CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.2. Resultados de la determinación de los ácidos grasos (AG) presentes en el aceite,
3.2.1. Identificación de los AG presentes en el aceite
Las condiciones cromatográficas de la técnica de cromatografía de gases utilizadas en el presente trabajo fueron tomadas del trabajo desarrollado por Herrera, (2011), en el cual se optimizaron dichas condiciones y se demostró que la temperatura óptima para lograr una buena separación de los posibles AG presentes en el presente trabajo es 200°C, aplicándola en modo isocrático. Dicha investigación tuvo como antecedentes los estudios publicados en múltiples trabajos científicos sobre la determinación de ácidos grasos presentes en productos vegetales, tales como:Caballero MJ. Y col. (2006);
Destaillats F. y col. (2007), entre otros.
En el trabajo realizado por Herrera (2011) se validó la técnica de GC para la determinación de cuatro ácidos grasos presentes fundamentalmente en tres especies de Cucurbita (Palmítico, Linoleico, Oleico y Esteárico). También se tuvo en consideración que la principal reacción de derivatización corresponde a la obtención de los metil ésteres de ácidos grasos. Esta reacción fue publicada por Christie WW., (1982; 1990; 1993), quien propone una metodología para la preparación de los metil ésteres empleando, metanol, a través de una catálisis ácida y básica[33, 37, 53].
Teniendo en cuenta lo anterior y utilizando ocho ácidos grasos metilados como patrones, se obtuvo un cromatograma con picos muy bien resueltos. La Figura 3.1
muestra el cromatograma obtenido para la mezcla de estos ocho patrones, los cuales aparecen en el siguiente orden en el cromatograma: metil caprato (tr=6,3 minutos), metil undecanoato (tr=7,5 minutos), metil laureato (tr= 8,9 minutos), metil miristato (tr=11,8 minutos), palmitato (tr= 16,7 minutos), seguido de los dos AG Insaturados (metil oleato [tr=23,6 minutos] y metil linoleato [tr=24,1 minutos]) y finalmente aparece el metil estearato (tr=25,6 minutos). Por su parte en la Figura 3.2 aparece el cromatograma obtenido para la muestra bajo las mismas condiciones de operación, observándose una total correspondencia en los tiempos de retención de ambos cromatogramas para siete de los patrones evaluados, no existiendo total coincidencia solo para el Metil undecanoato; este resultado permitió corroborar la presencia de estos
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siete AG en el aceite en estudio. Como se observa en el cromatograma de la muestra aparece adicionalmente a los picos identificados un pico a tr=4,08 minutosbien definido que no pudo ser identificado por la no disponibilidad de patrón de este ácido graso. Se decidió que el patrón restante (Metil undecanoato) con un tr=7,5 minutos fuese el estándar interno (SI) ya que cumplía las condiciones para ser usado para este fin.
Figura 3.1. Cromatograma obtenido para la mezcla de estos ocho patrones y el SI. Pico 1: Metil Caprato, Pico 2: Metil Undecanoato (estándar Interno), Pico 3: Metil Laureato, Pico 4: Metil Miristato, Pico 5: Metil Palmitato, Pico 6: Metil Linoleato, Pico 7: Metil Oleato, Pico 8: Metil Estearato.
Figura 3.2. Cromatograma obtenido para la muestra bajo las mismas condiciones de operación. min 5 10 15 20 25 30 35 40 45 pA 100 200 300 400 500 600 700 FID1 A, (DACIA\MEZCLAPATRON163.D) 6.33 4 7.59 3 8.86 5 11.8 31 16.6 57 23.5 59 24.0 05 25.6 39 min 5 10 15 20 25 30 35 pA 100 200 300 400 500 600 700 FID1 A, (DACIA\M2200-200000143.D) 2.67 9 2.71 1 2.795 2.832 2.924 2.953 4.08 6 6.335 8.921 11.882 16.694 23.5 67 24.0 80 25.6 53
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3.3. Resultados de la Validación de la técnica de Cromatografía de gases para la determinación de los ácidos grasos presentes en el aceite.
Teniendo en cuenta que el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el contenido de los ácidos grasos presentes en el aceite y considerando que la técnica de Cromatografía Gaseosa había sido validada para los AG Palmítico, Linoleico Oleico y Esteárico por Herrera, (2011) se decidió validar la técnica GC para los restantes AG identificados (Cáprico, Láurico y Mirístico). Lo anterior permitió que al finalizar el presente trabajo pudieran ser cuantificados los siete AG identificados en el aceite[53]. Linealidad
Para el cumplimiento de este parámetro fue necesario demostrar la linealidad para cada uno de los estándares. A continuación se exponen, por separado los resultados para cada uno de ellos.
Metil Caprato
La Figura 3.3 muestra la curva de calibración obtenida al evaluar la linealidad en la cromatografía de gases utilizada para la determinación cuantitativa del Metil Caprato en la muestra. Los criterios estadísticos utilizados para evaluar el parámetro aparecen en la Tabla A.1 (Anexo A). Si se comparan los valores obtenidos en cada parámetro con los criterios establecidos por las normas ICH, 2007, se puede afirmar que en todos los casos se encuentran dentro del intervalo especificado: La ecuación de la recta obtenida para el Metil Caprato fue Y = 0,099x + 0,134 con un coeficiente de correlación de 0,995 un coeficiente de variación de los factores respuesta 3,78 (inferior al 5%) y una desviación estándar de la pendiente de 0,0047, que es menor que el 2%. La fiabilidad de la ecuación se evaluó, además, a través del error típico cuyo valor es muy inferior a la desviación estándar de la variable Y. Con vistas a corroborar los resultados anteriores se realizó un análisis de varianza en el cual se obtuvo un valor de 6649,06 (F mucho mayor que el F crítico), estadísticamente significativo. Sin embargo el valor del coeficiente de calidad es muy inferior a 2,5 (0) por lo que se puede plantear que el método es lineal en el intervalo de concentración evaluado[51].
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Figura 3.3. Curva de calibración para la determinación del Metil Capratopor cromatografía de gases.
Metil Laureato
Los criterios estadísticos utilizados para evaluar el parámetro linealidad en la cromatografía de gases utilizada para la determinación cuantitativa de Metil Laureato en la muestra aparecen en la Tabla A.2 (Anexo A). La Figura 3.4 muestra la curva de calibración obtenida. La ecuación de la recta obtenida para el Metil Laureato fue Y = 0,072x – 1,035 con un coeficiente de correlación de 0,996, un coeficiente de variación de los factores respuesta 4,03 (≤ 5%) y una desviación estándar de la pendiente de 0,0049, que es menor que el 2%. La fiabilidad de la ecuación se evaluó, además, a través del error típico cuyo valor es muy inferior a la desviación Standard de la variable Y. Con vistas a corroborar los resultados anteriores se realizó un análisis de varianza en el cual se obtuvo un valor de 3068,97(F mucho mayor que el F crítico), estadísticamente significativo. Sin embargo el valor del coeficiente de calidad es muy inferior a 2,5 (0) por lo que se puede plantear que el método es lineal en el intervalo de concentración evaluado. y = 0.0999x + 0.1347 R² = 0.9953 0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 A m /A SI Concentración (µg\mL)
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Figura 3.4. Curva de calibración para la determinación del Metil Laureatopor cromatografía de gases.
Metil Miristato
Los criterios estadísticos utilizados para evaluar el parámetro linealidad en la cromatografía de gases utilizada para la determinación cuantitativa de Metil Miristato en la muestra aparecen en la Tabla A.3 (Anexo A). La Figura 3.5 muestra la curva de calibración obtenida. La ecuación de la recta obtenida para el Metil Miristato fue Y = 0,086x – 7,526 con un coeficiente de correlación de 0,993, un coeficiente de variación de los factores respuesta 5,09 (≤ 5%) y una desviación estándar de la pendiente de 0,0018, que es menor que el 2%. La fiabilidad de la ecuación se evaluó, además, a través del error típico cuyo valor es muy inferior a la desviación Standard de la variable Y. Con vistas a corroborar los resultados anteriores se realizó un análisis de varianza en el cual se obtuvo un valor de 3432,66 (F mucho mayor que el F crítico), estadísticamente significativo. Sin embargo el valor del coeficiente de calidad es muyinferior a 2,5 (0) por lo que se puede plantear que el método es lineal en el intervalo de concentración evaluado.
y = 0.0728x - 1.0358 R² = 0.9969 0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 0 100 200 300 A m /A S I Concentración (ug\mL)
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39 Figura 3.5.Curva de calibración para la determinación del Metil Miristato por
cromatografía gaseosa.
Precisión
Este parámetro incluye los términos repetibilidad y precisión intermedia. Para el primer caso la técnica se repitió sin alterar las condiciones, mientras que en el segundo la técnica se desarrolló en diferentes días.
La Tabla B.1 (Anexo B), muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros para el Metil caprato. El coeficiente de variación obtenido para la repetibilidad de la muestra fue de (1,393%), que resultó ser menor que el establecido para este ensayo cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (≤ 2%) lo que indica que la técnica posee buena repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación de 3,5%, inferior al establecido (≤ 5%), además, en este parámetro se evaluaron otros parámetros estadísticos que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos estadígrafos aparecen también reflejados en la misma tabla.
El análisis de varianza realizado muestra que no hay diferencias significativas entre los grupos al obtenerse en la prueba Fischer una F
cal < FCritica. Esto es ratificado por el Test de Cochrans (Ccal= 0,265) en el cual se obtuvo una Ccal < CCritica.Finalmente el Coeficiente de variación entre los grupos (CV (%) = 3,73) resultó ser menor que el valor obtenido para el coeficiente de variación de Horwitz (3,78%) ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas.
y = 0.0862x - 1.5261 R² = 0.9939 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 0 100 200 300 A M /A S I Concentración (µg\mL) Curva de calibración del Metil miristato
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En la Tabla B.2 (Anexo B), se muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros para el Metil Laureato.
El coeficiente de variación obtenido para la repetibilidad de la muestra fue de (1,54%), que resultó estar muy cercano al valor establecido para este ensayo cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (≤ 2%) lo que indica que la técnica posee buena repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación (2,06%) inferior al establecido (≤ 5%), además, en este parámetro se evaluaron otros parámetros estadísticos que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos estadígrafos aparecen también reflejados en la misma tabla. En el Test de Cochrans (Ccal.= 0,40) se obtuvo una C
cal < CCritica. Finalmente el Coeficiente de variación entre los grupos (CV (%) = 2,30) resultó ser menor que el valor obtenido para el coeficiente de variación de Horwitz (2,69%) ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas.
Por su parte la Tabla B.3 (Anexo B), muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros para el Metil Miristato. El coeficiente de variación obtenido para la repetibilidad de la muestra fue de (1,53%), que resultó ser menor que el establecido para este ensayo cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (≤ 2%) lo que indica que la técnica posee buena repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación (1,88%) inferior al establecido (≤ 5%), además, en este parámetro se evaluaron otros parámetros estadísticos que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos estadígrafos aparecen también reflejados en la misma tabla.
El análisis de varianza realizado muestra que no hay diferencias significativas entre los grupos al obtenerse en la prueba Fischer una Fcal < FCritica. Esto es ratificado por el Test de Cochrans (Ccal.= 0,49) en el cual se obtuvo una C
cal < CCritica. Finalmente el Coeficiente de variación entre los grupos (CV (%) = 2,12) resultó ser menor que el valor obtenido para el coeficiente de variación de Horwitz (2,86%) ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas. Los resultados obtenidos en ambos parámetros permiten asegurar que la técnica de cromatografía gaseosa para la determinación de ácidos grasos en la semilla de Attalea maripa es “precisa”.
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41 Exactitud
Las concentraciones añadidas del Metil capratocomo patrón y las recuperaciones obtenidas se recogen en la Tabla C.1 (Anexo C). El porcentaje de recuperación promedio fue de 102,98±1,56%, acorde a lo exigido para técnicas cromatográficas. Al realizar la curva de recuperación (Figura 3.6), el valor de la pendiente está dentro del rango obtenido en el ensayo, muy cercano al valor de recobrado promedio anteriormente calculado.
Estos valores demuestran una elevada exactitud en las determinaciones de Metil caprato en las muestras de aceite, con el procedimiento utilizado.
Figura 3.6. Curva de recuperación para el patrón de Metil Caprato en la técnica de cromatografía gaseosa.
Las concentraciones añadidas del Metil Laureato como patrón y las recuperaciones obtenidas se recogen en la Tabla C.2 (Anexo C). El porcentaje de recuperación promedio fue de 102,69± 0,96%. Al realizar la curva de recuperación, Figura 3.7, elvalor de la pendiente está dentro del rango obtenido en el ensayo, muy cercano al valor de recobrado promedio anteriormente calculado. Estos valores demuestran una elevada exactitud en las determinaciones de ácido láurico en las muestras de aceite, con el procedimiento utilizado.
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Figura 3.7. Curva de recuperación para el patrón de Metil Laureato en la técnica de cromatografía gaseosa.
Las concentraciones añadidas del Metil Miristato como patrón y las recuperaciones obtenidas se recogen en la Tabla C.3 (Anexo C). El porcentaje de recuperación promedio fue de 100,95± 2,60%. Al realizar la curva de recuperación, Figura 3.8, el valor de la pendiente está dentro del rango obtenido en el ensayo y está bien cercano con el valor de recobrado promedio anteriormente calculado. Estos valores demuestran una elevada exactitud en las determinaciones de ácido mirístico en las muestras de aceite, con el procedimiento utilizado.
Figura 3.8. Curva de recuperación para el patrón de Metil Miristato en la técnica de cromatografía gaseosa.
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43 Selectividad y Especificidad.
Como parte de determinación de los límites de detección y cuantificación se realizó la inyección del blanco solo y no se obtuvo respuesta lo que demostró la no existencia de interferencias al tiempo de retención de las sustancias presentes en la muestra. Si se comparan los picos cromatográficos de los patrones (Metil Caprato, Metil Laureato y Metil Miristico) con los correspondientes en la muestra bajo las condiciones óptimas de análisis (Figura 3.1 y 3.2) donde no se observaron a simple vista colas, frentes difusos u hombros, se puede inferir que no debe haber solapamientos de picos. Tampoco se observaron variaciones significativas en los tiempos de retención, los cuales se mantienen dentro de un intervalo de ± 2%.
Estos resultados muestran la no existencia interferencias apreciables que puedan afectar la determinación confiable de los ácidos grasos (cáprico, láurico y mirístico) en el aceite de semilla de Attalea maripa. Sin embargo, con vistas a ratificar los mismos se analizaron los factores de simetría de picos de patrones y muestras para cada ácido graso. Los parámetros estadísticos utilizados para la determinación de los intervalos de confianza de los factores de simetría aparecen en la tabla 3.1.
Tabla 3.1. Parámetros estadísticos utilizados para la determinación de los intervalos de confianza de los factores de simetría.
Cáprico Láurico Miristico
Patrón Muestra Patrón Muestra Patrón Muestra
x
= 1,02x
= 0,93x
= 1,34x
= 2,39x
= 1,16x
= 1,7 t = 1,83 t = 1,83 t = 1,83 t = 1,83 t = 1,83 t = 1,.83 S = 0,02 S = 0,047 S = 0,72 S = 0,6 S = 0,2 S = 0,34 n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 n = 10 Metil capratoLos factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se encontraban de forma tal que unos intervalos incluían a los otros. Para el patrón estos intervalos van
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desde 1,08 hasta -0,07 y en el caso de la muestra los intervalos oscilan desde 0,95 hasta -0,02
Metil Laureato
Los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se encontraban de forma tal que unos intervalos incluían a los otros. Para la muestra estos intervalos van desde 1.57 hasta -0,20 y en el caso del patrón los intervalos oscilan desde 2,59 hasta - 0,23.
Metil Miristato
Los factores de simetría de los picos para el patrón y la muestra, se encontraban de forma tal que unos intervalos incluían a los otros. Para la muestra estos intervalos van desde 1.23 hasta -0,07 y en el caso del patrón los intervalos oscilan desde 1,82 hasta - 0,11.
Teniendo en cuenta que en cada ácido graso el intervalo obtenido para la muestra está incluido en el intervalo obtenido para el patrón se puede descartar que exista solapamiento de los picos y por tanto es una buena razón para considerar la técnica
específica.
Límite de detección (LD) y de cuantificación (LC).
Los resultados del LD y LC para cada ácido graso se recogen en las Tablas D.1, D.2, D.3 y D.4 (Anexo D). Como límite de detección para el Metil caprato se obtuvo un valor de 1,68 µg/mL y como límite de cuantificación 5,09 µg/mL, mientras que para el Metil laureato se obtuvo un límite de detección 12,55 µg/mL y un límite de cuantificación de 38,02 µg/mL, valores que se encuentran por debajo del valor más bajo de concentración evaluado en la técnica. Como límite de detección para el Metil miristato se obtuvo un valor de 7,64 µg/mL y como límite de cuantificación 23,15 µg/mL
Con los resultados obtenidos en los cinco parámetros de validación se puede afirmar que la técnica de cromatografía de gases evaluada para la determinación de ácidos grasos en el aceite de semilla de Attalea maripa, es fiable.
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45 Aplicación de la técnica validada a la determinación de los ácidos grasos presentes en el aceite obtenido de Attalea maripa.
Una vez validada la técnica se aplicó en la determinación del contenido de ácidos grasos presentes en muestras de aceites obtenidos de attalea maripa. La Tabla 3.2
muestra los valores promedios obtenidos para los siete ácidos grasos presentes en el aceite.Se destaca que el aceite posee, del total de ácidos grasos, una tercera parte de los bien conocidos ácidos grasos insaturados (Oleico-ω9 y linoléico-ω6), que han sido ampliamente estudiados por su gran variedad de acciones sobre el organismo. Estos ácidos grasos comienzan a ser muy valorados por la medicina pues son eficaces para combatir muchos problemas de salud sin efectos secundarios. Los ácidos grasos Omega 3 y Omega-6 (especialmente el ácido linoléico, ácido gammalinolénico o GLA) son una clase de grasa poliinsaturada muy saludable que sólo podemos obtener a partir de la alimentación. Al sustituir productos ricos en ácidos grasos saturados por frutos secos ricos en ácidos grasos insaturados, la dieta mantiene idéntica energía pero se favorece la reducción del colesterol plasmático, en consecuencia se favorece la protección frente a las enfermedades cardiovasculares, resultando ser esencial en la prevención y en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. De ahí, el enorme interés existente por los productos ricos en ácidos grasos insaturados como los frutos secos, ricos en aceites, que facilitan una dieta orientada a reducir el colesterol total y el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Por todo lo anterior, en la composición de ácidos grasos en un aceite tiene mayor relevancia la presencia y cuantía de los insaturados, aunque los AG restantes le confieren importancia al aceite, al constituir fuente de estos en aquellos organismos que los requieran por su carencia debido a patologías asociadas. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se puede afirmar que el aceite evaluado posee gran potencialidad para su uso tanto en la industria alimenticia como cosmética por la variedad y cantidad de AG que posee[55].
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