ÁLVARO BAETA RUIZ
Nuevas mutaciones en POLG asociadas a epilepsia y retraso psicomotor.
Novel POLG mutations associated to epilepsy and pshychomotor retardation.
Trabajo de Fin de Grado. Facultad de Medicina
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Tutora: PILAR BAYONA BAFALUY
1
ÍNDICE
Página
RESUMEN 2
PALABRAS CLAVE 3
INTRODUCCIÓN 4
MATERIAL Y MÉTODOS 10
RESULTADOS: 11
1. Herencia 12
2. Cuadro clínico y pruebas complementarias 14
3. Histología 17
4. Bioquímica 19
5. Complementación funcional en fibroblastos 20
6. Tratamiento 24
DISCUSIÓN 26
CONCLUSIONES 28
BIBLIOGRAFÍA 29
2 RESUMEN
Estudiamos el caso de una niña de 4 años con clínica compatible con posible enfermedad mitocondrial. En el estudio genético mitocondrial se descartan mutaciones y delecciones del DNA mitocondrial, por lo que se decide secuenciar el exoma, encontrando dos mutaciones nucleares, ambas recesivas, en el cromosoma 15.
Las dos mutaciones afectan al gen que codifica para la POLG.
La primera mutación p.A1217P no está descrita en la literatura, mientras que la segunda p.N864S está descrita únicamente en dos hermanas. Comparamos el informe de nuestra paciente con el de las dos hermanas y con un control p.Y955C, extraído de la literatura, en busca de similitudes en la herencia, clínica, histología, bioquímica y tratamiento de las tres entidades.
Asimismo, estudiamos complementación funcional en fibroblastos en busca de la repercusión bioquímica de las dos mutaciones de nuestra paciente.
SUMMARY
We investigate a 4 year-old girl with symptoms of mitochondrial disease.
Mitochondrial DNA does not show any mutations or deletions, so we decide to have her exome sequenced, finding out two nuclears recesive mutations, at fifteenth chromosome. Both mutations affect the gene encoding POLG.
The first one, p.A1217P has not ever been described at literature, whereas the second one p.N864S is only described in two female siblings. We compare our patient’s clinical report with the two siblings one and with a p.Y955C control, of the literature, looking for clinical, biochemistral and histological similarities. We also compare their heritability and their treatment.
Finally, we have also studied functional complementation in fibroblasts in order to find biochemichal repercussion of our patient´s mutations.
3 PALABRAS CLAVE
ADN mitocondrial, ADN Polimerasa Gamma mitocondrial (POLG), cadena respiratoria, mutaciones en POLG, POLG Y955C, Alpers, PEO, ácido valproico, lidocaína, coenzima Q, riboflavina, carnitina.
KEY WORDS
Mitochondrial DNA, gamma polymerase DNA, mitocondrial respiratory chain complex, POLG mutations, POLG Y955C, Alpers, PEO, valproic acid, lidocaine, coenzyme Q riboflavine, carnitine
4 Figura 1. Genoma mitocondrial humano. ADN bicatenario circular formado
por 16569 pares de bases conteniendo 37 genes, de los cuales 13 codifican proteínas esenciales en la formación de complejos del sistema de fosforilación oxidativa, 22 tRNAs y 2 rRNAs.
INTRODUCCIÓN
1) ADN mitocondrial y polimerasa gamma
Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos que contienen la cadena respiratoria y cuya finalidad es la producción de energía mediante la síntesis de ATP. El DNA mitocondrial es muy característico, por lo que vamos a esquematizar sus peculiaridades:
El DNA mitocondrial, formado por 16569 pares de bases, es circular, de herencia exclusivamente materna y no está envuelto en cromatina.
Hasta un 97% del genoma mitocondrial es codificante.
Está formado por 37 genes, de los cuales 13 codifican proteínas esenciales en la formación de complejos del sistema de fosforilación oxidativa, 22 tRNAs y 2 rRNAs (Figura 1).
5
La segregación en las mitocondrias se produce de forma mucho menos controlada que la segregación nuclear, por lo tanto, su índice de mutaciones es más alto que el del genoma nuclear.
En los humanos existen varias copias de DNA mitocondrial por mitocondria y cientos de mitocondrias por célula.
El genoma mitocondrial no codifica todas las proteínas necesarias para su propio mantenimiento, sino que hay estructuras que dependen del DNA nuclear. Entre ellas, encontramos la DNA polimerasa gamma.
La depleción del ADN mitocondrial (disminución del número de copias del ADN mitocondrial) puede suponer la muerte celular.
El ADN mitocondrial se replica por un conjunto de proteínas y enzimas, entre las que se encuentra la polimerasa gamma, su proteína accesoria de unión a ADN mitocondrial de cadena sencilla, el factor de transcripción mitocondrial A y la helicasa Twinkle. De las 16 ADN polimerasas que existen en las células eucariotas, únicamente la ADN polimerasa gamma tiene función en el ADN mitocondrial.
La ADN polimerasa gamma está formada por una subunidad catalítica, codificada por el gen POLG cuyo locus se sitúa en 15q25 y por su proteína accesoria, codificada por POLG2, y situada en el locus 17q24.1. Hasta hace pocos años, sólo se conocía la función de replicar el DNA mitocondrial, pero en estudios recientes se ha demostrado que, además, se ocupa del reconocimiento y retirada de los fallos que aparezcan durante la replicación. La POLG es la encargada de replicar y reparar el DNA mitocondrial, por lo tanto, mutaciones en el gen que codifica para la POLG producirán depleción y disfunción mitocondrial, con sus respectivas consecuencias en la cadena respiratoria.
En 2001 se describió la mutación p.Y955C en el gen POLG y se asoció a Oftalmoplejía Progresiva Externa (PEO)4. Esta mutación tiene carácter dominante6. Posteriormente, se fueron descubriendo nuevas mutaciones en el gen POLG y se asociaron numerosas enfermedades, entre las que se encuentran el síndrome de Alpers, el síndrome de ataxia-neuropatía sensorial, síndromes de miocerebropatías infantiles, etc. (Figura 2).
6 2) Mutaciones en el gen POLG
Las mutaciones en este gen pueden dar lugar a un amplio rango de enfermedades, que varían mucho en la edad de inicio de los síntomas y su severidad. El espectro va desde una enfermedad hepato-cerebral rápidamente progresiva en la edad infantil, hasta la oftalmoplejia externa progresiva, que no debuta hasta la 6ª década de la vida:
1. Síndrome de Alpers-Huttenlocher: se trata de una de las formas clínicas más graves de todas las mutaciones que afectan al gen de POLG. Los síntomas pueden empezar desde el nacimiento o debutar entre los 2 y los 4 años de edad con un cuadro de déficit del desarrollo psicomotor y pérdida de las psicomotricidades ya adquiridas. El síntoma más frecuente son las crisis
Figura 2. Mutaciones en el gen POLG. La barra superior representa los intrones que codifican para proteínas POLG, mientras que la inferior representa la secuencia de aminoácidos. En color rosa y rojo encontramos las mutaciones descritas hasta la fecha que se han asociado a PEO; en azul, las asociadas a síndrome de Alpers, síndromes de miocerebropatías infantiles y síndromes de depleción mitocondrial y en verde, las asociadas a Síndrome de Ataxia- Neuropatía, MIRAS, SANDO o SCAE4.
7 epilépticas, que comienzan siendo controlables con tratamiento antiepiléptico y terminan haciéndose prácticamente intratables. En un gran número de ocasiones, tras el tratamiento con un ácido valproico, se produce hepatopatía.
Además, las crisis migrañosas y la ceguera cortical son otros síntomas que pueden aparecer. Sus mutaciones más frecuentemente asociadas son p.A467T y p.W748S y suelen heredarse con carácter recesivo. En la biopsia muscular, no suelen aparecer fibras rojo rasgadas pero sí depleciones mitocondriales. El tratamiento es simplemente paliativo. El pronóstico es muy malo con una esperanza de vida máxima de 12 años desde el inicio de los síntomas.
2. Espectro de las miocerebropatías infantiles (MCHS): es la forma más rara. Se presenta entre los primeros meses de vida y los 3 años. Se caracteriza por retraso psicomotor, acidosis láctica y miopatía. Otras características son fallo hepático, acidosis tubular renal, pancreatitis, etc. No suele asociar convulsiones.
3. Síndrome de depleción mitocondrial (MDS): grupo clínica y genéticamente muy heterogéneos, con herencia autosómica recesiva. Presenta tres formas clínicas:
Forma miopática, encefalomiopática y hepatocerebral. Se caracteriza por aparición de la sintomatología, que puede incluir vómitos, hipoglucemia, hipotonía y fallo de medro. La biopsia hepática muestra degeneración grasa, fibrosis y proliferación de conductos biliares. Pueden presentar también acidosis láctica.
4. Oftalmoplejía Progresiva Externa Crónica (CPEO): la oftalmoplejía es el síntoma más frecuente de las enfermedades mitocondriales y puede asociarse a enfermedades de herencia mitocondrial o a mutaciones en los genes nucleares que codifican para la POLG1. Este último tipo de mutaciones suele incluir afectación sistémica incluyéndose dentro de otros síndromes como el MNGIE (encefalopatía neuromiogastrointestinal). Pueden ser de herencia recesiva o dominante. En la histología, suelen aparecer fibras rojo rasgadas, COX negativas y múltiples deleciones en el DNA mitocondrial. Las mutaciones p.Y955C se incluyen dentro de este grupo.
8 5. Síndrome de Neuropatía Ataxica Sensorial, Oftalmoparesia y Disartria (SANDO):
puede iniciar su clínica únicamente con oftalmoparesia o acompañarse de neuropatía atáxica sensorial y disartria. La clínica suele comenzar en la edad adulta. Se han descrito patrones de herencia tanto recesivos como dominantes.
La biopsia muscular suele ser compatible con la normalidad, aunque en ocasiones puede presentar alguna fibra rojo rasgada. La aparición de múltiples deleciones del DNA mitocondrial es frecuente.
3) Fosforilación oxidativa
La cadena respiratoria mitocondrial (Figura 3) constituye la etapa final del metabolismo oxidativo y juega, por ello, un papel esencial en los mecanismos de producción de energía. Está formado por cinco complejos enzimáticos que están sujetos a un control dual por parte del genoma nuclear y del genoma mitocondrial y dos moléculas que actúan como nexo entre complejos:
Complejo I o NADH deshidrogenasa: el NADH, producido en reacciones de glicolisis, oxidación del piruvato o en el ciclo del ácido cítrico, dona sus electrones al complejo I liberándose energía, transportando protones desde la matriz hasta el espacio intermembrana y transfiriendo electrones a la Ubiquinona.
Complejo II o Succinato deshidrogenasa: no es bomba de protones a diferencia del resto de complejos. Se encarga de transportar los electrones del FADH2, producido en el ciclo del ácido cítrico, a la Ubiquinona.
Coenzima Q o Ubiquinona: transportador liposoluble que capta electrones de los complejos I y II y los transfiere al complejo III.
Complejo III o Complejo Citocromo bc1: capta los electrones desde la Ubiquinona y los transfiere al Citocromo C, produciendo gradiente de protones hacia el espacio intermembrana.
9
Citocromo C: transportador hidrosoluble de electrones entre los complejos III y IV.
Complejo IV o Citocromo C oxidasa: capta los electrones del Citocromo C para formar H20 y transloca protones al espacio intermembrana.
Complejo V o ATP sintasa: complejo encargado de sintetizar ATP mediante la unión de ADP y Pi gracias al gradiente de protones.
Figura 3. Esquema de la doble cresta mitocondrial representando la fosforilación oxidativa.
10 MATERIAL Y MÉTODOS
El material para la realización de este trabajo ha sido el informe clínico de la paciente, facilitado por el servicio de Neurología del Hospital Sant Joan de Deu de Barcelona y el estudio de fibroblastos de la paciente para diagnóstico molecular.
La paciente ingresó allí remitida para una segunda opinión por un cuadro clínico de encefalopatía no filiada y el servicio de Neurología decidió enviarnos el informe y las pruebas que fueron necesarias para conseguir un diagnóstico definitivo tras la sospecha de Síndrome de Kearns-Sayre.
En nuestro grupo: Biogénesis y patología Mitocondrial, del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Zaragoza, se descartan, en primer lugar, delecciones y depleciones del ADN mitocondrial en la biopsia muscular (PCR largo y Southern respectivamente). Posteriormente, se secuenció el exoma de la paciente encontrando únicamente dos mutaciones en el cromosoma 15, en el gen que codifica para la POLG, ambas dos en heterocigosis. Una de las mutaciones, la mutación c.3649G>C (p.Ala1217Pro), no está descrita en la literatura por lo que no podemos realizar ninguna comparación previa y la mutación c.2591A>G (p.Asn864Ser) únicamente está descrita en dos hermanas. Una vez conocidas las dos mutaciones, ambas en heterocigosis, se procede a realizar estudios de complementación funcional en fibroblastos de la paciente comparándola con un control sano y con el control portador de la mutación p.Y955C.
Asimismo, hemos recurrido a la bibliografía para conocer más acerca de la mutación p.N864S, que ya estaba previamente descrita y para buscar información del control que utilizaremos p.Y955C. Para ello, se ha utilizado la base de datos PubMed, usando las palabras clave ADN mitocondrial, POLG, cadena respiratoria, mutaciones en POLG, POLG Y955C, Alpers, PEO, ácido valproico, lidocaína, coenzima Q, riboflavina, carnitina.
11 RESULTADOS
Procedemos a estudiar el caso de una niña de 4 años, de nacionalidad rusa, con sospecha clínica de enfermedad mitocondrial. La paciente acude al Hospital San Juan de Dios de Barcelona en busca de una segunda opinión. En primer lugar, se le realizan estudios genéticos en busca de mutaciones o delecciones en el ADN mitocondrial y una biopsia muscular en busca de fibras rojo rasgadas. Ambas pruebas resultaron negativas y por lo tanto, se procedió a secuenciar el exoma de la paciente. En el exoma se hallaron dos mutaciones en heterocigosis en el gen POLG. La mutación c.3649G>C (p.Ala1217Pro) no está descrita en la literatura y la mutación c.2591A>G (p.Asn864Ser) únicamente está descrita en dos hermanas. Vamos a comparar el caso de nuestra paciente con el de las dos hermanas con la mutación p.N864S y con un control p.Y955C.
La comparación entre casos la vamos a subdividir en 6 apartados: herencia, cuadro clínico, histología, bioquímica, estudios moleculares y complementación funcional en fibroblastos y tratamiento.
12 1. Herencia
Los padres de la paciente son sanos y no consanguíneos. Una hermana de la paciente, la cual presentó crisis convulsivas, según refiere la familia, falleció al año y cuatro meses de edad por una infección congénita por Citomegalovirus. Otra hermana de la paciente está sana. Únicamente hemos recibido ésta información y el ADN de la madre de la paciente.
En cuanto al genograma de las hermanas1 con la mutación p.N864S, podemos observar que existen 3 mutaciones en carácter recesivo. El padre es portador de 2 de ellas, las cuales juntas no tienen repercusión en la clínica y la madre es portadora de la mutación p.Asn864Ser, también sin repercusión clínica (Figura 4).
Ambas hermanas afectas poseen las tres mutaciones en carácter recesivo, mientras que un hermano no padece ninguna de las mutaciones descritas.
La primera hermana, fallecida a la edad de 36 años, 11 años antes que su hermana, tuvo un hijo varón sano portador de la mutación POLG p.N864S, procedente de la abuela, mientras que la segunda hermana, fallecida también a la edad de 36 años, tuvo una hija sana con las otras dos mutaciones (p.T251L Y p.P587L) procedentes del abuelo.
De este genograma llegamos a la conclusión de que, tanto las dos mutaciones de las que es portador el padre como la mutación que padece la madre, la misma que nuestra paciente, carecen de repercusión clínica por separado pero sí cuando coinciden las tres en un mismo individuo.
13 Figura 4. Análisis de la segregación de las mutaciones de POLG. Los cuadrados representan a los hombres, los círculos a las mujeres, los símbolos pintados representan a los individuos afectos y los símbolos rayados representan a los individuos fallecidos. Los Alelos/Haplotipos entre grupos fueron reconstruidos desde los datos del genograma1.
Con los datos del genograma, podemos concluir que la mutación p.N864S es recesiva y no causa patología por sí sola. La mutación p.N864S únicamente podría ser causante de patología en caso de asociarse con otras mutaciones recesivas.
14 2. Cuadro clínico y pruebas complementarias
La paciente tiene un desarrollo psicomotor normal sin ningún antecedente relevante hasta los 20 meses de edad, cuando debuta con crisis convulsivas, unas 4 al día, caracterizadas por temblor cefálico y de extremidades. En los registros electroencefalográficos se aprecian paroxismos focales de predominio parietal izquierdo y paroxismos generalizados. Se le indica ácido valproico, pero la familia rechaza el tratamiento y decide tratarla con terapias naturales. Se muestra asintomática durante año y medio, hasta que en el contexto de un proceso infeccioso presenta una crisis con sacudidas de extremidades superiores sin pérdida de conciencia. Se identifica una serología positiva para Borrellia, por lo que se decide tratar con ceftriaxona/lidocaína IM. Tras la primera inyección, repite el episodio de crisis focal secundariamente generalizada que es controlada con tratamiento antiepiléptico y es dada de alta. Tras la segunda inyección de ceftriaxona/lidocaína IM, la paciente vuelve a sufrir episodios de crisis convulsivas que son refractarias a tratamiento antiepiléptico y requieren ingreso en la UCI Pediátrica, alimentación con sonda nasogástrica y ventilación mecánica invasiva.
Finalmente, la paciente se recupera del estatus y es dada de alta de la UCI Pediátrica con diversas secuelas neurológicas.
Actualmente, la paciente presenta hipomimia facial, hipotonía de predominio axial con hipo/arreflexia, hipertonía de extremidades a nivel distal y tetraparesia con predominio en hemicuerpo derecho. Además, la familia refiere que ha perdido la deambulación desde hace un año y que tiene dificultades en la manipulación de objetos.
En cuanto a las pruebas complementarias de nuestra paciente, encontramos patrones paroxísticos bioccipitales en el EEG con un EMG normal y atrofia de hemisferio izquierdo y aumento del espacio subaracnoideo.
15
CLÍNICA Paciente POLG
p.N864S/p.A1217P
Paciente POLG p.N864S1
Paciente POLG p.Y955C11
Edad aparición Lactantes Adolescentes Adultos
Oftalmoplejia (PEO) NO SÍ SÍ
Síntomas digestivos NO SÍ SÍ
Menopausia precoz Desconocido NO SÍ
Crisis epilépticas SÍ SÍ NO
Arreflexia SÍ SÍ NO
Ataxia SÍ SÍ SÍ
Deterioro neurológico progresivo SÍ SÍ SÍ
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
EMG Normal Neuropatía periférica Patrón
miopático
EEG Ondas delta
paroxísticas en región bioccipital
Actividad paroxística bifrontal
Desconocido
RMN
- Atrofia Hemisferio Izquierdo - Aumento
espacio subaracnoideo
Leucoencefalopatía Desconocido
Tabla 1. Tabla comparativa de los aspectos clínicos y las pruebas complementarias de la paciente p.N864S/p.A1217P, las hermanas p.N864S y un paciente p.Y955C.
16 Clínicamente, observamos que los tres tienen en común el deterioro neurológico progresivo y la ataxia y, además, nuestra paciente comparte la arreflexia y las crisis epilépticas con las hermanas portadoras de la mutación p.N864S. Por otro lado, los pacientes con la mutación p.N864S y los p.Y955C presentan oftalmoplejía y síntomas digestivos a diferencia de nuestra paciente. No existen grandes correlaciones en las pruebas complementarias.
Concluimos que la clínica neurológica es común en los tres casos. El sistema nervioso es uno de los sistemas más dependientes del metabolismo oxidativo, siendo de los tejidos más afectados.
No encontrar grandes similitudes en cuanto a la clínica y a las pruebas complementarias en los tres casos no es sorprendente, puesto que las enfermedades mitocondriales presentan una enorme variabilidad fenotípica.
17 3. Histología
La biopsia muscular es una prueba imprescindible en el algoritmo diagnóstico de las enfermedades mitocondriales, pero no excluyente. En numerosas ocasiones, en edad pediátrica, la biopsia muscular puede ser normal y no por ello se debe descartar el diagnóstico.
El tejido muscular se tiñe con la tinción tricrómica de Gomori y, posteriormente, se observa en busca de atrofias musculares y fibras rojo rasgadas. Estas fibras son típicas de muchas enfermedades mitocondriales con afectación miopática y consisten en fibras irregulares que se tiñen de rojo por el mayor número de mitocondrias que poseen en su interior. Además, se observa la actividad de la citocromo oxidasa (COX) en las fibras musculares, pudiendo estar disminuida en algunas enfermedades mitocondriales.
HISTOLOGÍA PACIENTE POLG p.N864S/p.A1217P
CONTROL POLG p.N864S2
CONTROL POLG Y955C11
FIBRAS
ROJO RASGADAS No Sí Sí
FIBRAS COX Alguna No No
RESULTADO NORMAL PATOLÓGICA PATOLÓGICA
Tabla 2. Tabla comparativa de la histología de la paciente p.N864S/p.A1217P, las hermanas p.N864S y el control p.Y955C.
18 En el caso de nuestra paciente, su biopsia muscular no demostró fibras rojo rasgadas y simplemente se apreció alguna fibra COX pálida, pudiendo ser interpretada su biopsia como normal. Por el contrario, las hermanas con la mutación p.N864S2 y el paciente control p.Y955C presentan numerosas fibras rojo rasgadas con actividad COX disminuida en sus respectivas biopsias (Tabla 2).
19 4. Bioquímica
En el Hospital San Juan de Dios de Barcelona se le realizó a la paciente una batería de pruebas bioquímicas muy completa, pero únicamente conocemos el resultado del hemograma, la gasometría y la bioquímica básica. Todos ellos resultaron ser compatibles con la normalidad.
El único parámetro bioquímico alterado de nuestra paciente es el ácido láctico, que se encuentra elevado (4,92mmol/l), mientras que en las analíticas previas, la paciente presentaba lactatos normales (1,4 y 1.7).
Ante una clínica compatible con enfermedad mitocondrial, el primer marcador bioquímico que debemos pedir es el ácido láctico. Su elevación es sugestiva de enfermedad mitocondrial, pero no específica.
En la bibliografía2 no constan elevaciones del ácido láctico en las hermanas p.N864S, pero sí en pacientes portadores de la mutación p.Y955C.
20 5. Complementación funcional en fibroblastos
Una vez descubiertas las dos mutaciones en el exoma de nuestra paciente debemos demostrar que las mutaciones tienen repercusión. La mutación p.N864S sabemos que, acompañada de otras mutaciones recesivas, tiene una importante repercusión en todos los complejos (Tabla 3), mientras que desconocemos la patogenicidad de la mutación p.A1217P que también presenta nuestra paciente, por lo que resultan necesarios los estudios moleculares y la complementación funcional en fibroblastos, para poder descartar que se trate de un falso positivo.
Procedemos a medir las actividades del complejo IV usando la actividad de la citrato sintasa como normalizador para comparar los resultados en los fibroblastos de nuestra paciente con un control sano y con un control portador de la mutación POLG p.Y955C.
Figura 4. Actividad Complejo IV/Citrato sintasa para células crecidas en glucosa.
Apreciando la figura 4, vemos que no existe una disminución de la actividad del Complejo IV en los fibroblastos crecidos en glucosa de nuestra paciente con respecto al control sano. Sí que se aprecia una disminución significativa de la actividad del Complejo IV en el control POLG p.Y955C (Figura 4).
0 50 100
150 Control FB
Control FB + POLG WT Patient FB
Patient FB + POLG WT Control FB + POLG Y955C 100%
*
p<0.05
Control FB Patient FB
POLG wt - + - + Y955C POLG + Control FB
CIV/CS
21 Figura 5. Actividad Complejo IV/Citrato sintasa para células crecidas en galactosa.
Encontramos una pequeña disminución de la actividad del Complejo IV en los fibroblastos crecidos en galactosa de nuestra paciente, pero no es lo suficientemente llamativa como para ser tenida en cuenta (Figura 5).
Por el contrario, en la bibliografía2 encontramos que existe una disminución significativa en la actividad de todos los complejos en músculo esquelético de una de las hermanas con la mutación POLG p.N864S, como se puede apreciar en la tabla 3.
Sujetos Complejo I Complejo II Complejo III Complejo IV Citrato sintasa
Paciente 0.13 0.04 0.17 0.52 60
Sujetos sanos
0.28 ± 0.05 (0.21–0.34)
0.28 ± 0.05 (0.20–0.35)
0.85 ± 0.30 (0.46–1.38)
3.20 ± 0.89 (1.93–4.68)
204 ± 73 (67–309)
La actividad de la citrato sintasa está expresada en mU/mg. La actividad de los complejos I-IV se expresa en mU/mU.
Tabla 3. Actividad enzimática de los complejos I-IV y citrato sintasa en músculo esquelético de la paciente p.N864S comparándola con 13 sujetos sanos2.
0 50 100
150 Control FB GAL
Control FB + POLG WT GAL Patient FB GAL
Patient FB + POLG WT GAL
100%
CIV/CS
22 La polimerasa gamma se encarga de la replicación del ADN mitocondrial, permitiendo aumentar el número de copias del mismo en función de las necesidades de la célula.
Por lo tanto, es de vital importancia medir el número de copias de ADN mitocondrial antes y después de la sobreexpresión de la POLG sin mutaciones, tanto en el control como en la línea celular derivada de la paciente. El número de copias de ADN mitocondrial se cuantifica por qPCR (PCR cuantitativa).
Figura 6. Niveles de mtDNA qPCR para células crecidas en glucosa.
Encontramos una disminución significativa de los niveles de copias de DNA mitocondrial en los fibroblastos crecidos en glucosa de nuestra paciente con respecto al grupo control sano, que se recuperan cuando se sobreexpresa la POLG. Asimismo, existe una disminución significativa del número de copias en el control POLG p.Y955C.
0 50 100 150
Control FB
Control FB + POLG wt Patient FB
Patient FB + POLG wt Control FB + POLG Y955C 100%
Control FB Patient FB
POLG wt - + - + Y955C POLG + Control FB
*
* p<0.0001
*
mtDNA/nuDNA
23 Figura 7. Niveles de mtDNA qPCR para células crecidas en galactosa.
Hallamos una disminución significativa de los niveles de copias de DNA mitocondrial en los fibroblastos crecidos en galactosa de nuestra paciente con respecto al grupo control sano. También existe una recuperación del número de copias cuando se sobreexpresa la POLG. La línea celular expresando POLG p.Y955C no es capaz de crecer en galactosa.
Por lo tanto, queda funcionalmente demostrado que ambas mutaciones recesivas tienen efecto en la replicación del ADN mitocondrial.
0 50 100
150 Control FB GAL
Control FB + POLG wt GAL
Patient FB GAL Patient FB + POLG wt GAL
100%
Control FB Patient FB
POLG wt - + - + Y955C POLG + Control FB
*
* p<0.0001
mtDNA/nuDNA
24 6. Tratamiento
El tratamiento en este tipo de patologías, a día de hoy, sigue siendo sintomático, por lo que vamos a revisar el tratamiento que ha llevado la paciente desde el inicio de los síntomas.
La paciente p.N864S/p.A1217P debutó con crisis epilépticas, unas 4 al día, a los 19- 20 meses de edad y le indicaron Ácido Valproico para reducir el número de episodios.
La familia rechazó el tratamiento y escogió la opción de tratar a la paciente con terapias naturales. Refieren que permaneció año y medio sin presentar crisis epilépticas a pesar de recibir únicamente terapias naturales.
Pasado año y medio desde el inicio de las crisis, la paciente volvió a presentar una crisis epiléptica en un contexto infeccioso y es tratada y controlada con Ácido Valproico. Durante el ingreso, se descubre la picadura de una garrapata y en la serología aparecen títulos elevados de IgM Anti-Borrelia, por lo que se inicia tratamiento con ceftriaxona y lidocaína IM. Refieren que justo tras la administración del tratamiento, presentó una nueva crisis epiléptica, que fue controlada con el tratamiento antiepiléptico actual, alargando el ingreso 4 días más. Pero, de nuevo, tras la segunda administración de ceftriaxona y lidocaína IM vuelve a presentar una crisis que es refractaria al tratamiento antiepiléptico y que requiere ingreso en UCI Pediátrica, alimentación por sonda nasogástrica y ventilación mecánica invasiva.
En la UCI Pediátrica es tratada con corticoides, gammaglobulinas, Aciclovir IV y cofactores (coenzima Q, Riboflavina y carnitina), además de diferentes tratamientos antiepilépticos, mejorando su sintomatología, pero presentando diversas secuelas motoras.
Actualmente, la paciente está en tratamiento antiepiléptico con Levetiracetam, Fenobarbital y Clonazepam. Se le retiró el Ácido Valproico por hipertransaminasemia.
Además, continúa tratamiento con los cofactores Carnitina, Riboflavina y Coenzima Q.
25 En cuanto al tratamiento con los cofactores citados, son de uso común en todas las enfermedades mitocondriales, puesto que mejoran la función de la fosforilación oxidativa ayudando a la formación de ATP y reducen el número de metabolitos tóxicos.
En nuestro caso, como carecemos de información bioquímica suficiente, vamos a comentar los efectos de cada uno de los cofactores que toma nuestra paciente:
- Riboflavina: se usa principalmente en las deficiencias del complejo I y como tratamiento empírico del resto de alteraciones de la cadena respiratoria, funcionando como cofactor en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y mejorando en algunos casos las alteraciones bioquímicas existentes e incluso, en algunos casos, la sintomatología de los pacientes.
- Coenzima Q (ubiquinona): uso comprobado en las deficiencias del complejo I, al igual que la riboflavina, y en las deficiencias de ubiquinona y controvertido en el resto de alteraciones de la cadena respiratoria. Se encarga de transportar electrones desde los complejos I y II al complejo C. Se trata de un potente antioxidante cuyo efecto consiste en prevenir el daño oxidativo.
- Carnitina: utilizado cuando se demuestra la deficiencia de carnitina plasmática o de forma empírica en otras alteraciones de la cadena respiratoria, mejorando en algunos casos la debilidad muscular y la encefalopatía.
Cabe destacar que el Ácido Valproico no debe ser utilizado en caso de enfermedad mitocondrial, puesto que inhibe la fosforilación oxidativa y afecta a la oxidación de ácidos grasos.
26 DISCUSIÓN
Ante la sospecha clínica de enfermedad mitocondrial debemos descartar mutaciones en el ADN mitocondrial en primer lugar, puesto que es mucho más sencillo que secuenciar que el genoma nuclear, ya que se trata de un ADN bicatenario circular formado por 16569 pares de bases. Si el resultado fuese negativo, entonces pasaríamos a secuenciar el genoma nuclear en busca de mutaciones nucleares que puedan afectar a la cadena respiratoria.
La utilización de técnicas de secuenciación masiva ha facilitado el descubrimiento de nuevos genes y mutaciones, pero el análisis de un gran número de exomas de individuos sanos ha demostrado un altísimo número de mutaciones que teóricamente son causa de enfermedad.
De ahí deriva la importancia de evitar falsos positivos con las nuevas mutaciones descritas, considerándolas patogénicas cuando realmente no lo son, y, para ello, se necesitan los estudios moleculares y la complementación funcional en fibroblastos.
Son la herramienta para determinar la patogenicidad de las mutaciones.
La comparativa clínica de las enfermedades mitocondriales es muy dificultosa por la gran variabilidad fenotípica que presentan este tipo de enfermedades, pudiendo afectar a cualquier órgano o tejido de forma aislada o multisistémica. Los órganos y tejidos más dependientes del metabolismo oxidativo son los más afectados. Entre ellos, destacamos el cerebro, el tejido muscular, el miocardio, el riñón o el hígado.
El rendimiento de las actividades enzimáticas es variable, puesto que depende de la afectación del tejido del cual se ha tomado la muestra. Asimismo, debido a la heteroplasmia mitocondrial, proceso por el cual pueden coexistir mitocondrias con ADN mitocondrial de distintos tipos en las mismas células, las actividades de la cadena respiratoria pueden ser normales en tejidos afectos.
27 El tratamiento de cualquier enfermedad mitocondrial es, a día de hoy, sintomático, pero debemos ser cautos con diversos fármacos. En el caso de nuestra paciente, tratar sus crisis epilépticas con ácido valproico sólo habría empeorado la clínica de forma súbita, puesto que el valproato sódico inhibe la fosforilación oxidativa y afecta a la oxidación de ácidos grasos pudiendo precipitar un fallo hepático19.
Nuestra paciente recibió dos inyecciones intramusculares de lidocaína, tras las cuales, su clínica empeoró bruscamente presentando secuelas neurológicas graves que no existían de forma previa a su administración. Los anestésicos locales inhiben la carnitina-acetilcarnitina translocasa, pudiendo tener efecto en la oxidación del piruvato. Hay un caso descrito de arritmia ventricular tras la administración de bupivacaína a un paciente con déficit de carnitina15. Únicamente está descrito in vitro, pero otros anestésicos locales, como la lidocaína, también pueden inhibir la carnitina- acetilcarnitina translocasa, aunque en menor grado que la bupivacaína15.
En nuestro caso, el curso clínico de nuestra paciente pudiera haber sido precipitado por la doble administración de lidocaína intramuscular.
28 CONCLUSIONES
La ausencia de mutaciones, deleciones y depleción del ADN mitocondrial no descartan la existencia de una enfermedad mitocondrial.
La secuenciación del genoma mitocondrial nos permite conocer nuevas mutaciones que podrían estar implicadas en enfermedades mitocondriales.
Para evitar falsos positivos, es necesario estudiar las mutaciones mediante la complementación funcional en células derivadas de la paciente para conocer su repercusión.
Nuestra paciente presenta dos mutaciones recesivas en el gen POLG, de las cuales, la mutación p.N864S sabemos que es patogénica si se asocia a otras mutaciones, pero desconocemos la posible repercusión de la mutación p.A1217P.
Tras la complementación funcional en fibroblastos, concluimos que ambas mutaciones tienen repercusión en la replicación del ADN mitocondrial, recuperando el número de copias de ADN mitocondrial cuando se sobreexpresa la POLG.
La comparativa clínica de nuestra paciente con las hermanas portadoras de la mutación p.N864S y con el control p.Y955C demuestra afectación neurológica en los tres casos, siendo la ataxia y deterioro neurológico progresivo común en las tres mutaciones. Además, las crisis epilépticas aparecen tanto en nuestra paciente como en las hermanas portadoras de la mutación P.N864S.
La clínica de nuestra paciente fue muy leve hasta la doble administración de lidocaína intramuscular, lo que nos hace pensar que la lidocaína podría haber empeorado la clínica neurológica de nuestra paciente de forma súbita.
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