TESIS DOCTORAL
Autor:
Natalia Casado Navas
Director/es:
Isabel Sierra Alonso
Damián Pérez Quintanilla
Sonia Morante Zarcero
Programa de Doctorado en Ciencias
Escuela Internacional de Doctorado
2018
APLICACIÓN DE SÍLICES MESOESTRUCTURADAS O DE
TÉCNICAS MICRO-EXTRACTIVAS EN LA PREPARACIÓN
DE MUESTRA COMBINADAS CON CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS DE ULTRA-ALTA EFICACIA PARA MEJORAR
Los versos del poeta Antonio Machado “Caminante, son tus huellas el camino y nada más, caminante, no hay camino, se hace camino al andar”, podrían definir metafóricamente el camino del investigador, un camino incierto, lleno de obstáculos y dificultades, cuyas huellas son el trabajo constante de todas aquellas personas que con estudio, paciencia, ilusión y esfuerzo intentan día a día dar un paso más hacia el conocimiento.
Me siento orgullosa de poder haber contribuído de alguna forma con mi trabajo a dejar una pequeña huella en la andadura de este gran camino y, ello se lo debo agradecer a la Universidad Rey Juan Carlos, al Departamento de Tecnología Química y Ambiental, al proyecto AVANSECAL y, sobre todo, a mis directores de Tesis, la Dra. Isabel Sierra Alonso, el Dr. Damián Pérez Quintanilla y la Dra. Sonia Morante Zarcero, que me han guiado y enseñado a caminar por este complejo mundo de la investigación a lo largo de estos años.
Gracias Isabel, por elegirme sin conocerme y confiar en mí, dándome la gran oportunidad de hacer esta Tesis Doctoral y formar parte de tu equipo docente e investigador.
Gracias Damián, por todas tus enseñanzas y buenos consejos, así como por tu disposición a echarme siempre una mano y aclarar todas mis dudas.
Gracias Sonia, por tu incansable apoyo, paciencia y dedicación, así como por tus numerosos consejos y enseñanzas ¡qué habría sido de mí y de esta Tesis sin ti!
ayudarme y hacerme los días más llevaderos y, en especial, a Mariana, que al estar en la misma situación que yo durante estos años, hemos podido compartir cursos, congresos, viajes y numerosas experiencias que nos han unido y que han hecho que, no solo seamos compañeras de trabajo, sino también amigas.
También agradecer a los alumnos de beca de colaboración y de trabajos fin de grado que han pasado por el laboratorio a lo largo de estos años, Ana, Sandra, Álvaro, Eva, Adrián, Javi, Jaime y Sara, que de alguna manera con su trabajo han contribuido al desarrollo de esta Tesis Doctoral.
Un especial agradecimiento al Dr. José Sousa Câmara, del Centro de Química de Madeira (CQM, Universidad de Madeira, Funchal) por haber aceptado dirigir mi estancia predoctoral dentro de su grupo de investigación. A la Dra. Rosa Perestrelo y a Catarina L. Silva por haberme enseñado el manejo de distintas ténicas micro-extractivas importantes para el desarrollo de esta Tesis Doctoral. Asimismo, agradecer a João y a Joselin, por su incondicional ayuda en el laboratorio y su cariño, que hicieron más amena mi estancia lejos de casa. También a Ana y a Mariangie, con las que compartí muchas risas en los tiempos libres y con las que aprendí a hablar “portuñol” y venezolano. Imposible dejar de mencionar a mis compañeros de la residencia de estudiantes Sasuma, quienes compartieron conmigo el día a día en Madeira y se convirtieron en mi familia durante los 5 meses de estancia, en especial a Oihane, Salma, Miguel, Ania, Magda, Bartek, Fernando, Fabio, Jose, Andrea, Jaro y Pablo.
Sin lugar a duda, quienes más merecen mi agradecimiento son mis padres y mi hermana, que durante todos estos años siempre me han apoyado y me han motivado para seguir adelante con mis sueños. Gracias Beatriz, por ser capaz de sacarme una sonrisa en mis peores momentos. Gracias Papá, por ser mi ejemplo de esfuerzo y perseverancia a seguir para lograr mis metas. Y, sobre todo, gracias Mamá, por haber estado siempre ahí, dándome apoyo incondicional, escuchándome, aconsejándome y animándome en todo momento.
A mi familia
“Todos tus sueños
pueden hacerse realidad si tienes el
coraje de perseguirlos”
La seguridad y calidad alimentaria constituyen a día de hoy una de las principales preocupaciones dentro del ámbito alimentario, lo que conlleva hacer frente a nuevos retos y desafíos para garantizar la salud de los consumidores y satisfacer sus demandas. Esto ha generado la necesidad de desarrollar nuevas metodologías analíticas rápidas, sensibles, selectivas y respetuosas con el medio ambiente que permitan evaluar y mejorar la seguridad y calidad de los alimentos. En este sentido, dada la complejidad de las matrices alimentarias, el análisis de alimentos requiere de un adecuado tratamiento de muestra previo a su análisis. La tendencia actual se encamina, por un lado, hacia el desarrollo de nuevos materiales, y por otro, hacia la aplicación de nuevos procedimientos micro-extractivos. Todo ello, combinado con potentes técnicas instrumentales de análisis rápidas, sensibles y selectivas da lugar a metodologías analíticas rápidas, eficaces y respetuosas con el medio ambiente.
En base a lo expuesto, el principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de nuevas metodologías analíticas avanzadas, basadas en el empleo de sílices mesoestructuradas híbridas como nuevos materiales para mejorar las etapas de preparación de muestra, y la propuesta de novedosas técnicas micro-extractivas, con el fin de crear estrategias rápidas, de bajo coste y respetuosas con el medioambiente. La combinación de estas estrategias con la cromatografía de líquidos de ultra-alta eficacia (UHPLC) ha permitido desarrollar métodos analíticos multi-residuo y multicomponente rápidos, sensibles, selectivos y eficaces para la determinación de contaminantes y compuestos bioactivos en distintas muestras de alimentos.
- Desarrollo de metodologías analíticas para evaluar la seguridad alimentaria (Capítulo III).
- Desarrollo de metodologías analíticas para evaluar la calidad
alimentaria (Capítulos IV y V).
En el Capítulo III se recogen tres artículos científicos en los que se han desarrollado nuevas metodologías basadas en el empleo de sílices mesostructuradas híbridas como fases de extracción en fase sólida (SPE) para la extracción multi-residuo de fármacos de uso veterinario en muestras de carne y su análisis por UHPLC acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). Los trabajos recogidos en este Capítulo evalúan la eficacia de la mono-funcionalización y bi-funcionalización de la sílice mesoestructurada hexagonal SBA-15 y su aplicación en SPE. Asimismo, se lleva a cabo una comparativa de la eficacia de extracción de diferentes sílices mesoestructuradas con distinta estructura y morfología. Los resultados obtenidos demuestran el gran potencial de estos materiales para la extracción multi-residuo de los fármacos de uso veterinario y muestran las grandes ventajas que ofrecen frente a otros materiales comerciales comúnmente empleados en SPE.
En los Capítulos IV y V se recogen los trabajos que llevan a cabo el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para evaluar la calidad alimentaria basadas en la determinación multicomponente de compuestos fenólicos en distintas muestras de alimentos.
El Capítulo IV agrupa dos artículos científicos en los que se optimizan y evalúan distintas técnicas micro-extractivas como, micro-extracción con
materiales sólidos empaquetados (MEPS), μSPEed® y μ-QuEChERS
técnicas convencionales como la SPE, permitiendo obtener gran eficiencia de extracción con un mínimo consumo de disolventes, muestras y tiempo, dando lugar a procesos más respetuosos con el medioambiente y más económicos. A su vez, los resultados obtenidos permiten ahondar en la calidad nutricional de estos productos, cuya composición ha sido relevada a un segundo plano, dando mayor importancia a su inocuidad.
El Capítulo V recoge dos artículos científicos basados en la aplicación por primera vez de sílices mesoestructuradas híbridas, cuyos poros presentan una estructura de agujero de gusano, como fases en la extracción en fase sólida dispersiva (dSPE) de compuestos fenólicos a partir de distintas
bebidas elaboradas a base de frutas y verduras, como zumos y smoothies,
utilizando UHPLC-MS/MS como técnica de análisis. De nuevo, los resultados obtenidos ponen de manifiesto las ventajas de las sílices mesoestructuradas frente a otros materiales comercialmente disponibles, y su gran potencial de extracción en distintas técnicas de tratamiento de muestra, así como su versatilidad para la extracción de compuestos de distinta naturaleza, como los compuestos fenólicos. Estos resultados pueden ser considerados estudios previos prometedores para realizar el posible acoplamiento de las sílices mesoestructuradas con las técnicas micro-extractivas, de modo que puedan desarrollarse potentes metodologías que posean las ventajas de ambos conceptos, con el fin de desarrollar procesos rápidos, sensibles, selectivos, económicos y respetuosos con el medioambiente, que son requisitos esenciales para poder ser incluidos dentro de la denominada “química verde”.
Nowadays, food safety and quality are one of the main concerns in the food field, which leads to face new challenges to ensure consumers health and meet their demands. This has resulted in the need to develop new quick, sensitive, selective and environmentally friendly analytical methodologies that allow evaluating and improving food safety and quality. In this sense, due to the complexity of food matrices, in food analysis a suitable sample preparation method is required prior to further analysis. The current trend heads, on one hand, to the development of new materials and, on the other hand, towards the application of new micro-extractive procedures. All this combined with powerful quick, sensitive and selective instrumental analytical techniques results in quick, effective and environmentally friendly analytical methodologies.
Based on the foregoing, the main goal of this PhD dissertation has been the development of new advanced analytical methodologies based on the use of hybrid mesostructured silicas as new sorbent materials to improve sample preparation, and the proposal of novel micro-extraction techniques, with the aim of developing quick, cost-effective and environmentally friendly strategies. The combination of these strategies with ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) has enabled to develop quick, sensitive, selective and effective multi-residue and multicomponent analytical methods for determination of contaminants and bioactive compounds in different food samples.
To achieve this goal, two main research lines have been addressed:
- Development of analytical methodologies to assess food safety
(Chapter III).
- Development of analytical methodologies to assess food quality
Chapter III gathers up three scientific articles related to the development of new methodologies based on the use of hybrid mesostructured silicas as sorbents for solid-phase extraction (SPE) in order to perform multi-residue extraction of veterinary drug residues from meat samples and their subsequent analysis by UHPLC coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The works collected in this chapter evaluate the effectiveness of mono-functionalization and bi-functionalization of a hexagonal mesostructured silica SBA-15 type and its application as sorbent in SPE. Likewise, in this chapter, the extraction efficiency of different mesostructured silicas with different structure and morphology is also compared. The results obtained prove the great potential of this materials to perform multi-residue extraction of veterinary drugs and show the great advantages over other commercial materials which are commonly used as SPE sorbents.
Chapters IV and V gather works which develop new analytical methodologies to assess food quality based on the multicomponent determination of phenolic compounds in different food samples.
Chapter IV collects two scientific articles in which different extraction techniques are optimized and evaluated, including
micro-extraction by packed sorbents (MEPS), μSPEed® and μ-QuEChERS
Chapter V collects two scientific articles based on the application for the first time of hybrid mesostructured silicas with wormhole-like porous framework as sorbent materials for dispersive solid-phase extraction (dSPE) of phenolic compounds from different beverages made of fruits and vegetables, such as juices and smoothies, using UHPLC-MS/MS as analysis technique. One more time, the results obtained show the advantages of mesostructured silicas over other commercially available materials, and prove their high extraction potential in different sample preparation techniques, as well as their versatility for the extraction of compounds of different nature, such as phenolic compounds, achieved by their mono- and bi-functionalization. These results can be considered preliminary promising studies to perform the possible coupling between mesostructured silicas and micro-extraction techniques. In this sense, new powerful methodologies that integrate the advantages of both concepts could be developed, with the aim to develop quick, sensitive, selective, cheap and environmentally friendly extraction procedures, which are essential requirements to be included in the so-called “green chemistry”.
I
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
I.1. Antecedentes 1
I.2. Seguridad Alimentaria 2
I.2.1. Problemática de los contaminantes emergentes 3
I.2.2. Fármacos de uso veterinario 5
➢ Marco legal 6
➢ β-bloqueantes 10
➢ β-agonistas 11
➢ Antiinflamatorios no esteroideos (AINES) 13
➢ Micotoxinas con actividad estrogénica no esteroidea 15
I.3. Calidad Alimentaria 17
I.3.1. Compuestos bioactivos 18
I.3.2. Compuestos fenólicos 19
➢ Clasificación y presencia de compuestos fenólicos en
los alimentos 23
• Ácidos fenólicos 23
• Lignanos 26
• Estilbenos 26
• Flavonoides 27
➢ Actividad biológica de los compuestos fenólicos 35
• Actividad antioxidante 35
• Actividad antiinflamatoria 37
• Actividad anticancerígena 38
• Actividad antimicrobiana 38
• Otras actividades biológicas 39
I.4. Desarrollo de métodos analíticos avanzados para el análisis
II
I.4.1. Etapa de preparación de muestra 41
➢ Técnicas de extracción y pre-concentración basadas
en el uso de fases sólidas. 44
• Técnicas de extracción convencionales
empleadas en este trabajo 44
• Técnicas micro-extractivas empleadas en
este trabajo 48
➢ Desarrollo de nuevos materiales como fases sólidas
para la preparación de muestra. 54
• Sílices mesoestructuradas 55
I.4.2. Etapa de análisis: técnicas instrumentales de análisis y
cuantificación 70
➢ Acoplamiento de la UHPLC a la espectrometría de
masas 75
• Ionización por electrospray (ESI) 78
• Trampa iónica cuadrupolar (IT) 80
• Análisis de tipo MSn y MS/MS 83
I.5. Antecedentes bibliográficos de la extracción y determinación de
contaminantes y compuestos fenólicos en alimentos 87
Artículo 1: “Current development and applications of ordered
mesoporous silicas and other sol-gel silica-based materials in food
sample preparation for xenobiotics analysis”
N. Casado, D. Pérez-Quintanilla, S. Morante-Zarcero, I. Sierra,
TrAC 88 (2017) 167 – 184. 97
Artículo 2: “Two novel strategies in food sample preparation for
the analysis of dietary polyphenols: micro-extraction techniques and new silica-based sorbent materials”
N. Casado, S. Morante-Zarcero, D. Pérez-Quintanilla, J. S. Câmara
III
CAPÍTULO III. SÍLICES MESOSTRUCTURADAS HÍBRIDAS COMO FASES
DE SPE PARA LA EXTRACCIÓN MULTIRRESIDUO DE FÁRMACOS DE
USO VETERINARIO EN MUESTRAS DE CARNE Y SU ANÁLISIS POR
UHPLC-IT-MS/MS
III.1. Introducción 207
III.2. Objetivos 209
III.3. Resultados y discusión 210
Artículo 3: “Application of a hybrid ordered mesoporous silica as
sorbent for solid-phase multi-residue extraction of veterinary drugs in meat by ultra-high-performance liquid chromatography coupled to ion-trap tandem mass spectrometry”
N. Casado, S. Morante-Zarcero, D. Pérez-Quintanilla, I. Sierra, J.
Chromatogr. A 1459 (2016) 24 – 37. 235
Artículo 4: “Evaluation of bi-functionalized mesoporous silicas as reversed phase/cation-exchange mixed-mode sorbents for multi-residue solid phase extraction of veterinary drug multi-residues in meat
samples”
N. Casado, D. Pérez-Quintanilla, S. Morante-Zarcero, I. Sierra,
Talanta 165 (2017) 223 – 230. 279
Artículo 5: “Evaluation of mesostructured silicas with wormhole-like framework as alternative sorbents for extraction of drug residues from food samples”
N. Casado, S. Morante-Zarcero, D. Pérez-Quintanilla, I. Sierra,
IV
CAPÍTULO IV. EVALUACIÓN DE TÉCNICAS MICRO-EXTRACTIVAS PARA
LA EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES EN ALIMENTOS INFANTILES Y SU
ANÁLISIS POR UHPLC-PDA
IV.1. Introducción 335
IV.2. Objetivos 338
IV.3. Resultados y discusión 339
Artículo 6: “Comparison of high-throughput microextraction
techniques, MEPS and μSPEed, for the determination of
polyphenols in baby food by ultrahigh pressure liquid chromatography”
N. Casado, R. Perestrelo, C. L. Silva, I. Sierra, J. S. Câmara, Food
Chem. (en revisión). 353
Artículo 7: “An improved and miniaturized analytical strategy based on μ-QuEChERS for isolation of polyphenols. A powerful approach for quality control of baby foods”
N. Casado, R. Perestrelo, C. L. Silva, I. Sierra, J. S. Câmara,
Microchem. J. 139 (2018) 110 – 118. 391
CAPÍTULO V. SÍLICES MESOSTRUCTURADAS HÍBRIDAS COMO FASES
SÓLIDAS PARA LA EXTRACCIÓN MULTICOMPONENTE DE
COMPUESTOS FENÓLICOS EN MUESTRAS DE BEBIDAS Y SU ANÁLISIS
POR UHPLC-IT-MS/MS
V.1. Introducción 429
V.2. Objetivos 434
V
multicomponent extraction of dietary polyphenols combined with ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem ion-trap mass spectrometry analysis”
N. Casado, S. Morante-Zarcero, D. Pérez-Quintanilla, J.S. Câmara,
I. Sierra, Microchimica Acta (enviado). 451
Artículo 9: “Preparation of reversed-phase/strong anion-exchange mixed-mode sorbents by bi-functionalization of HMS mesostructured silica for dispersive solid-phase extraction of polyphenols from juices”
N. Casado, D. Pérez-Quintanilla, S. Morante-Zarcero, I. Sierra (en
elaboración) 497
CAPÍTULO VI. DISCUSIÓN GENERAL
533CAPÍTULO VII. CONCLUSIONES GENERALES
541BIBLIOGRAFÍA
555VII
ACN: Acetonitrilo.
AECOSAN: Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición.
AINES: Antiinflamatorios no esteroideos.
AMS: Anionic Surfactant Templated Mesoporous Silica.
APCI: Ionización química a presión atmosférica.
ASE: Extracción acelerada con disolventes.
BET: Fisisorción de gases en sólidos.
BIN: Aguja insertada en barril (“Barrel inserted needle”).
C18: Octadecilsilano.
C8: Octilsilano.
CCα: Límite de decisión.
CCβ: Capacidad de detección.
CE: Electroforesis capilar.
CID: Disociación inducida por colisiones.
CLA: Ácido linoleico conjugado.
CMC: Concentración micelar crítica.
COX: Ciclooxigenasa.
DC: Corriente continua.
DHA: Ácido docosahexaenoico.
DPPH: Método del radical libre 2,2 difenil-1-picrilhidracilo
DRX: Difracción de rayos-X.
dSPE: Extracción en fase sólida dispersiva.
DVB: Divinilbenceno.
EPA: Ácido eicosapentaenoico.
VIII
EtAC: Acetato de etilo
FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura.
FDU: Fudan University.
FSM: Folded Sheet Materials.
FT: Transformada de Fourier.
FT-IR: Espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier.
GC: Cromatografía de gases.
HDL: Lipoproteínas de alta densidad.
HLB: Balance hidrofílico-lipofílico.
HMS: Hexagonal Mesoporous Silica.
HPLC: Cromatografía de líquidos de alta eficacia.
HPP: Altas presiones hidrostáticas.
I.U.P.A.C.: Unión Internacional de Química Pura y Aplicada.
ICP: Plasma de acoplamiento inductivo.
IT: Trampa de iones.
KIT: Korea Advanced Institute of Science and Technology. L0: Grado de funcionalización.
LC: Cromatografía de líquidos.
LDL: Lipoproteínas de baja densidad.
LDM: Límite de detección del método.
LLE: Extracción líquido-líquido.
LMR: Límite Máximo de Residuos.
LQM:límite de cuantificación del método.
LSE: Extracción líquido-sólido.
MAE: Extracción asistida por microondas.
IX
MAX: Mixed-mode anion-exchange
MCM: Mobil Composition of Matter.
MCX: Mixed-mode cation-exchange
MeOH: Metanol.
MEPS: Micro-extracción con materiales sólidos empaquetados.
MIP: Polímero de impronta molecular.
MRM: Monitorización de múltiples reacciones (“Multiple Reaction Monitoring”).
MRPL: Límite Mínimo de Funcionamiento Exigido.
MS/MS: Espectrometía de masas en tándem.
MS: Espectrometría de masas.
MSPD: Dispersión de matriz en fase sólida.
MSPE: Extracción magnética en fase sólida.
MSU: Michigan State University.
NF-κB: Factor nuclear kappa B.
NR4+: Amonio cuaternario.
OMS: Organización Mundial de la Salud.
PDA: Detector de matriz de fotodiodos.
PFP: Pentafluorofenilo
PMO: Periodic Mesoporous Organosilicas.
PS: Poroso de poliéster.
PSA: Aminas primarias y secundarias.
PT-SPE: Extracción con punta de pipeta en fase sólida (“Pippette-tip”).
Q: Cuadrupolo.
X
RF: Radiofrecuencia.
RMN: Espectroscopía de resonancia magnética nuclear.
RP: Fase reversa.
SBA: Santa Barbara Amorphous.
SBSE: Extracción por sorción sobre barra agitadora.
SEM: Microscopía electrónica de barrido.
SFE: Extracción con fluidos supercríticos.
SMIP: Impronta molecular en superficie.
SO3-: Ácidos sulfónicos. SPE: Extracción en fase sólida.
SPME: Micro-extracción en fase sólida.
TEM: Microscopía electrónica de transmisión.
TGA: Análisis termogravimétrico.
TOF: Tiempo de vuelo.
UAE: Extracción asistida por ultrasonidos.
UHPLC: Cromatografía de líquidos de ultra-alta eficacia.
UHPLC-IT-MS/MS: Cromatografía de líquidos de ultra-alta eficacia acoplada a
UV: Luz ultravioleta.
UV-Vis: Ultravioleta-visible
Vis: Luz visible.
μ-dSPE: miniaturización de la extracción en fase sólida dispersiva.
μ-MSPD: Miniaturización de la dispersión de matriz en fase sólida.
μ-QuEChERS: “Micro-quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”.
Introducción
Int
I.1
ANTECEDENTES
La seguridad, la calidad y la autenticidad son, actualmente, los tres grandes vectores sobre los que se mueve la industria alimentaria. En los últimos años, se ha producido en los países más desarrollados una evolución en el perfil del consumidor, que se caracteriza por estar cada vez más informado sobre la repercusión directa que tiene la alimentación sobre la salud, lo que le hace ser más exigente y crítico a la hora de adquirir alimentos [1].
Por este motivo, hoy en día los alimentos no se entienden tan solo como productos para satisfacer el hambre y las necesidades nutricionales, sino que además deben ser productos inocuos que no ocasionen ningún riesgo de infección o intoxicación, así como saludables y fidedignos, de modo que su consumo aporte una serie de beneficios sobre el organismo, y que su etiquetado se corresponda con la composición nutricional real del producto, evitando los fraudes y las adulteraciones.
Los términos seguridad y calidad son cada vez más reconocidos, aceptados y exigidos tanto por los consumidores, como por los organismos internacionales, lo que ha dado lugar a hacer frente a nuevos retos y desafíos para detectar y prevenir posibles riesgos alimentarios. En este sentido, es necesario desarrollar estrategias analíticas avanzadas que sean capaces de detectar situaciones que puedan incidir negativamente en la calidad y seguridad de los alimentos, y cuya implantación permita mejorar la determinación de estos parámetros, para garantizar así la salud de los consumidores y satisfacer sus demandas.
2
IntroducciónI.2
SEGURIDAD ALIMENTARIA
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), y la Organización Mundial de la Salud (OMS) definen la seguridad alimentaria como “el acceso físico y económico de todas las personas y en todo momento a suficientes alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias y sus preferencias en cuanto a alimentación para llevar una vida activa y sana” [2]. En el caso de los países industrializados, donde el acceso a una cantidad suficiente de alimentos parece asegurado, el aspecto que más preocupa es el relativo a la inocuidad de los alimentos, por lo que el principal objetivo en este caso es garantizar que los alimentos no produzcan ningún daño a los consumidores.
Para garantizar la seguridad alimentaria es necesario realizar un control integrado de toda la cadena alimentaria, que abarque todas las fases del proceso productivo y procesado de los alimentos, desde la fase primaria hasta el momento en que llegan a la mesa del consumidor, puesto que todas ellas son determinantes de la calidad del producto final. Por este motivo, en las últimas décadas, la seguridad alimentaria ha evolucionado hacia la exigencia de un mayor control de los alimentos a través del desarrollo de nuevos sistemas de producción, tecnologías y hábitos alimentarios, lo que ha permitido detectar nuevos riesgos, distintos de la contaminación clásica por microorganismos, procedentes de sustancias contaminantes cuya presencia en los alimentos ha pasado inadvertida hasta la fecha. A su vez, el hecho de que la salud de los consumidores pueda verse comprometida por la ingesta de alimentos ha dado lugar a una revisión de la legislación alimentaria, que ha puesto de manifiesto la necesidad de reorientar dicha legislación hacia una política más dirigida a la vigilancia [3].
Int
seguridad alimentaria. En este sentido, la contaminación de los alimentos puede ser de dos tipos: contaminación biótica, que es aquella producida por bacterias, y contaminación abiótica, derivada de la presencia de sustancias químicas y/o sus metabolitos [4]. Tradicionalmente, la atención prestada a la contaminación abiótica se ha centrado en el control de los contaminantes más convencionales, es decir, de aquellos que se encuentran más regulados debido al gran volumen en el que son emitidos. Sin embargo, dentro de este tipo de contaminación existe otro grupo de contaminantes, los denominados “contaminantes emergentes”, una serie de sustancias de las cuales hasta hace poco no se disponía de datos ni información sobre su existencia, y que, a pesar de no estar presentes en concentraciones elevadas, se ha visto que pueden ejercer numerosos efectos perjudiciales sobre el medioambiente y la salud de los seres vivos [5]. Por este motivo, en los últimos años se ha comenzado a prestar especial atención a este tipo de sustancias, ya que, debido a sus efectos dañinos, el control y la regulación de su presencia en los alimentos es algo imprescindible para poder garantizar la máxima seguridad alimentaria de los mismos.
I.2.1 Problemática de los contaminantes emergentes
4
Introducciónmetodologías analíticas oficiales para su determinación. Otra particularidad de estos compuestos es que, debido a su elevada producción y consumo, la introducción de los mismos en el medioambiente es continua, por lo que no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos [7].
Los contaminantes emergentes engloban una gran variedad de compuestos químicos, por lo que constituyen un grupo de sustancias muy diverso sin una clasificación clara, en el que se incluyen compuestos como: ácidos nafténicos, aditivos en gasolinas, aromas sintéticos, benzotriazoles, compuestos perfluorados, algunos edulcorantes artificiales, fármacos, drogas de abuso, hormonas, disruptores endocrinos, filtros solares, micro y nanoplásticos, plastificantes, productos de degradación de pesticidas y nuevos pesticidas, productos derivados de procesos de desinfección de aguas, retardantes de llama, surfactantes, etc. [6].
Int
bajos límites de detección, los cuales eran impensables hace tan solo una década [6].
Asimismo, debe considerarse como un objetivo fundamental en el desarrollo de metodologías analíticas para el control de contaminantes emergentes la puesta a punto de métodos que permitan la identificación, confirmación y detección de estos compuestos de forma rápida, sencilla, sensible, robusta y fiable [6].
En base a lo expuesto, los fármacos de uso veterinario se incluyen dentro de los contaminantes emergentes, sin embargo, como se ha indicado, en el caso de muchos alimentos la presencia de estas sustancias está regulada debido a los graves problemas que pueden causar sobre la salud de los consumidores. Por ello, parte de esta Tesis Doctoral aborda el desarrollo de nuevas metodologías analíticas que contribuyan al control de este tipo de sustancias en los alimentos de forma rápida y sensible, con el fin de mejorar la seguridad alimentaria.
I.2.2
Fármacos de uso veterinario
La Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (AECOSAN) define los residuos de medicamentos veterinarios en alimentos como “todas las sustancias farmacológicamente activas, ya sean principios activos, excipientes o productos de degradación, y sus metabolitos que permanezcan en los productos alimenticios obtenidos a partir de animales a los que se les hubiese administrado el medicamento veterinario de que se trate” [8].
6
Introducciónlo que puede provocar que no sean metabolizados correctamente por el animal y que, por tanto, permanezcan presentes en el músculo tras su sacrificio o en la leche tras su ordeño. Esta situación, daría lugar a su entrada dentro de la cadena alimentaria y, consecuentemente, suponer un grave riesgo para la salud de los consumidores, ya que numerosos estudios demuestran que una exposición prolongada a estos fármacos, incluso a bajas concentraciones, puede causar diferentes efectos secundarios, como reacciones alérgicas, efectos tóxicos, microbiológicos, teratogénicos o incluso carcinogénicos [9-11]. Por este motivo, el control y la monitorización de la presencia de residuos de fármacos veterinarios en alimentos es esencial para asegurar la seguridad alimentaria y evitar que lleguen al consumidor, para lo cual es necesario el desarrollo de métodos analíticos multi-residuo, que determinen en un único análisis el mayor número posible de compuestos pertenecientes a distintas familias químicas de forma rápida, sensible y selectiva, y que permitan a su vez llevar a cabo la cuantificación y confirmación de los residuos de fármacos veterinarios en alimentos con el fin de evitar fraudes y riesgos toxicológicos, así como cumplir con lo establecido en la legislación.
➢
Marco legal
Int
- Grupo A: Sustancias con efecto anabolizante y sustancias no
autorizadas
1. Estilbenos, derivados de los estilbenos, sus sales y ésteres
2. Agentes antitiroidianos
3. Esteroides
4. Lactonas del ácido resorcílico (incluido el zeranol)
5. Agonistas β-adrenérgicos
6. Las sustancias que, debido a su peligrosidad, como los
nitrofuranos y el cloranfenicol, no se les puede asignar un LMR en los alimentos de origen animal.
- Grupo B: Medicamentos veterinarios y contaminantes
1. Fármacos antibacterianos, incluidas las sulfamidas, quinolonas
2. Otros medicamentos veterinarios:
• Antihelmínticos
• Anticoccidianos, incluidos los nitroimidazoles
• Carbamatos y piretroides
• Tranquilizantes
• Antiinflamatorios no esteroideos (AINES)
• Otras sustancias con actividad farmacológica
3. Otras sustancias y contaminantes medioambientales:
• Compuestos organoclorados
• Compuestos organofosforados
• Elementos químicos
• Micotoxinas
• Colorantes
• Otros
8
IntroducciónCon el fin de controlar la presencia de estos residuos en los alimentos y proteger así la salud de los consumidores, la Decisión de la Comisión 657/2002/CE [13], por la que se aplica la Directiva 96/23/CE [12] del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de resultados, trata sobre el análisis y control de las sustancias medicamentosas, y en ella se especifican los métodos e instrumentos adecuados para la correcta identificación de los diferentes residuos orgánicos o contaminantes, así como los requisitos necesarios para llevar a cabo la validación de los métodos analíticos. Asimismo, para el desarrollo, la validación y la aplicación de estas metodologías analíticas que tienen como objetivo monitorizar la presencia de estas sustancias en los alimentos, la Unión Europea ha establecido Límites Máximos de Residuos (LMRs) para determinadas sustancias en productos alimenticios de origen animal. Actualmente, la norma que recoge y regula estos LMRs es el Reglamento (UE) nº 37/2010 (relativo a las sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere a los LMRs en los productos alimenticios de origen animal) [14]. En este reglamento se define el LMR como “el contenido máximo de residuos resultante de la utilización de un
medicamento veterinario, expresado en mg Kg -1 (ppm) o en μg Kg -1 (ppb)
sobre la base del peso en fresco, autorizado en la Comunidad Europea o reconocido como admisible en un producto alimenticio”. Este reglamento incluye un anexo en el que se recogen:
- Las sustancias autorizadas en producción animal: lista de sustancias
farmacológicamente activas para las que se establecen LMRs según la especie y la matriz analizada.
- Las sustancias prohibidas en producción animal: lista de sustancias
Int
sustancias que se nombran en este apartado son las siguientes:
Aristolochia spp. y sus formulaciones, cloranfenicol, cloroformo, clorpromacina, colchicina, dapsona, dimetridazol, metronidazol, nitrofuranos (incluida la furazolidona) y ronidazol.
El Anexo de este Reglamento se actualiza continuamente para cambiar o introducir valores de LMR de medicamentos utilizados en animales productores de alimento, así como para introducir sustancias farmacológicamente activas que sean consideradas de alto riesgo y que hasta el momento se desconociese su peligrosidad. Sin embargo, hay determinadas sustancias que no tienen establecido un LMR, como por ejemplo los fármacos cuyo uso está prohibido en producción animal, como es el caso de los agonistas β-adrenérgicos (incluidos en el grupo A de la Directiva 96/23/CE [12]). En estos casos, la Comisión Europea establece un Límite Mínimo de Funcionamiento Exigido (MRPL), que haría referencia al contenido mínimo recomendado de un analito en una muestra que podría ser detectado y confirmado [13]. Este término se define en la Decisión de la Comisión 657/2002 [13], no obstante, la mayoría de los valores de MRPL no están legislados, tan solo existen recomendaciones de ellos en las guías de los laboratorios comunitarios de referencia [15]. El MRPL sirve para armonizar el funcionamiento analítico de los métodos aplicables a las sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido.
10
IntroducciónEn base a lo expuesto, los trabajos que constituyen la parte de la Tesis Doctoral correspondiente al desarrollo de metodologías analíticas avanzadas para evaluar la seguridad alimentaria se han centrado en la determinación de fármacos de uso veterinario pertenecientes a ambos grupos (A y B), de acuerdo con la Directiva 96/23/CE [12], con el fin de desarrollar metodologías analíticas multi-residuo que permitan abarcar en un único análisis la determinación de compuestos de distinta clase. En este sentido, por su uso frecuente y por los graves problemas que causan sobre la salud humana, se han seleccionado como analitos objeto de estudio fármacos pertenecientes al grupo A, como los β-agonistas y el α-zearalanol,
y fármacos que se incluyen en el grupo B, como los β-bloqueantes y los
AINES.
➢
β
-bloqueantes
Los β-bloqueantes, también denominados β-antagonistas, son compuestos de estructura similar a la adrenalina que actúan a nivel de los receptores β-adrenérgicos de membrana [17]. En la Fig. 1 se muestran las estructuras químicas de los β-bloqueantes analizados en esta memoria.
Int
tiempo suficiente para ser eliminado del organismo, por lo que sus residuos pueden permanecer presentes en la carne y ser ingeridos por el consumidor [10, 18].
Figura 1. Estructura química de los β-bloqueantes analizados en esta memoria.
➢
β
-agonistas
Losβ-agonistas son sustancias de estructura análoga a la adrenalina y noradrenalina, por lo que al igual que los β-bloqueantes, también actúan a nivel de los receptores β-adrenérgicos de membrana, pero ejercen un efecto estimulante similar o idéntico al de la adrenalina, que es opuesto al H2N
O HN CH3
OH
CH3
O
Atenolol
H3CO
O N H CH3 CH3 OH H Metoprolol N H H3C
CH3
O HN CH3
CH3 O O OH Acebutolol O
O HN CH3
CH3 OH H Betaxolol O N H CH3 CH3 OH Propranolol N H CH3 OH NH2 OH O Labetalol N H O OH N H CH3
CH3
12
Introducciónproducido por los β-bloqueantes [19]. En la Fig. 2 se muestran las
estructuras químicas de los β-agonistas empleados como objeto de estudio de esta Tesis Doctoral.
Figura 2. Estructura química de los β-agonistas analizados en esta memoria.
HO
H
N CH3
CH3 CH3 OH H HO Salbutamol Cimaterol
HO HN CH3
CH3 CH3 OH OH Terbutalina H
N CH3
CH3
CH3
OH Cl
N
H2N
OH H
N CH3
CH3
Tulobuterol
H
N CH3
CH3
CH3
OH
Cl
H2N
Cl H
Clembuterol
H
N CH3
CH3
OH
Cl
H2N
Cl
Clemproperol
H
N CH3
CH3
OH
Br
H2N
Br
CH3
Brombuterol
H
N CH3
CH3
OH
H2N
Cl CH3 F F F Mabuterol HO OH NH OH
H3C
Int
Los β-agonistas se usan para el tratamiento de enfermedades respiratorias por su acción broncodilatadora, y como estimuladores del útero en los partos debido a su acción tocolítica. Su mecanismo de acción es
contrario al de los β-bloqueantes porque estimulan los receptores
β-adrenérgicos, fomentando la unión de éstos y produciendo su estimulación. Como consecuencia, se incrementa la frecuencia cardiaca, se contraen los vasos sanguíneos y se dilatan los conductos de aire. Sin embargo, su uso está prohibido en muchos países puesto que suelen utilizarse fraudulentamente por su acción promotora del crecimiento y por su habilidad de aumentar la masa muscular y reducir la masa grasa, ya que favorecen el anabolismo proteico, así como el aumento de la lipólisis, lo que da lugar a carnes menos grasas y con mayor contenido magro [10, 20].
➢
Antiinflamatorios no esteroideos (AINES)
Los AINES son un grupo heterogéneo de fármacos con estructura química diferente, pero con efectos bastante semejantes entre ellos. Se utilizan extensamente tanto en medicina humana como en veterinaria, debido a sus propiedades antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas [21]. En la Fig. 3 se muestran las estructuras químicas de los AINES empleados como analitos en esta memoria.
14
IntroducciónFigura 3. Estructuraquímicade los AINES analizados en esta memoria.
En animales productores de alimentos, estos fármacos se emplean principalmente para el tratamiento de enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades infecciosas, mastitis, enfermedades pulmonares y enteritis. Sin embargo, en ocasiones, los AINES también pueden administrarse fraudulentamente para mejorar la calidad del producto final, como, por
COOH O CH3
Ketoprofeno
H3C
CH3 COOH
CH3
Ibuprofeno
O H3C
COOH CH3
Naproxeno
F3C
CH3 H N COOH Flunixino S N H3C
N H
N S H3C
Int
ejemplo, para la obtención de carnes más pálidas y la reducción de grasa. Debido a su extendida utilización, es muy importante controlar la presencia de los residuos de AINES en los productos de origen animal, puesto que suponen un riesgo potencial y pueden llegar a ocasionar graves trastornos en la salud de los consumidores. Así, se ha demostrado en numerosos estudios que una exposición prolongada a estos fármacos puede causar efectos adversos en el sistema gastrointestinal, hematopoyético y renal, además, como todos los medicamentos, pueden interaccionar con otros fármacos y causar a su vez reacciones alérgicas [23, 24].
➢
Micotoxinas con actividad estrogénica no esteroidea
Las micotoxinas son sustancias tóxicas producidas por el metabolismo secundario de los hongos [25]. En concreto, existen unas micotoxinas con acción estrogénica, cuya estructura química corresponde a una lactona de ácido resorcicíclico, que son producidas por varias especies de hongos
pertenecientes al género Fusarium, que afectan principalmente a los
cereales [26]. Dentro de este grupo se incluyen la zearalenona y sus metabolitos α-zearalenol y β-zearalenol, la zearalanona (derivado de origen semi-sintético de la zearalenona) y los compuestos sintéticos α-zearalanol y β-zearalanol, también conocidos como zearanol y taleranol, respectivamente [27].
16
Introducciónanimales, ya que favorece la retención del nitrógeno de la orina y mejora la síntesis de proteína muscular. Generalmente, se administran para mejorar la conversión alimenticia y el aprovechamiento de los nutrientes por parte del animal [26].
En ocasiones, la presencia de estas sustancias en los alimentos de origen animal no se debe al uso incorrecto de las prácticas veterinarias, sino que en el caso de aquellas que son de origen natural, puede ser debida a la intoxicación del animal por la ingesta de alimentos contaminados con estas micotoxinas naturales. Por tanto, es importante controlar la presencia de estas sustancias en los alimentos de origen animal, independientemente de que sea de forma accidental o por un uso incorrecto de estos compuestos. La exposición de los consumidores a este tipo de sustancias con actividad estrogénica puede producir alteraciones en su sistema endocrino, que pueden perturbar los mecanismos homeostáticos del cuerpo, iniciando procesos anormales en el organismo [28].
Dentro de todos estos compuestos, el α-zearalanol es el que presenta
mayor actividad estrogénica, ya que, de todos ellos, es el que muestra mayor afinidad por los receptores estrogénicos [29]. Por este motivo, y al ser de origen sintético, en esta Tesis Doctoral se ha seleccionado, dentro de este grupo de compuestos, el α-zearalanol como analito de estudio, cuya estructura química se muestra en la Fig. 4.
α-Zearalanol
HO HO
O
O OH
H3C
Int
I.3 CALIDAD ALIMENTARIA
La palabra “calidad” procede etimológicamente de la palabra latina “qualitas” que significa “atributo, propiedad o naturaleza básica de un objeto”, por tanto, la calidad alimentaria está estrechamente ligada a las cualidades intrínsecas de un alimento, a partir de las cuales se puede juzgar su valor. De acuerdo a la Ley 28/2015, de 30 de julio, para la defensa de la calidad alimentaria [30], ésta se define como el “conjunto de propiedades y características de un producto alimenticio o alimento relativas a las materias primas o ingredientes utilizados en su elaboración, a su naturaleza, composición, pureza, identificación, origen y trazabilidad, así como a los procesos de elaboración, almacenamiento, envasado y comercialización utilizados y a la presentación del producto final, incluyendo su contenido efectivo y la información al consumidor final, especialmente el etiquetado”. Por lo que, en definitiva, la calidad alimentaria se entiende como el conjunto de cualidades que hacen que los alimentos sean aceptados por los consumidores, entre las que se incluyen la cualidad sensorial (aquellas cualidades percibidas por los sentidos, como el sabor, olor, color, textura y apariencia de un producto), la cualidad higiénica, la cualidad química, la cualidad nutricional y la cualidad tecnológica.
18
Introducciónpara satisfacer el hambre y las necesidades nutricionales, sino también como productos que contribuyan a prevenir el desarrollo de ciertas enfermedades asociadas a la nutrición, así como para mejorar el bienestar físico y mental [31]. Esto ha ocasionado que los consumidores se vean en la necesidad de seleccionar aquellos alimentos que puedan suponer una ventaja para mejorar su bienestar y calidad de vida, por lo que, en los últimos años, la industria alimentaria ha experimentado una gran demanda por parte de los consumidores de desarrollar productos saludables de gran calidad nutricional cuyo consumo aporte ciertos beneficios sobre el organismo [32, 33].
Los beneficios asociados al consumo de los alimentos se deben a su contenido en determinados compuestos, que más allá de contribuir al valor nutricional básico de un alimento, son capaces de actuar sobre el organismo promoviendo efectos beneficiosos y saludables sobre él. A este tipo de compuestos se les conoce como “compuestos bioactivos” [31].
I.3.1 Compuestos bioactivos
Int
Existen numerosas evidencias que ponen de manifiesto la existencia de compuestos bioactivos en muchos alimentos comunes de la dieta, tanto de origen animal como de origen vegetal, tales como, frutas, verduras, pescados, productos lácteos y cereales, entre otros [34]. No obstante, a pesar de que los alimentos de origen animal pueden aportar compuestos bioactivos, como por ejemplo los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de pescado, el ácido linoleico conjugado (CLA) de carne de rumiantes, péptidos de lácteos, luteína de yema de huevo, etc., son los productos de origen vegetal los que sintetizan una gran cantidad de compuestos bioactivos, denominados también fitoquímicos, que son componentes de los vegetales, generalmente producto de su metabolismo secundario, con papeles específicos en el crecimiento y supervivencia de las plantas, que a su vez, son fisiológicamente activos cuando se consumen [35, 36].
Los principales compuestos bioactivos se pueden clasificar según su origen biosintético en tres grandes grupos: terpenoides (carotenoides y esteroles), compuestos fenólicos y compuestos nitrogenados [36] (Fig. 5). Esta Tesis Doctoral se centrará en el estudio de los compuestos fenólicos, debido a su gran abundancia en los alimentos de origen vegetal, su amplia variedad y al gran interés de sus numerosos efectos beneficiosos sobre el organismo asociados a su consumo.
I.3.2 Compuestos fenólicos
20
Introducciónfitoquímicos procedentes del metabolismo secundario de las plantas, sintetizados a partir de la ruta del ácido shiquímico y/o del ácido malónico [36, 39] (Fig. 5). En general, estos compuestos tienen un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la mayoría de las plantas, ya que realizan funciones importantes para la supervivencia de las mismas como, por ejemplo: protección frente a radiaciones ultravioleta, altas temperaturas, baja disponibilidad de agua, así como ante ataques de microorganismos. Asimismo, favorecen la atracción de insectos polinizadores y animales que dispersan las semillas, y actúan como señales moleculares en la formación de nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces. Además, estos compuestos también tienen implicaciones significativas en las características organolépticas de las frutas y de los vegetales, confiriendo aroma, sabor, olor, astringencia o amargor a los productos que los contienen [36, 40].
Figura 5. Esquema de las rutas biosintéticas de los metabolitos secundarios de
Int
Los compuestos fenólicos constituyen un grupo con un gran número de sustancias ampliamente distribuidas en el reino vegetal, donde se han llegado a identificar más de 8000 compuestos, todos ellos con estructuras y propiedades muy diversas [39]. Todos estos compuestos se caracterizan por tener una estructura básica común, que consta de un anillo aromático unido a uno o más grupos hidroxilo, y que a su vez pueden presentar otros grupos funcionales como ésteres, metil ésteres, glicósidos, etc. [40]. De esta manera, pueden variar desde moléculas fenólicas simples, hasta compuestos altamente polimerizados. Los compuestos fenólicos se pueden clasificar según su fuente de origen, función biológica o estructura química. La clasificación estructural divide los compuestos fenólicos en diferentes clases según el número de anillos que contengan y los sustituyentes que lleven unidos [41]. En este sentido, en función de su estructura química, se pueden distinguir 4 grupos de familias: ácidos fenólicos, estilbenos, lignanos y flavonoides (Fig. 6). Los cuales a su vez pueden clasificarse en compuestos no flavonoideos (en los que se incluyen los ácidos fenólicos, los estilbenos y los lignanos) y compuestos flavonoideos (que engloba todos los flavonoides).
Int
➢ Clasificación y presencia de compuestos fenólicos en los alimentos
• Ácidos fenólicos
La estructura química de este tipo de compuestos se caracteriza por presentar un único anillo aromático unido a un grupo ácido funcional, lo que da lugar a diferentes estructuras según los sustituyentes carbonados que presente dicho núcleo [41, 43]. En este sentido, dentro de este grupo de compuestos, se distinguen principalmente dos familias: los ácidos hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos, cuyas estructuras químicas son de tipo C1-C6 y C3-C6, respectivamente, tal y como se muestra en la Fig. 7.
Figura 7. Estructura química general de los ácidos fenólicos.
Los ácidos hidroxibenzoicos se caracterizan por presentar un grupo carboxilo en el sustituyente del grupo fenol (el anillo aromático). Los diferentes ácidos hidroxibenzoicos se distinguen según la posición que ocupen los diferentes sustituyentes hidroxilo y/o metoxilo en el anillo, entre ellos destacan el ácido gálico, el ácido protocatéquico, el ácido vainíllico y el ácido siríngico [41, 43]. La Fig. 8 muestra las estructuras químicas de los ácidos hidroxibenzoicos empleados como analitos de estudio en esta memoria. Estos compuestos están presentes fundamentalmente en el té y en frutas como moras, frambuesas, fresas, granada y caqui, así como en las nueces, avellanas y en los vinos madurados en barricas de madera de roble [38, 43]. En menor cantidad pueden encontrarse en leguminosas, verduras y hortalizas (ajos, cebollas, espárragos y zanahorias), cereales y en frutas
Compuesto Radical (R)
Ácido hidroxibenzoico COOH
Introducción
24
como la pera y la ciruela. Generalmente, estos ácidos se encuentran presentes como componentes de estructuras más complejas, conocidas como taninos hidrolizables, formadas por la esterificación de estos compuestos con uno o varios grupos hidroxilo procedentes de una molécula de azúcar, como por ejemplo los galotaninos en mangos y los elagitaninos en las bayas y en la granada [38, 41, 43].Figura 8. Estructura química de los ácidos hidroxibenzoicos analizados en esta
memoria.
Por su parte, los ácidos hidroxicinámicos se caracterizan por tener como sustituyente una cadena lateral de 3 carbonos ácida unida al anillo aromático (Fig. 7). Se distinguen entre sí en función de la posición que ocupan los sustituyentes metoxilo y/o hidroxilo en el anillo, en este sentido, entre ellos desatacan el ácido cumárico, el ácido cafeico, el ácido ferúlico y el ácido sinápico [41, 43]. La Fig. 9 muestra las estructuras químicas de los ácidos hidroxicinámicos empleados como analitos de estudio en esta memoria. Estos compuestos son más comunes que los ácidos hidroxibenzoicos, y están presentes en una gran variedad de alimentos, como las frutas (moras, arándanos, kiwis, pomelo, ciruela, cerezas, uvas y manzanas), los tomates, el vino y el café. En los cereales destaca el contenido de ácido ferúlico, que es el compuesto fenólico más abundante del trigo, el arroz, la avena y el maíz [38, 43].
Compuesto R1 R2
Ácido gálico OH OH
Ácido protocatéquico H OH
Ácido vanílico H OCH3
Int
Figura 9. Estructura química de los ácidos hidroxicinámicos analizados en esta
memoria.
Normalmente, los ácidos hidroxicinámicos suelen encontrarse glicosilados o esterificados con ácido quínico, ácido siquímico o ácido tartárico. Los conjugados formados por la esterificación del ácido cafeico con el ácido tartárico o con los ácidos quínicos se conocen como ácido caftárico y ácido clorogénico, respectivamente (Fig. 10). El ácido clorogénico es muy abundante en muchas frutas, como las manzanas y los frutos rojos, especialmente en los arándanos, así como en el café y en el té [38, 41, 43].
Figura 10. Estructura química de los ácidos caftárico y clorogénico, analizados en
esta memoria.
Compuesto R1 R2
Ácido p-cumárico H H
Ácido cafeico OH H
Ácido ferúlico OCH3 H
Introducción
26
• Lignanos
Los lignanos se forman por la dimerización de dos unidades fenilpropanoides unidas por un puente de hidrógeno en la posición 8-8’, por
lo que presentan una estructura (C6-C3)2, tal y como se muestra en la Fig. 6.
Esta estructura es similar a la de la hormona estradiol, por lo que los lignanos se consideran fitoestrógenos, ya que son compuestos con actividad estrogénica o antiestrogénica [40]. Entre ellos destacan el matairesinol, el secoisalariciresinol, el pinoresinol y el laricresinol [41]. Las principales fuentes dietéticas de estos compuestos son la linaza y el sésamo, y también pueden encontrarse en menores concentraciones en los granos de cereal (centeno, trigo, avena y cebada), semillas oleaginosas y frutos secos (semillas de girasol, semillas de calabaza, anacardos, etc.), frutas (albaricoques, melocotones, fresas), verduras y hortalizas (brócoli, coles, ajo, zanahoria y espárragos), aceite de oliva y bebidas, como vino, cerveza, té y café [38, 43].
• Estilbenos
Los estilbenos son compuestos formados por la unión de dos anillos aromáticos a través de un doble enlace (Fig. 6), dando lugar a una estructura
de tipo C6-C2-C6 en sus dos posibles formas isoméricas, cis y trans [41]. Son
compuestos minoritarios de la dieta humana y no se encuentran con frecuencia en las plantas. El más relevante de todos ellos, debido a sus propiedades antioxidantes, anti-carcinogénicas, antiinflamatorias,
cardio-protectoras y neuro-cardio-protectoras, es el trans-resveratrol, tanto en su forma
Int
arándanos y uvas), el oxiresveratrol (en especies de la familia Fabaceae), el piceatanol y la pinosilvina (característicos de las especies de la familia Pinaceae) [38, 41, 43].
Figura 11. Estructura química de los estilbenos analizados en esta memoria.
• Flavonoides
Los flavonoides constituyen el grupo más extenso de compuestos fenólicos presentes en la naturaleza. Son compuestos de baja masa molecular con una estructura química común de tipo C6-C3-C6, que consta de dos anillos aromáticos (A y B) unidos por una cadena de 3 átomos de carbono, que normalmente forman un anillo heterocíclico de oxígeno (C) [41, 43], tal y como se muestra en la Fig. 6. En función del grado de oxidación y de la sustitución del heterociclo, los flavonoides pueden clasificarse en
distintos grupos: flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas,
antocianidinas y flavanoles, chalconas y dihidrochalconas. A su vez, dentro de cada grupo flavonoideo, se pueden distinguir diferentes compuestos en función del número y localización de los grupos hidroxilo y/o metoxilo en los anillos aromáticos A y B [43].
Introducción
28
sustituyentes del anillo B, siendo la quercetina, el kaempferol y la miricetina los compuestos más representativos de este grupo (Fig. 12) [41, 43].Figura 12. Estructura química de los flavonoles analizados en esta memoria.
Normalmente, en los alimentos se encuentran glicosilados, unidos principalmente a glucosa y/o ramnosa, destacando entre ellos la rutina, aunque también pueden unirse a otros azúcares como la galactosa, arabinosa, xilosa y al ácido glucurónico [38]. Las principales fuentes dietéticas de estos compuestos son las frutas y verduras, como por ejemplo las cebollas, las coles, los puerros, el brócoli, el tomate, los arándanos, las grosellas, las manzanas, los albaricoques, las peras, las judías y las cerezas, además del vino tinto, el té, el chocolate y las especias [38, 41, 43]. La Fig. 13 muestra las estructuras químicas de los flavonoles glicosilados empleados como analitos en esta memoria.
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5
Quercetina OH OH OH OH H
Miricetina OH OH OH OH OH
Int
Figura 13. Estructura química de la rutina y de la quercetina 3-β-D-glucósido, analizadas en esta memoria.
Las flavonas presentan una estructura muy similar a los flavonoles, que se caracteriza por tener un doble enlace entre los carbonos 2 y 3 (Fig. 6), sin embargo, son menos comunes en las frutas y verduras. Las flavonas más representativas son la apigenina, la luteolina, la wogonina, la baicaleína, la tangeretina, la crisina y la 6-hidroxiflavona [41, 43]. Estos compuestos se encuentran en importantes cantidades en el perejil, el apio, el pimiento dulce y en plantas aromáticas como la mejorana. Además, se han encontrado flavonas polimetoxiladas, como la tangeretina, la nobiletina y la sinensetina, en la piel de los cítricos, como la mandarina, y también pequeñas cantidades de las formas glucoconjugadas de apigenina y luteolina en las hojas de
arbusto sudafricano Aspalathus linearis, que se emplea para hacer el té
rooibos, y en el aceite de oliva virgen, las aceitunas, el tomillo, el orégano y las alcachofas. A su vez, las flavonas pueden estar presentes como C-glicosidos en algunos cereales, como el mijo y el trigo [38, 41, 43].
Las isoflavonas se caracterizan por tener el anillo B unido al carbono 3 (Fig. 6). Estos compuestos se consideran fitoestrógenos, ya que tienen una estructura muy similar a los estrógenos, con grupos hidroxilo en las posiciones 7 y 4’ de forma análoga a la configuración de la molécula de
Introducción
30
estradiol, por lo que presentan la capacidad de unirse a los receptores de estrógenos, dando lugar a efectos pseudohormonales [38, 41, 43]. Las isoflavonas se encuentran casi de forma exclusiva en las leguminosas, siendo la soja y sus productos derivados las principales fuentes de estos compuestos en la dieta humana. La genisteína, la daidzeína y la gliciteína son los compuestos más representativos de este grupo, y generalmente, suelen estar presentes en su forma libre, no unidas a azúcares [38, 41, 43].Las flavanonas se caracterizan por la ausencia del doble enlace entre el carbono 2 y 3, y por tener un centro quiral en C2 (Fig. 6). En las plantas suele
predominar el enantiómero con configuración α. Las principales formas
agliconas son la naringenina, hesperetina y eriodictiol, que se encuentran mayoritariamente en pomelos, naranjas y limones, respectivamente [41, 43]. No obstante, estos compuestos suelen encontrarse glicosilados en la posición C7, dando lugar a glucósidos como la hesperidina, que carece de sabor, o la neohesperidina y naringina, que poseen un intenso sabor amargo [38, 41, 43]. Los mayores contenidos de flavanonas se encuentran en las frutas cítricas, pero también pueden estar presentes en menor concentración en tomates y en algunas hierbas aromáticas, como la menta [38, 43]. La Fig. 14 muestra la estructura química de las flavanonas estudiadas en esta memoria.
Figura 14. Estructura química de las flavanonas analizadas en esta memoria.
Naringenina
Int
Las antocianidinas son pigmentos responsables del color de la mayoría de los frutos, las flores y otros tejidos de las plantas. La gama de colores va desde el naranja y el rojo hasta el azul y el morado, en función del pH y de la conjugación de estas sustancias con otros compuestos. A su vez, la intensidad del color suele ser proporcional al contenido de antocianidinas, el cual se incrementa a medida que tiene lugar la maduración del fruto [44]. Estructuralmente, estos compuestos derivan del 2-benzopirilio o ion flavilio (o flavilium), y es el único grupo de flavonoides constituidos por un radical de carácter catiónico. Asimismo, presentan un grupo hidroxilo en la posición C3 [41] (Fig. 6). Dentro de este grupo destacan la malvidina, cianidina, pelargonidina, delfinidina, ptunidina y peonidina [38, 41, 43]. Generalmente, las antocianidinas suelen estar presentes en su forma glicosilada, normalmente unidas a una molécula de glucosa en la posición C3, puesto que esta unión confiere estabilidad frente a cabios de pH, luz y condiciones de oxidación, previniendo así su degradación [41]. A las antocianidinas glicosiladas se las denomina antocianinas o antocianos, que se diferencian entre sí por las sustituciones hidroxilo y/o metoxilo del anillo B, y por la naturaleza y número de ácidos que esterifican los azúcares a los que se
encuentran unidos (principalmente ácido p-cumárico y ácido p-cafeico),
Introducción
Int
Figura 15. Estructura química de los flavanoles analizados en esta memoria.
A su vez, las unidades monoméricas pueden polimerizar entre sí, dando lugar a procianidinas, que consisten en dímeros, trímeros y polímeros formados por unidades de catequinas o epicatequinas unidas por enlaces carbono-carbono (C-C) entre las posiciones C4-C8 y C4-C6, pudiendo llegar en última instancia a la formación de polímeros complejos denominados proantocianidinas o taninos condensados [41, 43]. Según el tipo de unión que sucede entre las unidades monoméricas, pueden distinguirse dos tipos de proantocianidinas: de tipo A o de tipo B. Las de tipo A presentan un enlace adicional C2-O-C7 o C2-O-C5, además del enlace común C4-C8 o C4-C6, mientras que las de tipo B tan solo presentan el enlace C4-C8 o C4-C6 (Fig. 16). Las proantocianidinas son responsables del carácter astringente de los alimentos, y están presentes en una gran variedad de frutas (como las uvas,
(+)-Catequina (-)-Epicatequina
(-)-Epigalocatequina
Introducción
34
las manzanas, las peras, los melocotones, las ciruelas, las fresas, los arándanos, el kiwi, el caqui, etc.), cereales (sorgo, cebada, etc.), legumbres y frutos secos (judías, guisantes, almendras, etc.), hierbas y especias (comino, tomillo, vainilla, canela, lúpulo), así como en otros productos como el vino, el té, la sidra, la cerveza y el chocolate [38, 43].Figura 16. Representación de una proantocianidina de tipo A y de una
proantocianidina de tipo B.
