Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea Maripa

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(1)FACULTAD DE QUIMICA-FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA. Tesis para optar el título de Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS PRESENTES EN EL ACEITE DE SEMILLAS DE. Attalea maripa.. Autora: Dacia Petra Amania. Tutoras: Dra. C. María Elisa Jorge Rodríguez. Dra. C. Yanelis Saucedo Hernández. Santa Clara 2014.

(2) CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS PRESENTES EN EL ACEITE DE SEMILLAS DE. Attalea maripa.. Santa Clara 2014.

(3) Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad de Ciencias Farmacéutica, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución, para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.. Firma del Autor. Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.. Firma del Autor. Firma del Jefe de Departamento donde se defiende el trabajo. Firma. del. Responsable. Información Científico-Técnica. de.

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(5) De más estima es el buen nombre que las riquezas, y la buena fama más que la plata y el oro. Proverbios 22:1.

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(7) A mi preciosa y valiosa madre querida, Juliette Dina Amania-Josafath que siempre ha sido mi ejemplo a seguir. Madre tremenda y mujer virtuosa, que me apoyό en cualquier aspecto tanto físico como espiritual en todo el transcurso de mi formaciόn profesional, enseñándome que que hay un Dios viviente que conoce nuestras necesidades y las cubre al mismo tiempo….Te amo mami! A mi padre querido Reinhard Lieveld Amania que es mi protector, aparte de mi padre Celestial, Dios. El hombre que siempre se preocupa por mi, que me ama y cubre todas mis necesidades. Papi eres ejemplo de un verdadero padre, porque me lo has mostrado en todos los momentos de mi vida, especialmente estos últimos seis años ….Te amo! A mis hermanos Odilon Amania,Iranda Amania y Leandro Amania que me han apoyado de una forma extraordinaria durante este viaje largo. Les amo mucho!.

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(9) A Dios mi señor y Salvador. El que siempre estuvo conmigo todo estos tiempos. Al resto de mis hermanos Delsi Amania, Dimucia Amania,Benito Amania, Richard Amania, Harvey Amania, Paulina Amania y Kraidy Amania. A mi abuela Evodia Josafath y mi tío Richene Amania (oom Te) A mi prima Lietje Stedenburg y su esposo Henry Akiemboto A Naomi Josafath, Chequita Kensenhuis-Josafath y su esposo Jimmy Kensenhuis A mis amigos: Echo Anja Roos, Mey Lyn Dias Perez y familia A los siguientes miembros de mi pueblo Botopasie: Milthon Eduards, Ruel Wens (kapténg Bosa), Kordy Seedo y Belfor Manuel A mis tutores Dra. María Elisa Jorge Rodríguez y Dra. Yanelis Saucedo Hernández y a todos los que han contribuido en mi formación profesional durante la carrera y quienes me han brindado su ayuda para la realización de este trabajo..

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(11) RESUMEN. RESUMEN El aceite obtenido de las semillas de Attaleamaripa ha sido empleado en los países que poseen esta palmera por su marcada acción nutritiva y sus excelentes características organolépticas, es utilizado, además, como cosmético por ofrecer gran suavidad en el cabello y la piel. Sin embargo, este aceite carece de reportes sobre su composición y no se conocen sus potencialidades en el campo alimentario ni farmacéutico. Lo anterior motivó el desarrollo del presente trabajo, en el cual se realizó una evaluación del aceite obtenido en el pueblo Botopasie, Surinam, donde sus pobladores usan masivamente el mismo como alimento y cosmético. La evaluación incluyó la determinación de los parámetros físico-químicos, aplicando los ensayos descritos en farmacopeas vigentes para otros aceites vírgenes y la determinación cuantitativa de los ácidos grasos (AG) presentes en el aceite, utilizando la técnica de cromatografía de gases con detección por llama (GC-FID). La técnica fue validada para tres AG (cáprico, laurico y miristico) y para los restantes (palmítico, linoleico, oleico y esteárico) se aplicó la validación desarrollada en trabajos anteriores. Los parámetros físico-químicos del aceite son comparables con aceites vírgenes reportados en la farmacopea como el de oliva y el de almendra. La técnicaGC-FIDcon el uso de patrones, permitió identificar los ácidos grasos:cáprico, láurico, mirístico, palmítico, linoleico, oleico y esteárico. La validación realizada a la técnica comprobó su fiabilidad para la determinación del ácido cáprico, láurico y mirístico y su aplicación permitió cuantificar cada AG: cáprico 2,7%, láurico 3,9%,mirístico 1,1%,palmítico 6,1%, linoleico 0,6%,oleico 7,5% y esteárico 1,8%.Los resultados obtenidos permitieron asegurar que el aceite evaluado posee gran potencialidad para su uso tanto en la industria alimenticia como cosmética, por la variedad y cantidad de AG que posee.. Palabras claves: Attalea maripa, aceite vegetal, ácidos grasos.. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa..

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(13) ABSTRACT. ABSTRACT The oil obtained from the seeds of Attalea maripa has been used in countries that have identified this palm for its nourishing and excellent organoleptic properties, it is also used as a cosmetic for great softness to the hair and skin. However this oil lacks reports on its composition and its potentials are not known in the food and pharmaceutical field. This motivated the development of this work in which an assessment of the oil obtained in the village Botopasie, Surinam, where its inhabitants use this same oil in large quantities as food and cosmetics. The evaluation included the determination of the physical-chemical parameters, using the examples described in pharmacopoeias valid for other virgin oils and the quantitative determination of fatty acids (FAs) present in the oil using the technique of gas chromatography with detection by flame (GC-FID), validated in this work for three FAs and through the application of previously validated work for the other. The oil’s physical-chemical parameters are comparable to that of virgin oils reported in pharmacopoeia such as olive and almond. The GC-FID technique using patterns, allowed for the identificationof the following fatty acids: capric, lauric, myristic, palmitic, linoleic, oleic and stearic. The validation of the technique performed confirmed its reliability for the determination of capric, lauric and myristic acids and their application allowed for obtaining the following percentages for eachFAs: capric 2.7%, lauric 3.9%, myristic1.1%, palmitic 6.1%, linoleic0.6%, oleic and stearic with 7.5% and 1.8% respectively. The results obtained ensures safely that the oil tested in this work has great potential for use in both the food industry and cosmetics based on the variety and amount of FAs that it contains.. Keywords:Attalea maripa, vegetable oil, fatty acids.. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa..

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(15) ÍNDICE. ÍNDICE INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 1 CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 4 1.1. Consideraciones generales acerca de los aceites vegetales. Sus usos en el campo farmacéutico............................................................................................................................................ 4 1.2. Attalea maripa. Aspectos generales de la planta. .................................................................... 6 1.3. Aceites vegetales. Determinaciones analíticas. ........................................................................ 8 1.3.2. Metabolitos de mayor interés presentes en aceites vegetales. Ácidos grasos. Su importancia biológica y estudios analíticos aplicados en su determinación ........................10 1.4. Determinación de los parámetros de desempeño de los métodos analíticos: ................... 17 1.4.1. LINEALIDAD: ...........................................................................................................17 1.4.2. PRECISIÓN: ............................................................................................................18 1.4.3. ESPECIFICIDAD:.....................................................................................................19 1.4.4. EXACTITUD: ............................................................................................................20 1.4.5. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN: ......................................................21 1.5. Consideraciones finales del estudio bibliográfico. .................................................................. 22 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 23 2.1. Aceite vegetal, equipos y reactivos. .......................................................................................... 23 2.2. Determinación de los índices de calidad del aceite obtenido a partir de las semillas de Attalea maripa....................................................................................................................................... 24 2.2.1. Espectro UV .............................................................................................................24 2.2.2. Índice de refracción:. ................................................................................................24 2.2.3. Densidad relativa .....................................................................................................24 2.2.4. Índice de saponificación ...........................................................................................24 2.2.5. Índice de acidez .......................................................................................................25 2.2.6. Índice de peróxidos ..................................................................................................25 2.2.7. Índice de yodo ..........................................................................................................26 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................................................. 32 3.1. Resultados de los índices de calidad del aceite obtenido a partir de las semillas de Attalea maripa....................................................................................................................................... 32 3.2. Resultados de la determinación de los ácidos grasos (AG) presentes en el aceite, aplicando la Cromatografía Gaseosa. .............................................................................................. 34 3.2.1. Identificación de los AG presentes en el aceite. ......................................................34. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa..

(16) ÍNDICE 3.3. Resultados de la Validación de la técnica de Cromatografía de gases para la determinación de los ácidos grasos presentes en el aceite. ......................................................... 36 CONCLUSIONES..................................................................................................................................... 47 RECOMENDACIONES........................................................................................................................... 47 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 48. ANEXOS………………………………………………………………………………………….. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa..

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(18) INTRODUCCIÓN. INTRODUCCIÓN La fitoterapia tiene sus orígenes en los albores de la humanidad, desde que aparecen registros o referencias fiables. Al principio se utilizaba a través de rituales mágicos. El uso, desde tiempos antiguos, de las plantas para curar se pone de manifiesto por la existencia de herbarios desde la época de los sumerios, los asirios, los babilonios o los fenicios. En China y el resto de Asia el uso de plantas para tratar enfermedades se remonta a más de 10.000 años. Sin embargo, fueron griegos y romanos los primeros en sistematizar en occidente, a través de sus escritos, el estudio de las plantas medicinales [1]. Hasta la fecha, se han identificado más de 100.000 metabolitos secundarios en plantas[2].Sin embargo, se considera que el potencial que ofrece el reino vegetal como fuente de compuestos potencialmente útiles no ha sido suficientemente aprovechado, ya que sólo un limitado porcentaje de las 270.000 especies de plantas superiores conocidas han sido investigadas en cuanto a sus compuestos activos y es frecuente el caso en que las plantas son investigadas solamente por un tipo específico de actividad biológica[3]. Entre los compuestos obtenidos de plantas, los aceites vegetales juegan un rol importante. Los mismos están constituidos, principalmente por triglicéridos y una mezcla compleja de componentes minoritarios de un gran rango de naturaleza química, tales como fosfátidos, constituyentes insaponificables y ácidos grasos libres. Estos constituyentes muestran una amplia composición cualitativa y cuantitativa dependiendo de la especie de la cual fue obtenida y las condiciones agronómicas, climáticas, la calidad de las semillas así como el sistema de extracción y los procesos de refinación pueden causar variación en su composición[4]. Estos aceites tienen una función vital en el organismo al constituir importantes fuentes de energía, proporcionar vitaminas A, D, E, K y ácidos grasos (AG) esenciales que el organismo no produce. Entre estos últimos se destacan los ácidos insaturados oleico, linoléico y linolénico (ω-9, ω-6 y ω-3, respectivamente). Los ácidos grasos omega-3 y 6 de cadena larga aportan importantes beneficios en la prevención de enfermedades cardiovasculares[5].Además, el consumo regular de aceites vegetales ayuda a mantener. el. cociente. omega-3/omega-6. alto,. con. importantes. propiedades. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 1.

(19) INTRODUCCIÓN antiinflamatorias,. antitrombóticas,. antiarrítmicas,. hipolipidémicas. y. vasodilatadoras[6].Un adecuado cociente entre estos grupos de ácidos grasos tiene un impacto primordial en la salud, reduciendo la prevalencia tanto de enfermedades cardiovasculares como de otras enfermedades crónicas e inflamatorias[7-8]. Entre los aceites vegetales que son usadas en la costa norte de toda la Amazonía y en la zona tropical de los países del Caribe, Centroamérica y sur de Brasil, por sus propiedades alimentarias y farmacéuticas, se encuentra el obtenido de la almendra de las semillas de Attalea maripa. Este aceite ha sido poco estudiado, solo existen escasos reportes que refieren fundamentalmente aspectos agronómicos y taxonómicos de la planta. Sin embargo, el amplio uso que tiene el aceite en la alimentación y en medicina tradicional de los países que poseen esta palmera como antinflamatorio, cosmético, entre otros, así como el interés de la autora del presente trabajo por realizar estudios científicos que permitieran conocer la composición y con ello establecer en el futuro estándares de calidad, motivó el desarrollo de la presente investigación que posee como problema científico que no se conocen los parámetros físico químicos y la composición de ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa, lo que resulta de gran importancia para establecer los parámetros de calidad del aceite y justificar sus posibles usos farmacológicos y alimenticios. Por ello este trabajo científico parte de la hipótesis de que si se desarrolla y se valida una técnica analítica, que permita cuantificar los ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa y se determinan los parámetros de calidad del aceite, se podrán realizar estudios futuros que permitan establecer la monografía de control de calidad y relacionar esta composición con las principales acciones atribuidas al aceite. Para fundamentar dicha hipótesis se trazaron los siguientes objetivos: 1. Determinar los parámetros de control de calidad del aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa. 2. Identificar los ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa 3. Validar el método de cromatografía gaseosa (GC) para la determinación de tres ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 2.

(20) INTRODUCCIÓN 4. Cuantificar los ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa, aplicando métodos validados.. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 3.

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(22) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Consideraciones generales acerca de los aceites vegetales. Sus usos en el campo farmacéutico. El primer grupo importante de sustancias lipídicas de origen vegetal de aplicación en farmacia que figuran en tratados oficiales lo constituyen los aceites. En la Farmacopea Europea, (2005) están descritos los aceites obtenidos por expresión en frío de semillas y frutos de distintas especies vegetales. Figuran: el aceite de almendra, obtenido a partir de las variedades dulces y amargas de la especie Prunus dulcis (Miller.) D.A. Webb (Rosáceas), empleado en la fabricación de productos cosméticos y dermatológicos para irritaciones cutáneas; el aceite de cacahuete, obtenido a partir de las semillas descorticadas de Arachis hypogaea L. (Fabaceae) empleado como excipiente en la preparación de formas farmacéuticas parenterales; el aceite de oliva, obtenido en este caso por expresión en frío de los frutos maduros de Olea europaea L. (Oleaceae) que posee propiedades coleréticas y colagogas, ligeramente laxantes y por vía tópica suavizantes y emolientes, se utiliza también refinado como excipiente para preparaciones inyectables; el aceite de ricino que se obtiene a partir de las semillas de Ricinus communis L. (Euphorbiaceae) con propiedades laxo-purgantes y empleado en farmacia, ligeramente modificado, como vehículo de preparaciones inyectables.[9] La importancia de los lípidos en la nutrición y el desarrollo humano es reconocida desde hace décadas. Los lípidos son constituyentes importantes de la estructura de las membranas celulares, cumplen funciones energéticas y de reserva metabólica, y forman la estructura básica de algunas hormonas y de las sales biliares[10]. Además, algunos lípidos tienen el carácter de esenciales debido a que no pueden ser sintetizados a partir de estructuras precursoras[11]. Más aún, recientemente se ha identificado la participación de algunos lípidos en la regulación de la expresión génica en los mamíferos[12]. Los aceites son fuentes importantes de ácidos grasos en la naturaleza, constituyen un grupo graso de especial importancia, pues la mayoría tienen un amplio uso comestible. Según su composición se pueden hacer varios grupos: a) Aceites ricos en grasa saturada, como el de coco y en menor grado el aceite de palma. La riqueza de los mismos en ácidos grasos de la serie n-3 es cero en el caso del coco, y bajo en el de Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 4.

(23) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA palma; b) Aceites ricos en ácidos grasos de la serie n-6, que son la mayoría de los aceites, como algodón, borraja, cártamo, prímula, germen de trigo, girasol, maíz, nuez, pepita de uva y soja. El contenido en estos aceites de ácidos grasos de la serie n-3 suele ser muy bajo, excepto el aceite de germen de trigo, el de nuez, el de soja y el de grosella negra donde las cantidades son importantes, siendo el ácido α-linolénico el único representante de aquellos; c) Aceites ricos en ácido oleico (n-9). En este grupo se encuentran el aceite de avellana, el de colza y el de oliva. En ellos la riqueza en ácidos grasos de la serie n-3 es baja en el de avellana y oliva, y elevada en el de colza; d) Aceites ricos en ácido oleico y linoleico, incluyéndose aquí los de cacahuete y sésamo, con nula y pequeña cantidad en ácidos grasos de la serie n-3 respectivamente, concretamente α- linolénico. El aporte de ácidos grasos de la serie n3 depende del aceite comestible que se utiliza habitualmente. Si es aceite de girasol, la cantidad es muy baja, pues su riqueza en ácido α- linolénico es 0,1g/100g, mientras que si es el aceite de oliva este aporte es mucho mayor dado su contenido de 0,7g/100g[13]. Los aceites vegetales han desempeñado un papel de capital importancia en casi todas las culturas de todos los tiempos, acompañando a los orígenes mismos de la cosmética, la farmacéutica y las terapias corporales. Se ha descrito todo tipo de variedades y preparados, desde la India hasta China milenarias, desde Egipto hasta la Grecia y Roma antiguas, pasando por las numerosas culturas americanas precolombinas, y haciendo a un lado injustamente tantas otras tradiciones que incluso han desarrollado y perdurado hasta nuestros días. Hoy la ciencia y la tecnología respaldan lo que ya milenios de tradición y uso inductivo habían consagrado: las magníficas propiedades cosméticas y terapéuticas de las plantas, en una copiosa diversidad de activos que aún hoy continúan cautivando y asombrando a investigadores, con la misma fascinación mágica de las culturas ancestrales. El aceite vegetal, rico en proteínas, carbohidratos y vitaminas, entre otros componentes, posee propiedades físico-químicas que la hacen particularmente compatible con la estructura de la piel, lo que facilita su absorción y su acción. En primer lugar, son lipofílicos, es decir, se mezclan a otras grasas con facilidad, por ejemplo, las grasas presentes en la. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 5.

(24) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA piel. Al ser absorbidos de manera fácil y homogénea, sus activos se incorporan al metabolismo con eficacia y rapidez [14]. En resumen los lípidos son importantes en la nutrición por su alta aportación energética, además de su innegable papel como fuente de ácidos grasos esenciales. Las grasas y aceites comestibles comprenden el 30-40 % del aporte energético de una dieta equilibrada para el ser humano, sin embargo pueden ser menores del 5% de la dieta en algunos países subdesarrollados. En los años de 1966-1980 en los Estados Unidos fue consumido un promedio de 530 calorías de aceite vegetal por persona diariamente, mientras que en Centroamérica y al Norte y Oeste de África se consumieron 185 calorías de aceite vegetal por día. En ocasiones esta deficiencia dietética es causada por un suministro inadecuado de aceites vegetales, el problema puede llegar a ser particularmente agudo en países áridos debido a que de los 36 mejores cultivos oleaginosos solo siete (maíz, algodón, olivo, ajonjolí, girasol, cártamo y soya) pueden ser cultivados bajo condiciones relativamente secas. En la actualidad existe la necesidad de buscar nuevas fuentes de oleaginosas, con alto contenido de aceites, debido a que la disponibilidad total es insuficiente[15-16].. 1.2. Attalea maripa.Aspectos generales de la planta. Esta planta pertenece al género attalea, el cual posee unas 40 especies de plantas con flores que pertenecen a la familia aracaceae. Es originaria del sur de Florida, Caribe, Centroamérica y sur de Brasil. Este género ha sido poco estudiado, solo existen escasos reportes que refieren fundamentalmente aspectos agronómicos y taxonómicos de esta planta y que se describen a continuación.Attalea maripa es una palmera distribuida en toda la Amazonia y en la zona tropical de los países vecinos. Se encuentra en ambientes tan distintos como las sabanas y los bosques vírgenes. Abunda en la zona de la desembocadura del río Amazonas. Es una palmera de tierras con buen drenaje y de suelos arcillo arenosos. La corona está formada por 10 a 22 hojas erectas con largos pecíolos de hasta 2 m y las hojas de hasta 10 m de largo, dirigidas hacia el ápice del tallo, con los foliolos en grupos de tres a cinco dirigidas en diferentes direcciones, formando hojas crispadas. Son plantas monóicas que presentan tres o más inflorescencias por planta, pudiendo el espádice tener solamente flores Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 6.

(25) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA masculinas, sólo flores femeninas o tener flores de ambos sexos. El fruto es una drupa ovoide de 5 a 6 cm de largo, con el ápice en punta y la base protegida por tina induvia (cáliz persistente); el epicarpio es fibrosocoriáceo: el mesocarpio o pulpa comestible es pastoso, color amarillo anaranjado, sabor ligeramente dulce y agradable y el endocarpio es grueso, duro, con una a tres semillas[17]. Según Almeida y Dantas da Silva, (1997) el contenido medio de humedad es de 33% en el fruto fresco. El promedio de masa de fruto seco de fruto es 18 g, capa exterior (16%), mesocarpio (26%), cáscara leñosa interior (49%) y núcleos aceitosas (9%). En un estudio agronómico reportado, realizado por Salm R., (2005), se examinó como la morfología de semillas de dos grandes palmeras arborescentes, Attalea maripa (Aubl.) Mart. yAstrocaryum aculeatum G. Mey puede ser afectada por la sombra de semillas en un bosque amazónico estacionalmente seco. Además de ser más pequeña y producida en números más grandes que los de A. aculeatum, las semillas de A. maripa también presentan una cantidad sustancialmente menor de las reservas nutricionales disponibles para el embrión. Los resultados sugieren que, dentro de la escala espacial considerada, la lluvia de semillas de A. maripa es más restringido a la zona circundante en torno a sus congéneres reproductivos que la de A. aculeatum y podrían ser menos atractivas para ciertos tipos roedores (por ejemplo Dasyprocta Aguti) [18] En un estudio realizado en la Amazonia brasileña del este, zona caracterizada por las lluvias estacionales, se examinό los cambios estacionales en la dieta y los comportamientos de forraje de dos grupos de monos ardillas (Saimiri sciureus), durante 12 meses. Los frutos de palmeras Attalea maripa representaron el 28% de los registros anuales de alimentación de frutas y los cambios dietéticos en la estación seca se correlacionó con una disminución en los frutos de la planta maduros, lo que muestra el uso de la misma con fines comestibles[19]. Los racimos deben ser cosechados cuando los frutos estén completamente maduros, para tener su máximo contenido de aceite. Cada racimo pesa alrededor de 48 kg, pudiendo llegar hasta los 77 kg[20]. Entre otros usos de la planta se encuentra que las hojas jóvenes son utilizadas para techos y paredes de las casa. Los nativos utilizan los peciolos para sus dardos y puntas Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 7.

(26) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de flechas. La espata de consistencia rígida leñosa se encorva fuertemente cuando se seca y se utiliza como asiento. El tallo puede dar un buen palmito, pero el grosor del estípite dificulta su colecta. Las semillas pueden ser utilizadas para la obtención de aceites que podrían tener uso comestible o en la industria[21]. 1.3. Aceites vegetales. Determinaciones analíticas. Según la definición reportada en farmacopeas recientes como la European Pharmacopoeia (Eur. Ph.), 2005) y la British Pharmacopoeia (B.P.), 2007los aceites grasos vegetales son, principalmente, triglicéridos sólidos o líquidos de ácidos grasos. Pueden contener pequeñas cantidades de otros lípidos, tales como ceras, ácidos grasos libres, glicéridos parciales o residuos no saponificables[9, 22].. 1.3.1. Ensayos reportados en monografías analíticas para su evaluación. Los aceites grasos vegetales se obtienen de las semillas, el fruto o el hueso/pepita de diversas plantas por expresión o extracción con disolvente y a continuación posiblemente refinado e hidrogenado. Puede añadirse, si es necesario, un antioxidante adecuado. Aceite virgen: Aceite obtenido de materias primas de calidad especial por procedimientos mecánicos (por ejemplo, expresión en frío o centrifugación). Aceite refinado: Aceite obtenido por expresión y/o extracción con disolvente y, subsiguientemente,. por. refinado. con. álcalis. (seguido. por. decoloración. y. desodorización) o refinado físico. Aceite hidrogenado: Aceite obtenido por expresión y/o extracción con disolvente y, subsiguientemente, refinado con álcalis o refinado físico y, posiblemente, a continuación decoloración, seguido por desecación, hidrogenación y posterior decoloración y desodorización. Las monografías de control de la calidad de aceites vegetales reportados en las farmacopeas recientes (B.P., (2007) y Eur Ph., (2005) incluyen diferentes ensayos cualitativos y cuantitativos. entre los que se destacan: Densidad relativa, Rotación. óptica, Punto de solidificación, Índice de refracción, Índice de acidez, Índice de yodo,. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 8.

(27) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Índice de peróxidos, Índice de saponificación e Índice de insaponificable, entre otros[9, 22]. La European Pharmacopoeia., (2005) incluye entre sus monografías de control de calidad más de 40 monografías que pertenecen a aceites vegetales. La Tabla 1.1 muestra una selección de estas monografías con los ensayos que las conforman. Como se observa los ensayos de acidez, peróxidos, material insaponificable, así como el contenido de ácidos grasos se repiten en la mayoría de las monografías y no existen marcadas diferencias en los ensayos seleccionados para los distintos tipos de ensayos[9]. Tabla 1.1. Resumen de los ensayos presentes en monografías de aceites vegetales Ensayos. Coco (Ref). Girasol (Ref). Trigo (Virgen). Oliva (Virgen). Ricino (Virgen). Arachis (Hid).. Soya (Hid.). Absorbancia. -. -. -. X. X. -. -. Acidez Peróxidos Insaponifica-ble. X X X. X X X. X X X. X X X. X X X. X X X. X X X. Impurezas alcalinas. X. X. -. -. -. X. X. Agua Ac.Grasos Esteroles Índice de Refr.. X -1,449. X X (1,474). X X X 1,475. X X -. X X X. X. X. -. -. En cuanto a los valores reportados para los distintos ensayos que se incluyen en dichas monografías, la Tabla 1.2 muestra ejemplos de una selección de los mismos para aceites vírgenes donde se destaca que resultan ensayos comunes la densidad relativa, el índice de acidez y el índice de peróxidos; mientras que el resto son reportados en pocas monografías, en las cuales se requiere de este ensayo.. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 9.

(28) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 1.2. Valores reportados de los ensayos físico-químicos en las monografías de aceites vírgenes incluidas en la Farmacopea Británica, 2007. Ensayos Espectro UV (valor Absorbancia) Índice de refracción Densidad relativa Índice de saponificación Índice de acidez Índice de peróxidos Índice de yodo. Almendra (virgen) ≤ 0,2 a 264nm y 276nm; ˃7 a 232nm-270nm. Castor (virgen) -. Trigo (virgen) -. Linseed (virgen) -. 1,479. Oliva (virgen) ≤ 0,20 a 270 nm; ˃ 8 a 232nm270nm -. -. 1,474. 1,480. 0,916. 0,958. 0,913. 0,925. 0,931. -. -. -. -. 188 - 195. ≤2. ≤5. ≤2. ≤ 20. ≤ 4,5. ≤ 15. ≤ 10. ≤ 20. ≤ 15. ≤ 15. -. -. -. -. 160 - 200. 1.3.2. Metabolitos de mayor interés presentes en aceites vegetales. Ácidos grasos. Su importancia biológica y estudios analíticos aplicados en su determinación 1.3.2.1. Importancia biológica. Dentro de la gran diversidad estructural que caracteriza a los lípidos, los ácidos grasos (AG) son quizás las estructuras de mayor relevancia. Los ácidos grasos se dividen en dos grandes grupos según sus características estructurales: ácidos grasos saturados (AGS) y ácidos grasos insaturados (AGI). Estos últimos, dependiendo del grado de insaturación que posean se pueden clasificar como ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) y ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) [23]. En dependencia de la posición del doble enlace, contabilizando desde el carbono extremo al grupo funcional carboxílico, los AGMI y los AGPI pueden clasificarse en tres series principales: ácidos grasos omega-9 (primer doble enlace en el carbono 9), ácidos grasos omega-6 (primer doble enlace en el carbono 6) y ácidos grasos omega-3 (primer doble enlace en el carbono 3). Los ácidos grasos omega-9 no son esenciales ya que los humanos podemos introducir una insaturación a un AGS en esa posición. De esta forma, el ácido oleico (C18:1, omega-9), por ejemplo, al cual se le atribuyen Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 10.

(29) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA propiedades nutricionales beneficiosas (como componente del aceite de oliva), no requiere estar presente en nuestra dieta. No ocurre lo mismo con los ácidos grasos omega-6 y omega-3, ya que nuestro organismo no puede introducir insaturaciones en dichas posiciones[24]. De esta forma, ácidos grasos como el ácido linoléico (C18:2, omega-6, AL) y el ácido alfa linolénico (C18:3, omega-3, ALN) sí son esenciales, por lo cual nuestra dieta requiere contenerlos en proporciones bien determinadas ya que su carencia o desbalance en la ingesta produce serias alteraciones metabólicas[25]. Actualmente el consumo está constituido principalmente por ácidos grasos de la serie ω6 debido a que los aceites que mayoritariamente ofrece el mercado contienen altas proporciones de ácido linoléico (ω6) y muy bajas proporciones o nada de ácido αlinolénico (ω3). De esta forma, se sugiere incentivar el consumo de ácidos grasos ω3, sin dejar de consumir ácidos grasos ω6[26]. La relación recomendada y adecuada de 4/1 de ácidos grasos ω6 -ω3 respectivamente. Varias encuestas han demostrado que cerca del 60% de la población tiene una deficiencia de ácido α-linolénico, en conjunto con una ingesta elevada de ácido linoleico[27]. En resumen los ácidos grasosOmega 6 y 3 poseen grandes beneficios e indicaciones para la salud humana,entre las cuales se destacan queayudan a combatir el colesterol y los triglicéridos incidiendo en las enfermedades cardiovasculares, reducen los niveles de prostaglandinas que son las responsables de muchos procesos inflamatorios por lo que pueden sernos de gran ayuda en caso de enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, son muy eficaces en el tratamiento de problemas de piel como el eccema atópico entre muchas otras acciones en el organismo [28]. Todo lo anterior justifica la necesidad de disponer de fuentes externas de estos ácidos grasos, como vía para suministrarlos ante la carencia de ellos en el organismo, ya sea a través de la dieta o en forma de medicamentos, así como conocer la proporción en que se encuentran en las fuentes naturales que lo contienen.. 1.3.2.2. Estudios analíticos aplicados en la determinación cuantitativa de los ácidos grasos. El desarrollo de técnicas y procedimientos analíticos modernos para obtener información detallada sobre la naturaleza y composición de nuevos aceites y productos Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 11.

(30) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA grasos son de utilidad para identificar el origen biológico de éstos, además de la presencia de grasas extrañas o contaminantes que están relacionados con aspectos de salud y seguridad[29]. La evaluación química de grasas y aceites se realiza mediante ensayos fisicoquímicos y métodos instrumentales que son de gran valor en la separación e identificación de compuestos.Para fines se pueden utilizar procedimientos sencillos de cromatografía de gases, utilizando columnas empacadas y un detector de ionización de flama, que permiten obtener perfiles de ácidos grasos adecuados. En la actualidad, gracias a los avanzados equipos de cromatografía de gases y al uso de columnas capilares que tienen gran poder de resolución, se conoce con detalle y precisión la composición de ácidos grasos en grasas y aceites. La cromatografía de gases permite determinar la composición de ácidos grasos en los aceites y en las grasas, después de realizar la conversión de triglicéridos en ésteres metílicos, que son más volátiles[30-32]. Los estudios analíticos reportados para la determinación cuantitativa de ácidos grasos en fuentes vegetales o animales incluyen un paso previo de derivatización. La literatura consultada muestra. que la principal. reacción de derivatización corresponde a la. obtención de los metil ésteres de ácidos grasos., cuya reacción se describe a continuación: Reacción de Transesterificación:. Esta reacción incluye una metodología para la preparación de los metil ésteres empleando. metanol, a través de una catálisis ácida y básica fue reportada por. Christie, (1993) y ha sido la más empleada durante las últimos tres décadas, mientras que la técnica de cromatografía gaseosa (GC), con el empleo de diferentes detectores y condiciones cromatográficas, fue utilizada para la identificación y cuantificación de los Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 12.

(31) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ácidos grasos presentes en una variedad grande de muestras. A continuación se exponen algunos ejemplos que dan muestra de ello[33]. En el trabajo referido de Ganga R. y col., (2005) se realizaron determinaciones de ácidos grasos, con la aplicación de. técnicas cromatográficas (GC); durante el. desarrollo del estudio se investigó el efecto de la sustitución de aceites de pescado por aceites vegetales, ricos en ácido oleico, linoleico y linolénico, en la dieta. Para lograr este objetivo los metil ésteres se produjeron, a partir de alícuotas extraídas de alimentos, plasma y sangre, por transmetilación con catálisis ácidas, durante toda la noche a 500C Según la metodología descrita por Christie W, (1993). Los metil ésteres de los ácidos grasos se separaron y se cuantificaron por cromatografía de gases empleando las condiciones cromatográficas descritas por Izquierdo y col. (1996), que incluyen el uso de una columna capilar DB-23 un gradiente de temperatura que con una rampa amplia a 1900C [34-35]. La utilidad de los etil y metil esteres como estándar interno en la cuantificación por Cromatografía de gases (CG) se evaluó por Thurnhofer y Vetter, (2006), quienes probaron los ésteres metilados de ácidos grasos transesterificados, empleando el aceite de girasol como referencia. Los resultados mostraron que dichos compuestos pueden ser utilizados en la cuantificación individual de ácidos grasos presentes en aceites y otras muestras alimenticias [36]. Destaillats F. y col. (2007) realizaron una comparación de métodos analíticos útiles para medir el contenido de ácidos grasos en leche, mostrándose las ventajas y desventajas que poseen cada uno dependiendo del tipo de ácido graso a determinar. Los métodos analíticos fueron la cromatografía en capa delgada (CCD) para la determinación cualitativa y la CG y la HPLC para la determinación cuantitativa de ácidos grasos presentes en esa matriz. Los ácidos grasos se metilaron por hidrólisis básica con metóxido de sodio metanólico y el hexano como disolvente de extracción. La CCD incluyó como fase móvil una mezcla de hexano y de metil éter, como fase estacionaria la sílica gel impregnada con nitrato de plata y como revelador la luz ultravioleta. Por su parte en la cromatografía líquida se empleó acetonitrilo como fase móvil y una columna C-18, mientras que en la GC se utilizó una columna capilar de. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 13.

(32) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA silica CP-Sil 88, detector de ionización por llama y se empleó una programación de temperatura de 60 0C por 5 min., con incremento hasta 165 0C a (15 0C/ min.) [37]. En los últimos cinco años los estudios cromatográficos han mantenido el uso de la cromatografía gaseosa introduciendo como método de detección la espectrometría de masas (GC/MS). Por solo citar algunos ejemplos Wang ZY y col. (2008) determinaron el contenido de aceite y ácidos grasos presentes en la semilla de Jatropha curcas, Cherif y col., (2009) aplicaron la técnica para determinar el contenido de estos ácidos y los esteroles en el aceite de almendra, mientras que Amin y col. (2010) proponen una técnica validada para determinar los ácidos grasos en el aceite de Cumin, como materia prima y en formulaciones transdermales. Para ello se usó la GC/MS que permitió determinar la presencia de 32 ácidos grasos, con mayor proporción del linoléico y el oleico. En la generalidad de los ejemplos encontrados en la literatura se combina esta técnica novedosa con la detección empleando el detector de ionización por llama. En todos casos se aplica una previa derivatización aplicando la reacción de Christie W, (1993)[38-40]. Eruca es un género de plantas nativas del sur de Europa y Asia central, donde ha sido cultivada desde hace siglos. El aceite obtenido de Eruca sativa Mill, planta que pertenece a este género, posee un alto contenido de ácido erúcico. Uğur A y col. (2010) evaluaron el efecto de los períodos de siembra (otoño y primavera) y tres formas de los fertilizantes que contienen nitrógeno en la composición de ácidos grasos de los aceites obtenidos a partir de las semillas de esta planta. La determinación se realizó aplicando la técnica de cromatografía de gases capilar acoplado a espectrometría de masas con previa obtención de los metil éteres correspondientes [41]. Messaoud (2011) realizó un análisis comparativo de diferentes componentes del Myrtus communis, entre los cuales estaban los ácidos grasos. Para ello realizó la obtención previa de los metil esteres a través de la previa metilación con metanol en medio ácido y aplicó la técnica de GC para su determinación cuantitativa, empleando como condiciones cromatográficas un detector FID y un gradiente de temperatura que osciló entre 190 y 2100C. Como resultado se obtuvo el perfil de ácidos grasos de las semillas de pericarpio y demostró que los ácidos grasos poliinsaturados constituyeron la fracción principal (54,3-78,1%). Se obtuvo que los porcentajes más altos son de Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 14.

(33) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ácido linoleico (78,0%) y ácido oleico (20,0 %) en las semillas y pericarpio de los frutos blancos , respectivamente [42]. El aceite de oliva se encuentra dentro de los aceites más estudiados en todo el mundo. En estudios recientes se evaluaron mezclas de aceitede girasolyaceite de oliva, que contienen 50% de aceite de oliva, en comparación conmezclas con40% y60% de ellos, respectivamente, en base a su perfil cromatográfico de ácidos grasos. Los ésteres metílicosdeácidosgrasosse. analizaronpor. GC-FID. y. se. procesana. través. de. herramientasquimiométricas[43].Se demostró que el método propuesto sería capaz de discriminar mezclas con una diferencia en la concentración de aceite de oliva menor que 5%[44]. La Sarcocornia ambigua (Michx.) es la especie más ampliamente distribuida del género perenne del hinojo marino en América del Sur, y se nota un gran potencial biotecnológico como un cultivo de regadío de agua salada. D'oca y colaboradores (2012) determinaron las composiciones cualitativas y cuantitativas de los ácidos grasos en las semillas de esta especie que se cultiva en el sur de Brasil. El análisis de los extractos en hexano realizado por GC- FID, utilizando una columna capilar DB-5 con un modo isocrático de temperatura a 180oC. El análisis mostró cinco picos prominentes para el aceite de esta semilla: 42,9% de ácido linoleico ω6, 20,4% de ácido palmítico, 18,5% de ácido oleico, 4,5% de ácido esteárico y 4,0%de ácido linolénico ω3. La suma del palmítico y esteárico saturado (24,8%) en el aceite de semilla de S. ambigua superó valores citados para los aceites de uso comercial, ninguno de los componentes de ácidos grasos no deseados se encuentran en el aceite de semilla de S. ambigua, por lo que podrían ser recomendadas para el consumo animal o la producción de biocombustibles [45]. Fatima y col (2012) analizaron el espino amarillo (Hippophae rhamnoides L.) planta resistente con fruta, que es conocida históricamente por sus propiedades medicinales y nutracéuticos. Para el análisis se aplicó la técnica de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GC-MS). El producto más reconocido de espino amarillo es su aceite de la fruta, en el cual se comprobó la presencia mayoritaria de los ácidos grasos esenciales, linoleico y α - linolénico mientras que en el aceite de la pulpa se determinaron altos niveles de ácido palmitoleico monoinsaturado [46]. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 15.

(34) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA El dátil es una de las plantas de producción de alimentos más antiguos del mundo donde siempre ha jugado un papel importante en la economía y la vida social. Biglar y col. (2012) determinaronla composición de ácidos grasos y el contenido total de tocoferoles de 14 aceites de semillas dátil iraníes, empleando la técnica de cromatografía gaseosa. De acuerdo con los perfiles de ácidos grasos, siete ácidos grasos se encuentran como mayoritarios, estando el ácido oleico casi en un 50% en las semillas, lo que permite proponer estas como una fuente rentable de aceite valioso para futuras aplicaciones industrials [47]. En las Semillas de Ribes rubrum, un subproducto de la producción de su jugo, es reconocido como una valiosa fuente de aceite rico en ácidos grasos poliinsaturados. Šavikin y col. (2013) evaluaron 28 variedades de grosella para determinar su contenido de aceite y la composición de ácidos grasos. La determinación se realizó a través de la técnica de GC-FID, con una fase estacionaria DB-5 y previa derivatización a través de la reacción de Christie W, (1993), en medio básico. El contenido de aceite en las semillas varió desde 18,2 hasta 27,7% y el ácido linoleico fue el componente principal, con contenidos que van desde 32,7 hasta 46,9% de ácidos grasos totales. No se observaron diferencias cuantitativas en los perfiles de ácidos grasos entre variedades de diferente color de la fruta [48]. Recientemente en el marco de una colaboración con los Institutos Nacionales de la Salud Oficina de Suplementos Dietéticos y el Centro de la Administración de Alimentos y Medicamentos para la Evaluación e Investigación de Drogas, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología ha desarrollado Estándar Material de referencia ( SRM ) 3274 Aceites botánico que contiene Omega- 3 y los ácidos grasos omega -6 y SRM 3275 Omega-3 y Omega- 6 ácidos grasos en el aceite de pescado. Los valores de fracción de masa de ácidos grasos se basan en los resultados de los análisis utilizando cromatografía de gases con detección de ionización de llama (GC-FID) y espectrometría de masas (GC/MS). Estos materiales especificados de riesgo complementan otros materiales de referencia disponibles en la actualidad con las fracciones de masa para analitos similares y son parte de una serie de materiales especificados de riesgo que se están desarrollando para los suplementos dietéticos [49]. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 16.

(35) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.4. Determinación de los parámetros de desempeño de los métodos analíticos: Para la determinación de los parámetros de desempeño de los métodos analíticos se consultó como bibliografía las normas de armonizaciόn,International Conference on Harmonisation (ICH, siglas en inglés), (2005) y las normas de validación de métodos analíticos del Centro Estatal Control de la Calidad de los Medicamentos (CECMED) (2007). Validación de los métodos analíticos: La validación de los métodos analíticos utilizados en la actividades de control desempeña un papel determinante pues de ellos depende la comprobación confiable y reproducible de los índices de calidad de las materias primas y productos, lo cual contribuye notablemente al aseguramiento de la calidad, seguridad y eficiencia de los mismos. Existen características de funcionamiento que definen la aptitud de un método analítico para el uso al que se destina. Dichas características son las siguientes. Características de practicabilidad: Son las que deciden si el procedimiento analítico es fácil o difícilmente realizable en la práctica. Los parámetros de practicabilidad se evalúan en la fase de desarrollo del método analítico: tiempo, coste, tamaño de la muestra, calificación del personal, tipo de equipo e instrumentación, condiciones de seguridad, etc. Características de idoneidad: Son el conjunto de parámetros que garantizan que el sistema responde, en el momento del análisis, a los requisitos fijados en la validación del método. La idoneidad verifica el buen funcionamiento del sistema (instrumento y método) en el momento de su uso. Características de fiabilidad: Son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validación. Los parámetros que expresan la fiabilidad de los métodos analíticos son: linealidad, exactitud, precisión, límite de detección y cuantificación y selectividad.. 1.4.1. LINEALIDAD: Este estudio se efectuará tanto sobre soluciones patrón de analito como sobre muestras problemas que contengan concentraciones crecientes del analito.. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 17.

(36) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los estudios de linealidad responderán a diseños similares a los que se describen a continuación: a) El ensayo se puede efectuar tanto con material de referencia del analito, como con muestras problemas que contengan concentraciones crecientes de analito que cubran el intervalo del método. Cuando se trata de la valoración de una materia prima se analizaran de 3 a 5 soluciones patrón en un intervalo de concentraciones entre 80 y 120% de la concentración teórica. Cuando se trata de la valoración del principio activo en un producto terminado se analizaran entre 5 y7 soluciones patrón en un intervalo de concentraciones entre 50 y 150% de la concentración teórica del principio activo en la muestra. En los dos casos el análisis se realizará como mínimo por triplicado b) Se evaluarán los datos estadísticamente a fin de verificar la linealidad y proporcionalidad según se describe a continuación: Significación de la regresión: Se determinará el coeficiente de correlación (debe ser ≥ 0,990) y el de determinación (valores superiores a 0,98). Verificación de linealidad: Se efectuará por determinación del CV de los factores de respuesta (cociente respuesta / concentración), el cual no será superior al 5%. También se evaluará la varianza de la pendiente de la línea de regresión. Verificación de proporcionalidad: Los resultados de este ensayo deberán incluir el 0 para el grado de probabilidad definido. Prueba de falta de ajuste: Se implementará para demostrar que los valores se ajustan a una línea recta.. 1.4.2. PRECISIÓN: La precisión de un procedimiento analítico expresa el grado de concordancia entre una serie de mediciones obtenidas a partir de la misma muestra homogénea bajo las condiciones prescritas. Debe investigarse la precisión utilizando muestras homogéneas, auténticas. Sin embargo, si no es posible obtener una muestra homogénea se emplean muestras artificialmente preparadas o una disolución de la muestra. La determinación de la precisión se realizará a 3 niveles, siempre que proceda: intraensayo (repetibilidad), interensayo (precisión intermedia) e interlaboratorios Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 18.

(37) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA (reproducibilidad). Las muestras a incluir en este estudio serán lotes de producción (muestras reales). a) Evaluación de la repetibilidad: (1) se utilizarán 2 o más concentraciones de una muestra homogénea, las cuales serán analizadas 6 veces como mínimo en una misma corrida, (2) se prepararan muestras de 3 concentraciones diferentes, una inferior, media y superior del intervalo especificado y realizar 3 réplicas de cada una o (3) realizar un mínimo de 6 determinaciones a la concentración del 100 %. b) Evaluación de la precisión intermedia: Se implementará un diseño donde se evaluarán 3 concentraciones de una muestra (como mínimo) en duplicado, por al menos 2 analistas en 3 días diferentes. Se recomienda, siempre que sea posible, que cada analista emplee instrumentos y materiales diferentes. c) Evaluación de la reproducibilidad: Se implementará en forma de estudio interlaboratorio. Se evaluarán de 3 a 5 muestras (en un esquema de 2 a 4 concentraciones por muestra) por duplicado, involucrando diferentes analistas, reactivos e instrumentos en cada laboratorio. Las muestras se analizarán en 6 ensayos independientes como mínimo.. 1.4.3. ESPECIFICIDAD: La especificidad es la capacidad de un método analítico de detectar inequívocamente el analito en presencia de compuestos que pueden estar presentes en la muestra (impurezas, productos de degradación, componentes de la matriz, etc.). Esto implica en ensayos de identificación asegurar la identidad del analito en cuestión y en ensayos cuantitativos asegurar que todo el procedimiento analítico ejecutado brinda una respuesta exacta del contenido del analito en la muestra. La tendencia mayoritaria es la utilización de métodos relativamente específicos (cromatografía líquida y de gases) en los que la presencia de otros componentes tienen escasa influencia en los resultados. La especificidad de un método analítico se determina comparando los resultados del análisis de muestras conteniendo impurezas, productos de degradación, sustancias relacionadas o excipientes con los resultados del análisis de muestras que no contienen dichas sustancias. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 19.

(38) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La evaluación de la especificidad, en función de las características de los métodos de ensayo, deberá estar dirigida a los siguientes aspectos: a) Identidad: Se demostrará que el método es capaz de identificar el principio activo en presencia de otras sustancias. b) Pureza: Se demostrará que el método permite una evaluación cualitativa o cuantitativa de las impurezas específicas. c) Determinación cuantitativa de un componente (o para ensayos de actividad): Se asegurará que la señal medida por el método analítico corresponde exclusivamente al analito sin interferencias de excipientes, productos de degradación y/o impurezas.. 1.4.4. EXACTITUD: La determinación de la exactitud deberá realizarse por estudios de adición y recuperación de cantidades conocidas de muestras de referencia o patrones a excipientes a fin de comparar el valor medido experimentalmente (observado) con el valor real (esperado). La determinación de este parámetro podrá realizarse por algunos de los siguientes métodos: a) Análisis repetido de una muestra de concentración conocida: Se realizará por adición de una concentración conocida de un analito o patrón a un placebo. Deberán implementarse entre 6 y 10 ensayos y se calculará el porciento de recuperación. Se implementarán pruebas de significación apropiadas. b) Análisis repetidos de muestras de concentraciones conocidas diferentes: Se seguirá un diseño similar al anterior. Se utilizarán 3 concentraciones como mínimo (intervalo alto, medio y bajo) y se realizarán los análisis por triplicado. En este tipo de estudio, se evaluará la influencia del factor concentración. c) Método de adición de patrón: Se tomarán alícuotas de una muestra a las que se añaden cantidades conocidas de un patrón, dejando una alícuota como control de muestra. Dichas muestras se analizarán en paralelo por triplicado y se evaluarán contra una curva de calibración preparada con soluciones patrones. Se calculará la recuperación como medida de exactitud y su significación por pruebas estadísticas apropiadas. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 20.

(39) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA d) Comparación con otro método validado: Podrá implementarse a concentración única o en un intervalo de 2 a 4 concentraciones diferentes. En cualquier caso se analizarán las muestras 6 veces como mínimo. Se implementarán pruebas de significación apropiadas. Para que la evaluación de la exactitud se considere satisfactoria, no existirán diferencias significativas entre los valores obtenidos experimentalmente y los valores verdaderos. Si esta diferencia es pequeña, la exactitud es buena[50].La falta de exactitud puede ser por exceso o por defecto. Las desviaciones por exceso pueden ocurrir cuando existen interferencias analíticas y la selectividad del método no es adecuada. En este caso debería modificarse el método para hacerlo más efectivo. Las desviaciones por defecto se presentan en métodos muy laboriosos, con varias fases, extracciones, purificaciones, etc. que se traducen inevitablemente en una disminución de la recuperación. 1.4.5. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN: Límite de cuantificación: Cantidad más baja de analito que puede medirse cuantitativamente en una muestra con exactitud y precisión aceptables. Límite de detección:Cantidad más baja de analito que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse, como una concentración o cantidad exacta. La evaluación de ambos parámetros puede efectuarse y responder a los siguientes diseños. a) Relación señal ruido: Se compararán la respuesta del blanco (matriz sin analito) con las muestras que contienen pequeñas cantidades de analito adicionadas al blanco. Deberá obtenerse el nivel medio de ruido del blanco y se multiplicará por 2 o 3 para el límite de detección o por 6 o 10 para el de cuantificación. Posteriormente se compararán estos valores con las respuestas de las series blanco más analito y se hallará la concentración de analito que corresponda al valor de la señal. b) Estudio de la menor cantidad detectable: Muy recomendado para cromatografía de capa delgada en la detección de impurezas y/o productos de degradación en IFA. Se determinará la carga máxima de IFA que se separa correctamente en las condiciones Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 21.

(40) CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA cromatográficas establecidas, y posteriormente se prepararán diluciones constantes de esta IFA (a una concentración ya evaluada) más cantidades decrecientes del analito a estudiar. El límite de detección se calculará a partir de la dilución en que no sea posible distinguir entre la respuesta del analito y la del blanco. El resultado se expresará en valor absoluto o en porciento (con respecto a la carga máxima). c) Por estimación: El límite de detección y el de cuantificación podrán extrapolarse del valor de la ordenada en el origen (en unidades de concentración), de la recta del ensayo de linealidad o por análisis repetido del blanco de la muestra. En todos los casos se aplicarán cálculos matemáticos para estimar ambos límites y estos serán verificados mediante el análisis de muestras que contengan el analito en concentraciones iguales o aproximadas a los límites estimados. Tanto el límite de detección como el de cuantificación son valores numéricos.[51-52].. 1.5.Consideraciones finales del estudio bibliográfico. El aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa es utilizado como alimento por su alto valor nutricional a lo largo de toda la zona amazónica, donde crece la palmera portadora de estas semillas. Esta planta ha sido poco estudiada, solo existen escasos reportes que refieren fundamentalmente aspectos agronómicos y taxonómicos de esta planta. Con respecto a estos estudios analíticos, referidos para la determinación cuantitativa de los ácidos grasos, se precisa que: (A) Los ácidos grasos deben ser derivatizados, previo a su determinación por GC, para lo cual se recomiendan como las metodologías más utilizadas las reportadas por Christie,(1993), que incluyen la metilación, con metanol, en medio ácido o básico.; (B) las técnicas cromatográficas poseen las mayores ventajas para la determinación de ácidos grasos en aceites vegetales con énfasis la GC-FID y la GC-MS; (C) los estudios reportados del aceite obtenido de las semillas de Attalea maripa son muy escasos, solo existen escasos reportes que refieren fundamentalmente aspectos agronómicos y taxonómicos de esta planta [35].. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 22.

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(42) CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS. CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Aceite vegetal, equipos y reactivos. Obtenciόn del aceites vegetales:. Para la obtención del aceite se utilizaron las semillas de Attalea maripa. El aceite utilizado fue previamente extraído en el pueblo Botopasie, Surinam mediante un proceso donde se tuestan las semillas de Attalea maripa. Luego estas semillas se trituran en un pilón hasta que se logra liberar el aceite de la almendra, visualizándose el líquido viscoso en el cual estarían dispersas todas las partes no solubles en el aceite de las semillas. A continuación seadiciona igual contenido de agua, se calienta por varias horas y se logra la separación de ambas fases, propiciándose la extracción del aceite. El agua se eliminό por evaporación y se filtrό. Equipos: Balanza digital, Boeco, Alemania. Rotoevaporador, Buchi R-200, Francia. Cromatógrafo Gaseoso, Agilent 6890N series, EE.UU. Reactivos más utilizados: Metanol, Lichrosolv, Merck Ácido Sulfúrico, Panreac. Heptano, Panreac Hidróxido de potasio, Panreac Tiosulfato de sodio, Merck Tolueno, Panreac Bicarbonato de potasio, Merck Metil Decanoato (caprato), PolyScience Metil Hendecanoato (undecanoato), PolyScience Metil Dodecanoato (Laureato), PolyScience Metil Tetradecanoato (miristato), PolyScience Metil Hecadecanoato (palmitato), ACROS organics,Belgium Metil Linoleato, SIGMA, EEUU Metil Oleato, ACROS organics,Belgium Metill Octadecanoato (estearato). Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 23.

(43) CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS Ácido Clorhídrico, Panreac. Ácido Acético Glacial, Merck. Almidón, Merck. Fenolftaleína, Merck.. 2.2. Determinación de los índices de calidad del aceite obtenido a partir de las semillas de Attalea maripa. Los índices de calidad del aceite fueron seleccionados teniendo en cuenta los parámetros incluidos en las monografías de control de la calidad de aceites vegetales reportados en las farmacopeas relativamente recientes, tales como: espectro UV, índice de refracción, densidad relativa, índice de saponificación, índice de acidez, índice de peróxidos, índice de yodo y como ensayo cuantitativo la determinación de ácidos grasos presentes en el aceite. A continuación se exponen los procedimientos de trabajo para cada ensayo[9, 22].. 2.2.1. Espectro UV:A 0,05 g de la sustancia a examinar, se le añadió ciclohexanoy se diluyó hasta 50,0 mL con el mismo disolvente. Se desarrolló el espectro de absorción en el intervalo de longitud de onda comprendido entre 200 y 300nm.. 2.2.2. Índice de refracción:Se realizó la determinación, utilizando un refractómetro digital de Abbe, teniendo como condiciones 20 ± 0,5°C, en relación a la longitud de onda de la línea D del sodio (λ = 589,3 nm). Se determinó el ángulo límite.. 2.2.3. Densidad relativa: Se determinó por la relación entre la masa de 2 mL del aceite a 20 °C y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura en un matraz aforado.. 2.2.4. Índice de saponificación:Se introdujo 2 g del aceite en un matraz de vidrio borosilicatado de 250 mL y acoplado a un condensador a reflujo. Se añadió 25 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 mol/L. Se acopló un condensador y se calentó a reflujo durante 1 hora. Luego se añadió 1 mL de disolución defenolftaleína y se valoró Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 24.

(44) CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS inmediatamente (mientras esté caliente) con HCl 0,5 mol/L (n1 mL de HCl 0,5 mol/L). Se realizó un ensayo en blanco en las mismas condiciones (n2 mL de HCl 0,5 mol/L), siendo M la masa de la sustancia a examinar en gramos, se calculó el índice de saponificación por la siguiente expresión:. IS . 28,05  n1  n2  M. 2.2.5. Índice de acidez:Se disolvió 2 g del aceite en 10 mL de una mezcla formada por volúmenes iguales de alcohol y éter (el disolvente debe ser neutralizado previamente con hidróxido de potasio 0,1M en presencia de 0,5 mL de disolución de fenolftaleína). Una vez disuelto, se valoró con hidróxido de potasio 0,1mol/L. La valoración se da por terminada cuando el color rosa persiste durante 15 segundos por lo menos (n mL de hidróxido de potasio 0,1 mol/L). La masa de la muestra (M) se expresó en g. Se calculó elíndice de acidez empleando la siguiente expresión:. IA . 5,61 n M. 2.2.6. Índice de peróxidos:En un matraz cónico de 250 mL con tapón esmerilado se introdujo 5 g del aceite. Se añadió 30 mL de una mezcla de 3 volúmenes de ácido acético glacial y 2 volúmenes de cloroformo. Se agitó hasta disolver la sustancia y se añadió 0,5 mL de disolución saturada de ioduro de potasio. Se continuó la agitación durante un minuto exactamente, a continuación, se añadió 30 mL de agua. Se valoró con tiosulfato de sodio 0,01 mol/L, añadido lentamente sin dejar de agitar hasta que la coloración amarilla hubiera prácticamente desaparecido. A continuación se añadió 5 mL de disolución de almidón y se prosiguió la valoración agitando enérgicamente hasta la desaparición de la coloración (n1 mL de tiosulfato de sodio 0,01 mol/L). Se realizó una valoración en blanco en las mismas condiciones (n2 mL de tiosulfato de sodio 0,01 M). La valoración en blanco no debe requerir más de 0,1 mL de tiosulfato de sodio 0,01. Dacia Petra Amania Cuantificación de los ácidos grasos presentes en el aceite de semillas de Attalea maripa. 25.