.
La epigenética se define como “la rama de la biología que estudia los cambios en la función genética que se transmite de una generación a otra por herencia meiótica o mitótica y que no puede ser explicada por cambios en la secuencia del DNA” (Russo et al., 1996). La epigenética se define mejor como el estudio de los cambios en los organismos provocados por la modificación de la expresión génica, en lugar de la alteración del código genético en forma de DNA y se utiliza para denotar la forma en que los genes interactúan con el medio ambiente, con el fin de producir cada fenotipo individual (Bošković y Rando, 2017).
El concepto ha cambiado desde 1942, donde se acuñó el término por Conrad Hal Waddington y actualmente, la epigenética se ha descrito como la ciencia encargada de estudiar las alteraciones en la expresión de genes que surgen durante el desarrollo y la proliferación celular, por medio de procesos que no cambian la información (secuencia) contenida en el material genético, pero que se llevan a cabo a través de modificaciones específicas relacionadas con la remodelación de la cromatina mediada por modificaciones químicas de las histonas y del DNA. Estos cambios en el DNA pueden ser estables y conservarse a través de divisiones mitóticas y meióticas de las células, es decir, pueden heredarse (Crews y McLachlan, 2006).
El comportamiento de una célula es definido por la expresión de sus proteínas constituyentes en ese momento, las cuales son el resultado de patrones específicos de la expresión de genes. Las células modulan la expresión de los genes bajo ciertos mecanismos, como re-arreglando al DNA con proteínas llamadas histonas, las cuales forman unas estructuras conocidas como nucleosomas. El nucleosoma, es la unidad estructural fundamental de la cromatina y es el primer nivel estructural de la misma (Figura 1). Estudios recientes indican que la expresión genética se regula no sólo por regiones que se encuentran dentro del mismo gen o por factores que permiten su transcripción, sino también por una serie de eventos conocidos como mecanismos epigenéticos que incluyen la modificación de las histonas, la metilación del DNA y la regulación por RNAs no codificantes (Rodenhiser y Mann, 2006).
Es decir, no solo la epigenética tiene un papel primordial en la identidad celular, mediante mecanismos previamente mencionados, también la expresión génica de las células puede ser modulada por factores externos (ambiente), introduciendo el término de la activación o inactivación de los genes; es decir, que las modificaciones epigenéticas influyen en la actividad de los genes (Crews y McLachlan, 2006). Investigaciones en este campo han evidenciado una estrecha relación entre modificaciones epigenéticas y el desarrollo de enfermedades, y es el motivo por el que la investigación básica haya comenzado a trasladarse a la investigación clínica. Hoy se sabe que estos cambios epigenéticos son también susceptibles de ser manipulados, lo que abre un amplio horizonte de posibilidades terapéuticas hoy en día insospechadas.
Por lo anterior, es importante destacar la existencia de varios niveles de regulación de la expresión génica. El más común se da a nivel de la síntesis de ácido ribonucleico (RNA) a partir de DNA (transcripción), aunque también existe una regulación a nivel post-transcripcional (corte y empalme), traduccional (síntesis de proteínas a partir de un RNA mensajero; mRNA) y post-traduccional (modificaciones post-traduccionales). Sin lugar a dudas, la forma de regular la expresión génica que ha revolucionado el modo de interpretar la relación de los genes con el medio
ambiente, está a cargo de los distintos mecanismos epigenéticos, dentro de los cuales se incluyen, la metilación del DNA, las modificaciones post-traduccionales de las histonas y el silenciamiento génico mediado por RNAs no codificantes.
Figura 1. Representación esquemática de las modificaciones epigenéticas y de los cambios reversibles en la organización de la cromatina que determina la expresión de los genes. Dentro de las modificaciones epigenéticas se encuentran la modificación de histonas,
metilación del DNA y la regulación mediada por ncRNAS; estas modificaciones alteran la expresión de los genes sin modificar su secuencia, sino que, alteran su actividad ya sea activando su transcripción o silenciándola. Modificado de Rodenhiser y Mann, 2006.
I.I Mecanismos epigenéticos de regulación de los genes
I.I.I Metilación del DNA
Consiste en la unión covalente de un grupo metilo (-CH3) en la posición 5 del anillo de pirimidina de una citosina. Esta metilación inhibiría la expresión génica de forma directa, desplazando la unión habitual al DNA de los factores activadores de la transcripción y de forma indirecta, atrayendo a unas proteínas de unión a citosinas metiladas que actuarían reprimiendo la transcripción; ambos mecanismos tienden al silenciamiento génico (Fazzari y Greally, 2004; Lister et al., 2009).
La metilación del DNA ocurre en citosinas seguidas por guaninas (dinucleótidos CpG). Algunos dinucleótidos están concentrados en regiones llamadas islas CpG (localizadas muy comúnmente en las regiones promotoras y sin la presencia habitual de 5-metilcitosinas). Otros dinucleótidos CpG –que no forman parte de las islas– son los que generalmente se encuentran metilados (Lister et al., 2009).
En cuanto al cómo se heredan este estado del DNA, desde el punto de vista estructural, las citosinas se hallan en una secuencia de dinucleótidos 5’CpG3’ (cadena complementaria 5´GpC3´), por lo que ambas cadenas podrían metilarse de una forma tal que durante la replicación cada una de las hebras hijas conserve una cadena con esta región metilada a partir de la hebra original (metilación simétrica). Por otra parte, desde el punto de vista funcional, las DNA-metil-transferasas (enzimas encargadas de la metilación del DNA en mamíferos) pueden reconocer la secuencia 5´metil-CpG3´ y metilar el residuo de citosina de la cadena complementaria, permitiendo así la herencia del estado de metilación de los dinucleótidos CpG (Solomon, 1998). Estas enzimas no solo median la metilación de novo (metil-transferasas de novo), sino también el mantenimiento del patrón de metilación durante la replicación (metil-transferasas de mantenimiento) (Goll y Bestor, 2005).
La metilación del DNA también tiene una gran trascendencia en la regulación de la transcripción (Fuks, 2005; Klose y Bird, 2006), en la diferenciación celular (Reik, 2007), en la estabilidad del genoma (Jones y Takai, 2001) y en la defensa contra
virus y parásitos que potencialmente podrían dañar al DNA, a través del silenciamiento de sus secuencias (Mohtat, 2010). Finalmente, el estado de metilación influye en la remodelación de la cromatina: las regiones de heterocromatina se encuentran altamente metilada que las regiones de eucromatina.
Dado que este es un proceso reversible, también existe un mecanismo mediante el cual el DNA se desmetila. Las plantas son las únicas en poseer un mecanismo para la desmetilación activa del DNA que involucra glicosilasas de DNA que eliminan el 5’CpG3’ e inician su reemplazo con una citocina no modificado a través de una vía de reparación de escisión de base (BER). En Arabidopsis, se han descrito diferentes glicosilasas que llevan a cabo esta función, entre las cuales se incluyen ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING 1) y sus parálogos DME (DEMETER), DML2 y DML3 (DEMETER-LIKE 2/3) (Morales-Ruiz et al., 2007, Córdoba et al., 2018). ROS1, DML2 y DML3 contrarrestan la metilación excesiva en varios cientos de loci a través del genoma en los tejidos vegetativos (Córdoba et al., 2018). La desmetilación activa del DNA cumple funciones importantes durante varias etapas del ciclo de vida de la planta, incluida la germinación de la semilla, la maduración del fruto y las respuestas a una variedad de condiciones de estrés (Penterman et al., 2007)
La consideración de este mecanismo nos lleva así a la segunda categoría principal de marcas epigenéticas, las modificaciones postraduccionales de histonas.
I.I.II Modificación de histonas.
Las modificaciones postraduccionales de las histonas (acetilación, ubiquitinación, biotinilación, metilación, sumoilación y fosforilación) son reguladores clave de los procesos asociados con el DNA. La proteína histona está compuesta por un octámero con dos copias, cada una de histona 2A (H2A), histona 2B (H2B), histona 3 (H3) e histona 4 (H4). Los residuos de aminoácidos en H3 y H4 son más propensos a modificaciones debido al extremo N-terminal que sobresale de la estructura cuaternaria, que se encuentra accesible para las enzimas modificadoras. La modificación del extremo de las histonas es un punto de control clave para
determinar la estructura de la cromatina y las regulaciones genéticas (Eichten et al. 2014).
Estas modificaciones, a su vez, se pueden presentar como una combinación de ellas, de manera que influyen en el acceso de la maquinaria de transcripción a la región del DNA involucrado. Así, estas señales actuarían como un código que indicaría si la cromatina se encuentra activa (nucleosoma relajado y gen con capacidad de expresarse) o inactiva (nucleosoma condensado y gen silenciado). Por supuesto, al ser varias las modificaciones post-traduccionales de las histonas, también son diversas las enzimas modificadoras involucradas en este proceso. Las más estudiadas son las acetiltransferasas (acetilan las histonas, relajan al nucleosoma y activan la expresión del gen) y las desacetilasas de histonas (desacetilan las lisinas de las histonas, condensan el nucleosoma y silencian el gen) (Razin, 1998).
La acetilación de histonas se produce mediante la adición enzimática de un grupo acetil (COCH3) de la acetil coenzima A. Las enzimas modificadoras involucradas en
la acetilación de histonas se denominan acetiltransferasas de histona (HAT) y juegan un papel crítico en el control de la acetilación de histona H3 y H4. Se han identificado más de 20 HAT que se pueden clasificar en cinco familias: GNAT1, MYST, TAFII250, P300 / CBP y coactivadores de receptores nucleares como ACTR (Dokmanovic et al., 2007).
Mientras que la fosforilación, la acetilación y la ubiquitinación de los extremos N-terminal de las histonas están asociadas con la regulación positiva de los genes, los procesos de desacetilación y biotinilación están asociados con la regulación negativa de los genes (Chen et al. 2010). Por otro lado, la metilación de histonas es una de las modificaciones covalentes más importantes, ya que se ha reportado que afecta tanto la regulación positiva como la negativa de la expresión génica (Law y Jacobsen 2010). La metilación de histonas se define como la transferencia de uno, dos o tres grupos metilo de S-adenosil-L-metionina a residuos de lisina o arginina de proteínas de histona por las metiltransferasas de histona (HMT); entre las cuales se encuentran MLL1, Ash1, SET1 y ALR que catalizan la metilación de la histona
H3 en la lisina 4 (H3-K4); además, ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 y Eu-HMTase son metiltransferasas de histona que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3-K9) en células de mamíferos. Y, enzimas como EZH2 que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 27 (H3-K27) (Wood, 2004). En Arabidopsis, la trimetilación de la histona H3 en K4 y K36 se asocia con genes transcritos activamente, mientras que la trimetilación de H3 en K9 y K27 predomina en la cromatina condensada de forma constitutivamente y facultativamente, respectivamente, así como en los genes globales inactivos en el desarrollo (Nakayama et al. 2001; Li et al. 2012).
En caso de acetilación, K-36 en la histona H3 (H3K36ac) se descubrió recientemente que participa en diversas modificaciones de la cromatina en las plantas; experimentos de secuenciación de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina de todo el genoma, revelaron que esta modificación H3K36ac alcanza su punto máximo en el extremo 5’ de los genes, principalmente en los dos nucleosomas inmediatamente distales al sitio de inicio de la transcripción, independientemente de la longitud del gen. H3K36ac está altamente enriquecido en eucromatina, pero no en heterocromatina y, si bien, H3K36ac está asociado con la actividad génica, no se encontró una relación lineal entre H3K36ac y los niveles de transcripción, lo que sugiere que H3K36ac es un indicador binario de transcripción (Mahrez et al. 2016). Como se puede apreciar, la metilación de histonas envía señales más complejas, ya que pueden tanto favorecer la expresión génica como reprimirla (Mohtat, 2010), en función de cuáles sean los residuos de aminoácidos metilados.
Complejos remodeladores de cromatina: Trithorax (TrxG) y Polycomb (PcG)
El trabajo realizado en Drosophila melanogaster ha demostrado que una cascada finamente regulada de factores de transcripción expresados transitoriamente establece patrones iniciales de expresión génica. Posteriormente, estos estados de expresión son conservados por los sistemas de memoria celular epigenética. Las proteínas del grupo Polycomb (PcG) y las proteínas del grupo Trithorax (TrxG) son vitales para estos patrones de expresión génica estables y heredables (Steffen y Ringrose, 2014).
El complejo de proteínas PcG generalmente mantienen la represión génica, mientras que el complejo de proteínas TrxG mantienen el estado de expresión activa de sus genes diana. Aunque, esto puede parecer sencillo, se va encontrando con mayor frecuencia una interacción compleja entre estos dos sistemas antagónicos. De hecho, varios genes deben mantener la capacidad de responder a nuevas señales y cambiar su estado de activación, y los mecanismos que permiten cambiar entre la acción PcG y TrxG se incorporan al sistema (Dorighi et al., 2013). De esta manera, se pueden lograr estados de expresión génica estables que aún permiten cambios dinámicos.
En las plantas, se sabe que el complejo PcG reprimen el regulador maestro de semillas y los genes de maduración durante la germinación a través de modificaciones de la cromatina, como la deposición de marcas de trimetilación de histona H3 lisina 27 (Bratzel et al., 2010; Bouyer et al., 2011). Las proteínas PcG se encuentran en dos complejos represivos PcG (PRC), PRC1 y PRC2 (Schwartz y Pirrotta, 2007). PRC2 consta de múltiples proteínas, EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2), VERNALIZATION 2 (VRN2), FERTILIZATION INDEPENDENT SEED 2 (FIS2), FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) y MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (MSI1) (Hennig et al., 2003), así como las metiltransferasas que trimetilan H3K27, CURLY LEAF (CLF), MEDEA (MEA) y SWINGER (SWN) (Chen, 2010). Por su parte, PRC1 incluye las cuatro proteínas responsables de la ubiquitinación de H2A, AtRING1A / 1B y AtBMI1A / 1B (Yang et al., 2013).
En contraste, las proteínas del grupo trithorax (trxG) forman complejos multiméricos que con frecuencia se asocian con genes transcritos activamente. Los factores trxG incluyen proteínas con dominio SET (Su (var) 3-9, Enhancer-of-zeste y Trithorax) con actividad de metiltransferasa H3K4, como TRX, ASH1 y otras proteínas asociadas (Kingston y Tamkun, 2014). Mantienen estados de expresión génica adecuados durante el desarrollo a través de múltiples mecanismos que incluyen la modulación de la estructura de la cromatina, así como modificaciones de la histona, incluyendo la deposición de las marcas H3K4me2 / 3 (Alvarez-Venegas, 2010). El
factor trxG de la planta ARABIDOPSIS HOMOLOG OF TRITHORAX1 (ATX1) tiene actividad de metiltransferasa H3K4me3 (Alvarez-Venegas y Avramova, 2005) y promueve el inicio de la transcripción reclutando a la RNA polimerasa II (Ding et al., 2011).
En los últimos años, una serie de estudios han proporcionado información sobre esta relación antagónica. Dada la importancia de la regulación de TrxG y PcG durante la embriogénesis y el crecimiento, muchos de estos estudios se han llevado a cabo durante el desarrollo y pueden dar evidencias sobre los mecanismos que rigen las elecciones de destino celular (Geisler y Paro, 2015). Además de las regiones reconocidas como blancos de TrxG y PcG, que continúan en expansión, la comprensión de la interacción entre estos sistemas no solo es informativa para la biología del desarrollo, sino que también es de interés para ampliar nuestra comprensión de la regulación general de la expresión génica (Steffen y Ringrosa, 2014). Del mismo modo, estos temas convergen en áreas de profundo interés en la investigación de la biología de la cromatina, como el papel de los RNAs largos no codificantes (lncRNA) en la regulación de la expresión génica.
I.I.III. RNAs no codificantes (ncRNAs): Reguladores potenciales de
la expresión génica.
En los últimos años se ha producido un cambio importante en nuestra concepción de la regulación del genoma. Es ahora obvio que la mayoría de los transcritos de la célula se generan a partir de genes “no convencionales” que no codifican proteínas, y una parte muy significativa de ellos dan lugar a moléculas de RNA no codificante (ncRNAs). Los ncRNAs pertenecen a diversos grupos y participan en muchos procesos celulares. Estos van desde los ncRNAs de vital importancia que se conservan en la mayoría de los organismos, hasta aquellos que son específicos para una o unas pocas especies relacionadas.
Estas últimas moléculas, en función de sus características, que son distintas de las de los ncRNAs “housekeeping”, que incluyen a los rRNA, los tRNA y los pequeños RNA nucleolares, se pueden clasificar de acuerdo a diferentes criterios, uno de ellos es de acuerdo a la longitud por lo que podemos encontrar RNAs pequeños (small
non-coding RNAs; sncRNAs), que tienen una longitud menor a 50 nucleótidos (nt) y entre los cuales se incluyen los siRNA y microRNA que tienen papeles importantes en la regulación mediada por el silenciamiento génico a nivel transcripcional y post-transcripcional, respectivamente (Ghildiyal et al.,2009). Además, se encuentran los RNAs intermedios que varían en tamaño entre 50 y 300 nt y finalmente, se encuentran los RNAs largos no codificantes (Long non-coding RNA; lncRNAs) que poseen tamaños mayores a 300 nt.
I.I.III.I. Long non-coding RNA: Localización en el genoma y función.
Los lncRNAs comprenden, en su mayoría, por moléculas transcritas por RNA polimerasa II (Pol II), esto implica que son presumiblemente poliadenilados, pueden contener 5’-Cap, así como también pueden ser sometidos a procesos de splicing como los mRNAs (Ling-Ling, 2016). Sin embargo, existe una creciente evidencia de que algunos lncRNAs pueden ser transcritos por otras RNA polimerasas como Pol V (Chao et al., 2014).
Ahora es ampliamente reconocido que, aunque no codifican a alguna proteína, los lncRNAs tienen múltiples funciones regulatorias en la expresión génica tanto a nivel transcripcional y post-transcripcional en diversos contextos celulares y procesos biológicos (Ling-Ling, 2016). Los lncRNAs están implicados en numerosos fenómenos biológicos importantes, como la conformación de los cromosomas y la actividad enzimática reguladora alostéricamente. Los patrones específicos de expresión de lncRNA coordinan el estado celular, la diferenciación, el desarrollo y también está correlacionadas a la aparición de diferentes enfermedades (Quinn & Chang, 2016). Una mejor comprensión de los lncRNA es crucial para vincular estas transcripciones de entidades no codificantes a la biología del RNA y para abordar sus funciones celulares en profundidad.
Las funciones de la mayoría de los lncRNA son desconocidas, y muchos lncRNAs pueden no tener funciones apreciables, pero los roles funcionales y los mecanismos de acción de algunos lncRNAs qie ya han sido catacterizados. Su papel regulatorio es llevado a cabo a través de diferentes mecanismos entre los cuales se incluyen (Ling-Ling, 2016):
• Actuando como reclutadores de factores de transcripción o complejos modificadores de la cromatina hacia la molécula DNA o RNA sobre la cuál actúan.
• Secuestradores de proteínas de unión a RNA (RBPs).
• Interactuando físicamente con su RNA o DNA blanco por complementariedad de bases.
A su vez, estas moléculas pueden clasificarse de acuerdo a su localización en el genoma (Figura 2). Pueden transcribirse a partir de la cadena opuesta de los genes que codifican proteínas (transcritos naturales antisentido; NATs), intrónicos, cuya transcripción inicia en algún intrón en sentido y dirección a su gen blanco, pero sin sobreponerse a algún exón del gen y, otra clase de lncRNAs son aquellos que se transcriben a partir de regiones intergénicas en el genoma, estos llamados lincRNAs transcripcionalmente independientes del gen blanco y que se encuentran separados al menos por una distancia de 1 kilobase de sus genes aledaños (Long intergenic non-coding RNA) (Chekanova, 2015).
Figura 2. Clasificación de los lncRNAs de acuerdo a su localización en el genoma. Los
lncRNA se clasifican de acuerdo a la región en donde son transcritos por lo que podemos encontrar, (a) antisentidos naturales (NATs), (b) aquellos que funcionan como Enhancers (eRNA), (c) Intertergénicos (lincRNAs) e (d) intrónicos (incRNA); siendo los lincRNAs los más abundantes.
Diversos estudios revelan que los lncRNAs son importantes y poderosos reguladores que pueden actuar en su entorno genómico vecino (en cis) o difundirse a sitios de acción distantes (en trans).
HOTTIP es un lincRNA de acción en cis que promueve la expresión del gen HOXA (Figura 3A). Transcrito desde la punta 5ʹ del locus HOXA, HOTTIP interactúa directamente en el locus HOTTIP con la proteína WDR5, que es un componente de la proteína 1 de leucemia mieloide / linfoide o de linaje mixto (MLL1), el complejo de histona lisina metiltransferasa y, a través de un bucle de cromatina, dirige MLL1 al locus HOXA, que está a una distancia de hasta 40 kb, lo que induce la trimetilación de H3K4 y la transcripción HOXA. Además de demostrar su actividad en cis, disminución en la expresión de HOTTIP disminuye la expresión de HOXA, pero no la expresión del gen altamente homólogo HOXD (Wang et al., 2011).
HOTAIR, es un lincRNA que se transcribe desde el locus HOXC, silencia a HOXD, así como a los genes en otros cromosomas (Gupta et al., 2010). HOTAIR funciona como un andamio para PRC2, induciendo así la trimetilación H3K27 y la desmetilación H3K4, respectivamente, para reprimir la transcripción de forma coordinada (Figura 3B).
Figura 3. Activación y represión génica coordinada por complejos modificadores de cromatina y RNA largos no codificantes (lncRNA). (A) Un lncRNA, HOTTIP, se transcribe desde la punta 5’ del locus HOXA y recluta el complejo MLL para activar los genes del grupo
HOXA mediante asociación directa con WDR5. (B) HOTAIR lncRNA se transcribe desde el locus HOXC y recluta a PRC2 al locus objetivo HOXD. (Tomado de Dong-Hwan y Sibum, 2012).
Otro ejemplo destacable, es el papel regulatorio que tiene el lincRNA Xist, que organiza a XCI en cis (Penny et al., 1996). Es un transcrito de 17 kb expresada desde el centro de inactivación X (Lee et al., 1996), que es una región de 500 kb. En los mamíferos, Xist es requerido para el silenciamiento aleatorio de uno de los dos cromosomas X, al propagarse y reclutar proteínas PRC para el futuro cromosoma X inactivo (Xi) (Tian y Lee, 2010).
En el caso de plantas, un análisis exhaustivo de más de 200 conjuntos de datos de transcriptoma de Arabidopsis thaliana identificó ~40,000 lncRNAs probables, incluyendo más de 30,000 NATs y más de 6000 lincRNAs (Wang et al., 2014; Liu et al., 2012). De hecho, este enfoque se ha empleado para identificar los lncRNA en las plantas y reveló que existen expresiones correlativas entre los lncRNA y sus genes vecinos que codifican proteínas, lo que sugiere que la mayoría de los lncRNA identificados están actuando en cis (Liu et al. 2012). Dos de los ejemplos mejor caracterizados en plantas es la regulación mediada por lncRNAs del locus de FLC. Se identificaron dos clases de lncRNAs que participan en la represión de FLC mediada por la vernalización. Un grupo de lncRNAs, COOLAIR, se transcribe desde el extremo 3' de FLC en una dirección antisentido (Figura 4). Los niveles de expresión de COOLAIR aumentan de manera transitoria en una etapa temprana de la vernalización, y las variantes distalmente poliadeniladas de COOLAIR se superponen en parte con el extremo 5' del mRNA de FLC. Esto ha sugerido que COOLAIR desempeña un papel en la interferencia transcripcional de FLC (Swiezewski et al. 2009). Sin embargo, los mutantes de inserción (en los que la transcripción de COOLAIR está alterada) muestran una expresión de FLC reducida por vernalización (Helliwell et al. 2011). En este modelo, la transcripción de este lncRNA afectaría la transcripción FLC; sin embargo, los detalles moleculares sobre la función de COOLAIR en la represión de FLC mediada por la vernalización aún no se han concluido.
Por otro lado, COLDAIR, que se transcribe desde el primer intrón de FLC en sentido de FLC, es inducido transitoriamente por la vernalización, y su inducción está controlada por un promotor críptico inducible por frío ubicado dentro del elemento
de respuesta de vernalización (Heo y Sung 2011). La transcripción in vitro y los análisis generados mostraron que COLDAIR se une a la proteína CLF, un homólogo del componente E(z) del complejo modificador de la cromatina PRC2 y ensayos de inmunoprecipitación de RNA verificaron que COLDAIR se asocia con PRC2 in vivo (Figura 4). Además, se observó un enriquecimiento de CLF y H3K27me3 en la región de la cromatina donde se encuentra FLC en respuesta a la vernalización. En líneas mutantes de COLDAIR, se ve afectado en gran medida la expresión de FLC, disminuyendo el reclutamiento de PRC2, indicando que COLDAIR es necesario para el reclutamiento de esta maquinaria a la cromatina de FLC (Saleh et al., 2008). Por lo tanto, COLDAIR es similar a los ncRNAs HOTAIR y Xist ya que son actores importantes para reclutar PRC2 y regular esas regiones en la cromatina. En conjunto, el silenciamiento del gen epigenético mediado por lncRNAs a través de complejos como PRC2 parece ser un mecanismo conservado evolutivamente entre plantas y animales.
Figura 4. Esquema de la regulación de FLC durante el curso de la vernalización.
Previo al cambio de temperatura (frío), FLC se transcribe activamente mediante complejos de activación, como el complejo COMPASS. Altos niveles de H3K4me3 son observados en la región de FLC. Aún no se ha determinado si los lncRNA, similares a
HOTTIP en la activación de HOXA, funcionan para reclutar complejos similares a
Trithorax para FLC. Durante el frío, un lncRNA, COLDAIR, recluta el complejo PRC2 a FLC a través de su asociación directa con PRC2, metilando H3K27. Después del frío, el FLC es silenciado de manera estable por los complejos similares a PRC2 y PRC1, manteniendo / extendiendo una marca represiva, H3K27me3 a través de la cromatina
Como se mencionó anteriormente, la mayoría de los lncRNAs son transcritos por RNA Pol II; además de dos RNA polimerasas específicas de plantas adicionales, Pol IV y Pol V (Wierzbicki et al., 2008; Li et al., 2014). La mayoría de los lncRNA están poliadenilados; sin embargo, en otros análisis en Arabidopsis se identificaron cientos de lncRNAs no poliadenilados que son inducidos durante condiciones abióticas específicas (Di et al., 2014).
Una gran variedad de lncRNA de plantas están regulados por el desarrollo y/o el medio ambiente, por lo que representan componentes funcionales importantes en la regulación del transcriptoma. Por ejemplo, muchos lincRNAs muestran cambios significativos en diferentes órganos de manera específica o durante el estrés, lo que sugiere que están regulados dinámicamente y podrían funcionar en el desarrollo y en la respuesta de estas condiciones adversas (Liu et al., 2012). Sin embargo, la regulación de lncRNAs en plantas sigue siendo poco conocida y, para este estudio, resulta importante entender como estas moléculas puede regular a sus genes blanco y su relación con el estrés abiótico.
I.II. La respuesta al estrés abiótico en plantas
Las plantas al ser organismos sésiles, están en constante contacto con diferentes cambios ambientales que pueden llegar a ser perjudiciales para su crecimiento, supervivencia y/o distribución. Esto quiere decir, que las plantas se encuentran en constantes condiciones de estrés que pueden diferenciarse en estrés de tipo biótico y abiótico. Entre los factores bióticos se incluyen a organismos como insectos, hongos, bacterias, virus, etcétera; los cuales, con sus interacciones, pueden afectar la fisiología de la planta. Por otro lado, los factores abióticos (aquellos de enfoque en este trabajo), incluyen factores ambientales como temperaturas extremas, deficiencia hídrica, salinidad, deficiencia de oxígeno y deficiencia de minerales, entre otras, causando un fuerte impacto sobre la planta.
El estrés desencadena una amplia gama de respuestas de las plantas, desde alteraciones en la expresión génica y el metabolismo celular hasta cambios en la tasa de crecimiento y el rendimiento del cultivo. La duración, la gravedad y la velocidad a la que se impone un estrés influyen en la forma en que responde una
planta. Varias condiciones adversas en combinación pueden provocar una respuesta que es diferente de la causada por un solo estrés (Buchanan, 2015). En muchos casos el estrés se mide con relación a la supervivencia de la planta, el rendimiento del cultivo, el crecimiento (acumulación de biomasa) o los procesos de asimilación primaria (incorporación de CO2 y minerales) que están relacionados con
el crecimiento (Taiz et. al, 2006). Por todo esto, las plantas han desarrollado mecanismos a diferentes niveles como molecular, celular y fisiológico, para contrarrestar los daños causados por el ambiente, por lo que desarrollan una “tolerancia al estrés” (Yoshida et al.,2014).
Los mecanismos moleculares que subyacen a las respuestas de las plantas al estrés abiótico, incluidos los cambios en la expresión génica y la transducción de señales celulares, se han analizado exhaustivamente, y ahora se sabe que varios factores de transcripción y moléculas señalizadoras juegan un papel importante en la homeostasis celular en condiciones de estrés (Buchanan, 2015).
I.II.I. Estrés por deficiencia hídrica (sequía)
El déficit hídrico se define como el contenido en agua de un tejido o célula, cuando resulta inferior a su contenido hídrico en su estado más hidratado (Taiz et. al, 2006). En términos generales, existen tres categorías en las que se clasifican las diferentes estrategias que las plantas emplean para hacer frente al estrés causado por deficiencia hídrica. En la primera categoría podemos definirla como el retraso de la desecación, la cual consiste en la habilidad para mantener la hidratación del tejido. En la segunda categoría se clasifica como la tolerancia a la desecación, que es la habilidad para funcionar mientras la planta está deshidratada. Una tercera categoría es el escape de la sequía, la cual comprenden aquellas plantas que completan su ciclo vital durante la estación húmeda, antes de que inicie la sequía (Taiz et. al, 2006).
Los mecanismos de respuesta ante el estrés hídrico (sequía) que en general emplean las plantas son los siguientes:
Reducción del área foliar: Cuando el contenido hídrico de una planta se
disminuye, las células se encogen y las paredes celulares se relajan. Esta reducción en el volumen celular da lugar a una menor presión de turgencia y a la consiguiente concentración de los solutos en las células.
Absición foliar: Cuando las plantas han desarrollado una importante cantidad de
área foliar y éstas se encuentran bajo estrés hídrico, las hojas sufren senescencia y posiblemente abscisión. Este mecanismo es efectivo a largo plazo, ya que supone un ajuste que mejora el estado en que se encuentra la planta cuando la disposición de agua es limitada.
Extensión radicular hacia suelos más profundos: La inhibición de la expansión
foliar reduce el consumo de carbono y energía, una gran parte de los productos asimilados por las plantas pueden ser distribuidos por el sistema radicular, donde pueden sustentar un posterior crecimiento. Al mismo tiempo, los apéndices radiculares pierden turgencia en suelos secos.
Cierre de estomas: La incorporación y la pérdida de agua en los estomas formados
por estas células guarda, cambia su turgencia y modula la apertura y cierre de los mismos. Como las células guarda se encuentran localizadas en la epidermis foliar, pueden perder el agua directamente por evaporación a la atmósfera. El descenso de la presión de turgencia provoca el cierre estomático por cierre hidropasivo (Taiz et. al, 2006).
Limitación de fotosíntesis: La deshidratación de las células del mesófilo inhibe la
fotosíntesis, se desajusta el metabolismo del mesófilo y el uso eficiente del agua normalmente desciende (Taiz et. al, 2006).
Ajuste osmótico de las células: El ajuste osmótico es el aumento neto del
contenido de solutos por célula, y es dependiente del cambio del volumen que tiene lugar como consecuencia de la pérdida de agua.
I.II.II. Estrés por salinidad
La acumulación de sal en el suelo afecta el funcionamiento de las plantas y la estructura del suelo. En la planta genera efectos osmóticos que repercuten
negativamente en sus funciones fisiológicas vitales, como, por ejemplo, en la tasa de crecimiento de la planta la cual se ve inhibida significativamente.
La tolerancia a la salinidad de las plantas es variable, dependiendo de la fase de desarrollo en la que se encuentre cuando ocurre el estrés. Las plantas despliegan una variedad de rasgos para combatir el efecto nocivo de los suelos salinos. El mecanismo esencial es el ajuste osmótico, todas las células deben acumular suficientes solutos para equilibrar la presión osmótica extra en la solución del suelo para mantener la turgencia. Para lograr esto, las plantas usan dos estrategias en diferentes grados: excluyendo Na+ y Cl-, particularmente a partir de hojas, y
dependiendo de solutos orgánicos para llevar a cabo un ajuste osmótico (“exclusión iónica”); ó la acumulación suficiente de Na+ y Cl- para equilibrar los de la solución
del suelo, pero con una regulación iónica estricta en varios compartimentos celulares (“tolerancia a nivel de tejidos”; Munns et. al, 2015).
I.III. Mecanismos de respuesta de las plantas al estrés
La sequía o el déficit hídrico es uno de los principales factores abióticos estresantes que afecta directamente a todos los aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas, causando deshidratación y una reducción en el rendimiento de los cultivos. El principal resultado del choque por sequía es un desequilibrio metabólico y osmótico que conduce a la pérdida de turgencia y al cierre de estomas (Zhu 2001; Sazzad 2007). Esto limita la absorción de dióxido de carbono y, por lo tanto, provoca la disminución del crecimiento celular y la reducción de la fotosíntesis (Shinozaki y Yamaguchi 2000). Si el estrés por déficit hídrico se prolonga lo suficiente como para alcanzar el punto de marchitez permanente, provocará la muerte de la planta. Se sabe poco sobre cómo los mecanismos de reconocimiento al estrés por parte de las plantas; las intrincadas vías de señalización que se supone que participan en la alteración de la expresión génica en respuesta al estrés aún no han sido dilucidadas; sin embargo, existe evidencia considerable de que la regulación de las respuestas al estrés de la planta involucra la síntesis de diferentes hormonas, como, por ejemplo, el ácido abscísico (ABA), ácido jasmónico (JA) y el etileno.
I.III.I. ABA como un regulador clave en condiciones de déficit
hídrico.
El estrés hídrico, es un factor importante que restringe la productividad en el crecimiento de la planta y puede causar un daño crítico a esta. Bajo condiciones de estrés osmótico muchos genes que funcionan en torno a la respuesta y tolerancia al estrés se inducen, de igual forma, el ABA es acumulada dadas estas condiciones y genera una respuesta, incluidas el cierre estomático y el arresto en la germinación (García et al. 2008). Se ha observado que esta hormona tiene una influencia sobre la maduración de la semilla y la tolerancia al estrés en plántulas, dos aspectos importantes de la biología vegetal que impacta en la agricultura.
ABA es una fitohormona que está involucrada en una amplia gama de mecanismos fisiológicos de las plantas. En general, ABA se consideró un inhibidor del crecimiento de brotes y raíces que actúa para ahorrar agua y energía bajo estrés. ABA también evita la pérdida de turgencia en condiciones de disponibilidad reducida de agua. Uno de los primeros procesos de protección que se observan en plantas estresadas es el cierre estomático y también tiene un papel muy importante en el arresto de la germinación y el mantenimiento de la latencia de las semillas. En condiciones ambientales estresantes, como escasez de agua, salinidad alta y temperaturas extremas, entre otras; el contenido de ABA en las plantas aumenta significativamente, estimulando los efectos de tolerancia al estrés que ayudan a las plantas a adaptarse y sobrevivir bajo estas condiciones adversas (Zhu, 2002). La producción de ABA es también esencial para la acumulación celular de varios metabolitos y proteínas que tienen un papel importante en la resistencia al estrés osmótico (Buchanan et. al, 2015).
La expresión génica en respuesta a estrés puede ser regulada por varias vías dependientes o independientes de ABA. A lo largo de los años a partir de 1960s, se han identificado más de 100 mediadores implicados en la señalización de ABA mediante estudios moleculares, genéticos, bioquímicos y farmacológicos (Ng et al, 2014).
Los factores de transcripción dependientes de ABA son principalmente miembros de familias numerosas como bZIP (BASIC LEUCINE ZIPPER) (Banerjee y Roychoudhury, 2015), MYB (MYELOBLASTOSIS) (Golldack et al., 2011), WRKY (WRKY DNA-BINDING PROTEIN) (Chen L. et al., 2012) ó AP2 (APETALA 2) (Golldack et al., 2011). ABI5 (ABA-insensitive five), un factor de transcripción bZIP que funciona en la señalización central de ABA y juega un papel clave en la latencia de las semillas. Esto quiere decir que ABI5 es un regulador importante en el proceso de germinación, así como el arresto del crecimiento en plántulas (Wang et al., 2011). Durante la germinación de semillas y plántulas jóvenes, la percepción de la señal de ABA también se rige por el factor de transcripción ABI5 (Yoshida et al., 2010). Su expresión se activa por la sequía y el estrés salino durante la germinación de la semilla dentro de un corto período de desarrollo, que ocurre entre 48 y 60 h después de la estratificación. Por lo tanto, la actividad ABI5 provoca la transcripción de varios genes que se encuentran implicados en la inhibición de la germinación de semillas o el crecimiento temprano de las plántulas (Frinklestein, 2012).
El cambio en la expresión génica, es una parte fundamental para que la respuesta al estrés pueda llevarse a cabo y así elucidar el panorama en el desarrollo de la tolerancia al estrés; es por esto, que la identificación de diferentes factores que puedan estar regulando la vía de señalización de las moléculas involucradas en la respuesta, es un tema de estudio de amplio interés.
I.III.II. ABI5: El regulador crucial del proceso de germinación de
semillas.
Se mostró una correlación entre la sensibilidad ABA, la expresión de ABI5 y el restablecimiento de la tolerancia a la desecación (Maia et al., 2014). La inhibición del crecimiento del embrión y la raíz en una etapa posterior del desarrollo garantiza una mayor retención de agua y, por lo tanto, tolerancia a la sequía (López-Molina et al., 2001; Brocard et al., 2002; Maia et al., 2014). Bajo estrés, las cinasas SnRK2.2, SnRK2.3 y SnRK2.6 fosforilan el dominio de trans-activación de ABI5 en tejidos vegetativos. La fosforilación de ABI5 cambia su conformación y permite sus interacciones adicionales con otras proteínas (Nakamura et al., 2001). Los primeros
objetivos de ABI5 que se identificaron fueron los genes que codifican a las proteínas LEA, EM1 (EARLY METHIONINE-LABELED 1), EM6 y LEAD34 (Finkelstein y Lynch, 2000). Muchos genes diana de ABI5 están asociados con el proceso de germinación, por ejemplo, PGIP1 (PROTEÍNA DE INHIBICIÓN DE POLIGALACTURONASA 1) y genes de PGIP2 (Kanai et al., 2010) (Figura 5).
La inducción de su expresión mediada por ABI5 conduce a la inhibición de la actividad de las poligalacturanasas, lo que resulta en el retraso de la ruptura de la cubierta de la semilla y, por lo tanto, en la germinación. En estos procesos, ABI5 está bajo la regulación negativa de PED3 (PEROXISOME DEFECTIVE 3), que codifica el transportador de casete de unión a ATP que está asociado con la oxidación de ácidos grasos. Por lo tanto, ABI5 actúa como un regulador crucial de la germinación a través de su participación en los aspectos fisiológicos y bioquímicos de este proceso (Kanai et al., 2010).
Figura 5. Genes regulados por ABI5. ABI5 activa la expresión de inhibidores de la germinación
de las semillas. La activación de otro grupo de genes como LEA también está regulada positivamente por ABI5 bajo estrés abiótico. Además, ABI5 influye negativamente en el contenido de clorofila y la eficiencia de la fotosíntesis. Tomada y modificada de Skubacz et al., 2016.
II. Antecedentes
II.I. PLncDB: La base de datos de los RNAs no
codificantes.
Los RNAs no codificantes (ncRNAs) son una familia de RNA que no codifican para una proteína, como se explicó previamente. Estos lncRNA muestran una expresión específica del tejido, y un gran número de ellos responden al estrés abiótico (Liu et al., 2012). Sin embargo, la función de estos lncRNAs permanece en gran parte inexplorada. Los loci genómicos de muchos lncRNA están asociados con modificaciones de histonas y metilaciones de DNA que sugieren una regulación epigenética de estos loci (Guttman et al., 2009; Liu et al., 2012).
La identificación de miles de lncRNAs en Arabidopsis y otras plantas, se han publicado en diversas bases de datos; sin embargo, a través de un gran número de lncRNAs recopilados junto a la integración de conjuntos de datos de transcriptoma derivados de varias muestras, incluidos diferentes tejidos, etapas de desarrollo, mutantes y tratamientos de estrés, se publicaron en el 2013 mediante la base de datos generada por el equipo de Nam-Hai Chua de la Universidad de Rockefeller en Nueva York. De este modo, esta información fue importante para iniciar con el estudio de caracterización de la función de un RNA intermedio no codificante LINCAFP, denominado así por su localización entre el gen AFP1 (ABI5-BINDING PROTEIN) y el gen NTF2 (NUCLEAR TRANSPORT FACTOR 2) (Figura 6).
Este lincRNA que se encuentra en el locus de afp1 genera un gran interés por conocer si tiene un papel regulatorio sobre afp1. LINCAFP, como se nombró debido a su localización, se encuentra, río arriba de NTF2 (Nuclear Transport Factor 2) el cual tiene un papel muy importante en la eficiencia del importe proteico al núcleo. Lo interesante de este loci es que estos tres genes se encuentran altamente expresados en condiciones de estrés salino, sequía y en tratamiento con ABA (Figura 6), por lo que se piensa que el principal papel regulatorio operado por LINCAFP toma lugar en condiciones específicas de estrés y puede tener un papel en la germinación y crecimiento de plántulas como AFP1.
Con esto, para elucidar la función que pueda tener este lincRNA, es necesario conocer las funciones de los genes que comprenden a este loci, estas incluyen propiedades y mecanismos de acción por parte de los lincRNAs que nos ayudarán a comprender la importancia de su localización y de sus genes aledaños para aproximarnos a conocer la función que puede desempeñar y también los contextos biológicos en los que puede participar.
II.I.I. Los RNAs largos no codificantes intergénicos (lincRNA:
Características y función
Los lincRNAs se definen como RNAs no codificantes transcritos de forma autónoma de más de 300 nucleótidos que no se superponen a los genes codificadores anotados. Los lincRNA se han distinguido como una de las clases más amplia de trancritos de lncRNA, ya que muchos lncRNA comparten la secuencia con los genes que codifican a proteínas (Guttman et al., 2009).
Figura 6. Análisis de expresión de loci. Los resultados de microarreglos dieron la información
sobre las condiciones para la expresión NTF2, LINCAFP y AFP1. LINCAFP y el gen río arriba AFP1 tienen una expresión diferencial en condiciones de estrés abiótico como sequía, salinidad y tratamiento de ABA. http://chualab.rockefeller.edu/
Los lincRNAs tienen funciones regulatorias como la remodelación de la arquitectura de la cromatina y el genoma, la estabilización del RNA y la regulación de la transcripción. Además, los lincRNA pueden participar como finos moduladores de la expresión de genes vecinos de manera tejido-específico a través de una diversidad de mecanismos, ayudando a la comprensión de una rápida evolución del genoma no codificante (Ransohoff et al., 2017).
Por otro lado, la falta de superposición física entre los lincRNAs y genes que codifican proteínas, es la diferencia que distingue a los lincRNAs de las otras clases de lncRNA, esto se ha respaldado por análisis de expresión génica, ya que, hablando específicamente de plantas, generalmente los lincRNAs tienen una menor expresión que los mRNAs; sin embargo, su expresión está fuertemente ligada a condiciones de estrés y tiende a expresarse en tejidos específicos; adicionalmente también se ha encontrado que, al contrario de los lincRNAs, las otras clases de lncRNAs no alteran los genes adyacentes ante una disrupción genética de los mismos (Ulitsky and Bartel, 2013).
Los lincRNAs se distinguen por tener diversos mecanismos de acción para la regulación de sus genes blanco y se ha descrito que tienen preferencia por sus genes vecinos y esta regulación puede ser llevada a cabo, ya sea en cis o trans (Ransohoff et., 2017), como en los casos previamente descritos del papel de HOTAIR y HOTTIP (Figura 3).
Estas son evidencias de los diferentes tipos de mecanismos de regulación que emplean los lncRNAs y, como la regulación puede inducir el silenciamiento de sus blancos o, incluso activar su transcripción dependiendo del complejo proteico al cual recluten. Además, tiene la capacidad de regular genes codificados en otros cromosomas o, genes dentro de su mismo loci. Debido a este último caso, nuestro interés se centra en determinar si LINCAFP tiene un papel regulatorio sobre sus genes vecinos, debido a sus patrones de expresión que correlacionan con estos genes en condiciones de estrés, en especial, con AFP1, ya que, al igual que LINCAFP, este presenta una acumulación ante condiciones de sequía, salinidad y bajo tratamientos con ABA (Figura 6).
II.II. ABI5-BINDING PROTEIN 1 (AFP1) regula la respuesta
al estrés en la germinación de semillas de Arabidopsis.
AFP1 es un miembro de una pequeña familia de cinco proteínas de unión a ABI5 específicas de la planta (AFP) regula la respuesta al estrés en la germinación de semillas y plántulas de Arabidopsis (López-Molina et al., 2002).
Se identificaron varios miembros principales de la familia, caracterizando los dominios que contenían y su relación con la respuesta al estrés dependiente ABI5, encontrando tres dominios altamente conservados entre ellas, que, aunque se conservan dentro de la familia AFP, no son homólogos a ningún dominio de función conocida, excepto por una presunta señal de localización nuclear (dominio B) y un dominio que resultó ser necesario para la interacción con ABI5, denominado como dominio C; el dominio A sigue sin ser caracterizado (Figura 7) (García et., al 2008). Se han caracterizado cuatro miembros de la familia AFP1 (At1g69260), AFP2 (At1g13740), AFP3 (At3g29575) y AFP4 (At3g02140). De los que, posteriormente, AFP4 se demostró que está regulado por ABA (Huang y Wu 2007) y que AFP2 tiene un papel regulatorio en condiciones de estrés por calor (Chang et al., 2018). Sin embargo, AFP1 ha sido la proteína descrita que funciona como un regulador negativo de la respuesta a ABA en Arabidopsis thaliana.
Como se sabe, la eficacia de la disminución del crecimiento post-germinativo dependiente de ABA, recae directamente en los niveles de la proteína ABI5 (Brocard et al. 2002). Hasta ahora, se han identificado pocos reguladores negativos de la disminución del crecimiento mediada por ABA en Arabidopsis. Estos reguladores incluyen ERA1, una subunidad de una farnesil transferasa (Cutler et al. 1996), y ABH1, una proteína de unión de mRNA Cap (Hugouvieux et al. 2001). Sin embargo, los blancos de estos reguladores no se han sido identificados, por lo que el panorama de cómo actúan no se ha esclarecido completamente.
En el 2003, se demostró que AFP1 es un regulador negativo de las respuestas a ABA cuya función es a través de la regulación del factor de transcripción ABI5. Se evaluó que los mutantes de afp1-1 son hipersensibles a ABA ya que su germinación se ve inhibida en presencia de ABA, un resultado comparable para las semillas que sobreexpresan la proteína de ABI5 (Yanping Wang et al., 2011). Además
,
también se demostró una interacción física entre ABI5 y AFP1 en experimentos de coinmunoprecipitación y se observó una correlación inversa en los niveles de la proteína ABI5 y AFP1 en mutantes afp1-1 y contrastan con plantas transgénicas 35S :: AFP1 sugiriendo que AFP1 puede regular negativamente los niveles de proteína ABI5, a pesar de tener niveles similares de mRNA de ABI5 (López-Molina et al., 2003). Posterior a esto, para determinar si ABI5 también se degrada vía proteasoma 26S in vivo, se evaluaron los efectos de los inhibidores del proteasoma en los niveles de proteína ABI5 en tres contextos genéticos, WT, 35S :: AFP1 y la mutante afp1; los resultados mostraron un mayor aumento en 35S :: AFP1 que en las plantas WT principalmente porque, en ausencia de inhibidores, se detectaron niveles más bajos de ABI5 en la primera mencionada. En contraste, los niveles de ABI5 en los mutantes afp1-1 ya eran tan altos como los de la línea transgénica 35S :: AFP1 tratada con inhibidor, y solo se observó un aumento muy pequeño en el tratamiento con inhibidor. Por lo tanto, AFP1 regula a ABI5 de maneraFigura 7. Familia de proteínas AFP. Esquema de las tres regiones de mayor homología,
dominios designados A, B y C, donde se ha determinado que C es necesario para la interacción con ABI5. La longitud de cada proteína en los residuos de aminoácidos se indica a la derecha.
postraduccional y facilita su proteólisis mediada por ubiquitina mediante la maquinaría de proteasoma 26S (Figura 8).
Adicionalmente, se realizaron estudios de localización subcelular donde se mostró que los complejos AFP / ABI5, se localizan en cuerpos nucleares. De manera interesante, dado que la mutante de afp1-1 es hipersensible a ABA, la localización en los cuerpos nucleares, pareciera no ser necesaria para la función ABI5 (López-Molina et al., 2003). De hecho, estas estructuras subnucleares pueden representar sitios de degradación para ABI5, que es promovida por AFP1.
Esta conclusión está respaldada por el hallazgo de que los cuerpos nucleares AFP / ABI5 también contienen COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1), una proteína con motivo de ligasa E3 RING (Stanek y Fox, 2017). Se ha propuesto que los cuerpos nucleares que contienen COP1 son sitios de inactivación y degradación de proteínas (Stanek y Fox, 2017; Wang et al. 2001).
Figura 8. Interacción de AFP1 y ABI5. Los niveles de ABI5 son clave para que se lleve a cabo
un eficiente arresto del crecimiento en la etapa de post-germinación cuando se presenta déficit hídrico. AFP1 atenúa las señales de ABA al estimular a ABI5 a la degradación mediada por ubiquitinación.
II.III NTF2 media el importe de la proteína Ran
convirtiéndose
en
un
auxiliar
en
el
tráfico
nucleocitoplasmático.
El tráfico nucleocitoplasmático se produce a través de complejos de poros nucleares (NPC), que es una estructura de canales proteicos que perforan la membrana nuclear (Quimby et al., 2001). Los NPC contiene aproximadamente 30 proteínas diferentes que se denominan colectivamente como nucleoporinas y se localizan simétricamente en todo el complejo de poros (Rout et al., 2000). Se sugiere que la ubicación especial y las características de estas proteínas están involucradas directamente en el transporte nucleocitoplasmático.
Investigaciones adicionales indican que la importación de cargas de proteínas no solo necesita señales de localización nuclear (NLS) sino también receptores de transporte solubles de la familia importina β, y se ha demostrado que los receptores de transporte de la familia importina β interactúan con las nucleoporinas (Macara, 2001). Ran es otro elemento imprescindible en el transporte nucleocitoplasmático de macromoléculas. Aunque Ran se localiza en toda la célula, alrededor del ~80% se concentra dentro del núcleo (Moore, 1998). Al igual que otras pequeñas GTPasas, Ran existe con capacidad de unión a GTP ó GDP (Avis y Clarke, 2000). Los receptores de transporte de la familia de la importina β, que juegan un papel en el transporte de proteínas y RNA entre el núcleo y el citoplasma, utilizan la unión RanGTP para regular sus afinidades por las moléculas de carga. Se internalizan en el núcleo en ausencia de RanGTP y salen del núcleo como complejos de RanGTP, disminuyendo así a Ran del núcleo de manera continua. Para reponer las reservas nucleares de Ran, RanGDP se importa al núcleo mediante la pequeña proteína homodimérica Nuclear Transport Factor 2 (NTF2; Quimby et al., 2000).
Inicialmente, NTF2 se une a RanGDP citoplasmático, lo que da como resultado una mayor afinidad de NTF2 por los componentes del NPC. El complejo NTF2-RanGDP se acopla en el lado citoplasmático del NCP y se transfiere al lado nuclear. El mecanismo molecular preciso de esta translocación no se ha descrito hasta el
momento, así como la translocación a través de NPC de cualquier otro sustrato (Figura 9) (Mattaj y Englmeier, 1998).
Después de la translocación a través del NPC, Ran necesita ser liberado de NTF2 en el núcleo. Un mecanismo plausible sería el intercambio de nucleótidos para generar RanGTP para el cual NTF2 no tiene afinidad detectable (Paschal et al., 1996). RanGDP podría disociarse transitoriamente de NTF2 en el núcleo y su conversión a RanGTP por RCC1 podría evitar la nueva unión. Alternativamente, el intercambio de nucleótidos mediado por RCC1 podría desplazar activamente a Ran de su portador de importación. El sistema portador NTF2 acoplado al intercambio de nucleótidos es aparentemente suficiente para suministrar a los receptores de transporte de la familia β de la importación con RanGTP en el núcleo y, en principio, debería ser capaz de mantener el RanGTP nuclear libre a un nivel bajo (Ribbeck et al., 1998).
Figura 9. Esquema de los ciclos de transporte nucleocitoplasmático de Ran. RanGTP se
exporta del núcleo vinculado a factores de importación / exportación como importin β, transportin, RanBP7 y CAS. RanGAP citoplásmico y RanBP1 juntos eliminan RanGTP del receptor de importación / exportación y desencadenan la hidrólisis de GTP para formar RanGDP. RanGDP luego se une a NTF2 y se reimporta a través de NPC en el núcleo donde el complejo se disocia y RCC1 regenera RanGTP. Tomada de Ribbeck et al., 1998.
