(S3-O98)
EFECTO DE ALTAS CONCENTRACIONES DE CO
2EN EL CONTROL
FÚNGICO Y CALIDAD DE UVA DE MESA
IRENE ROMERO, MARÍA TERESA SÁNCHEZ-BALLESTA, MARÍA ISABEL ESCRIBANO y CARMEN MERODIO
Departamento de Ciencia y Tecnología de Productos Vegetales, Instituto del Frío, CSIC, José Antonio Novais 10, 28040 Madrid, [email protected] , Telf.: 91 5492300, Fax: 915493627
Palabras clave: quitinasa - expresión génica - bajas temperaturas – antocianos – resveratrol RESUMEN
En este trabajo nos hemos centrado en el efecto del pretratamiento con un 20%
CO2+20% O2+60% N2 durante 3 días en el mantenimiento de la calidad del fruto (color, sólidos solubles y acidez titulable), acumulación de antocianos totales, trans-resveratrol en la piel y en la expresión de genes que codifican para proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) en uvas de mesa cv. ‘Cardinal’. Nuestros resultados indican que este tratamiento gaseoso redujo los cambios metabólicos asociados a la conservación a 0ºC y fue eficaz en el control fúngico durante el periodo de almacenamiento. Concretamente, el tratamiento limitó la acumulación de antocianos totales asociada con la aplicación de bajas temperaturas (0ºC) durante la fase inicial de conservación. El menor ataque fúngico de las bayas tratadas con altas concentraciones de CO2 se correspondía con una menor expresión del gen que codifica para la quitinasa de clase I. Asimismo, el patrón de cambios en el contenido de resveratrol en la piel de uva durante su conservación a 0ºC y posterior transferencia a temperatura ambiente revelan la eficacia del tratamiento en la restricción del crecimiento fúngico, sin afectar a la calidad del fruto.
EFECT OF HIGH CO2 LEVELS ON FUNGAL DECAY AND QUALITY IN STORED TABLE GRAPES
Keywords: resveratrol – anthocyanins – chitinase - gene expression - low temperatures ABSTRACT
The effect of pretreatment with 20% CO2+20% O2+60% N2 for 3 days was studied with regards to its effectiveness on the maintenance of fruit quality (color, soluble solids content and titratable acidity), total anthocyanins content, trans-resveratrol levels in the skin and the pattern of specific PR genes in table grapes cv. ‘Cardinal’. Our results indicate that this short-term high CO2 treatment reduced the metabolic changes associated with low temperature storage at 0ºC and it was effective for controlling fungal decay during storage period. Specifically, this treatment restrained the accumulation of total anthocyanins observed the first days of storage at 0ºC in non-treated table grapes. The lower fungal decay observed in CO2-treated grapes was consistent with a reduction in the expression of class I chitinase.
Moreover, the pattern of changes in trans-resveratrol content in the skin during low temperature storage and upon transfer to 20ºC confirm the efficacy of high CO2 pretreatment in reducing total fungal decay, maintaining fruit quality.
INTRODUCCIÓN
Los frutos tienen la capacidad de inducir o activar una serie de mecanismos en respuesta a factores ambientales que pueden llegar a tener efectos opuestos dependiendo de la concentración, tiempo de aplicación y grado de susceptibilidad. En la de piel de uva roja, los cambios en el contenido de antocianos son fácilmente visibles y cuantificables durante los procesos de desarrollo y maduración. Sin embargo, la información disponible sobre su inducción y regulación por factores ambientales es limitada. En diferentes plantas se ha observado que la concentración de antocianos totales incrementaba en respuesta a diferentes tipos de estreses tanto bióticos como abióticos. Concretamente, se ha observado una acumulación de estos compuestos en respuesta a radiaciones ultravioleta, ataque fúngico y bajas temperaturas (Winkel-Shirley, 2001). Estos compuestos derivan de la ruta de los fenilpropanoides cuya enzima clave es la fenilalanina amonio liasa (PAL), y cuyas propiedades cinéticas también se ven afectadas por las bajas temperaturas de conservación (Maldonado et al. 2007). Debido a la naturaleza y función de los fenilpropanoides, se considera que la activación de su ruta biosíntetica es parte del mecanismo de defensa que la célula desarrolla frente a las condiciones estresantes a las que está sometida (Dixon and Pavia, 1995).
Respecto al ataque fúngico, las respuestas más comunes y mejor caracterizadas de defensa están relacionadas con la síntesis de proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs) y la acumulación de fitoalexinas (Jeandet al. 1995; Sanchez-Ballesta et al. 2006). Las fitoalexinas en uvas están constituidas por un grupo restringido de moléculas pertenecientes a la familia del estilbeno. Dentro de las PRs son las quitinasas y ß-1,3-glucanasas dos de sus mayores familias. Estudios previos en nuestro laboratorio han mostrado en uva de mesa de la variedad ‘Cardinal’ una inducción en la expresión génica de una quitinasa y β-1,3-glucanasa de clase I relacionada con el ataque por patógenos, siendo posterior en los frutos tratados con CO2 que son más tolerantes al ataque por Botrytis cinerea (Romero et al. 2006).
Para estudiar el efecto beneficio del pretratamiento (20% CO2+20% O2+60% N2
durante 3 días) a uvas de mesa cv.” Cardinal tanto en respuesta a las bajas temperaturas de conservación (0ºC) como al ataque fúngico, hemos realizado el análisis molecular de la quitinasa y la determinación del contenido de antocianos totales y de trans-resveratrol.
MATERIALES Y MÉTODOS
Uvas de mesa (Vitis vinifera cv. ‘Cardinal’) procedentes de Sevilla, con un contenido en sólidos solubles totales del 12.7% y con un 0.81% de acidez titulable, se prerrefrigeraron con aire forzado durante 14 h a -1ºC antes de su conservación a 0 ± 0.5 ºC. Los racimos libres de defectos patológicos y físicos se dividieron en dos lotes. Cada lote, formado por 5 cajas de plástico (3 Kg frutos por caja), se almacenó en una cabina de neopreno de 1 m3 de capacidad.
El sistema de acondicionamiento empleado permitía alcanzar niveles de humedad relativa del 95-97%. Un lote se mantuvo en aire durante 33 días (frutos no tratados) y al otro lote se le aplicó un tratamiento gaseoso de 20 %CO2+20 %O2+60 %N2 durante 3 días (frutos tratados con CO2). Después del tratamiento con CO2, los racimos se transfirieron al aire y se mantuvieron a 0ºC hasta finalizar el periodo de ensayo.
Durante la conservación se analizaron distintos atributos de calidad tales como contenido en sólidos solubles SSC (%), acidez titulable (% ácido tartárico) y color (L*, a* b*) de la piel de la uva. La podredumbre se calculó como porcentaje de granos infectados y destriados respecto al peso total del racimo.
A partir del RNA extraído de la piel de la uva mediante el método de Salzman et al.
(1999) y usando RT-PCR se aisló el cDNA que codifica para la quitinasa clase I y se
realizaron los análisis de expresión mediante Northerns siguiendo la metodología descrita por Romero et al. (2006).
El contenido de antocianos totales se determinó siguiendo el método descrito por Wrolstad (1976). Brevemente, muestras de piel de uva (0.5 g) homogeneizadas en nitrógeno líquido se extraían con 0.01% HCl en 0.5 ml metanol usando ultra-sonicación en agua fría. La absorbancia de los sobrenadantes filtrados se media en un espectrofotómetro UV-VIS (UV- VIS 1601 Shimadzu) a 510 nm y a 700 nm a pH 1.0 y 4.5, utilizando para el cálculo A=
[(A510-A700)pH1.0 - [(A510-A700)pH4.5], con un coeficiente de extinción molar de la malvidina- 3-glucósido de 28,000 L mol-1 cm-1. Los resultados se expresaban como mg de malvidina-3- glucósido equivalente por gramo de peso fresco.
El contenido en trans-resveratrol se determinó utilizando la metodología analítica basada en la combinación de la Desorción Láser (LD) con la Ionización Multifotónica Resonante (REMPI) y posterior detección por Espectrometría de Masas por Tiempo de Vuelo (TOFMS) y siguiendo protocolo descrito en Sánchez-Ballesta, et al.(2006).
Los datos de tres repeticiones han sido procesados por ANOVA (Statigraphic program, STSC, Rockville, MD.) para un nivel de significancia P≤0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del pretratamiento con alto CO2 en el contenido de antocianos totales y parámetros de calidad
El inicio del periodo de conservación a 0ºC de uva de mesa ‘Cardinal’ se caracterizó por un fuerte incremento en el contenido de antocianos totales en la piel de los frutos no tratados. Después de 3 días de conservación a 0ºC, el nivel de antocianos totales en los frutos no tratados era 1.63 veces mayor que el de los frutos antes de iniciarse el periodo de conservación frigorífica (día 0). Sin embargo, en los frutos tratados durante 3 días con un 20%
de CO2 este incremento era menor (1.2 veces). Esta tendencia cambió cuando cesó el tratamiento con CO2 y los frutos se transfirieron al aire, alcanzándose valores similares a los 6 días de conservación (Fig. 1).
El incremento inicial en la concentración de antocianos totales observado en los frutos no tratados no iba acompañado por cambios significativos en los parámetros de color, que permanecieron con valores similares a los cuantificados en uvas al inicio del periodo de conservación. Al avanzar el tiempo de almacenamiento, el contenido en antocianos totales descendió tanto en los frutos tratados como en los no tratados, no observándose diferencias significativas al final del periodo de conservación. Respecto a los parámetros de calidad analizados, o bien observamos un mejor mantenimiento de la calidad inicial en los frutos tratados con CO2, o no se detectaron diferencias significativas entre los frutos tratados y no tratados (ej. luminosidad y contenido en sólidos solubles totales) (Tabla 1).
La acumulación de antocianos totales después de 3 días de conservación a 0ºC estaba acompañada por un marcado incremento en la abundancia de los mensajeros de la PAL en los frutos no tratados, decreciendo ligeramente después de 6 días. Este incremento en los niveles de mensajeros en respuesta a las bajas temperaturas era menor después de 3 días de tratamiento con un 20% CO2 a 0ºC (Romero et al. 2007). Mori et al. (2005) demostraron que las bajas temperaturas nocturnas marcadamente incrementaron la síntesis de antocianos en uvas a través de la regulación de la actividad de la enzima PAL.
Si bien es conocido que la uva es un fruto tolerante a las bajas temperaturas, nuestros resultados sobre la reducción de la activación de la síntesis de antocianos en la fase inicial del periodo de conservación por altas concentraciones de CO2 nos está indicando por un lado, que estos compuestos parecen estar implicados en la percepción de las bajas temperaturas y por otro, que el tratamiento gaseoso limita su sensibilidad.
Eficacia del pretratamiento con altas concentraciones de CO2 en el control de podredumbre durante al conservación a 0ºC y posterior transferencia a 20ºC.
Los resultados obtenidos en las condiciones del ensayo, en cuanto a la evolución de las pérdidas globales en frutos tratados y no tratados se indican en la Figura 2. En la Figura se ha calculado el porcentaje en peso de granos de uva dañados frente al peso de los racimos de la caja del lote. El tratamiento de 3 días con altas concentraciones de CO2 realizó un control eficaz de la infección hasta el día 22 de la conservación a 0ºC. Posteriormente, en la transferencia a temperatura ambiente la eficacia en la restricción del crecimiento fúngico fue menor, alcanzándose unas pérdidas globales próximas al 20% en peso de granos destriados. A pesar de este incremento, los valores era significativamente menores que los alcanzados en los frutos no tratados.
Efecto del pretratamiento con alto CO2 en el contenido de trans-resveratrol durante la conservación a 0 ºC y posterior transferencia a 20 ºC.
La acumulación de trans-resveratrol en la piel de uvas mantenidas en aire o tratadas con CO2 se indica en la Figura 3. El contenido en trans-resveratrol decreció significativamente en la piel de los frutos no tratados después de 3 días a 0ºC. Este descenso en el contenido de resveratrol era mayor en los frutos tratados con alto CO2. La reducción del contenido de resveratrol por altas concentraciones de CO2 cesó al finalizar el tratamiento. Al analizar los resultados de la evolución del contenido de trans-resveratrol al final del periodo de almacenamiento y en el transcurso de los primeros dos días de transferencia a temperatura ambiente, se observó una relación directa entre el porcentaje de podredumbre y el nivel de acumulación de esta fitoalexina en la piel de uva. La mejor situación sanitaria de los frutos tratados con CO2 en la fase final de la conservación frigorífica era concomitante con una menor acumulación de trans-resveratrol. Posteriormente, en los ensayos a temperatura ambiente para la simulación de la venta, el mayor impulso en la síntesis de trans-resveratrol observado en los frutos tratados con CO2 con respecto a los frutos no tratados iba asociado a un fuerte incremento en el porcentaje en peso de granos infectados y destriados.
Efecto del pretratamiento con alto CO2 en la expresión del gen de la quitinasa clase I durante al conservación a 0ºC
En trabajos previos (Romero et al. 2006) aislamos los cDNAs que codifican para la quitinasa clase I (Vcchit 1b) y para la β-1,3-glucanasa (Vcgns 1) de piel de uva de mesa cv.
‘Cardinal’. Nuestros resultados (Figura 4) indican un aumento en la abundancia en los niveles de mRNA Vcchit 1b en uvas no tratadas al prolongarse el periodo de conservación a 0ºC. La expresión del transcrito acompañó el incremento en el porcentaje de uvas infectadas durante la conservación. Los resultados sobre el patrón de expresión del gen de la quitinasa clase I en uvas tratadas con altas concentraciones de CO2 evidencian la eficacia del tratamiento gaseoso en el retraso y reducción del ataque fúngico.
CONCLUSIONES
El pretratamiento con un 20% CO2+20% O2+60% N2 durante 3 días es eficaz en la mejora de la conservación de uva de mesa cv. ‘Cardinal’ al reducir no sólo las respuestas asociadas al desarrollo de la infección fúngica sino también las relacionadas con la percepción de las bajas temperaturas en la fase inicial del periodo de conservación.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo está financiado por la CICYT proyecto AGL2005-04502. La cuantificación de trans-resveratrol se realizó en la Unidad de Láseres y Haces Moleculares, Instituto Pluridisciplinar, Madrid. MT.S.-B. y R.M. tienen contratos I3P .
BIBLIOGRAFÍA
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Wrolstad, R. E. 1976. Colon and pigment analysis in fruit products (Bulletin 624), Corvallis, Oregon: Oregon Agricultural Experimental Station.
Table 1. Parámetros de calidad de uvas cv. ‘Cardinal’no tratadas y tratadas con CO2 después de 33 días de conservación a 0ºC.
Parámetros de calidad 0 días 33 días a 0ºC
Aire CO2
Sólidos solubles (º Brix) 12.85a 14.10b 14.28b Acidez titulable (% ác. tartárico) 0.84a 0.69b 0.77c Índice de maduración (SSC/TA) 15.24 20.23 18.43
pH 3.33a 3.69b 3.64b
L* 35.95a 24.56b 23.22b
a* 16.75a 2.61b 3.94c
C* 16.89a 2.84b 4.07c
z Valores seguidos por la misma letra dentro de cada fila no difieren significativamente entre sí (LSD = 95%)
Figura 1. Efecto del pretratamiento con CO2 (20%) en el contenido de antocianos totales en la piel de uva de mesa ‘Cardinal’ durante la conservación a 0ºC
Días a 0ºC
0 3 6 12 22 33
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Aire CO2
Antocianostotales (mg/g peso fresco)
Días a 0ºC
0 3 6 12 22 33
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Aire CO2
Antocianostotales (mg/g peso fresco)
Figura 2. Efecto del pretratamiento con CO2 (20%) en la evolución de la podredumbre en los granos de uva durante la conservación a 0ºC y posterior transferencia a 20ºC durante 2 días.
Figura 3. Efecto del pretratamiento con CO2 (20%) en el contenido de trans-resveratrol en la piel de uva de mesa ‘Cardinal’ durante la conservación a 0 ºC y posterior transferencia a 20ºC durante 2 días.
0 5 10 15 20 25 30 35
20 30 40 50 60
70 CO2
0 5 10 15 20 25 30 35
80
Aire
Días a 0ºC
transresveratrol (µg/g peso fresco)
CO2
0 5 10 15 20 25 30 35
20 30 40 50 60
70 CO2
0 5 10 15 20 25 30 35
80
Aire
Días a 0ºC
transresveratrol (µg/g peso fresco)
CO2
0 5 10 15 20 25 30 35
20 30 40 50 60
70 CO2
0 5 10 15 20 25 30 35
80
Aire
Días a 0ºC
transresveratrol (µg/g peso fresco)
CO2
2
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30
Días a 0ºC
Podredumbre (% peso fresco) aire
CO 2
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30
Días a 0ºC
Podredumbre (% peso fresco) aire
CO 2
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30
Días a 0ºC
Podredumbre (% peso fresco) aire
CO
Aire CO
20 3d 6d 12d 19d 22d 28d 33d 3d 6d 12d 19d 22d 28d 33d Vcchit1b
rRNA
Figura 4. Efecto del pretratamiento con CO2 (20%) en los niveles de mRNA de Vcchit1b en la piel de uva de mesa ‘Cardinal’ durante la conservación a 0 ºC.
