biología molecular biología molecular
aplicada aplicada
emplea principios de la estructura y la emplea principios de la estructura y la función del DNA y de las proteínas para función del DNA y de las proteínas para estudiar las bases de fenotipos producidos estudiar las bases de fenotipos producidos por genotipos bajo condiciones normales y por genotipos bajo condiciones normales y
patológicas patológicas
mediante herramientas y técnicas que explotan mediante herramientas y técnicas que explotan
la información contenida en las moleculas de la información contenida en las moleculas de
un organismo (sobre todo DNA)
un organismo (sobre todo DNA)
La información química La información química contenida en un polimero contenida en un polimero
simple (ácido nucleíco) simple (ácido nucleíco) controla el desarrollo y controla el desarrollo y
mantenimiento de un mantenimiento de un organismo vivo complejo organismo vivo complejo
4 bases:
4 bases: Guanina (G), Adenina (A), Citosina (C), Timina (T)Guanina (G), Adenina (A), Citosina (C), Timina (T) En un oligonucleótido de 10 nucleótidos puede haber 4
En un oligonucleótido de 10 nucleótidos puede haber 41010 posiciones posiciones distintas de las cuatro bases (1.048.576)
distintas de las cuatro bases (1.048.576)
En nucleo de una célula humana hay más de 10
En nucleo de una célula humana hay más de 1099 nucleótidos, es nucleótidos, es decir más de 4
decir más de 41000.000.0001000.000.000 de combinaciones de secuenciasde combinaciones de secuencias
Procesamiento de la información genética Procesamiento de la información genética
en la célula (eucariotas)
en la célula (eucariotas)
Procesamiento de la información genética Procesamiento de la información genética
en la célula (eucariotas)
en la célula (eucariotas)
TRES DIMENSIONES EN UNA PROTEÍNA TRES DIMENSIONES EN UNA PROTEÍNA
INTERACCIONES CON:
INTERACCIONES CON:
Otros aminoácidos y con Otros aminoácidos y con elementos de estructura elementos de estructura secundaria en la misma secundaria en la misma
subunidad subunidad
Otras subunidades Otras subunidades
Ligandos específicos Ligandos específicos Estructuras celulares Estructuras celulares
Perspectiva
Perspectiva
El emparejamiento de las bases conduce a la El emparejamiento de las bases conduce a la
doble hélice y a la hibridación doble hélice y a la hibridación
Heteroduplex DNA
Heteroduplex DNA--RNA formado durante la síntesis de RNARNA formado durante la síntesis de RNA
Doble hélice
Doble hélice Emparejamiento Emparejamiento
A A - - T T
≈ 2°C
≈ 2°C
C C - - G G
≈ 4°C
≈ 4°C
La cantidad de DNA en solución La cantidad de DNA en solución puede ser determinada mediante puede ser determinada mediante
espectrofotometria ultravioleta.
espectrofotometria ultravioleta.
Las bases del Las bases del
DNA son menos DNA son menos
accesibles a la accesibles a la luz ultravioleta luz ultravioleta
en doble en doble
cadena que en cadena que en cadena sencilla cadena sencilla
La desnaturalización de la doble hélice de DNA es La desnaturalización de la doble hélice de DNA es
un proceso cooperativo un proceso cooperativo
Tm es la temperatura a la que el 50% del DNA se Tm es la temperatura a la que el 50% del DNA se
denaturaliza denaturaliza
La Tm de un duplex de un ácido nucleíco se La Tm de un duplex de un ácido nucleíco se
modifica por tres factores principales:
modifica por tres factores principales:
1.1. Composición de basesComposición de bases 2.2. Longitud del duplexLongitud del duplex
3.3. Fuerza iónica de la soluciónFuerza iónica de la solución
Los desapareamientos en un heteroduplex producen una Los desapareamientos en un heteroduplex producen una disminución de 1ºC por cada 1% de secuencia desapareada disminución de 1ºC por cada 1% de secuencia desapareada
Factores que afectan la desnaturalización y Factores que afectan la desnaturalización y
renaturalización de la doble hélice renaturalización de la doble hélice
Efecto Efecto sobre Tm
Efecto sobre Efecto sobre renaturalización Parametro
Parametro sobre Tm renaturalización Composición
Composición Longitud
Longitud
Fuerza iónica Fuerza iónica
% error
% error
Concentración Concentración
Denaturalizantes Denaturalizantes
Temperatura
↑ ↑ TmTm ↑ ↑ % GC% GC
↑ ↑ TmTm ↑ ↑ longitudlongitud
↑ ↑ TmTm ↑ ↑ % Na% Na
↓ ↓ TmTm ↑ ↑ % error% error Sin efecto
Sin efecto
↓ ↓ urea, formamida
Sin efecto Sin efecto
↑ ↑ vel.vel. ↑ ↑ longitudlongitud
Optimo a 1,5 M Na Optimo a 1,5 M Na
↓ ↓ vel.vel. ↑ ↑ % error% error
↑ ↑ vel.vel. ↑ ↑ conc.conc.
Optimo a 50% form.
Optimo a 50% form.
Optimo a 20ºC
Optimo a 20ºC ↓↓ Tm urea, formamida
Temperatura Tm
El apareamiento de El apareamiento de
bases tiene lugar en la bases tiene lugar en la
doble hélice del DNA doble hélice del DNA
y tambien en las y tambien en las
interacciones intra e interacciones intra e
inter
inter - - moleculares del moleculares del RNA y del DNA de RNA y del DNA de
cadena sencilla
cadena sencilla
Las hebras sencillas de Las hebras sencillas de DNA desnaturalizaddo DNA desnaturalizaddo
pueden ser pueden ser
renaturalizadas y renaturalizadas y
adoptar formas de adoptar formas de
doble hebra
doble hebra
La hibridación sobre un La hibridación sobre un
DNA inmovilizado (en DNA inmovilizado (en
filtro) permite saber si filtro) permite saber si
una solución de DNA o una solución de DNA o
RNA desnaturalizado RNA desnaturalizado
contiene secuencias contiene secuencias
complementarias de las complementarias de las
cadenas inmovilizadas
cadenas inmovilizadas
El DNA y el RNA pueden ser separados del El DNA y el RNA pueden ser separados del
resto de componentes celulares por métodos resto de componentes celulares por métodos
físico
físico - - químicos químicos
La electroforesis La electroforesis
horizontal en geles de horizontal en geles de
agarosa permite agarosa permite
separar las moleculas separar las moleculas
de DNA por su tamaño de DNA por su tamaño
(0,2
(0,2 - - 10 kb). 10 kb).
La electroforesis vertical La electroforesis vertical
en geles de en geles de
poliacrilamida permite poliacrilamida permite separar las moleculas separar las moleculas
de DNA con diferencias de DNA con diferencias
en una sola base
en una sola base
La transferencia (blot) e La transferencia (blot) e
hibridación usando la hibridación usando la
tecnica de Southern tecnica de Southern
permite identificar permite identificar
secuencias específicas secuencias específicas
de DNA
de DNA
Cortar y Pegar
Cortar y Pegar
Los enzimas de restricción son endonucleasas que Los enzimas de restricción son endonucleasas que
reconocen y cortan secuencias específicas en la doble reconocen y cortan secuencias específicas en la doble
hélice de DNA.
hélice de DNA.
Los enzimas de restricción son endonucleasas que Los enzimas de restricción son endonucleasas que
reconocen y cortan secuencias específicas en la doble reconocen y cortan secuencias específicas en la doble
hélice de DNA.
hélice de DNA.
ER y sus metilasas protegen ER y sus metilasas protegen
en bacterias a infecciones en bacterias a infecciones
por fagos.
por fagos.
Las ER de Tipo II son Las ER de Tipo II son
homodimeros que se unen a homodimeros que se unen a
secuencias específicas de secuencias específicas de
DNA y rompen enlaces DNA y rompen enlaces
fosfodiester fosfodiester
Se requieren estirpes de Se requieren estirpes de
bacterias modificadas para
bacterias modificadas para
realizar DNA recombinante
realizar DNA recombinante
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción de Tipo I Enzimas de Restricción de Tipo I
Enzimas complejas
Enzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones : Cada enzima tiene 3 funciones
simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa
Cofactores
Cofactores: ATP, Mg: ATP, Mg2+2+ y Sy S--AdenosilmetioninaAdenosilmetionina 3 Subunidades
3 Subunidades: Reconocimiento, Actv. Endonucleasa y Actv. : Reconocimiento, Actv. Endonucleasa y Actv.
Metilasa se localizan en diferentes subunidades del Metilasa se localizan en diferentes subunidades del
complejo complejo
Sitio de reconocimiento
Sitio de reconocimiento: 15 pares de bases: 15 pares de bases Sitio de metilación o rotura
Sitio de metilación o rotura: a aprox. 1000 pb del 5’ de la : a aprox. 1000 pb del 5’ de la secuencia TCA en sitio de reconocimiento
secuencia TCA en sitio de reconocimiento 5’ A5’ AAACNNNNNNGTGC 3’CNNNNNNGTGC 3’
3’ TTGnnnnnnC
3’ TTGnnnnnnCAACG 3’ 5’ TG5’ TGANNNNNNTGCT 3’ANNNNNNTGCT 3’
3’ ACTnnnnnn
3’ ACTnnnnnnACGA 3’A
CG 3’ CGA 3’
Eco K
Eco K Eco BEco B
Enzimas de Restricción de Tipo II Enzimas de Restricción de Tipo II
Reconocen TETRA
Reconocen TETRA-, PENTA-, PENTA--, o HEXANUCLEOTIDOS, o HEXANUCLEOTIDOS Secuencias poseen un eje de simetria rotacional:
Secuencias poseen un eje de simetria rotacional:
PALINDROMO:
PALINDROMO:
5’ GAATTC 3’
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
3’ CTTAAG 5’
Eco RI Eco RI
Enzimas de Restricción de Tipo II reconocen Enzimas de Restricción de Tipo II reconocen
palindromos y producen 3 tipos de cortes
palindromos y producen 3 tipos de cortes
Enzimas de Restricción de Tipo III Enzimas de Restricción de Tipo III
Enzimas complejas
Enzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones : Cada enzima tiene 3 funciones
simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa
Cofactores
Cofactores: ATP, Mg: ATP, Mg2+2+ y Sy S--AdenosilmetioninaAdenosilmetionina 2 subunidades
2 subunidades: Actividad endonucleasa en una subunidad y : Actividad endonucleasa en una subunidad y Reconocimiento + Metilación en otra subunidad diferente
Reconocimiento + Metilación en otra subunidad diferente Sitio de reconocimiento
Sitio de reconocimiento: no palindromo: no palindromo Sitio de rotura
Sitio de rotura: separado del reconocimiento y diferente en : separado del reconocimiento y diferente en cada hebra
cada hebra
5’ CAT
5’ CATGGAACGCCGCAGAAGAGAAG//TTAAC AC 3’TTAAC AC 3’
3’ GTA
3’ GTACTGCGCTGCGTCTTC AATTGTCTTC AATTG//TG 3’TG 3’ Hga IHga I
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
Mapas de Restricción
COHESIVIDAD COHESIVIDAD
Capacidad de complementariedad entre extremos digeridos Capacidad de complementariedad entre extremos digeridos
por enzimas de restricción por enzimas de restricción
El orden y simetría de los sitios de corte de las ER tipo II El orden y simetría de los sitios de corte de las ER tipo II
tiene las siguientes consecuencias:
tiene las siguientes consecuencias:
a) La generación de extremos protuberantes con a) La generación de extremos protuberantes con
terminación de cadena sencilla que son complementarios terminación de cadena sencilla que son complementarios
en configuración antiparalela pero identicos en paralelo en configuración antiparalela pero identicos en paralelo 5’5’GG AATTCAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG AATTC AATTC 3’3’
3’3’CTTAACTTAA GGnnnnnnnnnnnnnnnnnnCTTAACTTAA G G 5’5’
COHESIVIDAD (2) COHESIVIDAD (2)
b) Los extremos de una molécula de DNA generados por b) Los extremos de una molécula de DNA generados por un ER puede tener complementariedad con otra molécula un ER puede tener complementariedad con otra molécula
con el mismo extremo:
con el mismo extremo:
MseI:
MseI: TT//TAATAA AseI:
AseI: ATAT//TAATAATT
BamHI:
BamHI: GG//GATCGATCCC Bgl II:
Bgl II: AA//GATCGATCTT Bcl I:
Bcl I: TT//GATCGATCAA Sau 3AI:
Sau 3AI: //GATCGATC
COHESIVIDAD (3) COHESIVIDAD (3)
c) Recombinantes producto de dos ER con extremos c) Recombinantes producto de dos ER con extremos
compatibles pueden perder secuencia original:
compatibles pueden perder secuencia original:
BamHI:
BamHI: GG//GATCGATCCC Bgl II:
Bgl II: AA//GATCGATCTT Producen:
Producen: GGATCTGGATCT AGATCC AGATCC Y en consecuencia adquirir una nueva diana:
Y en consecuencia adquirir una nueva diana:
Mbo I o Sau3AI
Mbo I o Sau3AI ((//GATCGATC))
COHESIVIDAD (4) COHESIVIDAD (4)
d) Endonucleasas con sitios múltiples de reconocimiento d) Endonucleasas con sitios múltiples de reconocimiento
que producen extremos heterogéneos:
que producen extremos heterogéneos:
//CCCCAAGGGG
//CCCCTTGGGG Eco RIIEco RII
GTGT//AGAGACAC GTGT//ATATAC AC GTGT//CGCGAC AC
GTGT//CTCTAC AC Acc IAcc I
CC//CCCGCGAAGG CC//CCCGCGGGG G CC//TTCGCGAAG G
CC//TTCGCGGGG G Ava IAva I
COHESIVIDAD (5) COHESIVIDAD (5)
e) Isosquizomería: Endonucleasas con identico sitio de e) Isosquizomería: Endonucleasas con identico sitio de
reconocimiento reconocimiento
Hind III
Hind III yy Hsu I: Hsu I: AA//AGCTTAGCTT
Pero que pueden tener diferente punto de corte:
Pero que pueden tener diferente punto de corte:
Sma I
Sma I CCCCCC/GGG/GGG Xma I
Xma I CC//CCGGGCCGGG
DNA ligasa DNA ligasa
Cataliza la formación de enlaces fosfodiester en moleculas de DNA de doble cadena entre extremos próximos cohesivos 3’-hidroxilo y 5’-fosfato
USO EN TECNOLOGÍA RECOMBINANTE:
- de E.coli (NAD como cofactor) - de fago T4 (ATP como energía)
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
Una reacción de ligación rquiere de 3 ingredientes (además de agua):
1. Dos o mas fragmentos de DNA con extremos compatibles.
2. Un tampon conteniendo ATP. El tampon se prepara concentrado (10x) y tras la dilución proporciona una concentración de 0.25 a 1 mM.
3. T4 DNA ligase. Una reacción tipica para insertar un fragmento en un plamiso puede necesitar entre 0.01 (protuberantes solapantes) a 1 (romos) unidades de ligasa
La temperatura optima de incubación es de 16 ºC y cuando se desea una eficiencia alta se requiere esta temperatura. Sin embargo la ligasa es activa en un amplio rango de temperaturas y para reaccciones rutinarias se efectuan entre 4ºC y temperatura ambiente, dependiendo de de los tipos de secuencias a ligar
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA
In vivo, la temperatura de la ligación óptima es de In vivo, la temperatura de la ligación óptima es de aproximadamente 37 ºC, aunque a esta temperatura el aproximadamente 37 ºC, aunque a esta temperatura el
emparejamiento de bases es inestable emparejamiento de bases es inestable
En el laboratorio se ha de determinar una temperatura de En el laboratorio se ha de determinar una temperatura de compromiso entre la óptima y aquella que garantiza el compromiso entre la óptima y aquella que garantiza el emparejameinto de las bases: dependencia en el contenido emparejameinto de las bases: dependencia en el contenido
en G+C en G+C
Extremo protuberante AATT: 5
Extremo protuberante AATT: 5--6ºC6ºC Para clonación de vectores: 5
Para clonación de vectores: 5--15ºC15ºC
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
DEPENDENCIA DE LAS CONCENTRACIONES DEPENDENCIA DE LAS CONCENTRACIONES
A una fuerza iónica (concentración salina) constante la A una fuerza iónica (concentración salina) constante la
preferencia entre reacción intra o intermolecular depende de:
preferencia entre reacción intra o intermolecular depende de:
1.1. Longitud del fragmento de DNALongitud del fragmento de DNA 2.2. Concentración de DNAConcentración de DNA
A concentracion constante:
A concentracion constante: Cuanto menor sea el fragmento se Cuanto menor sea el fragmento se favorecen reacciones intramoleculares (circularización).
favorecen reacciones intramoleculares (circularización).
A longitud constante:
A longitud constante: Según disminuye la concentración de Según disminuye la concentración de DNA se incrementa la probabilidad de circularización.
DNA se incrementa la probabilidad de circularización.
Las reacciones bimoleculares son las preferidas entre un Las reacciones bimoleculares son las preferidas entre un
vector y DNA lineal.
vector y DNA lineal.
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
Teória de la reacción de policondensación intramolecular Teória de la reacción de policondensación intramolecular
j j
(en g/l)(en g/l)= 51.1 x M = 51.1 x M
rr -1/2-1/2Permite calcular la concentración “j” de un fragmento de DNA Permite calcular la concentración “j” de un fragmento de DNA a la cual se igualan las velocidades iniciales de las reacciones a la cual se igualan las velocidades iniciales de las reacciones bibi-- y monomolecular de circularizacción.y monomolecular de circularizacción.
CIRCULARIZACIÓN CIRCULARIZACIÓN
DNA < j OLIGOMERIZACIÓNOLIGOMERIZACIÓN DNA > j
DNA < j DNA > j
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
Las reacciones bimoleculares entre monomeros de diferente Las reacciones bimoleculares entre monomeros de diferente longitud funcionan mejor cuando los dos substratos de la longitud funcionan mejor cuando los dos substratos de la
reacción estan en cantidades equimoleculares reacción estan en cantidades equimoleculares
La longitud del fragmento más corto va a determinar la La longitud del fragmento más corto va a determinar la concentración de extremos del vector que se necesita para concentración de extremos del vector que se necesita para competir con la circularización monomolecular del fragmento competir con la circularización monomolecular del fragmento
menor de la siguiente forma:
menor de la siguiente forma:
[inserto] = (Mr inserto / Mr vector) x [vector]
[inserto] = (Mr inserto / Mr vector) x [vector]
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación condiciones de ligación
Tamaño inserto
Tamaño inserto [vector] µg/ml[vector] µg/ml
kbkb LambdaLambda pBR322pBR322
31x10
31x1066 Da Da 2.6x102.6x1066 DaDa
0.50.5 97509750 813813
11 34473447 286286
22 12181218 102102
33 663663 5555
44 430430 3636
55 308308 2626
1010 109109 99
1515 5959 55
2020 3838 3.23.2
3030 2121 1.81.8
DNA ligasa:
DNA ligasa:
condiciones de ligación
condiciones de ligación
Enzimas modificantes de extremos Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal Transferasa Terminal Nucleasas: Dnasa y Rnasa Nucleasas: Dnasa y Rnasa
Fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina Polinucleótido quinasa Polinucleótido quinasa
Enzimas modificantes de extremos Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal (TT) Transferasa Terminal (TT)
Añade colas homopolimericas Añade colas homopolimericas
Substrato:
Substrato: extremos 3’ -extremos 3’ -OH con al menos 3 bases OH con al menos 3 bases protuberantes
protuberantes
Condiciones de reacción:
Condiciones de reacción: diferente para añadir diferente para añadir dAdA / / dTdT (Co(Co2+2+) ) o o dC dC / / dCdC (Mn(Mn2+2+))
Longitud de la cola:
Longitud de la cola: entre 10 y 30 bases y puede ser entre 10 y 30 bases y puede ser monitorizada (electroforesis o marcaje)
monitorizada (electroforesis o marcaje)
Enzimas modificantes de extremos Enzimas modificantes de extremos
Transferasa Terminal (TT) Transferasa Terminal (TT)
---
---CTGCAGCTGCAG--- ---
---GACGTCGACGTC--- Pst I
Pst I ---
---CTGCACTGCA3’3’ G---G--- ---
---G G 3’3’ACGTC---ACGTC---
---
---CTGCACTGCAGGGGGGGGGGGG3’3’ G----G---- ----
---
---G G 3’3’GGGGGGGGGGGGACGTCACGTC--- ----
TTTT
Desoxyribonucleasa I (DNasa I) Desoxyribonucleasa I (DNasa I)
Endonucleasa de páncreas que hidróliza cadena doble o sencilla Endonucleasa de páncreas que hidróliza cadena doble o sencilla
de DNA.
de DNA.
No hidroliza RNA No hidroliza RNA
Preferencialmente corta en enlaces adyacentes a residuos de C o Preferencialmente corta en enlaces adyacentes a residuos de C o
T (es por tanto una endonucleasa).
T (es por tanto una endonucleasa).
Con Mg hidroliza cada cadena independientemente al azar Con Mg hidroliza cada cadena independientemente al azar
Con Mn hidroliza ambas cadenas en el mismo sitio y proporciona Con Mn hidroliza ambas cadenas en el mismo sitio y proporciona
extremos romos o protuberantes de 1 o 2 bases.
extremos romos o protuberantes de 1 o 2 bases.
Productos: di, tri y tetranucleótidos 5’
Productos: di, tri y tetranucleótidos 5’-fosforilados. -fosforilados.
Aplicaciones de la Dnasa I:
Aplicaciones de la Dnasa I:
Elimina DNA de preparaciones de RNA Elimina DNA de preparaciones de RNA
Analiza interacciones DNA
Analiza interacciones DNA--proteina mediante “Footprinting” de proteina mediante “Footprinting” de Dnasa
Dnasa
Incision de DNA para marcaje de DNA Incision de DNA para marcaje de DNA
λλ-Exonucleasa-Exonucleasa
5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’-GpApApTpT-GpApApTpTOHOH--3’3’
3’3’--CpTpTpApAp-CpTpTpApAp-5’5’ 3’3’--CpCp + Np-+ Np-5’5’
Exonucleasa III
Exonucleasa III (E. coli)(E. coli)
5’5’-GpApApTpT-GpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’-G-GOHOH--3’3’ + Np-+ Np-5’5’
3’3’--CpTpTpApAp-CpTpTpApAp-5’5’ 3’3’--CpTpTpApAp-CpTpTpApAp-5’5’
Exonucleasa Bal 31
Exonucleasa Bal 31 (Alteromonas)(Alteromonas)
5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’--pApApApAOHOH--3’3’ + Oligo y mono+ Oligo y mono 3’3’--CpTpTpApAp-CpTpTpApAp-5’5’ 3’3’-- TpTp-TpTp-5’5’ nucleótidosnucleótidos
S1S1-- Nucleasa Nucleasa (Aspergillus)(Aspergillus)
5’5’--GGOHOH--3’3’ 5’5’--GGOHOH--3’3’
3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 5’5’--CpCp--5’5’
Nucleasa de alubia china Nucleasa de alubia china
5’5’-GpApApTpT-GpApApTpTOHOH--3’ 3’ 5’5’-GpA-GpAOHOH--3’3’
3’3’--CpTpCpTp--5’5’ 5’5’--CpTpCpTp--5’5’
Ribonucleasa A (RNasa A) Ribonucleasa A (RNasa A)
Endoribonucleasa de páncreas que hidróliza cadena sencilla de Endoribonucleasa de páncreas que hidróliza cadena sencilla de
RNA al extremo 3’ de residuos de pirimidinas (C y T).
RNA al extremo 3’ de residuos de pirimidinas (C y T).
Productos: mono y oligonucleótidos 3’
Productos: mono y oligonucleótidos 3’--fosforilados. fosforilados.
Aplicaciones de la RNasa A:
Aplicaciones de la RNasa A:
Elimina RNA de preparaciones de DNA Elimina RNA de preparaciones de DNA
Mapeo de mutaciones en DNA o RNA mediante escisión de Mapeo de mutaciones en DNA o RNA mediante escisión de
desapareamiento: La RNAsa hidroliza el RNA en los híbridos desapareamiento: La RNAsa hidroliza el RNA en los híbridos
de RNA:DNA en lugares de desapareamiento de una base y el de RNA:DNA en lugares de desapareamiento de una base y el
producto puede ser analizado producto puede ser analizado
Fosfatasa alcalína:
Fosfatasa alcalína:
Hidroliza grupos fosfato 5’ de DNA, de RNA de nucleótidos y de Hidroliza grupos fosfato 5’ de DNA, de RNA de nucleótidos y de proteínas.
proteínas.
5’-5’-GGOHOH--3’3’ 5’-5’-GGOHOH--3’3’
3’-3’-CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 3’-3’-CpTpTpApACpTpTpApAOHOH--5’5’
3 ORIGENES:
3 ORIGENES:
Bacteriano:
Bacteriano: Es el enzima mas activo pero el mas dificil de destruir al Es el enzima mas activo pero el mas dificil de destruir al final de la reacción.
final de la reacción.
Intestino de ternera.
Intestino de ternera. Es la mas utilizada en biología molecular porque Es la mas utilizada en biología molecular porque aunque es menos activa que la bacteriana se inactiva por proteas
aunque es menos activa que la bacteriana se inactiva por proteasas o as o mediante calor (75ºC 10 min).
mediante calor (75ºC 10 min).
Gamba:
Gamba: Se obtiene de una gamba de agua fría que permite que se Se obtiene de una gamba de agua fría que permite que se destruya facilmente por calor (65ºC 15 min).
destruya facilmente por calor (65ºC 15 min).
Fosfatasa alcalína:
Fosfatasa alcalína:
APLICACIONES:
APLICACIONES:
Antes de una reacción de ligación permite eliminar los grupos 5’
Antes de una reacción de ligación permite eliminar los grupos 5’-- fosfato de vectores que han sido digeridos con enzimas de
fosfato de vectores que han sido digeridos con enzimas de restricción. Previene la auto
restricción. Previene la auto--ligación del vector y facilita la ligación ligación del vector y facilita la ligación de otros fragmentos dentro del vector.
de otros fragmentos dentro del vector.
Eliminar los grupos 5’
Eliminar los grupos 5’--fosfato de fragmentos de DNA antes de fosfato de fragmentos de DNA antes de marcarlos con fosfato radioactivo mediante la polinucleótido marcarlos con fosfato radioactivo mediante la polinucleótido quinasa
quinasa
T4 Polinucleótido quinasa +
T4 Polinucleótido quinasa + λλ--3232P-P-ATPATP
Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’ 5’
de DNA o de RNA.
de DNA o de RNA.
Se utiliza en dos tipos de reacciones:
Se utiliza en dos tipos de reacciones:
La reacción directa:
La reacción directa: Transferencia del fosfato gamma del ATP al extremo 5’ de Transferencia del fosfato gamma del ATP al extremo 5’ de un polinucleotido (DNA o RNA).
un polinucleotido (DNA o RNA).
En la reacción de intercambio
En la reacción de intercambio:: El ADN o RNA diana con un 5’fosfato se incuba El ADN o RNA diana con un 5’fosfato se incuba con exceso de ADP y el fosfato se desfosforila y se tranfiere al
con exceso de ADP y el fosfato se desfosforila y se tranfiere al ADP para formar ADP para formar ATP. Despues se realiza la reacción directa con ATP con fosfato
ATP. Despues se realiza la reacción directa con ATP con fosfato marcado que se marcado que se transfiere al acido nucleíco.
transfiere al acido nucleíco.
T4 Polinucleótido quinasa +
T4 Polinucleótido quinasa + λλ--3232P-P-ATPATP
Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo Cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’ 5’
de DNA o de RNA.
de DNA o de RNA.
APLICACIONES:
APLICACIONES:
1)1) Fosforilación de linkers y adaptadores, o fragmentos de Fosforilación de linkers y adaptadores, o fragmentos de DNA como paso previo a la ligación que requiere un extremo DNA como paso previo a la ligación que requiere un extremo
5’fosfato. Los productos de PCR que se van a ligar 5’fosfato. Los productos de PCR que se van a ligar
normalmente se generan con cebadores no fosforilados.
normalmente se generan con cebadores no fosforilados.
2)2) Marcaje de oligonucleótidos (con Marcaje de oligonucleótidos (con 3232P) que se utiliza como P) que se utiliza como sondas de hibridación.
sondas de hibridación.
DNA polimerasas DNA polimerasas
DNA polimerasa I de
DNA polimerasa I de E. coliE. coli Fragmento Klenow
Fragmento Klenow DNA polimerasa T4 DNA polimerasa T4 DNA polimerasa T7 DNA polimerasa T7
DNA polimerasas termoestables DNA polimerasas termoestables Poseen actividad polimerasa 5’
Poseen actividad polimerasa 5’--3’3’
y tambien actividades exonucleasas 5’
y tambien actividades exonucleasas 5’--3’ y 3’3’ y 3’--5’.5’.
DNA polimerasas DNA polimerasas
DNA polimerasa I de
DNA polimerasa I de E. coliE. coli Fragmento Klenow
Fragmento Klenow DNA polimerasa T4 DNA polimerasa T4 DNA polimerasa T7 DNA polimerasa T7
DNA polimerasas termoestables DNA polimerasas termoestables Poseen actividad polimerasa 5’
Poseen actividad polimerasa 5’--3’3’
y tambien actividades exonucleasas 5’
y tambien actividades exonucleasas 5’--3’ y 3’3’ y 3’--5’.5’.
Trancriptasa reversa Trancriptasa reversa
DOS ACTIVIDADES:
DOS ACTIVIDADES:
1)1) 3’5’ DNA polimerasa3’5’ DNA polimerasa 2) Actividad RNasa H2) Actividad RNasa H
Proceden de los retrovirus Proceden de los retrovirus
Son DNA polimerasas que usa RNA como cadena molde: fluye la Son DNA polimerasas que usa RNA como cadena molde: fluye la
información genética en sentido reverso información genética en sentido reverso
Dos orígenes:
Dos orígenes:
Moloney Murine Leukemia Virus (M
Moloney Murine Leukemia Virus (M--MuLV)MuLV) Avian Myeloblastosis Virus (AMV)
Avian Myeloblastosis Virus (AMV)
Trancriptasas reversas Trancriptasas reversas
5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’ RT + dATP + dCTP + dGTP + dTTP 3’-TTTTTTTTTTTTTT-5’
5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’
3’-GCACGGATTCCGATCTGGCTAAGCGTTTTTTTTTTTTT-5’
Con Oligo dt(18)
Con Oligo dt(18) Hexameros al azarHexameros al azar
[RNA]
[RNA] [RNA][RNA]
Genoteca de cDNA:
Genoteca de cDNA:
DNA genomico vs DNA complementario DNA genomico vs DNA complementario
Genoteca de cDNA:
Genoteca de cDNA:
Expresión diferencial de genes en tejidos Expresión diferencial de genes en tejidos
Genoteca de cDNA:
Genoteca de cDNA:
Clonación de diferentes transcritos Clonación de diferentes transcritos
Genoteca de cDNA:
Genoteca de cDNA:
Identificación de diferentes transcritos Identificación de diferentes transcritos
Genoteca de cDNA:
Genoteca de cDNA:
Identificando función de diferentes transcritos Identificando función de diferentes transcritos
