Doctorado en Ciencia Animal
Tesis
Interacción entre Antibiótico, Prebiótico y Micotoxina
sobre la Salud Intestinal y Performance Productiva en
Lechones Post Destete
Por: Guadalupe Martínez
Facultad de Ciencias Veterinarias
U.N.C.P.B.A.
Doctorado en Ciencia Animal
Tesis
Interacción entre Antibiótico, Prebiótico y Micotoxina sobre la
Salud Intestinal y Performance Productiva en Lechones Post
Destete
Por: Guadalupe Martínez
Directora: Dra. María Ofelia Tapia
Codirector: Dr. Alejandro Luis Soraci
Facultad de Ciencias Veterinarias
U.N.C.P.B.A.
Miembros del Jurado:
Dra. Adriana B. Pérez Chaia
I
Dedicatoria
A mi hermosa familia que siempre me acompaña y alegra mi vida….
A mis padres, Ester y Juan
A mis hermanas, Gabriela y Valeria
A mis sobrinos, a mi cuñado Guillermo
A mi pareja Lucas y a mi hija Maitena
II
Agradecimientos
A mis directores, Dra. Ofelia Tapia y Dr. Alejandro Soraci les agradezco por ser parte de su grupo de trabajo desde mi graduación en la Carrera de Veterinarias, por dirigirme en varios proyectos de mis becas, por permitirme ingresar en la docencia universitaria y por motivar el trabajo en equipo, dentro del cual siempre me trataron como un par. Quiero agradecerles por transmitir, desde sus ejemplos, la pasión por la investigación y por dirigirme y co-dirigirme en mi tesis doctoral. Por todo lo descripto, es realmente un honor poder formarme con ustedes.
A mis compañeras de trabajo, María Belén Riccio, María Belén Fernández y Denisa Peréz Gaudio les doy gracias por compartir momentos de trabajo y de vida muy importantes. A Belén Riccio, le agradezco por ayudarme en los ensayos in vivo, por estar siempre presente para cuando la necesité y por regalarme una gran enseñanza: “para que las cosas salgan bien se requiere que nuestro pensamiento sea siempre positivo”. A Belén Fernández Paggi le agradezco por haberme enseñado sobre la producción porcina y por su excelente colaboración durante los ensayos in vivo. A Denisa Peréz Gaudio le agradezco por su importante colaboración en mis ensayos in vitro y ex vivo, y por sobre todo por ser mi compañera de estudio desde los comienzos de la carrera universitaria y por seguir siéndolo en nuestro camino como investigadoras y docentes de la casa. A Susana Diéguez, le doy las gracias por su predisposición en el uso de los equipos del laboratorio, todas las veces que fueron necesarias. A Laura Denzoin Vulcano le agradezco por su ayuda incondicional en la observación de cortes al microscopio óptico. A Julieta Decundo por su aporte en esta tesis. A Fabián Amanto le agradezco por permitirme realizar los ensayos en la granja comercial y por su enseñanza sobre el manejo de la producción, al igual que a todo su personal, y especialmente a Lucas Peralta, quienes fueron de gran ayuda en los ensayos in vivo. A Edgardo Rodríguez le doy gracias por su gran ayuda en el análisis estadístico y por brindarme el tiempo necesario para aclarar mis dudas estadísticas. A Sandra Pérez y Guillermo Arroyo les agradezco por la gran ayuda en los ensayos en cultivos celulares. A Nora Lía Padola y Analía Echeverría les doy las gracias por enseñarme y ayudarme en los cultivos bacterianos.
III
RESUMEN
El destete es considerado uno de los períodos más críticos de la producción porcina debido a su impacto negativo sobre la salud y performance productiva del lechón, principalmente en la primera semana post destete. En esta etapa, el lechón queda expuesto a factores fisiológicos, inmunológicos, microbiológicos, sociales, ambientales y nutricionales que conducen al conocido estrés post destete. En relación a los factores asociados a la alimentación, la presencia de compuestos contaminantes como las micotoxinas influye negativamente en el rendimiento productivo. El deoxinivalenol (DON) es una micotoxina producida por especies del género Fusarium y el cerdo representa la especie más susceptible a los efectos tóxicos que ocasiona. Existe escasa información de los posibles efectos subclínicos asociados a la ingestión de concentraciones bajas de DON, en particular en etapas de alto riesgo para el lechón como el destete.
Con el fin de reducir los efectos indeseables que se presentan en la etapa de destete y favorecer los rendimientos productivos se utilizan diferentes aditivos tales como los antibióticos y prebióticos. Los antibióticos son utilizados como aditivos promotores del crecimiento o como agentes terapéuticos, metafilácticos y profilácticos. Entre los antimicrobianos más utilizados se encuentra la fosfomicina (FOS), un antibiótico bactericida de amplio espectro y escasa toxicidad, empleada frecuentemente como una alternativa clínica para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistentes en la etapa post destete.
Los prebióticos son ingredientes alimentarios indigestibles que producen un efecto benéfico en el animal al estimular el crecimiento selectivo y la actividad metabólica de bacterias del colon. A este grupo pertenece la inulina, polímero oligomérico de fructosa de almacenamiento encontrado en muchas plantas, entre ellas en Cynara scolymus (variedad de alcachofa).
El objetivo general de la presente tesis fue evaluar el efecto de la interacción de un antibiótico, prebiótico y micotoxina sobre la salud intestinal y performance productiva en lechones post destete. El trabajo de tesis presentó cinco objetivos específicos:
I. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en
líneas de cultivos celulares. Se utilizó la línea celular HEp-2 como modelo celular del sistema respiratorio para evaluar la penetración del antibiótico FOS. Las concentraciones de antibiótico intracelular en células HEp-2 incubadas con 130 µg/ml de FOS cálcica, oscilaron entre 0,4 y 1,12 µg/ml con un tmax de 8 h. Cuando las células HEp-2 fueron incubadas con 130 µg/ml FOS y
IV
relación a la Cmax (1,10 µg/ml) y tmax (12 h). Se concluyó que DON no interfirió en la
penetración de FOS a las células HEp-2 y que la concentración de FOS intracelular fue baja permaneciendo en alta proporción como antibiótico extracelular. Por otro lado, se realizaron cultivos de células IPEC-J2 para evaluar la penetración del antibiótico FOS a los enterocitos. El Cmax del antibiótico intracelular en las placas de cultivo incubadas con 580 µg/ml FOS fue de
45,81 µg/ml con un tmax de 4 h. Cuando las células IPEC-J2 fueron incubadas con 580 µg/ml
FOS y 1 µg/ml DON, el Cmax del antibiótico intracelular fue 20,06 µg/ml y su tmax fue de 30 min.
Se concluyó que DON interfirió en la penetración de FOS a los enterocitos. Las concentraciones obtenidas de FOS en el interior de las células superaron los valores establecidos de CIM90 para la
mayoría de los patógenos de importancia en producción porcina.
II. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina
en explantes intestinales. Se desarrolló una técnica de cultivos de explantes de intestino procedentes del yeyuno de cerdos para estudiar la penetración de FOS a los enterocitos en presencia o ausencia de DON. La concentración intracelular de FOS no se modificó en presencia de las concentraciones de DON utilizadas. Se obtuvo un Cmax de 12 µg/ml y un tmax de 2 h. Solo
el 2% del antibiótico se acumuló intracelularmente y, por lo tanto, una alta proporción de FOS permanecería en la luz intestinal. Las concentraciones obtenidas de FOS en el interior de los enterocitos superaron los valores establecidos de CIM90 para la mayoría de los patógenos de
importancia en producción porcina.
Los resultados obtenidos en estudios in vitro y ex vivo sugieren que FOS puede constituir una alternativa apropiada para el tratamiento de infecciones del sistema respiratorio y del tracto intestinal causadas por microorganismos intra y extracelulares en lechones de recría.
III. Estudiar los cambios morfo-fisiológicos a nivel intestinal producidos por la fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones en lechones post
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concentración de ácidos grasos volátiles (AGVs), actividad enzimática (lactasa, sacarasa y maltasa) y cambios histológicos (área absortiva intestinal y células caliciformes).
Los tratamientos con FOS mejoraron la salud intestinal de lechones de destete por los efectos positivos sobre el pH, la microbiota intestinal, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. La FOS decreció el recuento de enterobacterias, la relación enterobacterias/bacterias lácticas (E/BAL) y los valores de pH en ciego y colon (p< 0,05). La adición de FOS en el agua de bebida produjo un aumento significativo en la actividad de maltasa (p< 0,05) en todas las porciones del intestino analizadas mientras que no tuvo efecto sobre las actividades de sacarasa y de lactasa. También, la FOS condujo a una mayor área de superficie de absorción intestinal (AAI) en yeyuno medio (p= 0,0034) y a un incremento en el recuento de células caliciformes en criptas del íleon (p= 0,0159).
Los tratamientos con Cynara scolymus mejoraron la salud intestinal de lechones de destete debido a los efectos positivos sobre la microbiota intestinal, la concentración de AGVs, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. El tratamiento con el prebiótico C. scolymus disminuyó el recuento de enterobacterias y, por lo tanto, la E/BAL en ciego y colon (p< 0,05) e incrementó la concentración de ácido butírico en ciego (p=0,0330). Los tratamientos con extracto de C. scolymus condujeron a una mayor actividad de maltasa en íleon (p= 0,0020) y mayor AAI en yeyuno medio e íleon (p< 0,05). En adición, el prebiótico C. scolymus incrementó el recuento de células caliciformes a valores en vellosidades (p= 0,0159) y criptas (p= 0,0143) de yeyuno medio.
VI
los grupos que no recibieron prebiótico. Estos tipos de interacciones entre aditivos podrían ser explicados por un fenómeno de adsorción del antibiótico a la fibra dietaria que en este caso es el extracto de C. scolymus.
Los tratamientos con DON afectaron la salud intestinal de lechones de destete generando efectos adversos sobre la concentración de AGVs, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. La micotoxina disminuyó la concentración total de AGVs (p= 0,0021), del ácido acético (p= 0,0104) y del ácido butírico (p= 0,0001). Se observó que los animales que recibieron la micotoxina en su dieta y se les adicionó el antibiótico o el prebiótico, el efecto sobre la concentración del ácido propiónico fue significativo (p< 0,05). En ambos casos, la presencia del antibiótico o prebiótico incrementó dicho AGV. Se observó un efecto perjudicial del DON (p< 0,05) sobre la actividad de diferentes disacaridasas (maltasa, sacarasa y lactasa) en distintas porciones del intestino delgado y disminuyó el recuento de células caliciformes presentes en las vellosidades de yeyuno medio (p= 0,0125) y en íleon (p= 0,0336).
IV.Determinar los efectos de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y
sus combinaciones sobre la adherencia bacteriana al mucus intestinal. Se trabajó con el mucus del íleon procedente de los lechones que recibieron distintos tratamientos en la sección experimental II. El resultado se expresó como un porcentaje de bacterias de E. coli adheridas a las glicoproteínas del mucus intestinal y un porcentaje de bacterias no adheridas. A mayor porcentaje de bacterias adheridas, el mucus intestinal es mejor debido a una mayor cantidad de glicoproteínas que sirven de receptores para bacterias patógenas y protegen a las células epiteliales intestinales de la colonización e invasión bacteriana. Se observó un efecto positivo del antibiótico, prebiótico y combinación antibiótico-prebiótico sobre las bacterias adheridas al mucus intestinal (p< 0,05). Con el tratamiento FOS se obtuvo un 83,67% de bacterias adheridas a las glicoproteínas; el extracto de C. scolymus produjo un 72,25% de bacterias adheridas y cuando antibiótico y prebiótico fueron administrados en forma conjunta se observó una adhesión del 81,61%. De manera contraria, la adhesión bacteriana al mucus intestinal en los grupos que no recibieron aditivos fue del 45,71%. En conclusión, los aditivos produjeron un mayor recuento de células caliciformes y, por lo tanto, mayor producción de mucus intestinal que condujo a una mayor adhesión de bacterias frecuentes en la etapa post destete a las glicoproteínas presentes en ese mucus.
V. Estudiar los efectos de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus y su combinación
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efectos benéficos sobre distintos parámetros de la salud intestinal de los lechones, producto de los tratamientos con FOS y/o C. scolymus, repercutieron positivamente en la performance productiva de los animales.
VIII
ABSTRACT
Weaning is considered one of the most critical periods of pig production because of its highly negative impact on the health and productive performance of the piglet, mainly in the first post-weaning week. In this period, the piglet is exposed to physiological, immunological, microbiological, social, environmental and nutritional factors that lead to the post weaning stress. The presence of contaminants, such as mycotoxins, negatively influences the productive performance. Deoxynivalenol (DON) is a mycotoxin produced by Fusarium sp. The pigs are the most susceptible animals to its toxic effects. There is little information on the possible subclinical effects associated to the ingestion of low concentrations of DON, particularly at weaning.
In order to reduce adverse effects in the weaning period and to improve the productive performance, different additives like antibiotics are used as growth promoters or as therapeutic, metaphylactic and prophylactic agents. Fosfomycin (FOS) is one the most widely used of these antimicrobials. It is a broad-spectrum bactericide antibiotic with low toxicity usually employed for the treatment of infections caused by resistant bacteria in the post-weaning stage.
Prebiotics are low digestible food ingredients that produce beneficial effects by stimulation of the selective growth and metabolic activity of caecum bacteria. Among them, inulin is a storage fructose oligomeric polymer found in many plants such as Cynara scolymus (artichoke variety).
The overall goal of this project was to evaluate the effect of antibiotic, prebiotic and mycotoxin interaction on intestinal health and productive performance of post weaning piglets. Five specific aims were proposed:
I. To study the interactive effect of the deoxynivalenol on fosfomycin penetration in
cellular culture lines. In order to evaluate antibiotic penetration in respiratory cells, the HEp-2 cellular line was used as respiratory system cellular model. Intracellular antibiotic concentrations in HEp-2 incubated with 130 µg/ml of calcium FOS, oscillated between 0,4 and 1,12 µg/ml with a tmax of 8 h. When HEp-2 cells were incubated with 130 µg/ml FOS and 1 µg/ml DON, no
significant variations were observed in Cmax (1,10 µg/ml) and tmax (12 h). It is concluded that
DON did not interfere on FOS penetration in the HEp-2 cells and that intracellular FOS concentration was low remaining in a high proportion as extracellular antibiotic. On the other hand, IPEC-J2 cells culture were performed to evaluate antibiotic penetration in enterocytes. Intracellular antibiotic Cmax in culture plates incubated with 580 µg/ml FOS was 45,81 µg/ml
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intracellular antibiotic Cmax was 20,06 µg/ml and its tmax was 30 minutes. We are concluded that
DON interfered in FOS penetration inside enterocytes.
II. To study the interactive effect of deoxynivalenol on fosfomycin penetration in intestinal
explants. In order to study the effect of DON on cell FOS penetration, an intestinal explants cultures technique from pig jejunum was used. Results indicated that FOS intracellular concentration was not modified by DON. A 12 µg/ml Cmax and a 2 h tmax were obtained. Our
study demonstrated that only 2% of the antibiotic was accumulated intracellularly and that a high proportion of FOS would remain in the intestinal lumen.
Results obtained from ex vivo and in vitro studiessuggest that FOS could be an excellent alternative treatment for intestinal tract and respiratory system infection caused by intra and extracellular microorganisms in piglets.
III. To study the intestinal morph-physiological changes produced by fosfomycin, extract
of Cynara scolymus, deoxynivalenol and their combinations in post-weaning piglets. Eight groups of weaning piglets (21 days old) received different treatment during 15 days. Group A: control, group B: Cynara scolymus (300 g/tons feed), group C: FOS (30 mg/kg BW in the drinking water), group D: DON (1 mg/kg in the feed), group E: Cynara scolymus and FOS combination, group F: Cynara scolymus and DON combination, group G: FOS and DON combination and group H: Cynara scolymus, FOS and DON combination. At day 15, three piglets of each group were slaughtered and gastrointestinal tract samples were immediately taken to evaluate pH, bacteriology (enterobacteria and lactic acid bacteria), concentration of volatile fatty acids (VFAs), enzymatic activity (lactase, sucrase and maltase) and histology changes (intestinal absorptive area and goblet cells).
The treatment with FOS improved the intestinal health of weaning piglets due to its beneficial effects on pH, intestinal microbiota, activities of disaccharidases and histology parameters. The FOS decreased enterobacteria count and enterobacteria/ lactic acid bacteria relationship (E/LAB) and pH in caecum and colon (p< 0,05). The addition of FOS in drinking water produced a significant increase in maltase activity (p< 0,05) in all analyzed intestinal regions but it did not have an effect on sucrose and lactase activities. Also, FOS achieved a greater intestinal absorption area (IAA) in medium jejunum (p= 0,0034) and a greater goblet cells count was observed in ileum crypts (p= 0,0159).
X
disaccharidases and histological parameters. The treatment with C. scolymus decreased the enterobacteria population and therefore E/LAB in caecum and colon (p< 0,05) and increased the concentration of butyric acid in caecum (p= 0,0330). The treatments with C. scolymus extract produced a greater activity of maltase in ileum (p= 0,0020) and greater AAI in medium jejunum and ileum (p< 0,05). In addition, C. scolymus increased the goblet cells count in villi (p= 0,0159) and medium jejunum crypts (0,0143).
There was a significant interaction between FOS and C. scolymus on enterobacteria count (p= 0,0004) and therefore in the E/LAB (p= 0,0016). An antagonistic effect between both additives was observed in caecum, that is to say, when the antibiotic and prebiotic were combined, the effect on enterobacteria and E/BAL was less than the one produced as individuals factors. An indifference interaction of this additives was observed in colon, that is to say, the effect on enterobacteria count produced by additives combination was similar to the one observed as individual factors. Regarding IAA, the combination of the antibiotic and the prebiotic showed an interaction of “indifference” type in medium jejunum and “antagonistic” type in ileum (p< 0,05). In medium jejunum, the effect on IAA produced by the combination of additives was similar to the one observed when additives were delivered individually. In ileum, treatments with C. scolymus alone increased the IAA, while in combination with the antibiotic, the effect on IAA was less (p< 0,05). When additives were combined, IAA was similar to groups without prebiotic. These interactions among additives could be explained by adsorption of the antibiotic to dietary fiber that in this case is the extract of C. scolymus.
The treatment with DON affected the intestinal health of weaning piglets generating adverse effects on concentration of VFAs, disaccharidases activities and histological parameters. The mycotoxin decreased VFAs total concentration (p= 0,0021), the acetic acid concentration (p= 0,0104) and the butyric acid concentration (p= 0,0001). The presence of the prebiotic or the antibiotic overcomes the negative effect of DON on propionic acid concentration (p< 0,05). In both cases, antibiotic or prebiotic presence increased this VFA. A DON negative effect (p< 0,05) on different disaccharidases activities (maltase, sucrose and lactase) was observed in different regions of small intestine. Mycotoxin reduced the goblet cells count from medium jejunum (p= 0,0125) and ileum villi (p= 0,0336).
IV. To evaluate the effects of fosfomycin, extract of Cynara scolymus, deoxynivalenol and
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receptor for pathogen bacteria and protected intestinal epithelial cells of bacterial colonization and invasion. The treatment with the FOS, C. scolymus and their combination had a positive effect on the percentage of bacteria adhered to the intestinal mucus (p< 0,05).
Percentages of bacteria adhered to intestinal mucus treated either with FOS, C. scolymus andthe combination of both were 83,67%, 72,75% and 81,61%, respectively, compared with the 45,71% observed in intestinal mucus that received no previous treatment. It can be concluded that additives produced an increase in the goblet cells count and therefore, a greater intestinal mucus production resulting in a higher adherence of E. coli to glycoproteins.
V. To study the effects of fosfomycin, extract of Cynara scolymus and their combination
on productive performance parameters in post-weaning piglets. Treatments with FOS, Cynara scolymus and additives combination improved the feed conversion (p< 0,05).
XII
ABREVIATURAS
AAI: área de absorción intestinal AGVs: ácidos grasos volátiles
APC: aditivos promotores del crecimiento CA: conversión alimentaria
CIM: concentración mínima inhibitoria
CIM90: concentración que inhibe el 90% de las cepas
Cmax: concentración máxima
DON: deoxinivalenol
E/BAL: relación enterobacterias/bacterias lácticas FOS: fosfomicina
GMD: ganancia media diaria H&E: hematoxilina y eosina
HEP-2: línea celular de carcinoma laríngeo humano
HPLC MS/MS: cromatografía líquida de alta resolución, acoplada a un detector de masas HPLC UV: cromatografía líquida de alta resolución, acoplada a un detector ultravioleta
IPEC-J2: línea celular del epitelio columnar de yeyuno medio de un lechón recién nacido libre de calostro
PAS: ácido peryódico Schiff PV: peso vivo
Tmax: tiempo en alcanzar la concentración máxima
UFC: unidades formadoras de colonia
PALABRAS CLAVES
1
ÍNDICE
DEDICATORIA ... I AGRADECIMIENTOS ... II RESUMEN ... III ABSTRACT ... VIII ABREVIATURAS ... XII PALABRAS CLAVES ... XII
Introducción general ... 4
Hipótesis ... 6
Objetivo general ... 6
Objetivos específicos ... 6
CAPÍTULO I: CONOCIMIENTO ACTUAL SOBRE LA TEMÁTICA Importancia de la Producción Porcina en Argentina ... 8
Etapas críticas de la Producción Porcina: Destete ... 10
Uso de Antibióticos en Producción Porcina ... 14
Fosfomicina ... 15
Farmacocinética ... 16
Farmacodinamia ... 17
Toxicidad ... 18
Prohibición del uso de antibióticos como promotores del crecimiento ... 18
Prebióticos ... 20
Compuestos con efecto negativo sobre la nutrición: Micotoxinas ... 21
2
Tricotecenos... 23
Mecanismo de acción y patogenia de la intoxicación ... 24
Absorción, distribución y excreción ... 25
Metabolismo del deoxinivalenol ... 25
Toxicidad ... 26
CAPÍTULO II: SECCIONES EXPERIMENTALES SECCIÓN EXPERIMENTAL I Efecto del deoxinivalenol sobre la penetración celular de fosfomicina en condiciones in vitro y ex vivo Introducción ... 29
ESTUDIO I Objetivo ... 30
Materiales y métodos ... 30
Resultados ... 34
Discusión ... 38
ESTUDIO II Objetivo ... 41
Materiales y métodos ... 41
Resultados ... 44
Discusión ... 45
SECCIÓN EXPERIMENTAL II Efectos sobre parámetros morfo-fisiológicos a nivel intestinal producidos por la fosfomicina, el extracto de Cynara scolymus, el deoxinivalenol y sus combinaciones en lechones post destete Introducción ... 48
3
Resultados ... 60
Discusión ... 72
SECCIÓN EXPERIMENTAL III Efecto de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones sobre la adherencia bacteriana al mucus intestinal en lechones post destete Introducción ... 78
Materiales y métodos ... 79
Resultados ... 81
Discusión ... 83
SECCIÓN EXPERIMENTAL IV Efectos de la fosfomicina, extracto de Cynara scolymus y su combinación sobre parámetros de performance productiva en lechones post destete. Introducción ... 85
Materiales y métodos ... 85
Resultados ... 87
Discusión ... 88
CAPITULO III Conclusiones Generales ... 91
Publicaciones y Comunicaciones surgidas de esta tesis ... 94
4
INTRODUCCIÓN GENERAL
5
intestino del lechón recién destetado, el cual se encuentra en etapa de adaptación a nuevas condiciones alimentarias.
Para obtener buenos rendimientos en producción animal intensiva, en la Argentina se utilizan, entre otros xenobióticos, a los antibióticos, ya sea como aditivos promotores del crecimiento (incorporados al alimento o agua de bebida a dosis subterapéuticas) o como agentes terapéuticos, metafilácticos y profilácticos (Witte, 2001; Carro y Ranilla, 2002; Torres y Zarazaga, 2002). Entre los antimicrobianos más utilizados en las producciones intensivas se encuentra la fosfomicina (FOS), un antibiótico bactericida de amplio espectro y de escasa toxicidad, que actúa interfiriendo en la síntesis de la pared celular microbiana (Pérez et al., 2014). Este antibiótico es empleado frecuentemente como una alternativa clínica para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistente en la etapa post destete (Soraci et al., 2011a).
El uso de antibióticos promotores del crecimiento ha sido prohibido por la Unión Europea a partir del año 2006 (Directiva 1831/2003/CEE) (Mathew, 2004; Dibner y Richards, 2005). La necesidad de limitar el uso de antibióticos como método de control de patógenos en los alimentos y las tendencias mundiales que impulsan al uso de productos naturales en su reemplazo, centran la atención en el potencial de compuestos con propiedades prebióticas con el fin de mejorar la calidad de los alimentos (Vondruskova et al., 2010).
Los prebióticos son compuestos indigestibles por el animal (Gibson y Roberfroid, 1995). A este grupo pertenece la inulina, polímero oligomérico de fructosa de almacenamiento encontrado en muchas plantas tales como cebolla, ajo, alcachofa y achicoria (Williams et al., 2001). La Cynara scolymus (variedad de alcachofa) contiene alrededor del 14% de inulina (Van Loo et al., 1995). Esta sustancia es resistente a las propiedades degradativas del tracto gastrointestinal por lo que alcanza el colon en forma intacta y puede estar disponible como sustrato para la flora del intestino grueso (Rasmussen et al., 1988).
6
asociaciones tanto de antibióticos y prebióticos en condiciones no óptimas de la producción intensiva como puede darse con la presencia de micotoxicosis.
HIPÓTESIS
En base a lo expuesto se propusieron las siguientes hipótesis,
I. La interacción fosfomicina y deoxinivalenol altera la penetración celular del antibiótico en condiciones in vitro – ex vivo.
II. El antibiótico, prebiótico, micotoxina y sus interacciones modifican la salud intestinal y performance productiva en lechones post destete.
OBJETIVO GENERAL
El objetivo general fue evaluar el efecto de la interacción de un antibiótico, prebiótico y micotoxina sobre la salud intestinal y performance productiva en lechones post destete.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en líneas de cultivos celulares.
2. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en explantes intestinales.
3. Estudiar los cambios morfo-fisiológicos a nivel intestinal producidos por fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones en lechones post destete.
4. Determinar los efectos de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones sobre la adherencia bacteriana al mucus intestinal.
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1. Importancia de la Producción Porcina en Argentina
Actualmente, la actividad porcina es considerada una importante producción ganadera en nuestro país, con un potencial favorable para seguir creciendo. En los últimos años, ingresaron nuevos productores a la actividad y existieron importantes mejoras en los establecimientos productivos. A pesar de que los sistemas de producción de pequeña y mediana escala productiva (10 a 200 madres) son los que prevalecen en el país, se ha producido un importante aumento en el número de productores que a partir de 100 madres han confinado parte o totalmente sus animales convirtiéndose en empresas tecnificadas de mayor eficiencia productiva (Senasa, 2015).
Diversos factores como el entorno natural, la disponibilidad de suelos, climas, superficies y agua que posibilitan la cosecha de alimentos indispensables para los cerdos, contribuyen a que el sector porcino argentino se desarrolle plenamente. En adición, existe una genética de primer nivel y la tecnología aplicada a la producción de carne porcina ha mejorado notablemente, acompañada por estrictos controles que permiten certificar la producción como “libre de enfermedades”. Existen buenos parámetros sanitarios, a tal punto que el país se encuentra libre del síndrome respiratorio y reproductivo porcino y del virus de la diarrea epidémica porcina. Estas enfermedades ingresaron y se dispersaron en distintos países del mundo (incluidos países limítrofes) generando un alto impacto económico (Gitep, 2014).
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Figura 1. Distribución geográfica de la producción porcina (Senasa, 2015).
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adecuada para el estándar deseable de una carne de calidad. A principios del siglo XX, gran parte del cerdo se usaba para producir grasa comestible. En la actualidad, la carne magra reemplaza gran parte de esa grasa que ha sido reducida casi en un 30%. Por todas estas características y por ser una importante fuente de proteínas, vitaminas y minerales; se estima que el consumo de carne porcina fresca en Argentina continuará en crecimiento (Mazzei, 2016).
2. Etapas críticas de la Producción Porcina: Destete
El destete impone una importante situación estresante para los lechones y se acompaña por marcados cambios fisiológicos, microbiológicos e inmunológicos del tracto gastrointestinal (Hampson, 1986; Heo et al., 2013). Producto de estos cambios, este período se caracteriza por importantes desórdenes entéricos acompañados de diarreas que afectan la performance productiva de los animales (Lallès et al., 2007a). En nuestros sistemas intensivos de producción porcina, el destete se realiza a los 21 días de edad, momento en el cual los lechones quedan expuestos a múltiples factores que en su conjunto conducen al estrés post destete (figura 2) (Laine et al., 2008). Los destetes precoces y por lo tanto el estrés en esta etapa son frecuentes porque se busca maximizar el rendimiento reproductivo, lo que implica más cerdos destetados por cerda/año (Alle y Touchette, 1999).
Figura 2. Factores que influyen en el estrés post destete.
A continuación se detallan los factores involucrados en la etapa de destete:
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agrupamiento de los lechones genera un incremento de la agresividad y el hociqueo. La presencia de peleas entre lechones tiene como finalidad el restablecimiento de jerarquías y constituye un comportamiento muy evidente durante el destete. La capacidad de los animales en constituir una organización social representa el mecanismo regulador de facilitación social y una actitud defensiva en la utilización del territorio, con el resultado de un ahorro metabólico importante que impacta en la performance del animal (Mota Rojas et al., 2014).
Factor nutricional: los lechones sufren un cambio de dieta pasando de la leche materna altamente digestible y adaptada a las enzimas presentes en el tubo digestivo, a una dieta sólida que no se ajusta a las necesidades del aparato digestivo aún inmaduro (Kelly et al., 1991a; Lallès et al., 2004; Gómez Insuasti et al., 2008). El lechón a esa edad no está preparado fisiológicamente para digerir dietas no lácteas basadas en carbohidratos, proteínas y grasas complejas (Zhang et al., 1997). Por lo tanto, la ingesta de alimento durante la primera semana post destete decrece a un 60-70% en relación al pre destete (Le Dividich y Seve, 2000).
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Por otro lado, la disminución de la actividad de disacaridasas presentes en el borde en cepillo de los enterocitos maduros afecta la digestión de nuevos carbohidratos (Hampson y Kidder, 1986). La atrofia de vellosidades y presencia de enterocitos inmaduros conducen a una menor actividad enzimática. En adición, la actividad de disacaridasas está influenciada por la edad, el estatus fisiológico y el carbohidrato dietario. Al momento del destete, existe una alta actividad de lactasa debido a que el principal azúcar presente en la leche es la lactosa. En la recría, comienza a incrementarse las actividades enzimáticas de maltasa y sacarasa, reduciéndose la actividad de la lactasa (Kelly et al., 1991b; Motohashi et al., 1997). Como consecuencia de la anorexia, la falta de energía, la presencia de enterocitos inmaduros y la falta de actividad de las disacaridasas, existe una menor digestión de los alimentos y una menor superficie de absorción intestinal (Spreeuwenberg et al., 2001; Xu et al., 2003; Hedemann et al., 2003; Awad et al., 2009).
Factor inmunológico: el lechón recién nacido depende de la inmunidad pasiva suministrada a través del calostro y la leche materna. De esta forma, el lechón recibe inmunoglobulinas que se absorben en el tracto intestinal durante las primeras horas de vida y, por otro lado, se les proporciona cierta inmunidad local a través de la inmunoglobulina A (Prunier et al., 2010). Por lo tanto, el lechón no es capaz de producir su propia actividad inmunológica en cantidades adecuadas hasta alcanzar los 28 o 30 días de edad. Por otro lado, el epitelio intestinal cumple dos funciones importantes que son la digestión y absorción de nutrientes, y actuar como una barrera protectora contra agentes nocivos y patógenos. El mucus intestinal es responsable de la lubricación del epitelio y de la protección contra patógenos y proteasas de origen endógeno o bacteriano (Bouhet y Oswald, 2005). Producto de los cambios fisiológicos observados en el destete, existe un menor número de células caliciformes y por lo tanto, menor producción de mucus intestinal (Oswald, 2006). El principal componente del mucus es la mucina, una proteína unida a largas cadenas de carbohidratos que contienen un azúcar neutral de hexosamina (Erdem et al., 2007). En adición a esta pobre respuesta inmunitaria del lechón recién destetado, el estrés social producto de la mezcla, lucha y aglomeración de los animales conduce a una liberación de cortisol en sangre, que deprime aún más la respuesta inmunitaria contra la infección bacteriana.
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peristálticos del tracto intestinal; modifican cuantitativa y cualitativamente la población bacteriana (Blomberg et al., 1995; O´Sullivan et al., 2005).
Cuantitativamente, las poblaciones bacterianas presentes en el estómago y la primera porción del intestino delgado son inferiores a la microbiota del intestino grueso. Esto se debe a que en el intestino delgado existe un rápido tiempo de tránsito intestinal y presencia de mecanismos, como el mucus y la inmunidad local, que dificultan la proliferación y adhesión bacteriana (Hao y Lee, 2004).
En relación a la composición, las bacterias que predominan en el estómago de los lechones son Lactobacillus sp., Streptococcus sp. y Helicobacter sp. En el intestino delgado se facilita el crecimiento de bacterias aeróbicas, anaeróbicas facultativas o estrictamente anaeróbicas que puedan adaptarse a los rápidos movimientos peristálticos, al pH cercano a 6 y a las secreciones biliares. En dicha porción se pueden encontrar bacterias como Lactobacillus sp., Bacillus sp., Clostridium sp. y enterobacterias como la Escherichia coli. El íleon es considerado una zona de transición entre la escasa microbiota de las porciones anteriores y la densa población bacteriana del intestino grueso. En el intestino grueso existe un predominio de bacterias anaeróbicas estrictas, entre las cuales se incluye Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Propionibacterium, Fusobacterium y Clostridium (Heo et al., 2013).
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grueso, donde tendría una mayor competencia por la supervivencia. Otras infecciones que pueden presentarse en esta etapa post destete son las producidas por Brachyspira hyodisenteriae (disentería porcina: DP), Brachyspira pilosicoli (espiroquetosis intestinal porcina: EIP) y la bacteria intracelular Lawsonia intracellularis (enteropatía proliferativa porcina: EPP). En particular la EPP y EIP son causas comunes de diarrea generalmente leve pero crónica, mientras que la salmonelosis y la DP pueden causar una enfermedad grave, con disentería (sangre en heces), síntomas sistémicos y a veces la muerte (Pluske et al., 2003a).
Otras patologías frecuentes en la etapa del destete son los síndromes respiratorios. Los microorganismos involucrados en dichas neumonías son Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchisceptica, Salmonella choleraesuis, Pasteurella multocida y Streptococcus spp.
Factor ambiental: al momento del destete, los lechones se separan de la madre y deben adaptarse a un nuevo ambiente. Este nuevo ambiente debe presentar características apropiadas en cuanto a la temperatura, ventilación, humedad de las instalaciones y luminosidad. La incapacidad de termorregularse en forma adecuada termina frecuentemente en estrés por frío, lo que altera además la motilidad intestinal (Pluske et al., 2003b). También se deben considerar los requerimientos físicos como son la densidad de población, el diseño de las instalaciones y de comederos. En este sentido, si la cantidad de comederos es insuficiente, dificultará el acceso del lechón al alimento y por consiguiente algunos lechones no comerán lo suficiente. De igual forma, el tipo de bebedero y su ubicación pueden dificultar la ingestión de agua requerida por el lechón (Niekamp et al., 2007). En adición, el traslado a un nuevo corral con una higiene deficiente aumenta la exposición antigénica a microbios que residen en las heces frescas o secas facilitando la transmisión fecal-oral (Lecce et al., 1983; Tzipori et al., 1983; Madec et al., 1998). Por ello es indispensable un medio ambiente adecuado para que los animales puedan tener su máximo desempeño productivo, asociado también a un adecuado bienestar animal.
3. Uso de Antibióticos en Producción Porcina
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pueden ser utilizados como aditivos promotores del crecimiento (incorporados al alimento o agua de bebida a dosis subterapéuticas) o como agentes terapéuticos, metafilácticos y profilácticos (Carro y Ranilla, 2002; Torres y Zarazaga, 2002). Cuando se utilizan como aditivos promotores del crecimiento (APC) provocan modificaciones de los procesos digestivos y metabólicos de los animales, que se traducen en aumentos de la eficiencia de utilización de los alimentos y en mejoras significativas de la ganancia de peso. Algunos procesos metabólicos modificados por los antibióticos son la excreción de nitrógeno, la eficiencia de las reacciones de fosforilación en las células y la síntesis proteica. Las modificaciones en el tracto digestivo, suelen ir acompañadas de cambios en la composición de la flora digestiva (disminución de agentes patógenos), reducciones en el ritmo de tránsito de la digesta, aumentos en la absorción de algunos nutrientes (vitaminas) y reducciones en la producción de amoníaco, aminas tóxicas y toxinas (Rosen, 1995). En resumen, la utilización de antibióticos reduce la incidencia de enfermedades, mejora la digestión y utilización de los alimentos, y reduce la cantidad de gases y excretas debido a una menor producción de metano y excreción de nitrógeno y fósforo. En cerdos mejora la tasa de parto, el tamaño de la camada, el peso al nacer y el número de lechones destetados por cerda. También los APC han reducido la incidencia del síndrome mastitis, metritis y agalactia (Quesada Arias, 2009) y han incrementado la ganancia de peso en un 3,3-8% y la eficiencia alimentaria en un 3% (Medina et al., 2008; Suiryanrayna y Ramana, 2015). Otros autores sugieren que el resultado de la utilización de promotores del crecimiento redunda en aumentos diarios de peso en el rango de 1 a 10% y en la obtención de carnes de mejor calidad (Erreclade, 2004). Debido a estos beneficios, la adición de antibióticos es común en el 90% de los alimentos iniciadores de cerdos, en el 75% de los alimentos para crecimiento, en más del 50% de los alimentos de engorde y en el 20% de alimentos para cerdas (Cromwell, 1991).
Fosfomicina
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Farmacocinética: es una molécula semejante al fosfoenolpiruvato, sólo tiene 3 átomos de carbono y carece de nitrógeno (Gobernado, 2003). Presenta una peculiaridad química no observada habitualmente con los compuestos fosforados orgánicos (Gattinger et al., 2006), ya que por un lado, está formada por un grupo epóxido al que se une un grupo fosfórico cargado negativamente y que es determinante para su acción antibacteriana (Baron y Drugeon, 1985), y por otra parte, la unión directa entre el carbono y el fósforo sin puente de oxígeno (figura 3) (Mc Luskey et al., 2005).
Figura 3. Estructura química de fosfomicina
Es una molécula hidrosoluble y con un peso molecular de 138,1, el más bajo de todos los antibióticos luego de la cicloserina. Es estable a pH de 4 a 11, con acción óptima a pH 6,2 (Moritz, 1986; Gutiérrez, 2008). Para la administración oral, la FOS se formula como sal cálcica o trometamina y como sal disódica para la administración endovenosa. La sustitución de los 2 átomos de hidrógeno del radical fosfórico por uno de sodio o uno de calcio da lugar a las sales disódica o cálcica, respectivamente (Escolar Jurado et al., 1998). La sal de trometamol, disponible desde el año 1990 (Gudiol, 2007), se obtiene agregando al radical fosfórico una molécula de trometamina. La trometamina (tris-hidroximetil-aminometano) es un tampón sintético para uso a corto plazo (Gomis et al., 1992) que duplica el peso molecular de FOS, sin contribuir ni interferir con su acción antibacteriana.
Nuestro grupo de trabajo determinó que la formulación de FOS como sal cálcica administrada por vía oral tiene una biodisponibilidad del 20 ± 1,85% (Pérez et al., 2012) y la sal disódica administrada por vía intramuscular tiene una biodisponibilidad del 85,5 ± 9,90% (Soraci et al., 2011a) para lechones post destete.
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de la molécula pasa por bilis, leche y calostro. La molécula no presenta transformación metabólica y es excretada por orina en forma activa (Roussos et al., 2009). La semivida de FOS es de 3-5 h y se elimina mayoritariamente por el riñón (10% a 60%) mediante filtración glomerular y un 20% de la droga se elimina por las heces (Eardley et al., 2006). La vía oral en el tratamiento de infecciones de menor gravedad (vías respiratorias altas) es insegura, ya que depende de la absorción intestinal. No obstante, en las infecciones del tracto digestivo, el antibiótico responde satisfactoriamente porque actúa en la luz intestinal (Gobernado, 2003).
Farmacodinamia: FOS es un fármaco bactericida porque bloquea la biosíntesis de la pared celular bacteriana en su primera etapa de la síntesis del peptidoglicano (Hernández et al., 2009). Impide de manera selectiva e irreversible la acción de la enzima piruvil transferasa, que cataliza la primera reacción en la síntesis de la pared celular al incorporar el fosfoenolpiruvato a la uridin-difosfato-N-acetil glucosamina; reacción que normalmente conduce a la formación de uridin-difosfato N-acetil murámico. La inhibición de la síntesis de peptidoglicanos origina una acumulación de los nucleótidos precursores con la correspondiente inactivación de la bacteria (Gobernado, 2003). La FOS es una droga tiempo dependiente es decir que debe alcanzar concentraciones constantes por encima de la concentración mínima inhibitoria (CIM) para ejercer su efecto bactericida (Toutain et al., 2002). El antibiótico puede ser utilizado como alternativa terapéutica para el tratamiento de infecciones causadas por cepas de E. coli resistentes a los antibióticos como fluorquinolonas y lactámicos. En adición, FOS se recomienda como antibiótico de primera línea en el tratamiento de infecciones del tracto urinario (Ko et al., 2007). Es un antibiótico de amplio espectro (Sauermann et al., 2005) que abarca bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus, Staphylococus epidermidis, meningococos y gonococos), Gram negativas (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas, Serratia, Salmonella, Shigella, Haemophilus, etc) y anaerobias (Clostridium, Actinomyces, Fusobacterium, Peptococcus, etc) (Mata et al., 1977; De Cueto et al., 2006). Presenta actividad in vitro contra Staphylococus aureus, Staphylococus epidermidis, Streptococcus pneumoniae y Enterococcusfaecalis.
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eritromicina, cotrimoxazol y quinolonas (Salhi et al., 1986; Dámaso et al., 1990; Falagas et al., 2008). Además de que la FOS es un agente inhibidor de las bacterias y por lo tanto antiinfeccioso, tiene otras propiedades, como inhibir la adhesión bacteriana a las células epiteliales y penetrar bien en la biopelícula de los exopolisacáridos. A nivel inmunológico, la FOS favorece la fagocitosis, modula la función de linfocitos y neutrófilos (Roussos et al., 2009) y tiene efectos sobre la inflamación aguda a través de las citocinas (Sauermann et al., 2005). Ejerce protección frente a la nefrotoxicidad que causan algunos fármacos como polimixinas, anfotericina B, aminoglucósidos, ciclosporina, vancominica, teicoplanina y cisplatino (Pakhomova et al., 2008).
Toxicidad: los efectos secundarios de la FOS son escasos y de poca gravedad. La dosis letal 50 en ratones (vía intraperitoneal) es de 4 g/kg para la sal sódica y de 20 g/kg para la sal cálcica (Gallego et al., 1974). Produce, ocasionalmente y por vía oral, heces blandas, diarrea, náuseas y vómitos. Se demostró la aparición de una disbacteriosis intestinal en perros que recibieron 2 g/día de FOS repartidos en 4 dosis durante 28 días, los animales se recuperaron totalmente a las dos semanas de finalizado el tratamiento (Dámaso et al., 1990). También se han descripto eosinofilia, trombocitosis y discretas elevaciones de transaminasas. Puede favorecer la aparición de hipernatremia o hipokaliemia en perfusión intravenosa (Baron y Drugeon, 1985). Desde el punto de vista de las alergias, no están descriptas ni anafilaxia ni hipersensibilidad grave, aunque se han comunicado algunos casos de ligero exantema o urticaria que generalmente no obligaron a suspender el tratamiento (Dámaso et al., 1990). Carece de acción teratógena para el conejo y el ratón, considerándose un fármaco seguro en la lactancia y probablemente en la preñez (Prieto, 1986). La administración parenteral por vía intramuscular es dolorosa, por lo que el solvente se prepara con xilocaína. En humanos se ha descrito induración en el sitio de inyección y también se ha visto que por vía endovenosa puede producir flebitis.
4. Prohibición del uso de antibióticos como promotores del crecimiento
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cruzada al antibiótico y/o a la familia de los mismos, agravando así el problema de la diseminación de la resistencia microbiana y los fracasos terapéuticos (Phillips, 1999; Hughes y Heritage, 2004; Dibner y Richards, 2005).
Las primeras autorizaciones de antibióticos como APC incluyeron un total de 13 sustancias (Directiva 70/524/CEE), que continuaron aumentando hasta alcanzar la cifra máxima de 24 sustancias en diciembre de 1998. Esta lista se ha ido reduciendo progresivamente, debido a que el Consejo de la Unión Europea ha prohibido la utilización de la mayoría de ellos. Hasta el 1 de enero de 2006, se permitían 4 antibióticos, 3 de ellos podían utilizarse en cerdos (flavofosfolipol, salinomicina sódica y avilamicina), 2 en aves (flavofosfolipol y avilamicina) y el antibiótico restante (monensina sódica) se permitía sólo en la alimentación del ganado de carne. A partir de la fecha anteriormente mencionada, la Unión Europea dispuso la prohibición total del uso de antibióticos en la alimentación animal (Reglamento 1831/2003), permitiendo sólo el uso de avilamicina en pavos hasta el año 2013 (Henrik et al., 1999; Wierup, 2001; Torres y Zarazaga, 2002; Caswell et al., 2003).
La presión regulatoria por parte de varias agencias y la percepción pública por la necesidad de eliminar antibióticos de la alimentación animal, conducen a la necesidad de buscar alternativas para remplazar los antibióticos y mantener una buena performance de crecimiento en los animales (Bae et al., 1999; Jin et al., 2008). Dicho interés por eliminar el uso de antibióticos en la dieta de los animales se extiende a otras partes del mundo y no sólo a Europa (Lusk et al., 2006).
La prohibición total del uso de antibióticos conduciría a consecuencias adversas en la producción como incremento de la edad al destete y reducción en el número de lechones destetados por cerda/año (Hayes et al., 2002; Stein, 2002, Heo et al., 2013). A su vez dicha prohibición no solo repercutiría sobre la salud de los animales sino que también generaría importantes pérdidas económicas. Bajo este sentido, la propuesta remitida por la Comisión de la Unión Europea hace hincapié en la necesidad de desarrollar alternativas válidas a los APC que cumplan con dos requisitos fundamentales: ser eficaces (ejercer un efecto positivo sobre la producción animal) y seguras (ausencia de riesgo para la salud humana, la salud animal y el medio ambiente).
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5. Prebióticos
Los prebióticos son ingredientes alimentarios ligeramente digestible que producen un efecto benéfico en el consumidor, al estimular el crecimiento selectivo y la actividad metabólica de un número limitado de bacterias en el colon (Gibson et al., 2004).Sus efectos benéficos sobre la salud intestinal son semejantes a los probióticos, pero con la ventaja de superar las restricciones de estos últimos como la inhabilidad para establecerse en el ecosistema intestinal debido a la presencia de barreras durante su tránsito (ácido gástrico y ácido biliar), así como también la falta de viabilidad y estabilidad (Kannan et al., 2005; Marinho et al., 2007). Los carbohidratos del prebiótico no pueden ser digeridos por las enzimas del aparato digestivo; con lo cual están completamente disponibles para ser fermentados por un grupo selectivo que incluye la microbiota benéfica intestinal (Yasuda et al., 2007).
Los prebióticos más utilizados en animales de producción son los oligosacáridos como lactulosa, tri, tetra, penta y hexasacáridos, fructo-oligosacáridos, manano-oligosacáridos, pectinas e inulina (Patterson y Burkholder, 2003). La inulina es un carbohidrato polidisperso constituido por cadenas de 25 a 30 (y hasta 60) moléculas de fructosa con enlaces β (2-1) fructosil-fructosa (Bosscher et al., 2006). La inulina ha sido reportada en más de 36.000 especies de plantas de familias de mono y dicotiledóneas (Carpita et al., 1989; Van Loo et al., 1995), tales como cebolla, ajo, espárragos, banana, alcachofa y achicoria (Yazawa et al., 1978; Niness, 1999).
La Cynara scolymus representa una importante fuente de inulina porque contiene más del 70% del prebiótico así como también azúcares en sus flores, ácidos orgánicos, proteínas y minerales (Van Loo et al., 1995; Vondruskova et al., 2010). Gracias a la configuración β del carbono anomérico C-2 en sus monómeros de fructosa, la inulina resiste la digestión en la parte superior del tubo digestivo. Al no ser absorbida en intestino delgado, es considerada un alimento colónico donde sirve de sustrato para bacterias endógenas que proveen de energía y de sustratos metabólicos al animal (Van Loo et al., 1995; Roberfroid, 2005).
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fermentación de carbohidratos por parte de bacterias benéficas y la transformación de sus productos por otras poblaciones de la microbiota intestinal, se generan AGVs, se incrementan las concentraciones de ácido láctico y disminuyen las concentraciones de amonio (Radecki y Yokohama, 1991; Pie et al., 2007). El butirato constituye un AGV importante por ser una importante fuente energética para los enterocitos (Houdijk et al., 2002; Vondruskova et al., 2010). En adición, el incremento de AGVs y ácido láctico conduce a la disminución del pH que impide el desarrollo de bacterias patógenas (Pelicano et al., 2005). Otros mecanismos como la producción de sustancias antibacterianas como las bacteriocinas producidas por la propia microbiota benéfica controlan la proliferación de los microorganismos patógenos. Otras de las funciones destacadas de los prebióticos es favorecer la salud intestinal, estimular la absorción mineral, la homeostasis lipídica, la inmunidad y la exclusión patógena (Gibson et al., 2004; Roberfroid, 2007; Samanta et al., 2013).
La suplementación dietaria con inulina ha demostrado tener un efecto positivo en el desarrollo de la microbiota intestinal, en la producción de AGVs, sobre la mucosa intestinal al incrementar la altura de vellosidades y en favorecer los parámetros de eficiencia productiva (Crittenden y Playne, 1996; Vondruskova et al., 2010).
La necesidad de eliminar el uso de antibióticos como método de control de patógenos en los alimentos y las tendencias mundiales que impulsan al uso de productos naturales en su reemplazo, centran la atención en el potencial de compuestos como los prebióticos que, por sus cualidades, han demostrado ser agentes promisorios en la producción animal y fundamentalmente, en explotaciones que requieren una alta producción como la industria porcina nacional.
6. Compuestos con efecto negativo sobre la nutrición: Micotoxinas
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Las micotoxinas son sustancias tóxicas resultantes del metabolismo secundario de diversas cepas de hongos filamentosos. Son compuestos orgánicos de bajo peso molecular y no poseen inmunogenicidad (Mallmann et al., 2010). La mayoría de los hongos que causan problemas en plantas y animales pertenecen a la subdivisión Deuteromycotina (Fungi imperfecti) que incluye tres géneros de importancia: Aspergillus, Fusarium y Penicillium. La infección de los cereales y leguminosas por éstos y otros hongos puede resultar en menor producción de granos y semillas, en el deterioro de su calidad nutritiva y en el desarrollo de toxicidad (Bennett y Klich, 2003; Lori et al., 2003). En muchos casos, las micotoxinas son producidas en el campo durante la etapa de crecimiento de la planta, sin embargo, también se producen o se incrementan durante la cosecha, secado y almacenamiento. Los factores más importantes en el proceso de producción de micotoxinas son la disponibilidad de agua y la temperatura.
Los alimentos contaminados afectan la economía de la industria animal por rechazo del alimento, disminución de la tasa de crecimiento, efectos negativos sobre la reproducción,
reducción de la función inmunológica, mortalidad de animales y contaminación de productos de origen animal(Devegowda, 2009).
La enfermedad causada por las micotoxinas se denomina micotoxicosis. En animales susceptibles, la enfermedad se inicia después de la ingesta de alimentos contaminados con una dosis tóxica de micotoxinas. La expresión de la enfermedad depende del tipo, dosis y combinación de las micotoxinas ingeridas (Hollinger y Ekperigin, 1999; Bennett y Klich, 2003). La micotoxicosis se considera un problema a nivel mundial, pero la incidencia de determinadas micotoxinas varía según las regiones geográficas, a causa principalmente de la diferencia climática. En climas como el nuestro, el desarrollo fúngico es favorecido por factores como las condiciones óptimas de humedad y temperatura (Mallmann et al., 2010).
Micotoxinas producidas por hongos del género Fusarium
Las especies del género Fusarium son comúnmente aisladas en la naturaleza, se hallan sobre diferentes sustratos cumpliendo su ciclo biológico, mediante micelios, conidios, clamidosporas y ascosporas. Son importantes fitopatógenos y ocasionan enfermedades tales como podredumbres y marchitamientos de diversos cultivos, alteran la calidad comercial de granos y frutos, además de afectar el alimento del hombre y los animales generando metabolitos tóxicos que actúan por contacto o ingestión (Lori, 1985).
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alimentación humana y en la producción de alimentos para animales. Las principales toxinas producidas por este género fúngico son los tricotecenos (deoxinivalenol, nivalenol, diacetoxiscirpenol, toxina T-2), zearalenona y fumonisina. Este proyecto se abocó al estudio de DON debido a que el cerdo constituye la especie más sensible a los efectos tóxicos producidos por DON (Rotter et al., 1996a; Piotrowska et al., 2014) y porque la casuística de micotoxinas en muestras que arribaron a nuestro laboratorio indicó que el DON constituyó una de las micotoxinas frecuentemente aislada. En relación a ello, en nuestro laboratorio se llevó a cabo un estudio para identificar la microbiota y las principales micotoxinas presentes en el trigo (como afrechillo) y el maíz (como grano seco o alimento fermentado); ingredientes empleados como alimento porcino en la zona sur de la provincia de Buenos Aires. Los resultados obtenidos indicaron que los principales hongos aislados en alimentos fermentados pertenecen al género Penicillium (74%), Aspergillus (32%) y Scopulariopsis (21%). En muestras de maíz los géneros más relevantes fueron Penicillium (70%), Fusarium (47%) y Aspergillus (34%), mientras que Penicillium (42%), Fusarium (27%) y Alternaria (25%) fueron los más aislados en el afrechillo de trigo. La micotoxina DON fue detectada en el 59% de las muestras de maíz, en el 45% de las muestras de trigo y en el 38% de las muestras de alimento fermentado (Roigé et al., 2009).
Tricotecenos
Los tricotecenos son un grupo de metabolitos sesquiterpénicos producidos principalmente por Fusarium graminearum y Fusarium Sporotrichiodes. Químicamente se caracterizan por un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 y un grupo epóxido entre los carbonos 12 y 13, que en su conjunto le confieren la toxicidad a las micotoxinas (Eriksen, 2003). Son conocidos como potentes inhibidores de la síntesis proteica. Se han identificado 180 tricotecenos que frecuentemente son encontrados en granos como trigo, maíz, cebada, arroz y avena. Dentro de este grupo, se destaca el DON que es conocido como “vomitoxina” por generar efectos eméticos en cerdos (figura 4) (Rotter et al., 1996b). La micotoxina DON es el tricoteceno de tipo B que se presenta con mayor frecuencia y es producida por varias especies de Fusarium que incluyen F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense y F. sambucinum. Se presenta comúnmente en granos, particularmente en maíz, trigo y cebada en áreas con clima templado (Alizadeh et al., 2015).
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los síntomas como náuseas, vómitos, dolores abdominales, diarrea, mareos y cefaleas. También se vieron afectados animales de granja como cerdos y pollos (Soriano del Castillo, 2007).
Figura 4. Estructura química del deoxinivalenol.
Mecanismo de acción y patogenia de la intoxicación.
La acción tóxica del DON se debe a distintos mecanismos, dos de los más importantes son:
a) Inhibición de la síntesis proteica, actuando en forma directa sobre la trascripción y transducción. Esta inhibición se produce por la unión de DON a la subunidad 60S de los ribosomas de las células eucariotas generando una potente acción inhibitoria de la peptidil-transferasa e impidiendo la incorporación de los aminoácidos al comienzo o en la elongación y terminación de la cadena polipeptídica (Eriksen y Pettersson, 2004; Dänicke et al., 2006). Como consecuencia de la inhibición proteica, DON decrece la expresión de claudinas y ocludinas en las células epiteliales lo que debilita la barrera intestinal conduciendo a una mayor permeabilidad a toxinas y bacterias (Pinton et al., 2009; Basso et al., 2013; Akbari et al., 2014; Przybylska-Gornowicz et al., 2015).
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proteica. El mecanismo exacto de dicha inhibición es desconocido pero podría deberse a un efecto secundario de la inhibición de la síntesis de proteínas o del efecto de apoptosis que producen los tricotecenos (Eriksen y Pettersson, 2004). Las micotoxinas actúan como agentes inmunosupresores (Desjardins, 2006; Eriksen, 2003). En adición, algunos tricotecenos como el DON incrementan las concentraciones de triptófano, serotonina y el ácido 5-hidroxindolacético en el cerebro, las cuales participan en la regulación de la ingesta de alimento (Leathwood, 1987; Swamy et al., 2002; Bonnet et al., 2012). En relación a ello, varios estudios han demostrado que DON inhibe la motilidad del intestino delgado mediado por receptores serotoninérgicos intestinales (Fioramonti et al., 1993; Eriksen y Pettersson, 2004).
Absorción, distribución y excreción
Las toxinas se absorben rápidamente luego de ser ingeridas y la mayor parte de la absorción se produce en las porciones proximales del tracto gastrointestinal (Dänicke et al., 2010). Se ha demostrado que entre un 80-90% de la absorción de DON se produce en estómago, duodeno y yeyuno proximal. Los tricotecenos son estables a pH neutro y ácido y por lo tanto, no son hidrolizados en el estómago (Eriksen, 2003). La absorción se produce por difusión pasiva; por otro lado, la toxina retorna al tracto intestinal a través de la circulación enterohepática (Grenier y Applegate, 2013). En cerdos, DON puede detectarse en muestras de sangre en menos de 30 min de la exposición oral a la toxina. Los tricotecenos no se acumulan en los tejidos debido a que son rápidamente excretados y solo trazas de toxinas (< 50 ng/g) pueden ser encontradas en subproductos animales. La principal ruta de excreción de DON después del ingreso por vía endovenosa es la urinaria y tras una exposición oral de DON puede ser excretada también por materia fecal (Prelusky et al., 1988, Eriksen y Pettersson, 2004).
Metabolismo del deoxinivalenol
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del DON (Yoshizawa et al., 1983; Westlake et al., 1987; Charmley et al., 1993; Dänicke y Brezina, 2013). La biotransformación intestinal de DON tiene lugar en el intestino grueso con lo cual existe una escasa detoxificación antes de que la micotoxina sea absorbida (Grenier y Applegate, 2013).
Toxicidad
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nervioso (Bonnet et al., 2012) y afecta adversamente la producción de la hormona de crecimiento (Sala Echave et al., 2008; Amuzie y Pestka, 2010; Alizadeh et al., 2015).
Existen pocos estudios que muestren evidencia de efectos adversos del DON sobre parámetros reproductivos. Se ha observado una tendencia hacia un menor peso y longitud de los fetos en cerdas alimentadas con 1,7 o 3,5 mg DON/kg de alimento durante la preñez. No se han observado efectos de DON sobre los pesos o el tamaño de los neonatos o en la ganancia de peso y tasa de supervivencia durante la etapa de lactancia (Chavez, 1984; Friend et al., 1986; Eriksen y Pettersson, 2004).
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