III. MATERIAL Y MÉTODOS
IV. 4. ANÁLISIS MEDIANTE RAPDS
Los seis cebadores empleados permitieron el análisis de 104 bandas en las muestras crioconservadas y control, con valores desde 400 hasta 2500 pb (Figura 15). Por otro lado, las plantas madre, y los controles in vitro se analizaron conjuntamente.
El primer paso para analizar la estabilidad genética en el proceso de crioconservación de
Mentha aquatica fue comparar las plantas madre de las poblaciones estudiadas con su
correspondiente material in vitro a partir del cual se tomaron los explantos para el ensayo de crioconservación. El análisis comparativo de los 49 fragmentos obtenidos en el análisis de las plantas madre y los controles in vitro reveló, en primer lugar que todos los individuos incluidos en el estudio mostraban genotipos distintos a excepción de los dos individuos de la población de Tapia que presentaban una similitud del 100%. Otro dato importante es que todos los individuos presentaban diferencias entre la muestra correspondiente a la planta madre y muestra del cultivo in vitro (Figura 16). El genotipo más estable es el de la población de Tapia, donde no se detectan diferencias entre las 2 plantas madre de los dos individuos ni entre las correspondientes muestras in vitro, pero entre los dos grupos de muestras la similitud es del 96%. Se podría considerar que se trata del mismo genotipo y las pequeñas variaciones que aparecen son debidas a errores de manipulación de los datos. En la población de La Griega se agrupa cada planta madre con su control in vitro, en el individuo 2.1 la similitud entre la planta madre y la planta in
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son las que presentan una menor similitud. Entre las plantas madre de L’Alcora y los controles in vitro se observa un coeficiente de similitud del 81%, además se agrupan por un lado las plantas madre de los dos individuos y por otro las plantas in vitro. En Fanzara ocurre lo mismo, las plantas madre de los dos individuos se agrupan, pero la similitud entre estas con los controles in vitro es de sólo el 79%.
Figura 15: Patrón de bandas obtenido con el cebador O20 en las muestras control (C1 y C2) y las crioconservadas (Cr1-Cr4) en las poblaciones de Tapia y L’Alcora. Las flechas marcan diferencias en el perfil de bandas dentro del mismo individuo.
Figura 16: Dendrograma obtenido a través del método UPGMA empleando el coeficiente de Jaccard entre las muestras de las plantas madre y los controles in vitro. Pm: planta madre, in: planta in vitro.
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El análisis de las muestras crioconservadas se realizó por población, incluyendo las muestras control del proceso de crioconservación. Para poder establecer una relación entre este análisis y el material in vitro del que se partía se realizó un análisis por población que consideraba la muestra in vitro, el control de crioconservación, una muestra crioconservada y planta aclimatada a condiciones ex vitro, cuando existía, (Figura 17).
Figura 17: Dendrogramas de planta in vitro y crioconservadas. Ac: planta aclimatada, c: control de crioconservación, Cr: crioconservada, in: planta in vitro.
En la población de Tapia, las plantas in vitro mostraron un coeficiente de similitud del 94% con las plantas crioconservadas (Figura 17). Éstas entre ellas no se agruparon por individuos. Tampoco se observa que sean más similares las muestras control entre ellas ni que éstas difieran de las plantas crioconservadas (Figura 18). Las muestras más alejadas, correspondientes a muestras crioconservadas, llegan a presentar un coeficiente del 88% de similitud.
La población de La Griega también presentaba ligeras diferencias entre las plantas in vitro y las crioconservadas, con un coeficiente de similitud entre ellas del 93% en el individuo 2.1 y de un 94% en el individuo 4.2 (Figura 17). El dendrograma correspondiente a las muestras crioconservadas agrupa de forma separada las muestras correspondientes a cada
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uno de los dos individuos de la población (Figura 19), lo cual concuerda con la clara
Figura 18: Dendrograma de la población de Tapia de las plantas crioconservadas y los controles.
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diferencia observada entre los dos genotipos de las plantas madre en el análisis previo (Figura 16). En ambos individuos las dos muestras controles no se agrupan entre ellas sino que lo hacen con muestras crioconservadas. Las muestras correspondientes al individuo 2.1 se agrupan con una similitud entre ellas de al menos un 93% (Figura 14) En este individuo, 2.1, el control 1 se une con una muestra crioconservada con un coeficiente del 97% y difieren (93%) de un grupo formado por las otras dos muestras crioconservadas y el segundo control. En el individuo 4.2 los dos controles y las muestras crioconservadas se agrupan con un coeficiente de aproximadamente el 96%, habiendo dos muestras crioconservadas que presentan el mismo genotipo (Gri4Cr1 y Gri4Cr2). En este último individuo la mayor diferencia aparece en una muestra correspondiente a un callo que se aleja mucho del resto (con un coeficiente del 59%).
En la población de L’Alcora se observan diferencias del orden de un 91% de similitud entre las plantas conservadas in vitro y las crioconservadas (Figura 17). Cuando se analizan las plantas crioconservadas (Figura 20), se observa que éstas no varían entre ellas a excepción de una muestras que se aleja del resto, con un coeficiente del 98% de similitud.
Figura 20: Dendrograma de la población de L’Alcora de las plantas crioconservadas y los controles.
Las plantas in vitro y las crioconservadas de la población de Fanzara difieren entre ellas y presentan un coeficiente de similitud del 85% (Figura 17). En el dendrograma de las plantas crioconservadas (Figura 21) se observa que las muestras correspondientes a los
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dos individuos estudiados se agrupan claramente entre ellas, a excepción de la muestra FAN1Cr3. En el individuo 4.1 se diferencia un grupo formado por el control y cuatro muestras crioconservadas con un coeficiente de similitud del 97% que difieren de una tercera muestra crioconservada (con un 94% de similitud). Por otro lado, en el individuo 1.2, los dos controles son idénticos entre ellos y a una muestra crioconservada; sin embargo, aparee otra muestra crioconservada que se aleja bastante del resto, con un coeficiente del 75%.
Figura 21: Dendrograma de la población de Fanzara de las plantas crioconservadas y controles.
Como ya se ha comentado con anterioridad, a partir de algunos explantos de las plantas crioconservadas se establecieron cultivos en tierra. Estos también se analizaron y compararon con el resto de muestras.
La muestra aclimatada de la población de Tapia presenta una similitud del 97% tanto con la muestra crioconservada como de la in vitro, que a su vez son distintas entre ellas (Figura 17).
En el caso de la población de La Griega la muestra aclimatada del individuo 2.1 es idéntica a las muestras control y crioconservada y difieren de la planta in vitro con un coeficiente de 93%. Sin embargo, en el individuo 4.2 la muestra aclimatada es idéntica a la muestra in vitro y ambas difieren de la muestra crioconservada (Figura 17).
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Finalmente, la muestra aclimatada del individuo 4.1 de Fanzara es idéntica a una muestra control de la crionsevación y presenta un 96% de similitud con la muestra crioconservada y un 89% con la muestra in vitro. En el individuo 2.1 la muestra aclimatada también se encuentra próxima a una muestra control de la crioconservación (94.5%) y la similitud con la muestra in vitro es del 85%.
Con respecto a las variaciones morfológicas observadas tras el proceso de crioconservación y descritas en el apartado IV.3. Evolución de los ápices tras la crioconservación de esta memoria, los análisis genéticos llevados a cabo con marcadores RAPDs no parecen poder explicar dichas variaciones. En el caso de la población de La Griega, concretamente en el individuo 4.2, se observó la aparición de tres hojas por nudo, en el 25% de las muestras estudiadas (tanto controles como crioconservadas), sin embargo en el análisis genético fue posible identificar en concreto esta variación.
Las plantas que presentaron hojas alternas fueron los dos individuos de las poblaciones de La Griega, el individuo 4.1 de Fanzara y el 4.2 de L’Alcora. En el caso de las poblaciones de La Griega y Fanzara, esta variación morfológica no parece tener relación con las variaciones genéticas detectadas con RAPDs. En la población de L’Alcora tampoco parece haber correlación entre ambos tipos de variación, puesto que todas las muestras del individuo 4.2 son genéticamente idénticas entre ellas y a las muestras del individuo 3.1, que no presentaron variaciones morfológicas.
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