DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA CL50-48, DE BARIO E HIDRÓXIDO DE SODIO, MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN UN
ECOSISTEMA, SOBRE Daphnia magna.
ALEXA VARGAS POVEDA
YARO ARMANDO PEREA MOSQUERA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTÁ D.C.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA CL50-48, DE BARIO E HIDRÓXIDO DE SODIO, MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN UN
ECOSISTEMA, SOBRE Daphnia magna.
ALEXA VARGAS POVEDA
YARO ARMANDO PEREA MOSQUERA
Trabajo de grado para optar el Título de Ingenieros Ambientales y Sanitarios
Director
PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER Químico INDUSTRIA
Lic. Química y Biología
MSc. Alta Gestión. Consultoría y Verificación Medio Ambiental MSc. Residuos Urbanos e Industriales
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTÁ D.C.
Nota de aceptación: _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________ _________________________________________ Firma del Director de Tesis
_________________________________________ Firma del Jurado 1
_________________________________________ Firma del Jurado 2
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por estar con nosotros en cada paso que damos, por fortalecer nuestros corazones e iluminar nuestras mentes, por haber puesto en nuestro camino aquellas personas que han sido nuestro soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
Por nuestros padres y hermanos quienes con su confianza y apoyo hicieron de esta carrera algo más que tan solo un camino que abrirá puertas al éxito. No hay palabras que puedan describir nuestro profundo agradecimiento hacia ellos, quienes durante todos estos años confiaron en nosotros; comprendiendo nuestros ideales y el tiempo que no estuvimos con ellos.
Y a nuestro director de tesis Pedro Miguel Escobar Malaver, por su apoyo y colaboración en la realización de este proyecto de investigación, por sus conocimientos compartidos y enseñados durante nuestro desarrollo profesional y sobre todo por hacer parte de ese grupo de educadores a quienes hoy les debemos las personas de juicio y criterio que somos.
CONTENIDO INTRODUCCIÓN ... 1 1. OBJETIVOS ... 4 1.1 OBJETIVO GENERAL ... 4 1.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4 2. ANTECEDENTES ... 5 3. MARCO TEÓRICO ... 15 3.1 ECOTOXICOLOGÍA ... 15 3.2 BIOENSAYOS ... 16 3.2.1 Clasificación de bioensayos ... 17 3.2.2 Ensayos toxicológicos ... 18
3.2.3 Evaluación estadística de los ensayos. ... 19
3.2.4 Importancia ambiental de los bioensayos ... 23
3.3 BIOINDICADOR– Daphnia s.p ... 25
3.3.1Daphnia magna ... 25
3.3.2 Importancia Ambiental ... 30
3.4 BARIO ... 31
3.5 HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)... 36
4. MARCO LEGAL ... 42
5. METODOLOGÍA ... 43
5.1 DISEÑO EXPERIMENTAL ... 43
5.2 FASES DE INVESTIGACIÓN ... 46
5.2.1 Fase I: Mantenimiento ... 46
5.2.2 Fase II: Ensayos de sensibilidad ... 49
5.2.3 Fase III: Ensayos de toxicidad ... 51
5.2.4 Fase IV: Alternativas de tratamiento - Vertimientos ... 51
5.2.5 Fase V: Obtención de resultados ... 53
5.2.6 Fase VI: Documentación ... 55
6.1 Mantenimiento del cultivo ... 59
6.2 Preparación agua reconstituida ... 72
6.3 Conteo de algas con la cámara Neubauer ... 73
6.4 Ensayos de sensibilidad ... 74
6.4.1 Análisis de varianza ANOVA para dicromato de potasio ... 76
6.4.2 Análisis Probit para dicromato de potasio ... 77
6.5 Ensayos de toxicidad ... 82
6.5.1 Análisis de varianza ANOVA para bario ... 84
6.5.2 Análisis Probit para bario ... 86
6.5.3 Análisis de varianza ANOVA para hidróxido de sodio ... 92
6.5.4 Análisis Probit para hidróxido de sodio ... 93
6.6 Ensayos de toxicidad - Vertimiento... 98
6.6.1 Análisis de varianza ANOVA para bario ... 99
6.6.2 Análisis Probit para bario ... 100
6.6.3 Análisis de varianza ANOVA para hidróxido de sodio ... 104
6.6.4 Análisis Probit para hidróxido de sodio ... 106
6.7 Carga Tóxica e Índice Tóxico ... 109
6.8 Alternativas de tratamiento ... 111
6.8.1 Tratamiento del vertimiento con contenido de bario ... 116
6.8.2 Tratamiento del vertimiento con contenido de hidróxido de sodio ... 119
CONCLUSIONES ... 128
RECOMENDACIONES ... 131
BIBLIOGRAFÍA ... 132
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Dosis letal del bario en algunas especies 35
Tabla 2. Marco legal 42
Tabla 3. Condiciones en el mantenimiento del cultivo 46
Tabla 4. Condiciones durante los ensayos de sensibilidad 50
Tabla 5. Rangos de carga tóxica 55 Tabla 6. Objetivos y actividades para cada fase del proyecto 56 Tabla 7. Parámetros de control del agua reconstituida 72 Tabla 8. Registro del conteo de algas con la cámara Neubauer 73 Tabla 9. Resultado prueba definitiva número 10 para dicromato de potasio 75 Tabla 10. Análisis de la varianza ANOVA – dicromato de potasioM10 76 Tabla 11. Concentración letal media (CL50-48) para dicromato de potasio 77
Tabla 12. Comparación de resultados de CL50-48 para dicromato de potasio 81 Tabla 13. Resultado prueba preliminar número 3para bario 83
Tabla 14. Resultado prueba definitiva número 2 para bario 84
Tabla 15. Análisis de la varianza ANOVA –bario M2 85
Tabla 16. Concentración letal media (CL50-48) para bario 86
Tabla 17. Comparación de resultados de CL50-48 para bario 89
Tabla 18. Resultado prueba preliminar número 3 para hidróxido de sodio 91
Tabla 19. Resultado prueba definitiva número 4 para hidróxido de sodio 91
Tabla 20. Análisis de la varianza ANOVA – hidróxido de sodio M4 92
Tabla 21. Concentración letal media (CL50-48) para hidróxido de sodio 93
Tabla 22. Comparación de resultados de CL50-48 para hidróxido de sodio 97
Tabla 23. Resultado prueba definitiva número 4 para bario (Vertimiento) 98
Tabla 24. Análisis de la varianza ANOVA – bario M4 (Vertimiento) 99
Tabla 26. Resultado prueba definitiva número 4 para hidróxido de sodio
(Vertimiento) 104
Tabla 27. Análisis de la varianza ANOVA – hidróxido de sodio M4 (Vertimiento) 105
Tabla 28. Concentración letal media (CL50-48) para hidróxido de sodio (Vertimiento) 106
Tabla 29. Datos obtenidos en el muestreo del vertimiento. 109
Tabla 30. Carga tóxica e índice tóxico de los vertimientos. 110
Tabla 31. Alternativas de tratamiento para metales 112
Tabla 32. Caracterización preliminar vertimiento de bario. 116
Tabla 33. Caracterización vertimiento de bario tratado. 118
Tabla 34. Caracterización final vertimiento de bario tratado. 119
Tabla 35. Caracterización preliminar vertimiento de hidróxido de sodio. 120
Tabla 36. Caracterización vertimiento de hidróxido de sodio tratado. 121
Tabla 37. Caracterización final vertimiento de hidróxido de sodio tratado. 122
Tabla 38. Caracterizaciones fisicoquímicas finales. 123
Tabla 39. Eficiencias de remoción. 125
Tabla 40. Carga tóxica e índice tóxico de los vertimientos pos-tratamiento. 125
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Bioindicadores a diferentes niveles de organización biológica, y
diferentes escalas temporales. 6
Figura 2. Grafico de la relación dosis – respuesta 19
Figura 3. Selección del método para la estimación de la CL50. 21 Figura 4. Morfología y anatomía interna del genero Daphnia s.p 26
Figura 5. Ciclo reproductor del género Daphnia s.p 28
Figura 6. Cultivo de organismos-ciclo de renovación 30
LISTA DE GRÁFICAS
Pág.
Grafica 1. Comportamiento de la Dureza Vs Tiempo 60
Grafica 2. Comportamiento del Oxígeno Disuelto Vs Tiempo 62
Grafica 3. Comportamiento de la Temperatura Vs Tiempo 65
Grafica 4. Comportamiento de la pH Vs Tiempo 67
Grafica 5. Control poblacional semanal 69
Grafica 6. Control poblacional mensual 71
Grafica 7. Comportamiento de la CL50-48 para dicromato de potasio 79
Grafica 8. Comportamiento de la CL50-48 para bario 87
Grafica 9. Comportamiento de la CL50-48 para hidróxido de sodio 95 Grafica 10. Comportamiento de la CL50-48 para bario – Vertimiento 102 Grafica 11. Comportamiento de la CL50-48 para hidróxido de sodio-Vertimiento 107 Gráfica 12. Índice tóxico (pre y pos-tratamiento) 126
ANEXOS
Anexo 1. Procedimientos
Anexo 2. Registro -Control de parámetros y actividades. Anexo 3. Control Poblacional Daphnia magna
Anexo 4.Resultados pruebas de toxicidad para dicromato de potasio, bario e hidróxido de sodio.
Anexo 5. Resultados pruebas de toxicidad para bario e hidróxido de sodio contenidos en un vertimiento de tipo industrial.
GLOSARIO
Agua Reconstituida. Agua preparada en el laboratorio provista de los reactivos
necesarios para garantizar las condiciones optimas de un ecosistema durante la aclimatación, estandarización, mantenimiento del cultivo de organismos de prueba y realización de ensayos de toxicidad.
Biocenosis. Es el conjunto de organismos de todas las especies que coexisten en
un espacio definido llamado biotopo que ofrece las condiciones ambientales necesarias para su supervivencia.
Bioconcentración. Es el proceso por el que un compuesto entra en un organismo
acuático directamente desde el agua a través de las agallas o de los tejidos epiteliales como consecuencia de un simple equilibrio químico de partición entre los tejidos y el agua.
Bioacumulación. Incluye tanto la bioconcentración como los procesos de entrada
de residuos químicos a través de la comida.
Biomagnificación. Hace referencia a la totalidad de procesos por los cuales la
concentración tisular de un compuesto químico bioacumulado se incrementen a medida que este material pasa a través de dos o más niveles tróficos.
Bioacumulación. Acumulación neta, con el paso del tiempo, de metales (u otras
sustancias persistentes) en un organismo a partir de fuentes tanto bióticas (otros organismos) como abióticas (suelo, aire y agua).
Bioensayo. Es un procedimiento que permite determinar la concentración, la
pureza y/o la actividad biológica de una sustancia, midiendo su efecto en un organismo, tejidos, células, enzimas o receptores.
Contaminante. Sustancia ajena física química o biológica presente en un
ecosistema natural en una concentración y con una duración más elevada de lo usual por causa de actividad antrópica directa o indirecta.
Concentración Letal. Concentración de tóxico estimada que se estima afecta a
una cantidad específica de los organismos del ensayo.
Concentración Letal Inicial Media (CL-I-50). Concentración nominal del agente
tóxico, al inicio de la prueba, que causa efecto agudo al 50 % de los organismos en un determinado periodo de exposición.
Concentración Letal Media (CL50). Concentración del compuesto tóxico que
afecta al 50% de la población de la especie modelo, causando su muerte, bajo condiciones de prueba en un tiempo determinado.
Curva Concentración – Respuesta. Curva que describe la relación entre la
concentración de un agente tóxico y el porcentaje de respuesta de una población de organismos acuáticos, en una prueba de toxicidad.
Dosis. Cantidad de sustancia administrada, expresada en términos de:
unidad/peso corporal.
Dureza. Medida de la concentración de iones de calcio y magnesio en el agua,
Ecosistema acuático. Es una unidad ecológica de carácter convencional y
disipativo en la cual un grupo de organismos interactúa entre si y estos con el medio acuático del que hacen parte.
Ecotoxicología. Es la ciencia que estudia la polución, su origen y efectos sobre
los seres vivos y sus ecosistemas.
Efecto. Es el cambio biológico producido tanto en el nivel de organismo individual
como en niveles de organización inferiores o superiores al individuo, asociado a la exposición a una sustancia tóxica.
Ensayo de Toxicidad. Determinación del efecto de un material o mezcla sobre un
grupo de organismos seleccionados bajo condiciones definidas. Mide las proporciones de organismos afectados o el grado del efecto luego de la exposición a la muestra.
Ensayo Preliminar (Screening). Prueba utilizada para determinar si se genera o
no un impacto. Se realizan utilizando una concentración determinada y un tiempo de exposición entre 24 y 96 horas.
Ensayo Definitivo. Prueba mediante la cual se establece la concentración en la
cual se presenta el efecto final establecido.
LOEC. Concentración más baja a la cual se observa efecto (LOEC, por sus siglas
en inglés).
NOEC. Concentración a la cual no se observa efecto. (NOEC, por sus siglas en
Oxigeno disuelto. Es la cantidad de oxigeno que esta disuelto en el agua y que
es esencial para la vida en estos ecosistemas / (ríos, lagunas, embalses, entre otros).
PMTC (concentración mínima del tóxico esperada). Concentración de un
efluente en el cuerpo receptor por debajo de la cual se esperaría que sólo un 5% de las muestras manifestaran efectos nocivos subletales, estimado con un nivel de confianza del 95% (PMTC, por siglas en inglés).
Replica. Batería de ensayo que contiene un número especifico de organismos en
una concentración dilución de muestra definida.
Tiempo de Exposición. Tiempo de contacto de los organismos involucrados en el
bioensayo con la sustancia prueba.
Tolerancia. Habilidad de un organismo a tolerar una condición dada por un
periodo de tiempo prolongado de exposición, sin que muera.
TOEC. Concentración umbral a la cual se observa efecto (media geométrica del
NOEC y LOEC).
Toxicidad. Es la capacidad de una sustancia de causar algún efecto nocivo sobre
organismos vivos que depende de la cantidad administrada o absorbida, vía de ingreso al organismo, distribución a lo largo del tiempo después de su administración, naturaleza y severidad del daño producido, tiempo necesario para producir el efecto.
Toxicidad Aguda. Efecto nocivo causado al os organismos utilizados en los
Toxicidad Crónica. Efecto tóxico causado a los organismos utilizados en los
bioensayos acuáticos relacionados con causar cambios en el apetito, crecimiento, metabolismo, reproducción, movilidad o la muerte en un periodo de cinco días en adelante.
Tóxico. Agente que puede generar un efecto adverso. Daño referido a la
estructura o función del sistema donde la introducción puede ser deliberada o accidental.
RESUMEN
La evaluación biológica de los efectos tóxicos que producen los contaminantes químicos sobre los organismos acuáticos es fundamental para establecer medidas de control que restrinjan o limiten la contaminación en los ecosistemas acuáticos receptores de descargas. Para realizar esta valoración con frecuencia se emplean como organismos de prueba a diferentes especies planctónicas, siendo Daphnia
magna el cladócero más utilizado en todo el mundo en pruebas de toxicidad
(Martínez, Rodríguez y Martínez, 2008)
Este proyecto contempla el mantenimiento de un cultivo de organismos de especie
Daphnia magna, para el cual se realizaron pruebas de sensibilidad iniciales con
dicromato de potasio obteniendo un valor de concentración letal media de 0,98 ppm. Posterior a ello se realizaron pruebas de toxicidad con bario e hidróxido de sodio, de las cuales se obtuvieron datos de CL50-48 de 27,83 ppm y 23,74 ppm, respectivamente. Para un vertimiento con contenido de bario y otro de hidróxido de sodio, los valores de CL50-48 fueron 32,40% y 18,72%. Se planteó por último una alternativa de tratamiento para dos vertimientos con contenidos de bario e hidróxido de sodio, obteniendo eficiencias de 86,10 y 97,79 % respectivamente.
ABSTRACT
The biological evaluation of the toxic effects of chemical pollutants on aquatic organisms is essential to implement control measures that restrict or limit pollution in aquatic ecosystems downloads. To make this assessment are often used as test organisms to planktonic species, Daphnia magna being the most common cladoceran worldwide in toxicity testing (Martinez, Rodriguez and Martinez, 2008)
This project involves the maintenance of a culture of organisms from species Daphnia magna, for which the initial susceptibility testing performed with potassium dichromate to obtain a median lethal concentration value of 0,98 ppm. Following this toxicity tests were performed with barium and sodium hydroxide, from which data were obtained from 27,83 ppm and LC50-48 of 23,74 ppm, respectively. For a dump containing barium and a sodium hydroxide, the LC50-48 values were 32,40% and 18.72%. Was raised at last an alternative treatment for two discharges with barium content and sodium hydroxide, giving efficiencies of 86,10 and 97,79% respectively.
1
INTRODUCCIÓN
La descarga de sustancias potencialmente tóxicas en cuerpos de aguas, así como los impactos sobre el recurso asociados a dicha actividad, son temas prioritarios en la Ingeniería Ambiental, pues la presencia de estos elementos dentro de los que se contemplan los metales y sustancias orgánicas complejas, han creado innumerables situaciones en las cuales los ecosistemas y la salud pública en general han sufrido grandes impactos. (Thomann, 1982)
Aunque no todos los productos químicos son nocivos para los organismos vivos, la descarga al medio ambiente de productos químicos peligrosos por aplicación directa (fertilizantes, plaguicidas y herbicida), o como productos de procesos de combustión (óxidos de azufre y de nitrógeno e hidrocarburos aromáticos policíclicos), o a través de los efluentes generados en la fabricación, transporte y consumo de productos utilizados por la sociedad moderna, hace que en muchos de los medios naturales se detecte en la actualidad niveles alarmantes de un gran número de sustancias tóxicas.(Díaz, Bustos y Espinoza, 1982)
Con base en esto, se hace necesario establecer parámetros de control de calidad de los recursos, con el fin de normalizar las concentraciones máximas de contaminantes que un cuerpo receptor puede asimilar. Para ello se han desarrollado durante los últimos años variedad de ensayos toxicológicos o herramientas de diagnóstico para diferentes niveles de organización que han sido usadas para evaluar algún daño en los organismos. El desarrollo reciente de bioindicadores basados en el estudio de las respuestas fisiológicas de los organismos a los contaminantes a que están expuestos, ha proporcionado las herramientas bioquímicas necesarias para desarrollar programas de evaluación sobre los efectos de dichos compuestos. (Bocquené et al., 1997)
2
La evaluación de los efectos tóxicos de los contaminantes se realiza a través de la exposición controlada de organismos de prueba seleccionados(que deseablemente son representativos de las comunidades en los ambientes acuáticos), a concentraciones establecidas de compuestos químicos (puros o en mezclas), o bien directamente a diluciones demuestras de efluentes contaminantes, muestras de agua de sistemas receptores de descargas, o muestras de formulaciones químicas comerciales, de composición conocida o desconocida, cuya toxicidad desea determinarse, normalmente en exposiciones cortas, lo que permite expresar el resultado como una concentración letal media (CL50), para un tiempo de exposición determinado. (Martínez, Rodríguez y Martínez, 2008).
Para la evaluación de los efectos tóxicos de los contaminantes químicos es importante la adecuada selección del organismo de prueba que se empleará, pues no sólo es necesario contar con un valor de CL50, sino que es también indispensable el poder inferir posibles daños sobre las comunidades acuáticas en los sistemas receptores, a partir de este resultado. (Dorn et al. 1987, Chapman 2000)
Para realizar esta valoración con frecuencia se emplean como organismos de prueba a diferentes especies planctónicas, siendo Daphnia magna el cladócero más utilizado en todo el mundo en pruebas de toxicidad. (Martínez, Rodríguez y Martínez, 2008).
El uso de cladóceros para test de toxicidad está ampliamente extendido porque se trata de organismos cuya amplia distribución geográfica permite disponer de ellos con facilidad, se adaptan bien a las condiciones de laboratorio, requieren poco espacio para su cultivo, su ciclo de vida es corto y, frecuentemente, son uno de los grupos de animales más sensibles a los compuestos químicos.
3
Daphnia magna presenta una serie de ventajas que la hacen especialmente
favorable como organismo bioindicadores en dichos ensayos. Su sensibilidad a los tóxicos, su reproducción partenogenética y sus ciclo vital y reproductivo relativamente cortos, facilitan el desarrollo de experiencias de laboratorio presentándose, además, raramente en combinación con otras especies. (Sánchez, 2006)
El siguiente proyecto de investigación establece dentro de la metodología, el mantenimiento de un cultivo de organismos de la especie Daphnia magna bajo condiciones controladas de laboratorio, la realización de pruebas preliminares y finales con dicromato de potasio a fin de determinar la sensibilidad de los bioindicadores, la realización de pruebas preliminares y finales para diferentes concentraciones de bario e hidróxido de sodio utilizando soluciones puras y dos vertimientos con contenidos de estas sustancias, la determinación de la carga tóxica para ambos vertimientos y la propuesta de tratamiento correspondiente.
Una vez reunidos los resultados de las pruebas finales de toxicidad se procede a realizar un análisis estadístico empleando el software Probit con el fin de determinar la concentración letal media CL50-48 de ambas sustancias para las soluciones puras y los vertimientos, y un análisis de varianza ANOVA con el cual se pretende comprobar si a diferentes concentraciones de las sustancias se presentan iguales o diferentes efectos toxicológicos.
Este proyecto hace parte de la investigación que se lleva a cabo por parte del profesor Pedro Miguel Escobar Malaver, el cual establece la CL50 de las sustancias de interés sanitario con diversas especies, entre las cuales se destacan peces, semillas, algas y pulgas de agua, con el fin de reordenar la normatividad de calidad de aguas, establecidos por los entes competentes.
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1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la concentración letal media, CL50-48, de bario e hidróxido de sodio, mediante bioensayos de toxicidad, en un ecosistema, sobre Daphnia magna.
1.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecer la concentración letal media (CL50-48), de dicromato de potasio, para
Daphnia magna.
Establecer la concentración letal media (CL50-48), de bario e hidróxido de sodio, para Daphnia magna.
Determinar la concentración letal media (CL50-48), de bario e hidróxido de sodio para Daphnia magna, contenidos en un vertimiento industrial.
Plantear una alternativa de tratamiento para el vertimiento industrial orientada a la prevención de los posibles efectos toxicológicos que presente el bario e hidróxido de sodio sobre un ecosistema acuático.
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2. ANTECEDENTES
A principios de los años 80, la toxicología acuática maduró considerablemente, con avances tan significativos como la identificación de bioindicadores adecuados para hacer un seguimiento a escala molecular de la toxicidad de ciertos compuestos, considerando como bioindicador cualquier cambio fisiológico, bioquímico o histológico como indicador de la exposición de un organismo a xenobióticos (Rand, 1995). La determinación de estos bioindicadores ha sido de gran utilidad para hacer seguimientos de la calidad medioambiental. (Stegeman et al., 1992)
Un bioindicador es cualquier respuesta a nivel bioquímico o celular que pueda ser relacionada cuantitativa o cualitativamente con la exposición a un compuesto químico (o grupo de compuestos químicos), y que puede ser empleada como bioensayo de la existencia en el medio de compuestos con capacidad tóxica, así como de sus efectos significativos sobre los organismos (Widdows, 1993). Es así como uno de sus principales objetivos es alertar de forma temprana la entrada de algún compuesto extraño a los organismos que esté ocasionando algún efecto a su salud.
Hasta la fecha se han propuesto diferentes “bioindicadores” o herramientas de diagnóstico a diferentes niveles de organización que han sido usadas para evaluar algún daño en los organismos.
Aunque la aplicación de bioindicadores fue propuesta en la medicina humana, estos también han sido aplicados en la toxicología clínica y, más recientemente, en la ecotoxicología. Un ejemplo de la aplicación de bioindicadores fue la medición de ciertos metabolitos de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en la orina de algunos trabajadores expuestos a estos compuestos. (Gold y Zapata, s.f)
6
Dependiendo de la concentración de dichos metabolitos se demostraba el grado de exposición de los trabajadores y se planteaba alguna alternativa para reducir la exposición, evitando daños irreversibles.
El estudio de los bioindicadores tanto en los mamíferos como en otros organismos tales como los peces, pueden ser evaluados a diferentes niveles de organización, como:
Bioquímicos y Moleculares (enzimas, proteínas, DNA, mRNA etc.) Celulares (cambios o daños en la membrana)
Histológicos (efectos en órganos y tejidos) Individuales (efectos en el crecimiento)
Figura 1. Bioindicadores a diferentes niveles de organización biológica, y diferentes escalas temporales.
Poblacionales (cambios en la reproducción) Comunidades (cambios en la diversidad)
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Como ya se mencionó anteriormente, aunque los bioindicadores pueden ser evaluados a diferentes niveles, entre más abajo sea el nivel de organización, el efecto podrá ser identificado con mayor anticipación y así se podrá alertar a las autoridades competentes de los posibles daños que los compuestos químicos presentes en los sistemas acuáticos pueden causar a los organismos, y de esta manera tomar las medidas preventivas y correctivas adecuadas ante el problema.
Todo lo contrario ocurrirá cuando el efecto sea detectado en los mayores niveles de organización, donde los cambios en la diversidad o en la reproducción serán difíciles de remediar y en algunos casos los daños serán irreversibles. Generalmente cuando se detectan efectos a este nivel ya es obvio que hay un problema.
La respuesta de los organismos, registrada a través de la respuesta bioquímica de los bioindicadores moleculares, permite detectar a priori la degradación potencial de los ecosistemas ocasionada por la exposición a elementos contaminantes. Así pues, aunque los bioindicadores no revelan directamente información acerca de los efectos de los compuestos químicos sobre los niveles superiores de organización biológica, pueden ser considerados como elementos tempranos de alarma en situaciones de impacto biológico. Es así como los bioindicadores tienen la ventaja de ser más rápidos y más baratos que el análisis químico. (Gold y Zapata, s.f)
Diversos estudios han puesto de manifiesto la supuesta relación existente entre el estado fisiológico de los organismos y los parámetros a nivel poblacional; como consecuencia de ello, los bioindicadores pueden jugar un papel sumamente importante en la evaluación de situaciones de riesgo ecológico. De esta manera, basándose en la magnitud y el patrón de las respuestas de los bioindicadores, las especies configuran su potencial medioambiental sirviendo algunas de ellas como organismos “centinela”, ya que son capaces de anunciar la presencia de
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contaminantes en el medio así como el alcance de la exposición a los mismos. (Mc Carthy y Shugart, 1990)
El uso de las respuestas bioquímicas y fisiológicas para evaluar biológicamente el impacto de los compuestos químicos en el medio natural ha ido en aumento en los últimos años (Ribeiro et al., 1999). El desarrollo reciente de bioindicadores basados en el estudio de las respuestas fisiológicas de los organismos a los contaminantes a que están expuestos, ha proporcionado las herramientas bioquímicas necesarias para desarrollar programas de evaluación sobre los efectos de dichos compuestos. (Bocquenéet al., 1997)
Desde sus comienzos, coincidiendo con la importancia del género Daphnia s.p en los estudios ecotoxicológicos, la toxicología acuática se ha servido de este crustáceo cladócero para efectuar ensayos, tanto in vivo como in vitro, conducentes a esclarecer el efecto de diversos compuestos con capacidad tóxica en distintos parámetros bioquímicos. Paralelamente al desarrollo creciente de estudios toxicológicos orientados en este sentido, se ha venido incrementando la utilización de Daphnia magna como organismo objeto de estos ensayos.
Los bioensayos son una herramienta que durante mucho tiempo han permitido evaluar la calidad de los ecosistemas acuáticos, y han sido enfocados a la prevención de la contaminación del ambiente mediante el establecimiento de parámetros de control que definen los niveles máximos de concentración de sustancias tóxicas contenidas en los residuos líquidos industriales que han de ser vertidos sobre cuerpos de agua receptores.
Dentro de las investigaciones realizadas mediante ensayos ecotoxicológicos se han utilizado organismos como Daphnia magna, caracterizada por ser una de las especies más representativas del género, con altas tasas reproductivas y de fácil aclimatación a condiciones de laboratorio.
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A continuación se describen algunas investigaciones desarrolladas mediante bioensayos sobre el género Daphnia s.p.
Estudios internacionales.
Daphnia exilis Herrick, 1895 (Crustacea: Cladócera). Una especie zooplanctónica potencialmente utilizable como organismo de prueba en bioensayos de toxicidad aguda en ambientes tropicales y subtropicales; por Fernando Martínez–Jerónimo, Jesús Rodríguez–Estrada y Laura Martínez– Jerónimo. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. México. Junio de 2008.
En este estudio se desarrolló un método para la producción controlada de neonatos de Daphnia exilis, un cladócero de gran talla que está ampliamente distribuido en América del Norte, y se evaluó su sensibilidad mediante bioensayos de toxicidad aguda a 20 y 25 °C, con el tóxico de referencia cromo hexavalente (Cr(VI)). La concentración letal media (CL50) determinada a 48 h fue de 0.1170 ± 0.0068 y 0.0802 ± 0.0057mg L-1, respectivamente a 20 y 25 °C, que son valores menores a los reportados para D. magna (0.2076 ± 0.0164 y 0.1544 ± 0.0175 4 mg L-1, a 20 y 25 °C respectivamente), lo que indica una mayor sensibilidad. Debido a su talla, facilidad de manejo y cultivo, así como por su sensibilidad, se sugiere a D. exilis como un organismo de prueba adecuado para la realización de estudios toxicológicos en latitudes tropicales y subtropicales.
Bioensayos de toxicidad aguda utilizando Daphnia magna straus (Cladócera, Daphniidae) desarrollada en medio de cultivo modificado; por Mónica Núñez y Jazmín Hurtado. Universidad peruana Cayetano Heredia. Perú, 2005.
Se aislaron 10 cepas de D. magna, se evaluó el desarrollo de la población (Conteo total de individuos y de hembras grávidas) empleando 3 medios de
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cultivo, medio A: jugo de alfalfa (0,250 gr/mL), medio B: levadura fresca disuelta y medio C: jugo de alfalfa y levadura disuelta. De las 10 cepas, 4 desarrollaron satisfactoriamente en el medio A, pero no sobrevivieron en los otros medios. En los ensayos ecotoxicológicos agudos frente a dicromato de potasio se encontraron valores promedio de EC50-24h 0,4045 mg/L ± 0,0389 y EC50-48h 0,1857 mg/L ± 0,0072. Con estas 4 cepas se realizaron ensayos ecotoxicológicos agudos para cianuro de potasio, que es un contaminante del sector minero, encontrándose valores de EC50-24h 1,5388 mg/L ± 0,1146 y EC 50-48h de 0,6359 mg/L ± 0,0516. Los valores de EC50 a las 48 horas están por debajo del límite permisible para liberación de cianuro en efluentes del sector Energía y Minas.
Calibración del Bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia pulex (Crustacea: Cladócera) usando un tóxico de referencia; por Jeannette Silva, Guillermo Torrejón, Enrique Bay-Schmith1 y Alberto Larrain. Chile, 2003.
El estudio de calibración que aquí se expone determina la precisión y exactitud intralaboratorio (Laboratorio de Bioensayos, Universidad de Concepción) alcanzadas en la ejecución del bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia
pulex De Geer 1877 (Crustacea: Cladócera) mediante la determinación de la
inhibición de la movilidad (mortalidad) utilizando bicromato de potasio (K2Cr2O7) como tóxico de referencia. El objetivo final del estudio de calibración es determinar la CL50-24h (concentración letal 50) promedio y el rango de sensibilidad, representado por los límites de vigilancia superior (LVS) e inferior (LVI), al 95 %, de la mortalidad de D. pulex frente al tóxico de referencia. La calibración fue realizada en base a nueve (n=9) valores de CL50-24 h de bicromato de potasio, dando como resultado el siguiente rango de sensibilidad = 0,092 - 0,197 mg.L-1y una CL50 - 24 h de 0,145 mg.L-1. Esos valores revelan una mayor sensibilidad de la población chilena de D. pulex respecto a las poblaciones del hemisferio norte.
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Bioensayos de toxicidad aguda en neonatos de Moina macrocopa (Straus, 1820) (Crustácea: branchiopoda) expuestos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH); por Mac-Quhae, César Augusto. Licenciado en Biología Marina. Universidad de Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela. Agosto de 2002.
Los bioensayos se realizaron con la especie Moina macrocopa (Straus, 1820), la cual fue colectada del canal de aguas servidas de la Ciudad de Juan Griego, Isla de Margarita, Venezuela e identificada por el Laboratorio de Cultivo de Zooplancton del Instituto de Investigaciones Científicas (I.I.C.) de la Universidad de Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela.
La selección de M. macrocopa obedeció a la disponibilidad de cepas por parte del I.I.C.; la existencia de protocolos estandarizados para bioensayos de toxicidad específicos descritos por Rodríguez y Esclapés (1995) y Esclapés (1999); su condición cosmopolita, reportándose en Venezuela en los estados Carabobo, Aragua y Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999); su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos; además de ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio.
Como conclusiones para este proyecto se establecieron las siguientes: 1) La CL50 de NaOH a las 48 h en agua sintética dura para Moina macrocopa por los métodos Binomial y Logit fue de (25,72 y 25,64) mg/L respectivamente. 2) La CL50 de NaOH a las 48 h en agua del río Orinoco para M. macrocopa por los métodos Binomial, Logit y Probit fue de (22,34; 21,57 y 21,61) mg/L respectivamente. 3) El hidróxido de sodio resultó más tóxico en el agua del río Orinoco que en el agua sintética dura. 4) Al adicionar hidróxido de sodio a las soluciones de exposición, se observó un incremento de pH de por lo menos 3,57 en el agua del río Orinoco, superior al aumento > 1,15 presentado en el agua sintética dura; y 5) Las condiciones físico-químicas, el alimento y los
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medios de cultivo resultaron óptimos para la reproducción y mantenimiento de
M. macrocopa.
Las recomendaciones planteados en la investigación fueron: 1) Utilizar técnicas diferentes de preparación de agua sintética dura (160 - 180 mg/L CaCO3) para cladóceros. 2) Estudiar si los fenoles aumentan el grado de toxicidad del hidróxido de sodio sobre los organismos acuáticos. 3) Realizar bioensayos de toxicidad crónica con hidróxido de sodio, donde se estudie el efecto producido sobre los aspectos biológicos y fisiológicos de Moina macrocopa. 4) Realizar bioensayos de toxicidad con hidróxido de sodio en otras especies acuáticas; y 5) Elaboración de normas donde se regule la concentración de hidróxido de sodio en los desechos industriales.
Estudios Nacionales.
En Colombia las Entidades de Manejo y Administración del Recurso EMAR son las encargadas de la realización de bioensayos y del establecimiento de la CL50-96 de las sustancias de interés sanitario (Concentración letal en la cual el 50% de la población expuesta muere). Aunque la legislación existe (Decreto 3930 de 2010), la capacidad de gestión es muy baja y no define con qué especies se deben realizar estas determinaciones. Actualmente sólo algunas entidades estatales como la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca C.A.R. dentro del programa de control de la contaminación de aguas bajo su jurisdicción ha empezado a realizar dichos bioensayos, usando Daphnia magna, especie reconocida y recomendada internacionalmente para la realización de estas pruebas.
Algunas de las investigaciones realizadas sobre el cladócero Daphnia magna son: Zúñiga de Cardoso, M. del C. 1989. Evaluación de Toxicidad aguda en métales
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pesados a través de Bioensayos con el microcrustáceo Daphnia magna (Cladócera). Revista Asociación de Ingenieros Sanitarios de Antioquia, AINSA. 9 (1): 77 – 96; Satizábal, C.A., M. Andrade B., M. del C. Zúñiga. 1999. Toxicidad aguda del aluminio sobre Daphnia magna en aguas con diferentes niveles de dureza. Actualidades Biológicas. 27(71): 131-142.
Estudios Universitarios
Universidades como la Nacional y la Pontificia Javeriana han desarrollado numerosas investigaciones con base en la dosis-respuesta a partir de diferentes organismos, entre los cuales se encuentra el cladócero Daphnia magna, donde han contribuido a la toma de decisiones como criterios de calidad de agua para el control de la contaminación en el recurso.
Por otro lado, la Universidad de La Salle creó un laboratorio especializado en bioensayos que durante años ha contribuido al análisis toxicológico de muchas sustancias que en la actualidad son descargados como residuos líquidos en diferentes efluentes de la capital, lo que le permite desarrollarse y especializarse cada vez más en este campo tan importante para el control de la contaminación. Este laboratorio, ha sido gestionado por Rubén Darío Londoño, Yaneth Parra y Pedro Miguel Escobar, en donde se realizaron proyectos de investigación utilizando bioensayos, dentro de los cuales se encuentran.
En 2010, Morales y Contreras determinaron que la CL50-48 para dicromato de potasio es de 29.55 mg/L, para selenio de 0.7797 mg/L y para bario de 29.55 mg/L, sobre Daphnia pulex. En este mismo año Torres y Quintero obtuvieron las siguientes concentraciones letales medias: dicromato de potasio de 0.99mg/L, arsénico de 0.0671 mg/L y aluminio de 0.8594 mg/L, utilizando como bioindicador
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Rodríguez y Torres, 2010, determinaron la concentración letal sobre Daphnia
magna obteniendo los siguientes valores. Dicromato de potasio: CL50-48 de 0.5 mg/L; fenol: CL50-48 de 8.967 mg/L; y cloro: CL50-48 de 0.282 mg/L.
En el 2008 Álvarez y Monge establecieron los siguientes valores utilizando
Daphnia magna. Dicromato de potasio: CL50-48 de 1.372 mg/L; cobre: CL50-48 de 0.0500 mg/L; y cromo: CL50-48 de 0.518 mg/L. en este proyecto se concluyo que “Daphnia magna posee una mayor resistencia y un mayor tiempo de respuesta frente a los metales cromo y cobre respecto a la Daphnia pulex”
Para el mismo año Zarate y Sierra obtuvieron las concentraciones letales de plomo y plata sobre Daphnia magna, obteniendo 9.49 mg/L y 8,925x10-8 mg/L, respectivamente. La concentración letal media para dicromato de potasio fue de 1.05mg/L
Gómez y Ramírez determinaron para glifosato una concentración letal media de 42.9053mg/L. Alcalá concluyo que la concentración letal media CL50-48, de níquel en Daphnia magna, para el vertimiento de la industria de galvanotecnia Nicrozync Ltda, fue de 5.89mg/L.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1 ECOTOXICOLOGÍA
La ecotoxicología es el estudio de los efectos adversos de compuestos químicos sobre los ecosistemas. Esta disciplina es relativamente joven y fue definida inicialmente por René Trahaut en 1969 combinando dos áreas diferentes: ecología (el estudio científico de las interacciones que determinan la distribución y abundancia de los organismos), y la toxicología (el estudio de efectos dañinos de las sustancias sobre los organismos vivos, principalmente el hombre).
En toxicología se limita la investigación a nivel de organismos, mientras que la ecotoxicología aspira a evaluar el impacto de compuestos químicos no solo en los individuos sino en poblaciones y el ecosistema. Los objetivos principales de la ecotoxicología son la obtención de datos para la evaluación de riesgos y manejo ambiental, y para el desarrollo de principios empíricos o teóricos para mejorar el conocimiento del comportamiento y efectos de los compuestos sobre organismos vivos. (Salazar, 2008)
Se trata, por lo tanto, de una ciencia que estudia el origen de los contaminantes, su transporte entre los distintos compartimientos ambientales, las transformaciones que sufren dichos contaminantes y, finalmente, los efectos que estos producen sobre los ecosistemas.
Establecer relaciones causa-efecto entre las perturbaciones ambientales causadas por el hombre y los efectos observados en sistemas naturales es difícil debido a la existencia de múltiples factores intrínsecos, y, especialmente porque no hay un enfoque único y ampliamente aceptado para la determinación de estas relaciones. Una causa puede ser definida como un estresante que ocurre a una intensidad,
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duración y frecuencia de exposición que genera un cambio apreciable en la integridad de los ecosistemas. La habilidad de establecer relaciones causa-efecto entre factores estresantes derivados de la actividad humana y los efectos ecológicos es particularmente importante en la política ambiental, ya que afecta aspectos tales como la regulación de los vertidos, la preservación de los espacios protegidos, la biorremediación de ecosistemas, y otros aspectos ambientales y legislativos.(Marín, 2007)
3.2 BIOENSAYOS
Los bioensayos se utilizan para determinar la toxicidad de contaminantes para diferentes especies de organismos, determinando las tasas de mortalidad que producen, u otros efectos no letales (subletales) que ponen en peligro la supervivencia de los individuos o de las poblaciones en el medio natural, como por ejemplo efectos negativos sobre el comportamiento, la reproducción o el metabolismo.
Los bioensayos incluyen también test de acumulación de los tóxicos en los organismos, diferenciándose entra las vías de entrada de los xenobióticos. Mientras que los animales terrestres acumulan contaminantes principalmente a través del alimento; en el medio acuático se pueden distinguir tres procesos bien diferenciados: bioconcentración, bioacumulación y biomagnificación. (Gallego, 2003)
El decreto 3930 del 25 de octubre de 2010, define un bioensayo acuático al procedimiento por el cual las respuestas de organismos acuáticos se usan para detectar o medir la presencia o efectos de una o más sustancias, elementos, compuestos, desechos o factores ambientales solos en combinación. Su aplicación más común se relaciona con la determinación de las CL50-48 definida
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como la concentración de una sustancia, elemento o compuesto, solos o en combinación, que produce la muerte al cincuenta por ciento (50%) de los organismos sometidos o bioensayos en un periodo de cuarenta y ocho (48) horas.
3.2.1 Clasificación de bioensayos
Los bioensayos en ecotoxicología acuática se clasifican, en función de su duración y del método que se emplea para añadir el tóxico al agua, de la siguiente manera:
Test a corto plazo: el periodo de tiempo oscila entre 48 y 96 horas y normalmente no se suministra comida a los organismos de experimentación; la gran ventaja de este tipo de bioensayos es la rapidez de los resultados.
Test a largo plazo: su duración oscila entre 7 días y uno o varios meses; la ventaja que presenta a los anteriores es su mayor fiabilidad.
Test estático: son bioensayos generalmente de corta duración en los que los organismos están durante todo el periodo de experimentación en el mismo medio.
Test de renovación o estático con renovación: en este tipo de bioensayo el medio se renueva periódicamente.
Test de flujo: es el más sofisticado, ya que el medio se va renovando continuamente mediante sistemas de circulación y dosificación automática. (Gallego, 2003)
También se pueden clasificar según su respuesta en:
Agudo: los organismos son expuestos al agente tóxico durante un periodo corto no mayora 96 horas, y se presenta una sola vez.
Subaguda: los organismos son expuestos al agente tóxico diariamente durante periodos que oscilan entre 15 días y 4 semanas.
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Crónico: el periodo de exposición cubre al menos, una generación del organismo de prueba. Son considerados como ensayos a largo plazo. Permiten evaluar la exposición continuada al tóxico y efectos subletales, como reducción de crecimiento o reproducción.
Subcrónica: en ellos el periodo de exposición al tóxico cubre al menos el 10% del periodo de generación del organismo de prueba. Se aplica a organismos que tienen ciclo de vida de por lo menos un año de duración. Permiten la evaluación de la alternancia de periodos de exposición al tóxico. (Escobar y Londoño, 2009)
3.2.2 Ensayos toxicológicos
Los ensayos toxicológicos se refieren a las pruebas a realizar durante el bioensayo y se trabajan dentro de este proyecto de investigación los siguientes.
- Preliminares. Estos ensayos son pruebas previas utilizadas para conocer las concentraciones del tóxico a trabajar en las pruebas definitivas. Son realizados bajo las mismas condiciones en que se realiza el cultivo de los organismos, en este caso para Daphnia magna, con concentraciones amplias donde se evalúan efectos de concentraciones comprendidas ente el 0% y 100% de mortalidad.
- Definitivos. Los ensayos definitivos son realizados según los resultados obtenidos en las pruebas preliminares, donde en este caso, se manejan intervalos de concentración más pequeños con el fin de establecer los valores de CL50-48 y/o CL50-24 horas, obteniendo la concentración exacta que es capaz de causar la muerte al 50% de los organismos a prueba en un periodo de exposición de 48 o 24 horas según corresponda la CL50 a calcular. (Gutiérrez y Herrera, 2010, p. 25)
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3.2.3 Evaluación estadística de los ensayos.
Uno de los aspectos importantes en toxicología y ecotoxicología es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta relación, conocida como la relación dosis-respuesta, constituye la base para la evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas en el medio ambiente. Los gráficos bivariables de estas relaciones muestran en general patrones no rectilíneos de tipo sigmoide.
Figura 2. Gráfico de la relación dosis – respuesta.
Existen muchas formas de determinar la toxicidad, y aunque los efectos bioquímicos, fisiológicos, reproductivos y de comportamiento son de gran utilidad, el indicador comúnmente más utilizado es la muerte del organismo de prueba. La mayoría de las pruebas de toxicidad suministran una estimación de la dosis (o concentración en el alimento, aire o agua) que produce una respuesta tóxica a un nivel del 50%. Como es el ejemplo de la dosis letal media definida como la concentración que mata al 50% de la población (CL50).
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Para poder dar cumplimiento a los requerimientos de validez y precisión de las pruebas es necesario utilizar una metodología estadística desde la planificación hasta la ejecución y, luego, el posterior análisis de los resultados. El criterio básico recomendado es seleccionar un método estadístico sencillo, que se ajuste a las condiciones experimentales y que permita obtener resultados válidos.
El principio básico en el diseño estadístico es la aleatorización, por ello los esfuerzos y el tiempo dedicados a cumplir con este principio producirán resultados más confiables y reproducibles, ya que el concepto de muestra aleatoria es un requisito indispensable para la validez de cualquier prueba estadística.
En las pruebas de toxicidad en general se utilizan dos diseños básicos:
1. Establecimiento de una relación dosis-respuesta: Como resultado del análisis de los datos de un diseño para estimar una relación dosis-respuesta, lo que se pretende obtener son las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado para relacionar las variables y, a continuación, utilizar el modelo con las estimaciones de los parámetros encontrados para determinar los valores de la variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto, en particular sobre los organismos expuestos. Entre estas concentraciones, la más utilizada es la que se conoce como concentración letal, efectiva o inhibitoria 50 (CL50/CE50/CL50), que es la concentración que produce la respuesta esperada sobre el 50% de los organismos expuestos.
- Establecimiento de una relación dosis-respuesta de tipo mortalidad: La selección del método a utilizar para estimar los valores de CL50/CE50/CL50 de este tipo de pruebas de toxicidad aguda con múltiples concentraciones dependerá de la forma de la distribución de tolerancias, y que tan bien las concentraciones o dosis seleccionadas la caracterizan (por ejemplo, el número de mortalidades parciales).
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En general, se recomiendan los siguientes cuatro métodos para la estimación de CL50/CE50/CL50: método Probit (paramétrico), método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico), método de Sperman-Karber (no paramétrico) y método gráfico.
En la siguiente figura se presenta el diagrama de flujo recomendado por la USEPA (1993) para la selección del método, basado en los requerimientos de cada uno.
Figura 3. Selección del método para la estimación de la CL50
No No No No Datos de mortalidad. núm. de muertos Dos o más mortalidades
¿Es el modelo apropiado? (Ensayo del X2 significativo)
Método Probit ¿Una o más mortalidades parciales? ¿Mortalidad cero en la concentración más baja y mortalidad 100% en la concentración más alta? Método de Sperman-Karber CL50 e intervalo de confianza al 95% Método de Sperman-Karber ajustado Método gráfico CL50 Sí Sí Sí Sí
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Análisis de regresión y análisis Probit. El procedimiento Probit permite encontrar
estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. Dosis dentro del marco de la regresión.
Consiste básicamente en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una población a los fenómenos físico peligroso; da una relación entre la función de probabilidad y una determinada carga de exposición.
Método de Litchfield-Wilcoxon. Este método consiste en la construcción de una
gráfica a partir de los datos obtenidos en pruebas de toxicidad aguda de un agente tóxico. Se utiliza papel prob-log, en el cual se colocan en el eje de las X el logaritmo (X) de las concentraciones usadas y en el eje de las Y el porcentaje de respuesta del efecto observado. Para el cálculo de la CL50/CE50/CL50 mediante este método, es necesario tener por lo menos, un porcentaje intermedio de efecto observado (valores entre 0 y 100% de efecto).
Método de Spearman-Kärber. El método de Spearman-Kärber es un método
aproximado, no paramétrico, que proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar. Si la distribución es simétrica, se obtiene una estimación de la concentración total mediana (CL50/CE50/CL50).
Método gráfico. Además de los métodos anteriores, se puede utilizar el método
gráfico para estimar la CL50/CE50/CL50. De forma similar, se parte de los datos obtenidos en las pruebas de toxicidad aguda, y utilizando papel logarítmico se grafican en el eje de las X las concentraciones (mg/L) y en el eje de las Y el porcentaje de mortalidad. Se colocan los puntos de los porcentajes de mortalidad observados (en escala lineal) en función de las concentraciones probadas (en escala logarítmica); se conectan los puntos obtenidos más cercanos al 50% del
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efecto observado, o sea, a la mayor concentración que no causa efecto tóxico y a la menor concentración que causa efecto tóxico. A partir de la recta trazada, se obtiene el punto de corte correspondiente al 50% del efecto observado. Este valor corresponde al CL50/CE50/CL50del estímulo o agente estudiado. Cuando no se logra hacer un ajuste adecuado de los datos, se pueden utilizar otros métodos para hacer las estimaciones de CL50/CE50/CL50.
2. Pruebas para evaluar la diferencia entre organismos expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0).
Este tipo de análisis se realiza para determinar la concentración más alta a la que no se observa efecto (NOEC) o la concentración más baja a la que se observa efecto (LOEC) e implica pruebas de hipótesis. El método clásico para este tipo de análisis es el ANOVA, el cual sirve para comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos son significativamente distintos a los valores de otro o más conjuntos de datos. El procedimiento para comparar estos valores está basado en la varianza global observada en los grupos de datos numéricos a comparar. Típicamente, el análisis de varianza se utiliza para asociar una probabilidad a la conclusión de que la media de un grupo de puntuaciones es distinta de la media de otro grupo de puntuaciones. (Castillo, 2004, pp. 99-110)
3.2.4 Importancia ambiental de los bioensayos
La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un método de detección relativamente simple y que se puede emplear para el monitoreo de causas y efectos de tipo ambiental y farmacológico. En un organismo, especial, la respuesta biológica (efecto) se puede generar a concentraciones menores a los límites de detección de los principales métodos analíticos y aunque, un método analítico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o concentración de compuesto o causa de daño, sus datos no indican el efecto biológico al
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ecosistema o al organismo de prueba los cuales se pueden observar en los organismos aún cuando la exposición a los compuestos o causas ha finalizado.
La detección de efectos en organismos se puede emplear para monitoreo lo que es muy útil para la inspección o vigilancia antes y después de un evento o dosificación de algún compuesto, vigilar la efectividad de un proceso de remediación o biorremediación y/o vigilar el cumplimiento de los parámetros estatales y federales de calidad ambiental.
Estas acciones se pueden aplicar en:
Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de nuevos productos.
Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o procesos. Obtener permisos de descarga.
Evaluación de riesgo ambiental.
Elementos de cargo o descargo en litigios.
Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger organismos de futuras afectaciones.
Sin embargo, la principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados, difícilmente, generan información específica de un compuesto, causa o condición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones experimentales en las cuales se incluye la muerte del organismo como un efecto normal y el problema es que las causas de este efecto pueden ser muchas y difíciles de detectar por medio de un Bioensayo como para decir que en este proceso, valió la pena el sacrificio del organismo.
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3.3 BIOINDICADOR– Daphnia s.p
Dentro del grupo de cladóceros, las especies del género Daphnia s.p son las más utilizadas como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogenética (lo cual asegura una uniformidad de respuesta) y el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de toxicidad, de carácter universal.
Su tamaño varía entre 0,2 y 5,0 milímetros. Habitan en medios acuáticos desde charcos a ríos y se alimentan esencialmente de fitoplancton, pudiendo también ingerir microorganismos como protistas y bacterias, así como material orgánico particulado y disuelto.
3.3.1Daphnia magna
La Daphnia magna es la especie más grande en tamaño del género Daphnia s.p, con condiciones del ambiente muy diferentes a sus parientes. Las D. magna hembras llegan a medir una longitud máxima de 6 mm, lo que las diferencia en tamaño y color con los machos de su misma especie (longitud máxima de 2 mm) dado que estas, por su alimento algal, obtienen un color pardo y trasparente.
- Morfología. El tamaño de Daphnia s.p está estrechamente relacionado con la disponibilidad de alimento en el medio al igual que su color.Constan de un caparazón o bivalvo de quitina, que encierra al tronco, pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano, también posee antenas frecuentemente largas y utilizadas en la natación. Además, presenta de cuatro a seis pares de apéndices troncales y el potsabdomen está girado ventralmente hacia delante. La mayoría de estos
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organismos son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en agua dulce. Su corazón se ubica detrás del la espalda y su ritmo cardiaco es aproximadamente 128 bpm en condiciones normales. (Salazar, 2008)
Figura 4. Morfología y anatomía interna del género Daphnia s.p.
- Locomoción. En los adultos, la función trófica corresponde a los pereiópodos que generan una corriente de agua en sentido caudo-cefálico, la filtran y retiran los posos del filtrado que serán compactados con una secreción mucosa y posteriormente ingeridos.
- Visión. La visión de los individuos de este género, reside en un único ojo compuesto de color oscuro localizado en la región antero-medial del céfalon, siendo el resultado de la fusión de dos ojos de color rosado al principio del segundo estadio del desarrollo embrionario. Daphnia s.p presenta fototactismo positivo, detectando los cambios en la luminosidad del entorno a través del ojo compuesto.
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- Incubación. Entre el dorso del cuerpo y el caparazón, las hembras presentan la denominada cámara dorsal de incubación a la que se abren los orificios genitales. Cuando la reproducción es sexual, el macho introduce su postabdomen entre las valvas del caparazón de la hembra, y deposita el esperma en el interior de la cámara incubadora.
- Color.Las Daphnias s.p son de color transparente en el medio natural, pero en ambientes con escasez de oxígeno, adoptan un ligero tono rosado por la síntesis de hemoglobina para aumentar la eficacia en la captación del escaso oxígeno ambiental. El hecho de que sinteticen hemoglobina como respuesta a situaciones de escasez de oxígeno es señal de que la utilizan para la respiración. (Sánchez, 2006)
- Ciclo reproductor. En el ciclo reproductivo de las Daphnias s.p se distinguen dos tipos de reproducción, con alternancia de generaciones (Figura 5).
Partenogénesis. Cuando los recursos alimenticios son abundantes en el medio y la densidad poblacional es baja, las hembras producen huevos diploides que se desarrollan en la cámara dorsal de incubación. Si se alimentan correctamente, los
Dáphnidos pueden liberar hasta 65 neonatos o más en cada camada aunque, en
general, el tamaño medio de la camada es de 12 neonatos, pudiendo llegar a liberar hasta un número de camadas entre 17 y 20 a lo largo de toda su vida. El tamaño de la camada varía de acuerdo con el nivel de recursos disponibles en el medio y con la edad de la hembra. Generalmente el tamaño de la camada aumenta hasta alcanzar un máximo cerca de la quinta, después de la cual decrece, probablemente debido a la edad de la hembra. En condiciones de laboratorio, cada hembra puede generar entre 200 y 450 descendientes en toda su vida.
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Reproducción sexual. La aparición de machos en una población se asocia a la existencia de determinadas condiciones ambientales adversas tales como elevada densidad poblacional con el consiguiente acumulo de productos de excreción que terminan resultando tóxicos para la población, deficiencia de recursos alimenticios en el medio, bajo contenido en oxígeno o temperaturas extremas. Estas condiciones inducen la aparición de huevos de resistencia, fruto de la reproducción sexual. Los huevos fecundados son grandes y sólo se producen dos en cada puesta, uno de cada ovario.
Figura 5. Ciclo reproductor del género Daphnia s.p
Muchas especies se reproducen por partenogénesis y poseen machos enanos; en la mayoría de casos se ha comprobado que existen períodos ocasionales de
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reproducción sexual, sobre todo cuando hay superpoblación, carencia de alimento o temperaturas adversas, las hembras partenogenéticas producen machos.
- Condiciones del Cultivo. Los cultivos de D. magna pueden mantenerse en recipientes de uno, dos o tres litros, o cualquier otro sistema que resulte funcional. Con el fin de mantener condiciones óptimas para el crecimiento de los individuos, se recomienda una densidad poblacional no mayor de 12 individuos por litro; manteniéndolas en recipientes de 2 L de vidrio transparentes y deben permanecer tapados.
Los organismos se deben mantener en agua reconstituida con una dureza entre 160 y 180 mg CaCO3/L; con una temperatura de 21± 2 °C; con un pH que deberá oscilar entre 7,6 y 8,0; una concentración de oxígeno la cual debe estar por encima de 6 mg/L; un fotoperiodo aproximado de 16 h luz/8 h oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux.
Diariamente se deben retirar las exubias (mudas) y los restos que se encuentren en el fondo de los recipientes. Cada semana se cambia el agua de los acuarios, los cuales deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua desionizada. No se deben emplear jabón ni otros detergentes.
De igual manera, a diario se deben retirar los neonatos con un ayuda de una pipeta Pasteur, con una abertura lo suficientemente ancha como para no ocasionar daños a los neonatos en caso de necesitarlos para posteriores pruebas de toxicidad.
- Limpieza y Mantenimiento. Los ciclos para el mantenimiento del cultivo permiten obtener un cultivo de organismos en etapas óptimas de reproducción. Por ello se recomienda mantener lotes de individuos separados por edad, desde 0-1 semana hasta cuatro o cinco semanas de la siguiente forma:
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Figura 6. Cultivo de organismos-ciclo de renovación.
Se recomienda desechar los organismos mayores a cuatro o cinco semanas, reemplazarlos e iniciar un nuevo cultivo con los neonatos colectados ese día. Cuando se van a realizar pruebas, el día previo se extraen los neonatos presentes en el cultivo para de esa forma garantizar que los neonatos encontrados al día siguiente tengan menos de 24 h de nacidos.
- Alimentación. Para la alimentación de los cultivos se pueden emplear suspensiones de diferentes especies de algas (Selenastrum capricornutum,
Ankistrodesmus falcatus Chlorella s.p Scenedesmus sp., etcétera), donde en
laboratorio se obtienen por el medio Bristol.Un exceso de alimento en las peceras pueden propiciar enfermedades en el cultivo como: malformaciones en la espalda o la apariencia de una cola quemada. (Díaz, Pica y Ronco, 2004)
3.3.2 Importancia Ambiental
Los ensayos de toxicidad con Daphnia magna permiten determinar la letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e
Inicio de partos Madurez sexual
0-24 h 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
Neonatos
Hembras que se descartan Ciclo de reproducción
Renovación del cultivo Pruebas de sensibilidad
