Estudio de la interacción de proteínas de leche y soya y su efecto en la agregación, durante el proceso de fermentación en la preparación de yogur

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ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS DE LECHE Y SOYA Y SU EFECTO EN LA

AGREGACIÓN, DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACIÓN EN LA PREPARACIÓN DE

YOGUR.

Ana Milena Díaz Bautista Ana María Giraldo Menassé

Proyecto de grado presentado como requisito para optar por el título de: Ingeniera Química

Dirigida por:

Oscar Alberto Álvarez SolanoPh.D Andrés González BarriosPh.D

Universidad de Los Andes Departamento de Ingeniería Química

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Contenido

Agradecimientos………....………....………....………....……….3

Lista de Figuras……….………....………....………...………..4

Lista de Tablas……….………....………....………...………...5

Resumen…………..………..………....………....………….6

1. Estado del Arte……….………....………....………....………...6

2. Materiales y Métodos……….………....………....………....………...7

2.1. Materiales……….………....………....………....………...7

2.2. Prueba de solubilidad de la proteína de soya……….……….7

2.3. Preparación de las mezclas……….………....………...8

2.4. Distribución de tamaño de partícula de las muestras……….………8

2.5. Potencial Z ……….……….………...8

2.6. Microscopía electrónica de barrido y óptica……….………...8

2.7. Caracterización reológica de diferentes matrices lácteas……….………..9

2.8. Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo………….………9

2.9. Estudio electroforético de diferentes matrices lácteas……….………9

3. Resultados y Discusión……….………....………....………....………..9

3.1. Prueba de solubilidad de la proteína de soya………....………....………....………...9

3.2. Seguimiento del pH………....………....………....………....………10

3.3. Distribución tamaño de partícula………....………....………....………...12

3.4. Potencial Z de las diferentes leches………....………....………....………...13

3.5. Microscopía electrónica de barrido y óptica………....………....………....………...14

3.6. Caracterización reológica………....………....………....………...………...17

3.7. Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo………...………...19

3.8. Estudio electroforético………...………...………...………...21

4. Conclusiones. ……….………....………....………....………...23

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Agradecimientos

Queremos agradecer, en primer lugar, aÓscar Álvarez y Andrés González por el constante apoyo, acompañamiento y la orientación a lo largo del proyecto, con lo cual fue posiblealcanzar las metas propuestas. De igual forma, agradecemos a Sara Pacheco, BernadetteKlotz y Gerardo González, grupo de apoyo del Instituto de Investigación de Alpina, por la asesoría, la retroalimentación brindada y la motivación por obtener el mayor provecho de este trabajo. A Jorge Mario Gómez por las observaciones realizadas y por mostrarnos la importancia de este tipo de proyectos dentro del diseño de productos. Finalmente, a los técnicos de los laboratorios y a los asistentes que estuvieron siempre dispuestos a colaborarnos en todas las pruebas realizadas.

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Lista de Figuras

1. Figura 1. Resultados de tamaño de partícula (a) y sólidos totales (b) en prueba de solubilidad de proteína de soya………10

2. Figura 2. Comportamiento del pH de las muestras a cada tiempo………..……….10 3. Figura 3. Variación del potencial Z para (a) Leche de soya (b) Leche bovina y del Tamaño de partícula para (c) Leche de soya (d) Leche bovina a diferentes pHs……….………11

4. Figura 4. Seguimiento del tamaño de partícula (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina…..….13 5. Figura 5. Tamaño de partícula para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación….……….……….………14

6. Figura 6.Imágenes de microscopio electrónico de barrido con aumento 2000x. Ancho de imagen: 131 μm. (a) 100% (b)80%(c)50%(d)20% (e) 0% Leche bovina……….………....………15

7. Figura 7. Imágenes de microscopio óptico para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina. Aumento de 1000x. Barra de 10µm.………16

8. Figura 8. Curvas de flujo: Viscosidad vs. Velocidad de corte para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina a diferentes horas de fermentación..………18

9. Figura 9. Viscosidad para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación ……….……….………19

10. Figura 10. Tixotropía de las mezclas de leche bovina a las 7 horas de fermentación………..19 11. Figura 11. NIR de mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina, a diferentes horas de

fermentación y (f) de todas las mezclas a las 7 horas de fermentación………..……….20

12. Figura 12. Geles de electroforesis para mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina………21

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Lista de Tablas

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RESUMEN:El presente trabajo estudia la interacción de las proteínas de leche bovina y de soya, y su efecto en el fenómeno de agregación proteica durante la preparación de yogur, a diferentes concentraciones. Se empleó leche descremada-deslactosada Alpina y proteína de soya. Se realizó una caracterización macroscópica (evaluación de las propiedades reológicas), microscópica (tamaño de partícula), morfológica (microscopio óptico y microscopio electrónico de barrido (SEM)), molecular (espectro de infrarrojo cercano (NIR)) y un estudio de electroforesis. Se determinó que existe un efecto significativo de la proteína de soya en la caracterización macroscópica, microscópica y molecular de las mezclas, y que las proteínas de leche bovina y soya tienen formas de agregación diferentes observadas en el SEM, gránulos y malla, respectivamente, lo que afecta la reología y el tamaño de partícula del sistema. La viscosidad por su parte presenta valores de 0.71 Pa*s para la muestra de 100% leche bovina, mientras que para el caso de 0%, la viscosidad es de 2.61 Pa*s. En este sentido, la estructura de la soya resulta más resistente, teniendo un efecto importante en el comportamiento creciente de la viscosidad, a medida que se aumenta la cantidad de soya de las mezclas.

1. Estado del arte

Las bebidas lácteas son un grupo de alimentos que están creciendo en producción y en consumo. En la producción de yogur, la industria láctea utiliza leche descremada o entera y algunos otros ingredientes lácteos como la leche ligera, leche concentrada, y polvo de suero de leche, así como edulcorantes, estabilizantes, proteína de suero concentrada, sabores de frutas, entre otros, que se utilizan para aumentar sólidos, normalizar las mezclas, y/o para mejorar la presentación, consistencia y atributos sensoriales. (Özer&Kirmaci, 2010).El yogur, por su presencia en el mercado y su alto consumo, es el producto fermentado de consumo diario más importante(Bakirci&Kavaz, 2008; Özer&Kirmaci, 2010). En el segmento del mercado de yogures, hay una preferencia creciente por productos de baja, o sin, grasa que difieren en la textura, en comparación con los productos de grasa entera (Duarte-Teles y Hickmann-Flores, 2007)

La soya es uno de los alimentos que ha llamado la atención en las últimas décadas por su alto valor nutritivo y sus propiedades en la prevención de enfermedades. Además tiene un alto valor energético, un elevado contenido de proteínas (37%), superior al de la carne. En comparación con el resto de legumbres, la soya aporta mayor cantidad de hierro, yodo, magnesio, ácido fólico y otras vitaminas como B1, B2, B3 Y B6. (Lehr, A. 2009).El consumo de alimentos de soya y la incorporación de la leche de soya y sus subproductos en las dietas humanas han estado aumentando debido a sus efectos beneficiosos sobre la nutrición y la salud (Rinaldoni et al., 2012). Estos efectos incluyen la reducción de colesterol, la prevención del cáncer, diabetes, osteoporosis, obesidad, la protección contra enfermedades del intestino y riñón, y alivio de algunos problemas de la menopausia (Anderson et al, 1999;. Friedman y Brandon, 2001; Shah et al. , 2007)

Existe un número limitado de estudios disponibles sobre las interacciones de las proteínas de soya en los sistemas de mezclas de proteínas. Existen estudios sobre las propiedades funcionales de las proteínas de soya y proteínas de la leche a partir de un desarrollo de producto, por ejemplo, en estudios comparativos de productos de yogur a base de proteínas de leche bovina y de soya(Lee, et al., 1990). Se tiene poca información acerca de la caracterización de los agregados formados entre las proteínas de soya y de leche durante el procesamiento de los alimentos. En los sistemas mixtos de proteínas de leche ysoya, se formanagregados, sin embargo, los mecanismos de formación de tales agregados no son bastante claros.

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Se necesita una mejor comprensión de la formación de agregados entre las proteínas de soya y proteínas de la leche, con el fin de mejorar la textura y la estabilidad de los productos alimenticios que contienen ambos sistemas de proteínas. De esta forma, el entendimientode dicha agregación podría facilitar el diseño de una amplia gama de nuevos ingredientes funcionales.

El presente trabajo tiene como fin estudiar los cambios de agregación de diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya durante la preparación de yogur a partir de una caracterización macroscópica (evaluación de las propiedades reológicas), microscópica (tamaño de partícula), morfológica (microscopio óptico y microscopio electrónico de barrido), molecular (espectro infrarrojo cercano NIR) y una electroforesis.

2. Métodos y Materiales

2.1 Materiales

Para el estudio propuesto se trabajó con leche bovina UHT descremada-deslactosada, marca Alpina. Dicha leche cuenta con un porcentaje de proteína de 3.2% y de sólidos no grasos (SNG) de 8.02%, valores a los cuales se estandarizaron las mezclas. Por otro lado, se utilizó proteína de soya aislada, (SolaeCompany™), con un contenido de 90% de proteína y 95% de SNG. Adicionalmente, para la fermentación, se incluyó el cultivo con Lactobacillusdelbrueckii ss. bulgaricus y Streptococcussalivarius ss. thermophilus, (YO-flexMild 1.0® Chr Hansen™). Cabe resaltar que en la metodología trabajada se desarrolló una réplica para cada prueba realizada. 2.2 Prueba de solubilidad de la proteína de soya

Con el fin de analizar la hidratación de la proteína de soya, se realizó la prueba de solubilidad, mezclando inicialmente la proteína con agua desionizada a 38°C. Posteriormente, cada 15 minutos, a partir de la adición de la soya, se tomaron muestras de la mezcla, las cuales se centrifugaron en una centrífuga marca ThermoElectronCorporation IEC CL40R, por 10 minutos. Finalmente, se hallaron tanto el tamaño de partícula, como los sólidos totales de las muestras de sobrenadante. El procedimiento para la determinación de los sólidos totales consistió en calentar y secar las diferentes muestras y, por diferencia de pesos, determinar los sólidos remanentes.

2.3 Preparación de las mezclas

Como primer paso para la preparación de las muestras, se preparó la leche de soya utilizando la proteína de soya aislada. Dicha proteína se dispersó en agua desionizada a 38°C, con agitación rápida y constante, hasta una temperatura entre 70-77°C, momento en el cual se incorporó azúcar blanca comercial. Se prosiguió con la hidratación por 10 minutos más; por último, se autoclavó la mezcla para esterilizarla. Cabe resaltar que la adición de azúcar tiene dos objetivos: incluir un sustrato de alimento para las bacterias utilizadas, así como ajustar todas las mezclas al valor correspondiente de SNG presentes en la leche bovina, mencionado anteriormente. Los valores de SNG antes de agregar azúcar, así como las cantidades de la misma, según los cinco niveles de concentraciones a estudiar, se muestran en la Tabla 1.

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Tabla 1.Cantidad de sólidos no grasos, azúcar y leche de soya según concentración de mezcla

Posteriormente, se procedió a mezclar en un erlenmeyer de 500 mL la leche bovina, con la leche de soya preparada anteriormente, en condiciones estériles y según las proporciones indicadas en la Tabla 1, para cumplir con las cinco concentraciones establecidas.

Con el fin de lograr mezclas más homogéneas, la mezcla fue llevada a agitación por 15 minutos en el agitador automático Orbital ShakerIncubator, marca MRC, así como a un sonicadorBranson 2510, por 15 minutos más. Finalmente, se dispusieron 5 erlenmeyers de 100 mL para cada uno de los niveles de tiempo de incubación (0, 2, 3, 5, 7 h) con la mezcla de leches, y se le adicionó 1% en volumen del inóculo. Estos erlenmeyers se llevaron a una incubadora marca Lab-Line Instruments INC. a 45°C por el tiempo designado para cada uno. Al ser retirados, se les tomó el pH con un pH-metro marca Mettler Toledo y se refrigeraron a 4°C.

2.4 Distribución de tamaño de partícula de las muestras

En primer lugar, para la distribución de tamaño de partículas, se utilizó la técnica de difracción de láser, con un equipo Mastersizer 3000 –Malvern Instruments, cuyos módulos empleados corresponden al Hydro EV y al AERO S, para líquidos y sólidos, respectivamente. Dado que se requiere cierta obscuricidad (alrededor de 10%), las muestras líquidas fueron diluidas en 500 mL de agua desionizada para sus respectivos análisis.

2.5 Potencial Z

En cuanto al potencial Z, las leches fueron tratadas con ácido fosfórico para disminuir el pH hasta valores de 7, 6, 5.5, 5, 4.5 y 4, con el fin de obtener una curva que permitiera hallar el punto isoeléctrico de cada una de las matrices mencionadas. Cada una de las muestras se analizó en el equipo Zetasizer Nano ZS - Malvern Instruments, a una temperatura de 20°C.

2.6 Microscopía electrónica de barrido y óptica

Para las pruebas de las estructuras y la morfología de la superficie, se trataron las muestras puras con un microscopio electrónico de barrido (SEM -Phenom G2TM_{Pro), a un aumento de 2000x. Para esta prueba fue}

necesario analizar una gota de la muestra congelada a -5°C, con el fin de evitar un cambio de fase instantáneo, a causa del haz de electrones.Así mismo, se utilizó un microscopio óptico, marca MoticType 102 M, donde se analizan las muestras en fase líquida, con un aumento de 1000x.

Concentración de Mezcla

(p/p)

SNG Mezcla sin azúcar

(p/p)

Cantidad azúcar en

100 mL Leche de soya (g)

Volumen de Leche de soya en

500 mL de mezcla (mL)

Cantidad de azúcar

en mezcla (g)

100% Leche bovina 8,02% 4,33 0 0

80% Leche bovina 7,15% 4,33 100 4,33

50% Leche bovina 5,85% 4,33 250 10,83

20% Leche bovina 4,55% 4,33 400 17,32

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2.7 Caracterización reológica de diferentes matrices lácteas

Con el fin de obtener una caracterización de los fluidos de las muestras, se realizó una prueba estacionaria con el reómetro de esfuerzo impuesto DHR 1 – TA Instruments, a una velocidad variable entre 1 s-1_{y 500 s}-1_{. La}

geometría empleada de la base fue un cilindro concéntrico, con un control peltier, para mantener una temperatura constante de 20°C. La base fue configurada con un rotor DIN de 14 mm de radio y 42 mm de alto. 2.8 Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo

Para los análisis de espectroscopía de infrarrojo cercanose trataron las muestras a temperatura ambiente (20°C-23°C), en un equipo FOSS SmartProbeTMAnalyzer5000, sobre la región espectral entre1100-2500nm, con intervalos de 2 nm. Para cada medición se utilizó un volumen de aproximadamente 10mL de muestra en una cubeta de vidrio. Los instrumentos fueron lavados con jabón, desengrasante y alcohol, luego fueron enjuagados con agua destilada y finalmente se secaron con aire entre cada prueba. Los datos de los espectros fueron reportados en modo de absorbancia, con el software VISION 3.50 service pack 6.

2.9 Estudio electroforético de diferentes matrices lácteas

Para la realización de las electroforesis de gel a base de poliacrilamida (SDS – PAGE), se empleó un equipo completo de Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA. Las muestras fueron analizadas según el protocolo recuperado de http://mach7.bluehill.com/proteinc/tutorial/sdspage.html

La electroforesis se llevó a cabo para una concentración de 12% de acrilamida para el gel de corrido y 4% para el gel de almacenamiento. Las bandas individuales de las diferentes proteínas fueron observadas a través de las mismas condiciones para todas las mezclas, diluyendo la muestra en agua desionizada, en una relación 1:6, en volumen total, para mayor definición sobre el gel. A su vez, las muestras diluidas se mezclaron con el buffer de muestra, en una relación 1:4 (buffer-muestra) y fueron sembradas, junto al marcador de pesos moleculares, cuyo rango de pesos se encuentra entre 6 y 200 kDa.

Tras sembrar un volumen de 12 μL en cada pozo, se corrió la prueba a 110 V, por 2 horas. Posteriormente, se tiñeron los geles con azul de Comassieal 0.2% y se decoloraron tres veces, a partir de una solución de metanol, ácido acético y agua desionizada.

3. Resultados y discusión

3.1 Prueba de solubilidad de la proteína de soya

La Figura 1 muestra la variación del tamaño de partícula, en cuanto los diámetros promedio, D[3,2] y D[4,3]. En ambos casos, los valores tienden a disminuir y éstos alcanzan valores cercanos a 0 μm a partir de los 30 minutos, lo cual demuestra que la proteína se ha hidratado y disuelto en su gran mayoría para dicho momento.

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agua. Cabe resaltar que la variación en los porcentajes de sólidos totales no presenta una gran variación, teniendo un rango de valores entre 4 y 5%.

Figura 1.Resultados de tamaño de partícula (a) y sólidos totales (b) en prueba de solubilidad de proteína de soya

3.2 Seguimiento del pH

En primer lugar, se realizaron las mediciones de pH para las diferentes concentraciones, para cada tiempo, cuyos resultados se muestran en Figura 2.

Figura 2.Comportamiento del pH de las muestras a cada tiempo

En la Figura 2. se observa que el pH tiende a disminuir conforme el tiempo aumenta, para todas las concentraciones. Sin embargo, al revisar las barras de error, se evidencia que la mayoría de éstas se alcanzan a superponer, con lo cual es posible afirmar que la concentración no tiene un efecto significativo en la variación del pH, a excepción de la concentración 0% Leche bovina, que se aleja de las demás concentraciones con el mayor pH inicial. En consecuencia, la soya presenta la fermentación más lenta, si se comparan los valores

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

0 1 2 3 4 5 6 7

pH Tiempo (h) 100% Alpina 80% Alpina 50% Alpina 20% Alpina 0% Alpina 4,200% 4,400% 4,600% 4,800% 5,000% 5,200%

0 20 40 60

Po rc en ta je d e ST Tiempo (min) (b) 0 20 40 60 80 100 120 140

0 15 30 45 60

Ta m añ o d e pa rt íc ul a (u m ) Tiempo (min) D[3,2] D[4,3] (a)

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Este comportamiento negativo responde a la actividad bacteriana, la cual a su vez se desarrolla de acuerdo a la curva de crecimiento de microorganismos. De esta forma, entre las primeras 2-3 horas se evidencia una disminución lenta del pH, correspondiente a una fase de adaptación por parte de las bacterias. A partir de la tercera hora, las bacterias empiezan a crecer exponencialmente, con lo que la cantidad de ácido láctico aumenta y, de esta forma, los valores de pH disminuyen rápidamente.

3.3Potencial Z de las diferentes leches

La prueba del potencial Z tiene como finalidad estudiar la estabilidad de la muestra a estudiar, en cuanto a la repulsión de las partículas presentes en la mezcla, teniendo en cuenta que a mayor valor absoluto de potencial, la estabilidad será mayor. Para el caso de las proteínas, el pH en el cual el potencial Z y en consecuencia la carga neta de las proteínas es igual a cero, se denomina punto isoeléctrico. Es en este punto donde se presenta la mayor agregación y decantación de las proteínas. (Zapata, 2011)

-20 -15 -10 -5 0 5 10 15

4 5 6 7

Po te nc ia l Z (m V) pH (a) -20 -15 -10 -5 0 5 10 15

4 5 6 7

Po te nc ia l Z (m V) pH (b) 0 5 10

1 10 100 1000

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (c) 0 5 10 15 20

0,1 1 10 100

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (d)

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Al analizar la leche de soya a diferentes pHs (Figura 3 (a)), se observa, en primer lugar, que el potencial Z es cero (punto isoeléctrico, pI) a un pH aproximadamente de 4.8, según la regresión. Es decir, que la mayor agregación y en consecuencia, los mayores tamaños de partícula se deben situar alrededor de este valor, lo cual se confirma en la distribución de tamaño de partícula, donde los mayores tamaños se ubican en un pH entre 4.5 y 5 (Figura 3 (c)). Este valor es similar con lo reportado en la literatura para las proteínas más importantes de la soya (Glicinina: pI=4.64; β-Conglicinina: pI=4.9) (Amigo, 2007). Adicionalmente, es importante señalar que la muestra con mayor estabilidad es la de pH=7, ya que presenta un valor de potencial cercano a -20 mV. Lo anterior podría contribuir a la presencia y formación de agregados fuertes en las muestras de la hora 0 para las mezclas con soya, tal como se verá a continuación.

Por otro lado, la leche bovina presenta un punto isoeléctrico alrededor de 4.4 (Figura 3 (b)), el cual se encuentra entre los mayores tamaños de partícula, al observar la distribución correspondiente (Figura 3 (d)). Este valor se aproxima a los puntos isoeléctricos que se encuentran en la literatura, siendo 4.6, 4.2-4.5 y 5.2, para las caseínas, α-Lactoalbúminas y β-Lactoglobulinas, respectivamente (Alais, 2003). En cuanto a la estabilidad, la muestra con un pH=7 se aproxima levemente a la estabilidad, sin embargo, no alcanza a llegar a valores donde ésta sería mayor, con lo cual es posible afirmar que la leche de soya es más estable que la leche bovina.

3.4 Distribución tamaño de partícula

En relación con el estudio del tamaño de partícula (Figura 4), se evidencia que, para los cinco niveles de concentración, el tamaño de partícula aumenta respecto al tiempo de fermentación, lo que obedece a la formación de agregados a causa de la disminución del pH hasta valores cercanos al punto isoeléctrico de las proteínas tanto de la leche bovina, como de la soya, cercanos al pH 4.6, tal como se mencionó anteriormente.Sin embargo, es importante notar que a medida que aumenta la cantidad de soya en la mezcla, para el tiempo de 0 horas se presentan poblaciones de tamaño de partícula tanto menores (0.1 – 2 μm), como mayores (10 – 100 μm). Lo anterior responde a agregados preliminares a la fermentación, presentes en la mezcla con tamaños de partícula semejantes a los correspondientes a la proteína de la soya sólida. Ésta presenta una distribución similar a las mezclas de 3 horas en adelante, donde las distribuciones comprenden los mayores tamaños de partícula ( D [3,2]>10 μm; D[4,3]> 50 μm). Teniendo en cuenta que la leche de soya se somete a un proceso deautoclave a 121°C, se lleva a agitación y sonicación, dichos procedimientos logran destruir una proporción de tales agregados, dando lugar a la presencia de una población de tamaños menores. En estudios preliminares, se afirma que la desnaturalización de las proteínas por calor es usualmente un requisito para la formación de geles de soya (Renkema, 2003). En ese sentido, es posible afirmar que el tratamiento térmico favorece la presencia de la población de agregados con tamaños de partícula grande, los cuales al disminuir la temperatura se mantienen.

Al comparar los valores de pH, así como los tamaños de partícula en las muestras de 7 horas (Figura 5), es posible observar que no se define una tendencia clara para ninguno de los dos casos. No obstante, si se tienen en cuenta los diámetros promedio tanto de la muestra 100% leche bovina y 0% leche bovina, es claro que el yogur a partir de leche bovina tiene un tamaño de partícula de aproximadamente la mitad que el yogur a base de 100% leche de soya. Lo anterior está estrechamente relacionado con el pH final (Figura 2.), que corresponde para la muestra 100% leche de soya a 4.72, valor que se encuentra muy cercano al punto isoeléctrico de las

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proteínas de la soya, mientras el pH final para la muestra de 100% leche bovina ha sobrepasado el pH isoeléctrico y la agregación es ciertamente menor, a medida que se aleja de dicho punto.

0 5 10 15 20

0,1 1 10 100

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (a) 0 5 10 15 20

0,1 1 10 100

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (b) 0 5 10 15 20

0,1 1 10 100

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (c) 0 5 10 15 20

0,1 1 10 100

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (d) 0 5 10 15 20

0,1 1 10 100 1000

Res

ul

ta

do

s %

Tamaño de partícula (um) (e)

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Figura 5.Tamaño de partícula para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación

De esta forma, si bien las muestras de los extremos presentan un comportamiento acorde con la distribución de tamaño de partícula y los valores finales de pH, el comportamiento de las concentraciones intermedias no puede ser explicado a partir de estas medidas, por lo cual se recurre a una explicación desde el punto de vista morfológico, donde las estructuras de ambos tipos de proteínas juegan un papel importante y podrían contribuir a una organización aleatoria de las matrices, respecto a sus estructuras, para las muestras con mezcla de ambas leches.

3.5Microscopía electrónica de barrido y óptica

SEM

El estudio morfológico de las muestras para cada concentración demuestra la formación de agregados en relación con el tiempo de fermentación, tal como se observa en la Figura 6. De acuerdo a lo anterior, es posible confirmar los resultados presentados en el Mastersizer para cada uno de los niveles de concentración.

Ahora bien, si se observa formación de agregados no sólo a lo largo del tiempo de fermentación para cada concentración, sino a lo largo de las concentraciones para las 7 horas, se encuentra una gran diferencia morfológica de agregados. Para las muestras donde prevalece la leche bovina, las estructuras se tornan más granulosas y porosas, mientras que las muestras con mayor cantidad de soya presentan una estructura similar a una red o malla, con una apariencia más tupida. Esta estructura parece contar con una mayor resistencia ante la ruptura, siendo plausible en el análisis del Mastersizer, donde la agitación pretende romper la macroestructura de leche de soya y las partículas que se analizan corresponden a porciones de la malla fuerte que se ha formado.

La morfología de las matrices estudiadas está estrechamente vinculada, en el caso de la leche bovina, con la presencia del aminoácido prolina, lo cual implica que las caseínas carezcan de estructuras secundarias y terciarias estables (Holt, 1993).

0 10 20 30 40 50 60 70

100% 80% 50% 20% 0%

Di

ám

et

ro

(u

m

)

Porcentaje Leche bovina

D [3,2] D [4,3]

(15)

Figura 6.Imágenes de microscopio electrónico de barrido con aumento 2000x. Ancho de imagen: 131 μm. (a) 100% (b) 80% (c)50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina

Lo anterior podría explicar que la estructura de dicha proteína presente una conformación más abierta. En cuanto a la leche de soya, es importante mencionar que en las proteínas presentes existen enlaces covalentes (puentes disulfuro) responsables, en mayor medida, de la estabilidad, el ensamble y el fortalecimiento de los

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)

(b)

(c)

(d)

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bovinaresulta más curva. En ese orden de ideas, la estructura curva de la leche bovina se romperá por plegamiento, mientras la plana lo hará por estiramiento, demandando una mayor cantidad de energía y, en consecuencia, la estructura será más resistente. Cabe anotar que dichas afirmaciones se presentan como posibles razonamientos, a partir de estudios semejantes aplicados a ambos tipos de leches.

Microscopio Óptico

Siguiendo con el análisis morfológico llevado a cabo con el microscopio electrónico de barrido,se muestran los resultados obtenidos con el microscopio óptico para las diferentes mezclas.

Figura 7.Imágenes de microscopio óptico paramezclas de (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina. Aumento de 1000x. Barra de 10µm.

Los resultados obtenidos, muestran la agregación para cada una de las mezclas. En tiempo igual a 0 se observan los cultivos de bacterias y una evolución en el tiempo. Para un tiempo de fermentación igual a 7 horas, se

(b)

(a)

(d)

(e)

(c)

(17)

3.6 Caracterización reológica

Por medio de una prueba de flujo estacionaria (Viscosidad vs. Velocidad de corte) para las diferentes mezclas en distintos tiempos de fermentación, fue posible observar una evolución en la viscosidad del fluido: viscosidades bajas para horas iniciales, y valores de viscosidad altos para horas finales de fermentación, evidenciando así la agregaciónde proteínas (Figura 8). Se observa una agregación a partir de la dos horas para 100% de leche bovina, mientras que para 0% la agregación se presenta desde las 5 horas.

Además, existe una diferencia significativa en la existencia de tixotropía en la muestra de 100% leche bovina y 0% leche bovina a las 7 horas de fermentación. La primera presenta tixotropía, mientras que la segunda no. Este valor fue hallado por medio del área entre las curvas de subida y de bajada de un reograma de Esfuerzo vs Velocidad de corte, los resultados se muestran en la Figura 9. Dicho comportamiento se debe a que la estructura formada en la muestra de 0% es tan fuerte que no puede ser destruida por la velocidad de cortea la que fue sometida. Una posible explicación, se basa en que se tiene una estructura más fuerte por la gran cantidad de enlaces disulfuro existentes en la leche de soya, responsables del fortalecimiento de los geles formadosy además de la existencia de una curvatura tal, que su deformación se presenta por estiramiento.

Por otro lado, al comparar los valores de la viscosidad para la fermentación de todas las mezclas en un tiempo de 7 horas, se observa un comportamiento creciente a medida que aumenta la cantidad de soya en dichas mezclas(Figura10); esta tendenciaestá fuertemente ligada a la relación del peso molecular de las proteínas de un polímero con el incremento de su viscosidad y de la resistencia a la ruptura de agregados. De esta forma, al tener la proteína de soya pesos moleculares mayores a los de la proteína de la leche bovina (caseínas mayoritariamente), la viscosidad será mayor para mezclas con más soya.

(18)

Figura 8. Curvas de flujo: Viscosidad vs. Velocidad de corte para mezclas de (a) 100% (b) 80% (c)50% (d) 20% (e) 0% Leche

0,001 0,01 0,1 1

1 10 100

Vi sc os id ad (Pa *S )

Velocidad de corte (1/s)

0,001 0,01 0,1 1

1 10 100

0,001 0,01 0,1 1 10 1 Vi sc os id ad (Pa *S )

100 1000 Velocidad de corte (1/s)

(a)

0,001 0,01 0,1 1

1 10 100

(c) 0,001 0,01 0,1 1 10

1 10 100

1 10 100 1000

(e)

(b)

100 1000

(19)

Figura9. Viscosidad para diferentes mezclas de leche bovina y leche de soya a las 7 horas de fermentación

Figura 10.Tixotropía de las mezclas de leche bovina a las 7 horas de fermentación

3.7 Caracterización espectral en la región cercana al infrarrojo

La espectroscopia infrarroja fue empleada para todas las mezclas a diferentes tiempos de fermentación en un rango de 1100 a 2500 nm. Las bandas de absorbancia observadas se presentaron a una longitud de onda de 1150 nm correspondiente al enlace O-H, asociado con agua, 1500 y 1800 nm, correspondientes al enlace C-H, asociado con aminoácidos.

Los resultados permiten observaruna evolución en el tiempo para cada mezcla, por lo que se evidencia el fenómeno de agregación en todas éstas (Figura 11). Al igual que lo reportado mediante el análisis reológico, se observa una agregación a partir de las dos horas para la muestra de 100% de leche bovina, mientras que para la de 0%, se presenta desde las 5 horas.

En la Figura 11 (f), se muestra la comparación para un tiempo de fermentación de 7 horas entre las diferentes mezclas, se observa el mismo comportamiento y un solapamiento entre éstas, indicando que no hay una diferencia significativa y que las estructuras formadas en las mezclas no pueden ser explicadas por formación o

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

100% 80% 50% 20% 0%

Vi

sc

os

id

ad

(P

a*

s)

% Leche Bovina

Velocidad de corte: 1 s^(-1) Velocidad de corte: 500 s^(-1)

0 1000 2000 3000 4000 5000

100% 80% 50% 20% 0%

Tx

ot

ro

pí

a

(P

a*

s-1)

(20)

Figura 11.NIR de mezclas (a) 100% (b) 80% (c) 50% (d) 20% (e) 0% Leche bovina, a diferentes horas de fermentación y (f)de todas las mezclas a las 7 horas de fermentación

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

Longitud de onda (nm)

0 hrs 2 hrs 3 hrs 5 hrs 7 hrs

(a)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

(b)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

(c)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

0 hrs 2 hrs 3 hrs 5 hrs 7 hrs 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

(e)

1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2

1000 1500 2000 2500

Ab

so

rb

an

cia

100% leche bovina 80% leche bovina 50% leche bovina 20% leche bovina 0% leche bovina

(f)

(d)

(21)

3.8 Estudio electroforético

Los resultados para la electroforesis permitieron identificar las proteínas existentes en cada una de las mezclas, sin embargo, no existen diferencias a través del tiempo para cada una de éstas, lo que indica que las proteínas se mantienen a lo largo de la fermentación. Además de lo anterior, se pudo corroborar que las proteínas presentes en la soya tienen un peso molecular mayor a las presentes en la leche bovina. Lasproteínas de soya más abundantes son las globulinas, glicinina (11S) y conglicinina (7S). Por otro lado, la proteína que abunda en la leche bovina es la caseína (más de 80%).

(a)

(b)

(c)

(d)

(22)

Para estudios posteriores se sugiere realizar este tipo de análisis para muestras centrifugadas, con lo cual se podría evidenciar el tipo de proteínas que abundan en cada una de las fases separadas, obteniendo un análisis más profundo de la presencia de proteínas en agregados solubles y no solubles.

4. Conclusiones

El presente estudio demostró que existe un efecto significativo de la proteína de soya en la caracterización macroscópica, microscópica y molecular de las mezclas de leche bovina y leche de soya. Lo anterior responde a las diferentes formas de agregación de cada una de las matrices, la cual se presenta por las fermentaciones que llevan las muestras hasta pHs cercanos a los puntos isoeléctricos de las proteínas.

La agregación de las proteínas, por su parte, influye en la morfología final de las muestras, presentando gránulos y mallas, en la lecha bovina y de soya, respectivamente, lo cual a su vez tiene un efecto significativo en la reología y el tamaño de partícula final de las muestras. En consecuencia, las mezclas con mayor cantidad de soya evidencian un comportamiento más viscoso mayor, como respuesta a una estructura más fuerte.

La espectroscopia infrarroja revela el mismo comportamiento y los mismos picos de absorción para todas las muestras al cabo de las 7 horas de fermentación, por lo cual los enlaces C-H y O-H presentes en éstas, no pueden ser usados para explicar las estructuras de las proteínas.

Por medio de la electroforesis, fue posible identificar las proteínas existentes en cada mezcla, sin embargo, no se observa un cambio de agregación en el tiempo.

En este sentido, el presente trabajo sugiere que la agregación individual de las proteínas influye, en gran medida, sobre la agregación de las muestras de ambas leches. No obstante, para trabajos futuros se propone realizar un análisis molecular más profundo de las mezclas, con el fin de evaluar la existencia de interacciones entre ambas proteínas y, así entender más detalladamente si éstas tienen un papel importante sobre la estructura final.

Referenciasbibliográficas

Alais C. (2003) Ciencia de la leche: principios de técnica lechera. Cuarta Edición. Editorial Reverté. España.

Amigo, M. (2007) Efecto de la desglicosilación enzimática en la antigenicidad del alérgeno β-conglicinina (7s globulina) de soja. Facultad de ciencias de la universidad autónoma de Madrid. Departamento de Química Física Aplicada. . Recuperado en línea el 8 de junio de 2013 en: http://digital.csic.es/bitstream/10261/21710/1/Amigo-Benavent%20DEA%20sep07.pdf

Bakirci, I., &Kavaz, A. (2008). An investigation of some properties of banana yogurts made with commercial ABT-2 starter culture during storage. International Journal of Dairy Technology.

Durand, A., Franks, G.V. &Hosken R.W. (2002) Particle sizes and stability of UHT bovine, cereal and grain milks. Callaghan, Australia. FoodHydrocolloids 17 (2003) 671–678

(23)

Duarte-Teles, C., &Hickmann-Flores, S. (2007). The influence of additives on the rheological and sensory properties of nonfat yogurt.International Journal of Dairy Technology.

Ferragut, V.(2009).Physical characteristics during storage of soy yogurt made from ultra-highpressure homogenized soymilk. Journal of Food Engineering.

Holt C. et al. (1993).Caseins as RheomorphicProteins :Interpretation of Primary and Secondary Structures of the as1-, β - and κ-caseins. J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1993, 89(15), 2683-2692

Lee, S.-Y.; Morr, C. V.; Seo, A. Comparison of milk-based andsoy-based yogurt. J. Food Sci. 1990, 55, 532-536 Renkema J. (2003). Relations between rheological properties and network structure of soy protein gels.Wageningen, The Netherlands. FoodHydrocolloids18 (2004) 39–47.

Renkema J. (2001). Formation, structure and rheological properties of soy protein gels. University of Wageningen, The Netherlands.

Rinaldoni, Ana. Campderros, M. (2012).Physico-chemical and sensory properties of yogurt from ultrafiltreted soy milkconcentrate added with inulin. Instituto de Investigación en Tecnología Química (INTEQUI), Argentina. Roesch, R. Corredig, A. (2005). Heat-Induced Soy-Whey Proteins Interactions: Formation ofSolubleand Insoluble Protein Complexes. Department of Food Science, University of Guelph, Guelph, Canada.Journal of Agricultural and Food Chemistry.

Vasbinder, A. (2002) Quantification of heat-induced casein / whey protein interactions in milk and its relation to gelation kinetics.NIZO Food Research.

Zapata, C. (2011) Determinación de las propiedades físico-químicas y funcionales del aislado e hidrolizado enzimático de la proteína de soya a escala piloto, para aplicación en alimentos. Escuela Politécnica Nacional. Quito. Recuperado en línea el 8 de junio de 2013 en: http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/4300/1/CD-3502.pdf