UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
MÁSTER UNIVERSITARIO EN RECURSOS FITOGENÉTICOS
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TRABAJO FIN DE MÁSTER
Variación somaclonal de Mentha aquatica tras su
crioconservación
AUTOR/A: Maria Reche Barceló CONVOCATORIA:
JULIO 2014
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Director del Trabajo: Mª Carmen Martín Fernández
La directora/El director del presente trabajo da el visto bueno para la presentación del mismo y posterior defensa.
Fdo. Mª Carmen Martín Fernández
Tribunal calificador:
Dr. Félix Pérez
Dra. Elena Torres
Dra. Sara Mira
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RESUMEN
La especie Mentha aquatica es un parental del híbrido Mentha x piperita, esta última de gran importancia económica debido a la explotación de sus aceites esenciales. La conservación de los parentales de las especies cultivadas es de gran valor, debido a que actúan como reservorio de genes a partir de los cuales se pueden llegar a extraer caracteres importantes como resistencia a plagas o tolerancia a salinidad. Para su conservación pueden emplearse las distintas técnicas asociadas a la conservación in situ y ex situ, en este último caso, una de las metodologías empleadas en especies que no producen semillas es la crioconservación. Se ha documentado que tanto el establecimiento del cultivo in vitro de las plantas como su crioconservación puede originar variaciones genéticas conocidas como variación somaclonal. En este trabajo se ha examinado la aparición de variación somaclonal en plántulas de Mentha
aquatica de cuatro poblaciones de la Península Ibérica que han sufrido un proceso de
crioconservación a través de la técnica droplet. La detección de variaciones genéticas se ha realizado a través de marcadores tipo RAPD, con seis cebadores. En el estudio se incluyeron controles de las plantas madre y de los cultivos in vitro. Se han observado variaciones genéticas asociadas al establecimiento del cultivo in vitro y al proceso de crioconservación respecto a las plantas madre. Las diferencias genéticas entre las plántulas que fueron sometidas al proceso de crioconservación son variables en función del genotipo de partida; a excepción de una población donde no se detectan prácticamente cambios, las variaciones producen coeficientes de similitud que varían desde un 59% hasta un 98%. Asimismo, se han observado variaciones morfológicas que en algunos casos no revierten tras la aclimatación a condiciones ex vitro si bien, no se han podido establecer conexiones claras entre las variaciones morfológicas observadas y las variaciones genéticas detectadas con RAPDs.
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer el esfuerzo y paciencia de mi tutora Mª Carmen Martín, así como a Elena González por ejercer de segunda tutora la primera mitad del curso. También a Consuelo Sansegundo por estar siempre dispuesta a ayudarme.
A mis compañeros del máster Julen, Santiago y Alberto por escucharme y darme su opinión cuando la he necesitado.
A Álvaro, por apoyarme en todos los aspectos de la vida. I als meus pares, sense ells res d’això hauria sigut possible.
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ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS
ADN: ácido desoxirribonucleicoAFLP: amplified fragment lenght polymorphism ANOVA: análisis de la varianza
BAP: benzylaminopurina
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio DMSO: dimetilsulfóxido
ECP/GR: European Cooperative Programme for Crop Genetic Resources Network EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EIFORGEN: Programa Europeo de Recursos Fitogenéticos Forestales
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura IPGRI: International Plant Genetic Resources Institute
MS: medio Murashige & Skoog NL: nitrógeno líquido
PCR: reacción en cadena de la polimerasa PEG: polietilénglicol
PVP: polivinilpirridoxona PVS2: solución vitrificante R: medio Reed
RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism TBE: tampón Tris, borato y EDTA
Tris: tris(hidroximetil)aminometano UPGMA: unweighted pair-group analysis
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LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1: Imagen de Mentha aquatica L. ... 9! Figura 2: Representación de un vástago de Mentha. A: vástago completo. ... 13! Figura 3: Segmento nodal de un vástago del individuo 4.2 de la población GRI. a. Peciolo de la hoja
cortada. b. Brotes a partir de la yema axilar. ... 14! Figura 4: Ápice procedente del brote de la yema axilar; del individuo 4.2 de la población GRI. a. Base
de las hojas eliminadas. b. Primeras hojas visibles ... 14! Figura 5: Tiras de papel de aluminio con los ápices preparados para su congelación. ... 15! Figura 6: Representación gráfica de los resultados obtenidos tras analizar los datos de la respuesta de los
ápices a distintos medios de cultivo. A: Número de vástagos desarrollados por ápice. B: Número de nudos del vástago principal. C: Número de raíces desarrolladas por ápice. D: Longitud (mm) del vástago principal. En la base de la figura se observan los p-valores extraídos al realizar el ANOVA con los datos. MS: medio de cultivo de Murashige y Skoog; R: medio de Reed ... 19! Figura 7: Ápices tras dos semanas de cultivo en medio R. A: Individuo 4.2 de la población de La Griega.
Las flechas señalan ápices sin desarrollo; B: individuo 7 de la población de Tapia y C: individuo 3.1 de la población de L’Alcora. ... 20! Figura 8: Ápices tras cuatro semanas de crecimiento. Las tres últimas filas corresponden a los ápices
control y el resto a los que han sufrido todo el proceso de crioconservación. ... 21! Figura 9: Representación gráfica de la tasa de supervivencia de los ápices en función de la población y el
tratamiento. En la parte inferior se detalla el p-valor de la regresión logística y del Chi-cuadrado. Pobl.: Población, Alc: Alcora, Fan: Fanzara, Gri: La Griega, Tp: Tapia, Crio: crioconservada, Pobl:Trat: interacción entre población y tratamiento. ... 22! Figura 10: Representación gráfica de la media del número de vástagos que desarrolló cada explanto tras
cuatro semanas de cultivo en medio MS. ... 24! Figura 11: Representación gráfica de la media de la longitud del tallo principal de cada explanto tras
cuatro semanas de cultivo en medio MS. ... 24! Figura 12: Representación gráfica de la media del número de nudos del vástago principal de cada
explanto tras cuatro semanas de cultivo en medio MS ... 25! Figura 13: Individuo 4.2 de la población de La Griega con morfologías anómalas en las hojas. La flecha
cortada indica una zona donde las hojas aparecen de forma alterna en lugar de opuesta. La flecha completa indica una zona donde se observan tres hojas dispuestas de forma opuesta. ... 25! Figura 14: Imágenes de los explantos desarrollados a partir de los ápices crioconservados pasados a
tierra. A: Individuo 4.1 de la población de Fanzara, la flecha cortada indica una zona con hojas alternas y la flecha completa señala las hojas nuevas opuestas. B: Individuo 4.2 de la población de la Griega, las flechas señalan nudos con tres hojas opuestas. C: Individuo 7 de la población de Tapia, se observa una morfología normal de las hojas nuevas sobre un explanto hiperhídrico. ... 26! Figura 15: Patrón de bandas obtenido con el cebador O20 en las muestras control (C1 y C2) y las
crioconservadas (Cr1-Cr4) en las poblaciones de Tapia y L’Alcora. Las flechas marcan diferencias en el perfil de bandas dentro del mismo individuo. ... 27!
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Figura 16: Dendrograma obtenido a través del método UPGMA empleando el coeficiente de Jaccard entre las muestras de las plantas madre y los controles in vitro. Pm: planta madre, in: planta in
vitro. ... 27!
Figura 17: Dendrogramas de planta in vitro y crioconservadas. Ac: planta aclimatada, c: control de crioconservación, Cr: crioconservada, in: planta in vitro. ... 28! Figura 18: Dendrograma de la población de Tapia de las plantas crioconservadas y los controles. ... 29! Figura 19: Dendrograma de la población de La Griega de las plantas crioconservadas y los controles. . 29! Figura 20: Dendrograma de la población de L’Alcora de las plantas crioconservadas y los controles. ... 30! Figura 21: Dendrograma de la población de Fanzara de las plantas crioconservadas y controles. ... 31!
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ÍNDICE GENERAL
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I. INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo se buscará la presencia de variación somaclonal en plantas de Mentha
aquatica tras un período de crioconservación. La elección de esta planta se debe a que se trata
de un pariente silvestre de la menta común o menta piperita (Mentha x piperita); en los siguientes apartados se explicará la importancia de la conservación de las especies silvestres emparentadas con las cultivadas así como el proceso de la crioconservación y los posibles efectos que puede tener sobre el material vegetal.
I. 1. IMPORTANCIA CONSERVACIÓN ESPECIES EMPARENTADAS
Las especies emparentadas con las plantas cultivadas incluyen tanto antepasados de estos cultivos como otras especies más o menos cercanas a ellos. Son una fuente de genes potencialmente aprovechables; ya que al tratarse de plantas no domesticadas por el hombre han desarrollado resistencias a plagas y enfermedades. Así como características que les han permitido adaptarse a distintas condiciones físicas, como altas temperaturas, sequías, alta salinidad en el suelo, etc. (Maxted et al. 2008). El ser humano se dio cuenta de este potencial desde el inicio de la agricultura, cruzando las plantas que ya poseía con otras silvestres para conseguir las características que mostraba dicha planta. Hoy en día, siguen existiendo campesinos que realizan estas tareas, como en Méjico, que cultivan el maíz cerca de parientes silvestres de esta especie para facilitar la mezcla entre ambas con el fin de mejorar la producción (Maxted et al. 2008).En la agricultura moderna se han empleado las especies silvestres emparentadas con las cultivadas para introducir la resistencia al ácaro del trigo, el tizón tardío de la patata o la enfermedad del raquitismo del arroz. También se han empleado para mejorar la tolerancia a la sequía como en trigo o a los suelos ácidos sulfatados como en el caso del arroz. Por otro lado, ya que no todo son resistencias a plagas o a condiciones físicas, también se han utilizado para aumentar el valor nutricional de algunos cultivos como el contenido de proteínas del trigo duro, el contenido de calcio de la patata y la provitamina A del tomate (Lane 2006). Para conseguir transferir estas características a los cultivos se han empleado técnicas de mejora vegetal clásica, mediante cruzamientos y selección. Las técnicas moleculares más modernas todavía no se han empleado para este tipo de materiales (Maxted et al. 2008). Se cree que no se están aprovechando todos los beneficios que pueden aportar estas plantas y que debería empezar a utilizarse las técnicas moleculares para agilizar el proceso de obtención de estas plantas mejoradas.
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del cual se quiere trabajar, ya sea almacenado en bancos de germoplasma o en colecciones ex situ o in situ. Si no se conoce que existe tal material, no se puede empezar a trabajar con él. Por lo que es muy importante conocer la presencia de este tipo de plantas en la naturaleza, así como dónde se encuentran para poder predecir qué tipo de características tendrán y si podrán ser aprovechables. Por esto es importante reconocer y conservar las especies emparentadas con las cultivadas. Sí que se han empezado a llevar a cabo proyectos de conservación de recursos fitogenéticos, pero hasta hace pocos años no se había incluido a los parientes silvestres en la propia definición de recurso fitogenético, por lo que no podía conservarse adecuadamente (Maxted et al. 2008).
En la conferencia de Leizping de 1996 organizada por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) se definió un recurso fitogenético como un material vegetal con valor actual o potencial en los campos de la alimentación, agricultura o forestal. Si se considera que la agricultura es el hecho de trabajar la tierra y cultivar plantas; se asume que la definición de recursos fitogenéticos engloba a todas las especies de platas domesticadas (Allem 2000). Al añadir a la definición las palabras valor
potencial, se pueden incluir las especies silvestres.
Se sabe que los recursos fitogenéticos son finitos y pueden perderse e incluso llegar a extinguirse por procesos de erosión genética. Éstos pueden frenarse mediante un uso sostenible de los recursos y de las prácticas agrícolas. Se calcula que el 50% de las especies vasculares Europeas están amenazadas en algún grado, y la pérdida infraespecífica que cree que todavía es mayor; por lo que virtualmente todas las especies pueden estar sujetas a una amenaza (Maxted et al. 2008). La pérdida de cualquier clase de diversidad genética significa que se están perdiendo caracteres potencialmente beneficiosos sin los cuales los cultivos no podrían hacer frente a futuros hipotéticos cambios ambientales o enfermedades. Este es un motivo por el cual es importante conservar los parientes silvestres, porque tal vez no sean útiles en el presente, porque no se conozca que beneficios pueden aportar, o porque no se dispone de la tecnología necesaria para conocerlo. Pero no significa que no puedan serlo en un futuro.
Debido a estos motivos se empezó a otorgar a los parientes silvestres la importancia que merecen, incluyéndolos en programas de conservación donde antes no se encontraban. En Europa, la conservación de especies vegetales ha estado asociada a Bioversity International (International Plant Genetic Resources Institute – IPGRI) y se ayuda por dos programas: la Red Europea de Recursos Fitogenéticos (European Cooperative Programme for Crop Genetic Resources Network – ECP/GR) y el Programa Europeo de Recursos Fitogenéticos Forestales (EIFORGEN). Ambos son programas dedicados a la
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conservación a largo plazo de los recursos fitogenéticos y a su uso sostenible. Además, en los últimos años el ECP/GR ha establecido como principal objetivo establecer y desarrollar un inventario de parientes silvestres de Europa y promover la concienciación pública de su importancia y de la necesidad de preservar la diversidad que albergan los parientes silvestres de las especies cultivadas (Maxted et al. 2008).
A la hora de conservar estas plantas, es necesario priorizar aquellas que sean más importantes desde un punto de vista socio-económico, porque las ayudas o esfuerzos de momento se centran en aquellas especies de interés potencial en el ser humano. Por este motivo es necesario definir y conocer exactamente qué significa el término de parientes silvestre y cuándo se puede aplicar.
Los parientes silvestres se definen como especies silvestres relacionadas con los cultivos; por lo que técnicamente podría considerarse como tal cualquier taxón perteneciente al mismo género del cultivo. Sin embargo esta definición es demasiado amplia y debe refinarse un poco. Para ello se emplea el grado de parentesco mediante el concepto de
gene pool (Harlan & de Wet 1971); los parentales más cercanos formarían parte del gene pool primario, los alejados al gene pool secundario y los más alejados al gene pool
terciario. Este concepto es válido cuando se dispone de información previa sobre la hibridación entre las distintas plantas. Pero si no se tiene tal información o no es posible realizar los experimentos de hibridación se emplea el método jerárquico (Maxted et al. 2006); se definen unos grupos, donde el Grupo 1a está formado por el cultivo de estudio, el Grupo 1b está formado por las mismas especies del cultivo, el Grupo 2 por la misma serie o sección que el cultivo, el Grupo 3 por el mismo subgénero, el Grupo 4 al mismo género y el Grupo 5 a la misma tribu o distinto género. Esta metodología asume que la distancia taxonómica está relacionada con la distancia genética. Por tanto, según Maxted
et al. (2006) un pariente silvestre es: “un taxón silvestre con un uso indirecto derivado de
su estrecha relación con un cultivo; esta relación se define por pertenecer al gene pool primario o secundario o a los Grupos 1, 2, 3 o 4.”
Debido a la gran heterogeneidad de los recursos fitogenéticos no existe una única estrategia de conservación. Puede ser in situ en su hábitat natural o ex situ bajo unas condiciones distintas a las naturales. De manera ex situ, la conservación se puede llevar a cabo en bancos de germoplasma (en campo, semillas, polen, crioconservación, etc.), en jardines botánicos, en áreas protegidas, etc. La conservación in situ ocurre en hábitats naturales cuando se trata de especies silvestres y en huertos tradicionales o colecciones de campo cuando se persigue la conservación de variedades tradicionales. Las especies capaces de ser conservadas ex situ se dividen en dos grandes grupos según su capacidad de soportar la desecación de sus semillas: las ortodoxas pueden soportar grandes tasas de
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desecación y las recalcitrantes que no pueden soportar una desecación. Para elegir el método adecuado de conservación ex situ es necesario responder a una serie de preguntas: ¿producen semillas?, si producen semillas, ¿son ortodoxas o recalcitrantes?, si no produce semillas, ¿tiene reproducción vegetativa?, si tiene reproducción vegetativa ¿cuál es el mejor propágulo para su reproducción?. Si produce semillas ortodoxas, se conservan las semillas a bajas temperaturas y a bajo contenido de humedad; si las semillas son recalcitrantes, se conservan en campos o en bancos in vitro. Si no producen semillas, se conservan en campos, bancos in vitro o crioconservadas (Hidalgo et al. 2007).
I. 1. CRICONSERVACIÓN
La crioconservación de las plantas implica el almacenaje del material vegetal en nitrógeno líquido a -196ºC o en su fase de vapor a -135ºC. Se aplica, como ya se ha comentado en aquellas especies con semillas recalcitrantes que no pueden almacenarse de otras formas y en especies que solo se propagan de forma vegetativa.
La ventaja principal de la crioconservación es que una vez que el material ha sido congelado, puede permanecer en este estado casi de manera indefinida; ya que se detiene el metabolismo de las células. Además, no es necesario la realización de subcultivos como en el caso del cultivo in vitro, solo se requiere rellenar los tanques con nitrógeno líquido periódicamente. Por otro lado, los gastos materiales y de mano de obra son menores que en las colecciones de campo; el espacio de almacenaje que se requiere es pequeño y prácticamente no se necesita mano de obra (Kaczmarczyk et al. 2012).
Para saber cómo funciona esta técnica, es necesario conocer la bioquímica del agua, porque gracias a ello se ha conseguido desarrollarla. El agua es una molécula formada por dos átomos de hidrógeno y uno de oxígeno, es de pequeño tamaño y tiene propiedades polares, electrostáticas, cohesivas, solventes y estabilizantes. Su comportamiento en los estadios de congelación se debe a su química bipolar, donde los átomos de hidrógeno llevan carga positiva e interactúan con los electrones no pareados del átomo de oxígeno para convertirse en una molécula dipolar. Éstas se unen unas a otras mediante puentes de hidrógeno. Además, pueden unirse a otros iones o moléculas otorgando los distintos estados de hidratación; es decir, el número de moléculas asociadas a un soluto es el indicativo del estado de hidratación de una célula. En contraste, las propiedades osmóticas de la célula vienen definidas por el flujo de solvente a través de una membrana pero no del soluto al que se encontraba asociado (Benson 2008).
Cuando el agua es líquida, los puentes de hidrógeno se rompen y forman constantemente; peor cuando se alcanzan los 0ºC se crean más puentes de hidrógeno, originando una estructura tridimensional definida, un cristal de hielo. Cuando se inicia la formación de un
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cristal de hielo, éste crece exponencialmente porque va reclutando a todas las moléculas de agua cercanas. Este proceso se conoce como nucleación y puede ocurrir tanto en el interior como en el exterior de la célula, ocasionando graves daños en las membranas por roturas o diferencias osmóticas (Benson 2008). Cuando se retira el agua, las soluciones se concentran y se vuelve más difícil el proceso de nucleación, porque hay menos número de moléculas de agua disponibles para formar el cristal de hielo.
Con el fin de evitar estos daños se han desarrollado dos grandes metodologías en la crioconservación: el enfriamiento progresivo para evitar la formación de cristales y la vitrificación.
Cuando se controla la velocidad de congelación, se puede permitir la formación de cristales extracelulares, variando el potencial osmótico y obligando al agua intracelular a salir al espacio extracelular para contrarrestar la variación. De esta forma, se consigue disminuir el número de moléculas de agua en el interior de la célula evitando la formación de cristales de hielo. Sin embargo, si este proceso se realiza demasiado rápido pueden producirse daños por desecación, ya que demasiada agua abandona la célula y se empiezan a producir los mismos síntomas a los de una desecación. Este método se suele denominar two step o “en dos pasos” para hacer referencia a que se realiza una congelación progresiva en dos grandes pasos. Suelen aplicarse primero sustancias crioprotectoras para a continuación descender la temperatura del material vegetal de forma lenta hasta los -40ºC. A partir de aquí se puede introducir el material directamente en nitrógeno líquido sin riesgo a que se formen cristales de hielo (Benson 2008; González-Benito et al. 2004).
Esta técnica está considerada por algunos autores como obsoleta, al tratarse de la primera en desarrollarse y por este motivo se desarrolló el método de vitrificación.
La vitrificación está basada en conseguir un estado vítreo o amorfo de las soluciones celulares; este estado se caracteriza por comportarse como un sólido, compartiendo las mismas características mecánicas y físicas pero por carecer de estructura organizada. Para lograr unas soluciones vítreas es necesario aumentar su viscosidad concentrándolas y aplicando distintos compuestos crioprotectores (Benson 2008).
Estas sustancias crioprotectoras, también mencionadas en la metodología two step se pueden definir como sustancias que previenen la formación de cristales y evitan los daños que éstos provocarían. Su finalidad es aumentar la viscosidad y el potencial osmótico de las soluciones intracelulares así como eliminar o incluso sustituir el agua. Se clasifican en penetrantes y no penetrantes según su capacidad de introducirse en la célula. Idealmente
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un compuesto crioprotector debería ser penetrante pero no tóxico. Los más empleados son el dimetilsulfóxido (DMSO), el glicerol, la sacarosa, el polietilénglicol (PEG) y la polivinilpirridoxona (PVP). Sin embargo, tanto el DMSO como el PVP son sustancias tóxicas (Benson 2008).
Independientemente de los métodos que se empleen para congelar el material que se quiera conservar, en algún momento será necesario descongelarlo y recuperarlo. Para ello, tras muchos estudios, se ha concluido que lo mejor es introducir el material directamente en un baño de agua a 40ºC para evitar la formación de cristales mientras se descongela lentamente (González-Benito et al. 2004).
Además de la toxicidad ya mencionada de las sustancias crioprotectoras, el material vegetal está expuesto a muchos tipos de estrés durante todo el proceso de crioconservación: cambios en el pH, cambios mecánicos de las membranas, deshidratación y rehidratación, estrés oxidativo y cambios de temperatura. Todos ellos pueden ocasionar daños como la formación de especies reactivas de oxígeno. Éstas aparecen por el estrés fotooxidativo durante el cultivo del material, por la escisión del material a conservar, por las posibles heridas realizadas, por los cambios de temperatura y por la aplicación de sustancias crioprotectoras. Las moléculas denominadas como especies reactivas del oxígeno se clasifican en radicales y no radicales, pero ambos tipos son muy perjudiciales en las rutas metabólicas, ya que intervienen en ellas. Pueden llegar a ocasionar la muerte del material vegetal. Por otro lado, también debido a la formación de especies reactiva de oxígeno, se produce la peroxidación de lípidos de membrana evitando que ésta funcione correctamente. También pueden producirse daños mecánicos de la membrana, pérdida de la respuesta osmótica o comportamiento alterado a causa de las expansiones celulares (Kaczmarczyk et al. 2012). Finalmente, pueden producirse fallos en la estabilidad genética y epigenética debidos a la suma de todos estos estreses y a algunas manipulaciones que pueden promover su aparición (Benson 2008).
I. 2. INESTABILIDAD GENÉTICA
Tal y como se acaba de ver, el material vegetal está sometido a condiciones físicas y químicas (altas y bajas temperaturas, adición de compuestos tóxicos, alta concentración de solutos, etc.) que pueden provocar cambios tanto morfológicos como a nivel genético . Además de los procesos propios de la metodología de crioconservación, las plantas deben pasar por un estadio de regeneración y de cultivo in vitro, viéndose entonces sometidas a las presiones que esta técnica supone.
Se han llevado a cabo estudios para determinar qué pasos son los más críticos en la crioconservación, y especialmente en la metodología de encapsulación-deshidratación. Se
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ha observado en cultivos de crisantemo que las variaciones genéticas que se observan son debidas al pretratamiento del material vegetal con sacarosa que aumenta el potencial osmótico (Martín et al. 2011). Así que el estrés por cambio de potencial osmótico parece el responsable de la aparición de variaciones genéticas y no la congelación del material en sí. Los cambios se acumulan a lo largo del proceso y por eso se expresan tras todo el proceso.
Otros estudios (Karty et al. 2008) asocian las variaciones genéticas que aparecen tras la crioconservación a la toxicidad del DMSO, al hecho de congelar el material vegetal y a la fase posterior de regeneración. Sin embargo, no siempre aparecen cambios genéticos tras este proceso, tal y como demuestra el análisis realizado en Quercus robur (Sánchez et al. 2008) donde no se observaron cambios asociados al protocolo de vitrificación ni al almacenaje en nitrógeno líquido aunque sí cambios mínimos cuando la metodología de crioconservación es la de encapsulación-deshidratación (0.10 %).
Las variaciones genéticas que se han estado mencionando se conocen mejor como variación somaclonal. Ésta se define como la variación originada por el cultivo de células o tejidos (Larkin & Scrowcroft 1981), pero algunos autores añaden que debe ser heredable (Bairu et al. 2011). Aunque esto no siempre puede comprobarse debido a incompatibilidad sexual, a la falta de producción de semillas, a poliploidías o a ciclos reproductivos demasiado largos.
Desde la primera vez que se detectó variación somaclonal (Braun 1959), ésta ha sido uno de los principales problemas en el cultivo in vitro cuando su fin es el de preservar la integridad genética de la planta tal y como se encontraba en el momento de establecer el cultivo. Sin embargo, puede ser de utilidad en programas de mejora genética vegetal cuando se están buscando nuevas variantes (Bairu et al. 2011).
Las variaciones somalconales pueden ser permanentes o temporales. Estas últimas provienen de cambios epigenéticos y fisiológicos, no son heredables y pueden ser reversibles. Los cambios permanentes suelen afectar a la secuencia de ADN o a la estructura cromosómica (Bairu et al. 2011), aunque también pueden existir cambios epigenéticos heredables.
Ya se ha visto que durante los distintos pasos del protocolo de crioconservación puede aparecer variación somaclonal; pero es importante recordar que también los procesos anteriores y posteriores de cultivo in vitro son susceptibles de generar este tipo de variaciones. El método de propagación del material vegetal puede favorecer la aparición de variaciones, como la presencia de tejidos desorganizados. También el tipo de material
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de partida es importante, ya que los meristemos apicales o axilares suelen ocasionar menos variación que otros tejidos más diferenciados (hojas, tallos o raíces). El tipo de medio de cultivo y los reguladores que se añaden son uno de los factores más importantes, ya que generan unas condiciones artificiales capaces de generar respuestas de estrés y por tanto variación somaclonal. Finalmente, el número y tiempo transcurrido entre subcultivos es decisivo; los subcultivos más seguidos suelen provocar mayores tasas de aparición de variación somaclonal (Bairu et al. 2011).
Una vez conocida la existencia y cómo aparecen este tipo de variaciones, es necesario detectarlas, y para ello existen varios métodos: morfológicos, fisiológicos y moleculares. Los métodos morfológicos buscan caracteres fenotípicos distintos a los de la planta madre con la esperanza de que vengan impuestos por variaciones genéticas. Sin embargo, esto no siempre es así, y las diferencias fenotípicas pueden aparecer por las condiciones de cultivo en las que se mantienen las plantas y no por variaciones a nivel de ADN. Los métodos fisiológicos buscan distintas respuestas a tratamientos con determinadas hormonas o sustancias, así como diferencias en la producción de compuestos del metabolismo, pero igualmente, no siempre responden a variaciones en la información genética del material, si no a diferencias en su expresión. Los métodos moleculares son más precisos que los anteriores ya que se buscan variaciones a nivel de la secuencia de ADN o del número y estructura de los cromosomas. Para este último tipo de variaciones se realizan técnicas citológicas, mientras que para las variaciones de la secuencia de ADN los siguientes métodos son los más empleados (Bairu et al. 2011):
• Los RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism) fueron de los primeros marcadores en emplearse para detectar variación somaclonal. Su metodología se basa en digerir el ADN extraído de la planta con enzimas de restricción y separar los fragmentos obtenidos mediante electroforesis. El ADN digerido es posteriormente hibridado con sondas marcadas (radiación o fluorescencia) de secuencia conocida. Se trata de un método complejo y caro, por lo que en la actualidad su empleo está bastante limitado tras la aparición de las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por lo general más sencillas.
• Los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) son marcadores arbitrarios; para su obtención se realiza una amplificación con cebadores decámeros generados al azar. El producto de la PCR se separa en una electroforesis en geles de agarosa y se observan las diferencias en las bandas que aparecen.
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arbitrarios. El ADN extraído se digiere con dos enzimas de restricción, una con una diana de seis pares de bases (generalmente EcoRI) y otra con cuatro pares de bases (generalmente MseI). Los fragmentos obtenidos se amplifican con dos cebadores diseñados para reconocer los extremos de la diana de corte. La primera amplificación se realiza con el cebador que reconoce la diana de corte más un nucleótido, y la segunda reconoce la diana más tres nucleótidos. De esta manera se reduce el número de fragmentos y de bandas a analizar, haciendo el proceso más manejable.
• Los microsatélites, en contraste con los dos métodos de PCR anteriores, reconoce lugares específicos. Se buscan diferencias en la longitud de las repeticiones en tándem del ADN. Para ello se diseñan cebadores específicos de la repetición.
I. 3. MENTHA AQUATICA
El género Mentha L. pertenece a la familia de las Labiadas; son plantas herbáceas o algo leñosas en la base, perennes, de crecimiento rápido y muy aromáticas. Presentan hojas simples y opuestas más o menos pelosas e inflorescencias formadas por cimas, espigas o cabezuelas. El género se compone de 20 especies distribuidas principalmente por Eurasia y África, aunque también se encuentran en Norteamérica, Australia y Nueva Zelanda. La hibridación entre especies es muy frecuente y da lugar a una gran variabilidad morfológica, lo que complica la sistemática del género
(Morales 2010).
La especie Mentha aquatica L. (Figura 1) es una hierba de hasta 150 cm de altura, con raíces estoloníferas y rizomatosa. Los tallos pueden llegar a los 5 mm de grosor, más o menos erguidos y en general muy pelosos en la parte superior. Las hojas son de ovadas a orbiculares, dentadas o aserradas y pecioladas; con nervios marcados por el envés y pelosas por ambos lados. Inflorescencia en cabezuela terminal con flores pediceladas actinomorfas. Se encuentra en cauces de aguas limpias, corrientes someras, lagunas, humedales, juncales, pastos y a veces en bosques de ribera. Aparece en toda la Península Ibérica (Morales 2010). Se considera que Mentha aquatica y Mentha spicata L. son los parentales del híbrido natural Mentha x
piperita, ésta última de gran importancia económica en el mundo por sus aceites Figura 1: Imagen de Mentha aquatica L.
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esenciales. El primer registro botánico de Mentha x piperita data de 1696, cuando la planta se recolectó en Inglaterra y se conservó en el herbario del Museo Británico. Su cultivo se inició en Inglaterra alrededor de 1750 con el fin de extraer el aceite. Rápidamente su producción y extracción se extendió a Estados Unidos y en los últimos 100 años, 22 países la cultivan. Entre ellos destacan Argentina, Australia, India e Italia con una producción de 25, 15, 350 y 30 toneladas respectivamente (Lawrence 2007). El aceite se emplea en una gran variedad de productos hoy en día como en cremas y pastas dentales, enjuagues bucales, jarabes, chicles o infusiones. Posee propiedades antisépticas y carminativas. En medicina tradicional se ha empleado como anestésico local y antiespasmódico, también en el control de los problemas intestinales, dolor dental, dolor de cabeza, náuseas y contracturas (Bhat et al. 2002).
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II. OBJETIVO
El objetivo principal de este trabajo es examinar la aparición de variación somaclonal en explantos de Mentha aquatica tras un proceso de crioconservación mediante la técnica
droplet. La variación somaclonal se analizará mediante el empleo de marcadores RAPDs
en plántulas procedentes del proceso completo de crioconservación comparadas con controles sometidos a los pretratamientos pero no a la inmersión en nitrógeno líquido. El estudio se lleva a cabo con individuos de diferentes poblaciones de la Península Ibérica y correspondientes a diferentes hábitats.
Entre los objetivos parciales se pueden señalar:
1. Establecer un protocolo de crioconservación en individuos procedentes de diferentes poblaciones de Mentha aquatica y determinar el medio de regeneración idóneo tras la crioconservación.
2. Analizar la estabilidad genética del material crioconservado y el efecto de los pretratamientos de crioconservación a la estabilidad genética mediante marcadores RAPD.
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III. MATERIAL Y MÉTODOS
El trabajo experimental se llevó a cabo en los laboratorios de cultivo in vitro del Departamento de Biología Vegetal en la Escuela Universitaria de Ingeniería Técnica Agrícola y en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid.
III. 1. MATERIAL VEGETAL
Se utilizaron dos individuos procedentes de cuatro poblaciones distintas de Mentha
aquatica tal y como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Listado de los distintos individuos y poblaciones de Mentha aquatica empleados.
Población Individuo Localidad Altitud
ALC ALC 3.1 L’Alcora (Castellón) 280 m
ALC 4.2
FAN FAN 1.2 Fanzara (Castellón) 231 m
FAN 4.1
GRI GRI 2.1 La Griega (Asturias) 20 m
GRI 4.2
TP TP 3 Tapia de Casariegos (Asturias) 19 m TP 7
Los vástagos se propagaron in vitro mensualmente y se mantuvieron en cámaras de crecimiento a 25ºC y un fotoperiodo de 16 h de luz (aprox. 40 µmol-2 s-1 de irradiancia procedente de tubos fluorescentes de luz blanca fría). El medio de cultivo empleado para la propagación in vitro fue el medio MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado con 3% de sacarosa, se ajustó el pH a 5,6-5,7 antes de autoclavar, y se solidificó con 0,7% de agar (agar bacteriológico Americano, laboratorios CONDA).
III. 2. RESPUESTA DE ÁPICES A DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO
Se estudió el medio de cultivo para ápices con un individuo de la población FAN. Se ensayaron el medio MS sin reguladores de crecimiento (MS) y con 0,5 mg/l 6-benzylaminopurina (BAP), denominando a este último medio R (Uchendu & Reed 2008). Ambos medios contenían 3% sacarosa, el pH se ajustó a 5,6-5,7 antes de autoclavar, y se solidificaron con 0,7% agar. Los medios se repartieron (10 mL) en cajas Petri de 6 cm de diámetro.13
Todos los medios de cultivo y materiales mencionados fueron esterilizados mediante un programa de autoclave de 20 minutos a 121ºC y 1 atmósfera de presión.
Se cultivaron 5 ápices por caja Petri, y el número de repeticiones fue de cuatro.
Los ápices se extrajeron a partir de segmentos nodales de un nudo (Figura 2), a los que se les eliminó las hojas con cuidado de no dañar las yemas axilares. Estos segmentos se cultivaron en tarros de cristal con medio MS y se incubaron en una cámara de cultivo a 25ºC con un fotoperiodo de 16 horas de luz y una irradiancia de 40 µmol-2 s-1.
Después de una semana de incubación las yemas axilares habían comenzado a brotar y se procedió a la extracción de los ápices (Figura 3 y Figura 4). Con ayuda de una lupa y con luz fría se procedió a separar los ápices de aproximadamente 1-2 mm, eliminando con cuidado las hojas externas. Los ápices se cultivaron en placas Petri (poniendo cinco ápices en cada placa) con medio MS o con medio R; se utilizaron cuatro réplicas por medio. Se incubaron durante cuatro semanas en una cámara de cultiva a 25ºC, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y una irradiancia de 40 µmol-2 s-1.
Cada semana se observó el número de ápices contaminados y a las cuatro semanas de cultivo se tomaron datos acerca del número de vástagos desarrollados, el número de raíces, el número de nudos del vástago principal, la presencia de callo y la longitud del vástago principal.
III. 3. CRIOCONSERVACIÓN MEDIANTE VITRIFICACIÓN-DROPLET
Se realizó la crioconservación de ápices procedentes de los individuos presentados en la Tabla 1 siguiendo el procedimiento explicado en los siguientes puntos. Todos los medios de cultivo y materiales mencionados fueron esterilizados mediante un programa de autoclave de 20 minutos a 121ºC y 1 atmósfera de presión.Figura 2: Representación de un vástago de Mentha. A: vástago completo.
B: segmento nodal recién cortado.
C: segmento nodal tras 1-2 semanas de cultivo. s.n. Segmento nodal.
Las líneas de puntos representan las zonas de corte.
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I.1.1 PRE-CULTIVO DE SEGMENTOS NODALES
Se extrajeron los segmentos nodales de la misma forma que la explicada en el apartado anterior. A continuación se cultivaron en botes (15 segmentos por bote) con medio MS y se incubaron durante dos semanas en una cámara de cultivo con temperaturas alternas (25ºC/ -1ºC; 16 h luz/ 8 h oscuridad) para su aclimatación al frío, con una irradiancia de 50 µmol-2 s-1.
I.1.2 PRE-CULTIVO Y TRATAMIENTOS DE ÁPICES
Tras el pre-cultivo de los segmentos nodales (Figura 3) se extrajeron los ápices (Figura 4) que se habían desarrollado a partir de las yemas axilares. A medida que se extraían los ápices se fueron colocando en placas Petri con medio MS para evitar su desecación.
A continuación cultivaron en placas Petri de 6 centímetros de diámetro con 2 papeles de filtro y 2mL de medio MS líquido suplementado con 0,3 M sacarosa (20-30 ápices por placa). Se incubaron a 25ºC con un fotoperiodo de 16 horas y baja irradiancia (10 µmol-2 s-1), durante un día.
I.1.3 VITRIFICACIÓN-DROPLET DE ÁPICES
Los ápices pre-tratados con el medio MS + 0,3 M sacarosa fueron colocados en placas Petri de 6 cm de diámetro con 2 papeles de filtro y 2 mL de solución de carga (MS + 2M glicerol + 0,4 M sacarosa) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se transfirieron los ápices (retirando el filtro superior de la placa Petri y colocándolo boca a bajo sobre otra placa Petri para depositar los ápices) a otra placa Petri con 2 papeles de filtro y 2 ml de solución vitrificante PVS2 (Sakai et al. 1990) durante 30 minutos sobre
Figura 3: Segmento nodal de un vástago del individuo 4.2 de la población GRI. a. Peciolo de la hoja cortada. b. Brotes a partir de la yema axilar.
Figura 4: Ápice procedente del brote de la yema axilar; del individuo 4.2 de la población GRI. a. Base de las hojas eliminadas. b. Primeras hojas visibles
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hielo picado. La solución PVS2 (MS + 0,4 M sacarosa + 30% p/v glicerol + 15% p/v etilenglicol + 15% p/v dimetilsulfóxido -DMSO) se preparó de forma que el DMSO se añadió en el último momento y se esterilizó mediante filtración, manteniéndola siempre fría. Se colocaron unas tiras de papel de aluminio de 5 mm x 2,5 mm sobre una placa Petri, y ésta a su vez sobre un bloque refrigerante congelado; pasados los 30 min en la solución PVS2, se colocaron con cuidado 5 ápices en cada tira de papel de aluminio y sobre cada uno 2 µl de solución PVS2 (Figura 5). Luego, con ayuda de unas pinzas, se colocó una tira de papel de aluminio dentro de un criovial, se cerró y rápidamente se sumergió en nitrógeno líquido y se mantuvo durante una hora. Transcurrido este tiempo se calentaron rápidamente los crioviales sumergiéndolos en un baño de agua caliente (40ºC) durante 20 segundos. A continuación se introdujo 1 ml de solución de lavado (MS + 1,2 M sacarosa) en el criovial y se volcó el contenido en una placa Petri con 2 papeles de filtro y 2 mL de solución de lavado; se dejó incubar durante 20 minutos. Se transfirieron los ápices al medio de recuperación (medio R, ver apartado III.2) y se mantuvieron en oscuridad (envueltos con papel de aluminio) a 25ºC durante un día. Finalmente se les quitó el papel y se cultivaron a 25ºC y a baja irradiancia (10 µmol-2 s-1) durante cuatro semanas. Transcurrido este tiempo, los ápices que sobrevivieron se pasaron a medio MS y se llevaron a cabo los subcultivos periódicos (una vez al mes) durante el tiempo que duró el trabajo experimental. Cuatro semanas después de este establecimiento en medio MS, se seleccionaron algunos explantos de los individuos para pasarlos a condiciones ex vitro. Se colocaron en macetas individuales a tierra, cubiertos con un bote de cristal en condiciones de luz y temperatura naturales durante dos semanas; luego se destaparon.
16 I.1.4 TOMA DE DATOS
Para evaluar el éxito del procedimiento de crioconservación se tomaron datos una vez cada semana durante un período de cuatro semanas. La toma de datos consistió en contar el número de ápices contaminados, la longitud del vástago principal, la presencia o ausencia de raíces y la aparición de hiperhidricidad. Cuando se pasaron los explantos a medio MS se continuó con la toma de datos, pero los parámetros a medir cambiaron; se contó el número de vástagos, la longitud del vástago principal y la aparición de morfologías extrañas en las hojas.
I.1.5 TOMA DE MUESTRAS
Para poder llevar a cabo el análisis genético del material crioconservado, pasadas las cuatro semanas de cultivo en placas con medio R y a baja irradiancia se tomaron muestras de hoja. Se tomaron dos muestras control de cada individuo de las 4 poblaciones estudiadas. En cada muestra se tomaron dos hojas, intentando que la cantidad fuera la misma, cortando las hojas en caso necesario. Se introdujeron en tubos eppendorf de 2ml con cuatro bolas de vidrio para su posterior pulverización y se conservaron congeladas a -80ºC hasta su utilización.
III. 4. EXTRACCIÓN DE ADN
Para realizar la extracción del ADN se ha seguido el protocolo de Gawel & Jarret (1991), pero con algunas modificaciones; por este motivo se detalla a continuación el proceso. Se tomaron las muestras congeladas a -80ºC y se introdujeron en nitrógeno líquido durante unos segundos. Se colocaron en el homogeneizador (Tissue Lyser II) durante 60 segundos. A continuación se añadieron 700 µl de buffer de extracción (CTAB, bisulfito sódico 3,8 g/l, !-mercaptoetanol 0,2% v/v y PVP 1% p/v) precalentado a 65ºC y se incubó durante una hora en un baño con agua a 65ºC. Pasado este tiempo se añadieron 600 µl de cloroformo y se mezcló por inversión durante 5 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se centrifugaron durante 7 minutos a 12.000 rpm. Se tomaron 500 µl del sobrenadante y se transfirieron a tubos eppendorf nuevos a los que se añadió 500 µl de isopropanol helado y se mezcló por inversión. Se dejaron las muestras toda la noche a -20ºC. A continuación se centrifugaron durante 7 minutos a 12.000 rpm. Se vertió el isopropanol y se dejaron los tubos abiertos boca abajo durante unos minutos para conseguir eliminar la mayor cantidad de líquido. Transcurrido el tiempo de secado se añadieron 300 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente para lavar el pellet y se centrifugó durante 7 minutos a 12.000 rpm. Se vertió el etanol de la misma forma que el isopropanol, pero esta vez se dejaron los tubos boca abajo durante 5 horas para conseguir
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que el pellet quedara completamente seco. Pasado este tiempo, se resuspendió el pellet con 75 µl de agua destilada y se congeló a -20ºC.
Estas muestras con el ADN resuspendido en agua se denominarán ‘extractos’.
III. 5. CUANTIFICACIÓN DEL ADN
Con el fin de conocer la cantidad de ADN que se había extraído se realizó una prueba de cuantificación. Para ello se mezclaron 5 µl de agua destilada, 5 µl de extracto y 2 µl de tampón de carga (Ficoll 400, EDTA 0.2M, azul de bromofenol 12.5% p/v en agua destilada esterilizada). Estas mezclas se cargaron en un gel de agarosa al 0.8%, (AGAROSE D1 LOW EEO) en TBE 1X (se preparó a partir de un stock concentrado a 10X que contenía Tris 1M, ácido bórico 1M y EDTA 0.5M en agua destilada), en buffer TBE 1X y se llevó a cabo la electroforesis a 110 V durante 10 minutos. A continuación, se tiñó el gel con bromuro de etidio durante 7 minutos y se lavó durante 30 minutos. Para su visualización se tomó una fotografía con luz ultravioleta utilizando un equipo de toma de imágenes digitales Kodak.
A partir del resultado obtenido se realizaron soluciones de trabajo en función de la cantidad de ADN presente, diluyendo los extractos en agua destilada esterilizada.
III. 6. ANÁLISIS MEDIANTE RAPD
De todas las soluciones de trabajo realizadas, se seleccionaron 6 muestras de cada individuo (una muestra control y cinco muestras crioconservadas) de las cuatro poblaciones (48 muestras en total) para realizar el análisis mediante RAPD. Además de las muestras procedentes de plantas crioconservadas y no crioconservadas pero a las que se les aplicó el mismo procedimiento a excepción de la inmersión en nitrógeno líquido; se analizaron también muestras procedentes de individuos de las mismas poblaciones conservados in vitro, muestras de las plantas madre (recogidas en el año 2013 y conservadas a -80ºC) y muestras de las plantas crioconservadas pasadas a condiciones ex
vitro. Se realizaron dos repeticiones de cada muestra y de cada cebador para obtener datos
fiables y reproducibles. Para evitar contaminaciones se emplearon tubos y puntas estériles.
Las amplificaciones mediante PCR se realizaron utilizando mezclas de reacción con 5µl de ADN procedente de las soluciones de trabajo, buffer de reacción MyTaq 5x, cebadores a una concentración final de 20 µM, 0.25 µl de polimerasa MyTaq, 13.75 µl de agua destilada estéril y una gota de aceite mineral para evitar la evaporación de la mezcla. Los cebadores empleados fueron: OPF-01 (5’-ACG GAT CCT G-3’), OPF-4 (5’-GGT GAT
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CAG G-3’),OPE-19 (5’-ACG GCG TAT G-3’), 7 (5’-CAG CAC TGA C-3’), OPO-10 (5’-TCA GAG CGC C-3’) y OPO-20 (5’-ACA CAC GCT G-3’) de OPERON. Se empleó el termociclador DNA Termal Cycler480 (Perkin-Elmer (Canada), Nepean, Ontario). Tras una desnaturalización inicial del ADN a 95ºC durante 1 minuto, se repitieron 35 ciclos con el siguientes esquema: 95ºC durante 15 segundos, 37ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 10 segundos. Se realizó una extensión final a 72ºC durante 10 minutos,. Los productos amplificados se resolvieron en un gel de agarosa al 1.5% en TBE 1X a 100 V durante 2 horas y media. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio durante 7 minutos y se lavaron con agua destilada durante 30 minutos antes de ser fotografiados con luz ultravioleta.
III. 7. CONSTRUCCIÓN DE LOS DENDROGRAMAS
Con los resultados de las electroforesis, y a partir de los marcadores reproducibles, se realizó una matriz de datos (presencia/ausencia de marcadores). A partir de ésta y con el programa NTSYSpc se creó una matriz de similitud empleando el coeficiente de Jaccard, (Jaccard 1908): GS(ij) = a / (a + b + c); donde a es el número de fragmentos de ADN polimórficos, b es el número de fragmentos presentes en i y ausentes en j, y c es el número de fragmentos presentes en j y ausentes en i. A partir de esta matriz se realizó un análisis de agrupamiento mediante el método UPGMA (Unweighted pair-group analysis) que permitió construir un dendrograma mediante el programa TREE. Todos estos análisis se realizaron con el programa NTSYS-PC version 1.80 (Rohlf 1992).
III. 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para realizar los análisis estadísticos se empleó el programa de software libre R; en los casos correspondientes se realizó la media de los valores medidos y se les aplicó un análisis de varianza (ANOVA). En los datos recogidos de forma binaria se llevó a cabo un análisis de regresión logística y la posterior prueba del Chi cuadrado. Los datos se han considerado significantes a partir de un p-valor de 0.05.
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IV. RESULTADOS
IV. 1. RESPUESTA DE LOS ÁPICES A DISTINTOS MEDIO DE
CULTIVO
Con el fin de evaluar cuál era el medio de cultivo más adecuado para el desarrollo de los ápices antes y después del tratamiento de la crioconservación, se midieron cuatro parámetros distintos: el número de vástagos, el número de nudos del vástago principal, el número de raíces desarrolladas por ápice y la longitud del vástago principal. Los datos recogidos de estos parámetros se muestran en la Figura 6. Como puede observarse, se encontraron diferencias significativas en dos de los cuatro valores medidos (número de vástagos y longitud del vástago principal).
Nº vástagos Nº nudos Nº raíces Long tallo p-valor <0,001 <0,05 0,1 <0,001
Figura 6: Representación gráfica de los resultados obtenidos tras analizar los datos de la respuesta de los ápices a distintos medios de cultivo. A: Número de vástagos desarrollados por ápice. B: Número de nudos del vástago principal. C: Número de raíces desarrolladas por ápice. D: Longitud (mm) del vástago principal. En la base de la figura se observan los p-valores extraídos al realizar el ANOVA con los datos. MS: medio de cultivo de Murashige y Skoog; R: medio de Reed
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IV. 2. RESPUESTA A LA CRIOCONSERVACIÓN
Para medir el efecto del proceso de crioconservación en los ápices se tomaron datos cada semana durante un período de 4 semanas mientras los ápices se encontraban en el medio R; en la Figura 7 se muestran tres imágenes de los ápices de los individuos 4.2, 7 y 3.1 de las poblaciones La Griega, Tapia y L’Alcora respectivamente.
Figura 7: Ápices tras dos semanas de cultivo en medio R. A: Individuo 4.2 de la población de La Griega. Las flechas señalan ápices sin desarrollo; B: individuo 7 de la población de Tapia y C: individuo 3.1 de la población de L’Alcora.
En esta figura pueden observarse algunos de los fenómenos surgidos a lo largo de la ejecución del experimento: (1) los ápices no crecían ni se desarrollaban (tal y como puede verse en los tres ápices de la placa A señalados con una flecha), (2) la presencia de contaminación por parte de bacterias formando colonias amarillas no observadas hasta el momento durante el cultivo in vitro (casi todos los individuos de la población de L’Alcora (placa C, sufrían esta contaminación), (3) el desarrollo anormal de los ápices por un fenómeno conocido como hiperhidricidad (exhibido por todos los ápices pertenecientes al individuo 7 de la población de Tapia (placa B)) y (4) el desarrollo normal de los ápices (tres de los seis ápices de la placa A).
La Figura 8 muestra el aspecto que presentaban las placas del ensayo tras cuatro semanas de cultivo.. A simple vista no se ven grandes diferencias entre los ápices control (aquellos que sufrieron el mismo proceso de crioconservación pero que no se introdujeron en nitrógeno líquido) y los que han completado todo el proceso de crioconservación. Por otro lado, se observan diferencias claras entre individuos de la misma población en el caso de Tapia, donde además, el individuo 7 es el que mejor ha respondido al tratamiento. Sin embargo, éste presenta hiperhidricidad en todos los ápices. Los dos individuos de la población de Fanzara son los que peor han reaccionado a todo el tratamiento. En los ápices de la población de L’Alcora persiste la contaminación por parte de la bacteria antes mencionada.
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Figura 8: Ápices tras cuatro semanas de crecimiento. Las tres últimas filas corresponden a los ápices control y el resto a los que han sufrido todo el proceso de crioconservación.
Para realizar el estudio estadístico, se tomaron los datos de forma binaria de cuatro parámetros distintos: supervivencia, presencia de raíces, presencia de contaminación e hiperhidricidad. Estas variables eran dependientes de tres factores: el tratamiento (crioconservación y control), la población y el individuo dentro de cada población. Se ha realizado una regresión logística con los distintos factores de forma individual.
Cuando se analizan las poblaciones sin tener en cuenta el tratamiento que se les ha aplicado, se observan diferencias significativas entre ellas. Siendo Fanzara la población que menor tasa de supervivencia tiene (con un 35%), y Tapia la de mayor supervivencia
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con un 76%. Si se analiza el tratamiento sin tener en cuenta la población también aparecen diferencias significativas, presentando una mayor supervivencia aquellos ápices que no han sido sometidos al proceso de congelación, como cabe esperar. Finalmente, cuando se analizan los distintos individuos dentro cada una de las poblaciones sin tener en cuenta el tratamiento, no se observan diferencias entre ellos a excepción del individuo 7 de Tapia, que sí muestra una variación muy significativa respecto al resto de individuos. Por otro lado, se ha analizado la interacción de los factores (Figura 9), observándose que existe una relación entre el tratamiento y la población a la hora de evaluar la supervivencia de los ápices a la crioconservación. La supervivencia de los ápices de la población de Fanzara varía mucho en función del tratamiento, en la crioconservación solo sobrevive el 16% mientras que en el control viven el 73%. Estas diferencias también se observan, aunque no tan acusadas, en la población de L’Alcora, con una supervivencia del 48% en crioconservadas y del 73% en control. En las otras dos poblaciones las diferencias no son significativas. Sin embargo, como las diferencias entre las dos primeras poblaciones son tan grandes al tratar al factor población respecto al tratamiento, al realizar las pruebas estadísticas aparece como significativa su relación.
Pobl. Alc Fan Gri Tp Trat. Control Crio Pobl:Trat p-valor <0,001 0.27 <0,01 0,1 <0,01 <0,001 <0,001 <0,001 <0,05
Figura 9: Representación gráfica de la tasa de supervivencia de los ápices en función de la población y el tratamiento. En la parte inferior se detalla el p-valor de la regresión logística y del Chi-cuadrado. Pobl.: Población, Alc: Alcora, Fan: Fanzara, Gri: La Griega, Tp: Tapia, Crio: crioconservada, Pobl:Trat: interacción entre población y tratamiento.
El parámetro de la presencia o ausencia de raíces proporciona unos resultados similares a los de supervivencia en cuanto al efecto de la población. El efecto de la población es muy significativo respecto a la aparición de raíces; este resultado se mantiene cuando se descompone en las cuatro poblaciones distintas; siendo la población de La Griega aquella con un mayor porcentaje (78%) y la de Fanzara la de menor (34%). Sin embargo, el
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tratamiento de crioconservación no ha tenido ningún efecto en el desarrollo de las raíces debido a que los porcentajes en ambos tratamientos es prácticamente el mismo, 63% crioconservadas y 64% en control.
La aparición de contaminación fue mayor en aquellos ápices que sufrieron el proceso de crioconservación que en los controles. Entre las poblaciones, Fanzara, Tapia y La Griega mostraron porcentajes similares de contaminación, pero L’Alcora presentó un 94% de contaminación de sus ápices.
Se observa que todos los explantos del individuo 7 de Tapia son hiperhídricos.
IV. 3. EVOLUCIÓN DE LOS ÁPICES TRAS LA CRIOCONSERVACIÓN
Tras las cuatro semanas en medio R, los explantos fueron traspasados a medio MS en tarro para analizar su posterior desarrollo. Se recogieron datos una vez a la semana durante cuatro semanas sobre número de vástagos, longitud del vástago principal, número de nudos del vástago principal, presencia de raíces, presencia de hiperhidricidad y aparición de morfologías extrañas. Debido a que estos datos se recogieron de forma numérica, se pudo realizar la media de cada variable medido respecto a los factores población, individuo y tratamiento. De esta manera se realizó un análisis de las medias de los datos y averiguar el grado de significación entre ellos. Se analizó el efecto de cada factor de forma independiente y en conjunto.Transcurridas cuatro semanas del establecimiento del cultivo en medio MS los resultados sobre el número de vástagos que presenta cada explanto varían de manera significativa en función de la población y del individuo pero no por el tratamiento que recibieron (Figura 10). Cuando se toman las variables de individuo y tratamiento juntas, las diferencias que aparecen son significativas, pero no cuando se analiza la población en función del tratamiento.
La longitud del vástago principal muestra diferencias entre poblaciones e individuos, pero no por el tratamiento que recibieron (Figura 11). Cuando se analizan las variables individuo y tratamiento juntas o las de población y tratamiento juntas, no se obtienen diferencias significativas.
El número de nudos del vástago principal varía de forma significativa en función del tratamiento y del individuo de la población, pero no en función de la población (Figura 12). Tampoco se observan diferencias al tratar las variables de forma conjunta.
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Población Individuo Tratamiento Ind:Trat Pobl:Trat
p valor <0.05 <0.001 0.418 <0.05 0.628
Figura 10: Representación gráfica de la media del número de vástagos que desarrolló cada explanto tras cuatro semanas de cultivo en medio MS.
Población Individuo Tratamiento Ind:Trat Pobl:Trat
p valor <0.05 <0.001 0.289 0.74 0.756
Figura 11: Representación gráfica de la media de la longitud del tallo principal de cada explanto tras cuatro semanas de cultivo en medio MS.
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Población Individuo Tratamiento Ind:Trat Pobl:Trat
p valor 0.07 <0.001 <0.05 0.497 0.374
Figura 12: Representación gráfica de la media del número de nudos del vástago principal de cada explanto tras cuatro semanas de cultivo en medio MS
Todos los explantos de las poblaciones presentan raíces.
La hiperhidricidad del individuo 7 de Tapia, persiste en el cultivo en medio MS; algunos de los vástagos nuevos que aparecen revierten a un estado normal. En algunos explantos de las poblaciones de Fanzara y La Griega aparecieron hojas alternas en lugar de opuestas (propias de la especie). Además, en los dos individuos de la población de La Griega, tanto en plantas control como crioconservadas, se observaron que algunos vástagos donde en las hojas basales aparecían dos hojas opuestas, los vástagos nuevos que se desarrollaban presentaban tres hojas en el nudo en lugar de dos (Figura 13).
Transcurridas las cuatro semanas de cultivo en medio MS, se pasaron a tierra algunos explantos de cada población e individuo para comprobar cómo se desarrollaban y analizar si los cambios morfológicos observados revertían. Se observa que los individuos con hojas alternas pierden esta característica a medida que se van desarrollando nuevas hojas. Sin embargo, aquellos que presentaban tres hojas en lugar de dos, mantienen este carácter en
Figura 13: Individuo 4.2 de la población de La Griega con morfologías anómalas en las hojas. La flecha cortada indica una zona donde las hojas aparecen de forma alterna en lugar de opuesta. La flecha completa indica una zona donde se observan tres hojas dispuestas de forma opuesta.
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todos los nuevos vástagos que se desarrollan. Las plantas con hiperhidricidad revierten a un estado normal (Figura 14).
Figura 14: Imágenes de los explantos desarrollados a partir de los ápices crioconservados pasados a tierra. A: Individuo 4.1 de la población de Fanzara, la flecha cortada indica una zona con hojas alternas y la flecha completa señala las hojas nuevas opuestas. B: Individuo 4.2 de la población de la Griega, las flechas señalan nudos con tres hojas opuestas. C: Individuo 7 de la población de Tapia, se observa una morfología normal de las hojas nuevas sobre un explanto hiperhídrico.
IV. 4. ANÁLISIS MEDIANTE RAPDS
Los seis cebadores empleados permitieron el análisis de 104 bandas en las muestras crioconservadas y control, con valores desde 400 hasta 2500 pb (Figura 15). Por otro lado, las plantas madre, y los controles in vitro se analizaron conjuntamente.
El primer paso para analizar la estabilidad genética en el proceso de crioconservación de
Mentha aquatica fue comparar las plantas madre de las poblaciones estudiadas con su
correspondiente material in vitro a partir del cual se tomaron los explantos para el ensayo de crioconservación. El análisis comparativo de los 49 fragmentos obtenidos en el análisis de las plantas madre y los controles in vitro reveló, en primer lugar que todos los individuos incluidos en el estudio mostraban genotipos distintos a excepción de los dos individuos de la población de Tapia que presentaban una similitud del 100%. Otro dato importante es que todos los individuos presentaban diferencias entre la muestra correspondiente a la planta madre y muestra del cultivo in vitro (Figura 16). El genotipo más estable es el de la población de Tapia, donde no se detectan diferencias entre las 2 plantas madre de los dos individuos ni entre las correspondientes muestras in vitro, pero entre los dos grupos de muestras la similitud es del 96%. Se podría considerar que se trata del mismo genotipo y las pequeñas variaciones que aparecen son debidas a errores de manipulación de los datos. En la población de La Griega se agrupa cada planta madre con su control in vitro, en el individuo 2.1 la similitud entre la planta madre y la planta in
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son las que presentan una menor similitud. Entre las plantas madre de L’Alcora y los controles in vitro se observa un coeficiente de similitud del 81%, además se agrupan por un lado las plantas madre de los dos individuos y por otro las plantas in vitro. En Fanzara ocurre lo mismo, las plantas madre de los dos individuos se agrupan, pero la similitud entre estas con los controles in vitro es de sólo el 79%.
Figura 15: Patrón de bandas obtenido con el cebador O20 en las muestras control (C1 y C2) y las crioconservadas (Cr1-Cr4) en las poblaciones de Tapia y L’Alcora. Las flechas marcan diferencias en el perfil de bandas dentro del mismo individuo.
Figura 16: Dendrograma obtenido a través del método UPGMA empleando el coeficiente de Jaccard entre las muestras de las plantas madre y los controles in vitro. Pm: planta madre, in: planta in vitro.
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El análisis de las muestras crioconservadas se realizó por población, incluyendo las muestras control del proceso de crioconservación. Para poder establecer una relación entre este análisis y el material in vitro del que se partía se realizó un análisis por población que consideraba la muestra in vitro, el control de crioconservación, una muestra crioconservada y planta aclimatada a condiciones ex vitro, cuando existía, (Figura 17).
Figura 17: Dendrogramas de planta in vitro y crioconservadas. Ac: planta aclimatada, c: control de crioconservación, Cr: crioconservada, in: planta in vitro.
En la población de Tapia, las plantas in vitro mostraron un coeficiente de similitud del 94% con las plantas crioconservadas (Figura 17). Éstas entre ellas no se agruparon por individuos. Tampoco se observa que sean más similares las muestras control entre ellas ni que éstas difieran de las plantas crioconservadas (Figura 18). Las muestras más alejadas, correspondientes a muestras crioconservadas, llegan a presentar un coeficiente del 88% de similitud.
La población de La Griega también presentaba ligeras diferencias entre las plantas in vitro y las crioconservadas, con un coeficiente de similitud entre ellas del 93% en el individuo 2.1 y de un 94% en el individuo 4.2 (Figura 17). El dendrograma correspondiente a las muestras crioconservadas agrupa de forma separada las muestras correspondientes a cada
