Identificación y análisis funcional de variaciones de la secuencia del Gen FOXC1 en glaucoma congénito primario

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(1)Universidad de Castilla-La Mancha Facultad de Medicina Departamento de Ciencias Médicas. IDENTIFICACIÓN Y ANALISIS FUNCIONAL DE VARIACIONES DE LA SECUENCIA DEL GEN FOXC1 EN GLAUCOMA CONGÉNITO PRIMARIO. TESIS DOCTORAL Cristina Medina Trillo Albacete, 2014 1.

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(3) Universidad de Castilla-La Mancha Facultad de Medicina Departamento de Ciencias Médicas. IDENTIFICACIÓN Y ANALISIS FUNCIONAL DE VARIACIONES DE LA SECUENCIA DEL GEN FOXC1 EN GLAUCOMA CONGÉNITO PRIMARIO. Cristina Medina Trillo. Director: Prof. Dr. Julio Escribano Martínez Memoria para optar al GRADO de DOCTOR Albacete, 2014. 3.

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(5) Facultad de Medicina. Albacete, 12 de febrero de 2014.. D. Julio Escribano Martínez, Doctor en CC. Biológicas y Catedrático de Genética en la Universidad de Castilla-La Mancha. CERTIFICA:. Que Doña Cristina Medina Trillo, Licenciada en Biología por la Universidad de Alicante, ha realizado bajo su dirección el trabajo de Tesis Doctoral que lleva por título “IDENTIFICACIÓN Y ANALISIS FUNCIONAL DE VARIACIONES DE LA SECUENCIA DEL GEN FOXC1 EN GLAUCOMA CONGÉNITO PRIMARIO”, para optar al grado de Doctor. Revisada la presente memoria, considero que reúne los requisitos necesarios para ser presentada y defendida ante el Tribunal correspondiente.. Fdo.: Prof. Dr. Julio Escribano Martínez Catedrático de Genética Área de Genética, Facultad de Medicina Universidad de Castilla-La Mancha Avda. de Almansa 14, 02006 Albacete Tel.: 967 599200, ext.: 2928 Email: [email protected]. 5 Avda. de Almansa,14, 02006-Albacete, Spain | Telf.: 902 599200.

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(7) Facultad de Medicina. Financiación Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación procedente del Instituto de Salud Carlos III (Ministerio Ministerio de Ciencia e Innovación) a través de doss redes r temáticas de investigación RETICS (Red Temática de Investigación Cooperativa Sanitaria; Sanitaria RD07/0062/0014 y RD12/0034) y de un proyecto de investigación en salud (PI11/00662).. 7.

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(9) Me gustaría dedicar unas palabras de gratitud a todas aquellas personas que durante estos años de trabajo han estado a mi lado, compañeros, amigos y familia que de una forma u otra han contribuído en esta tesis doctoral. En primer lugar deseo agradecer a mi director de tesis, el Profesor Dr. Julio Escribano el haber confiado en mí, su constante ayuda y su ejemplo de pasión por el trabajo. Quiero agradecer al Dr. Francisco Sanchez todo lo que he podido aprender de él a lo largo de estos años. A mis compañeros de laboratorio Dani, Pilar, Fran, Ana, Juanma y Jesús. Os quiero agradecer el apoyo que me habéis dado y vuestra ayuda invaluable en todo momento. A pesar de lo difícil del camino habéis conseguido que solo las risas acompañen nuestro trabajo diario. A Maria José Cabañero por su labor metódica e impecable. Quiero mostrar un agradecimiento especial a mis amigas más queridas de Socuéllamos y de Albacete. Siempre habéis confiado en mi capacidad para finalizar este trabajo animándome a seguir adelante. A Jesús, porque gracias a su cariño, paciencia y apoyo constante he sacado las fuerzas diarias para terminar este objetivo. Gracias por haberme acompañado y por compartir esta experiencia de vida. Pero mi mayor agradecimiento se lo debo a mi familia, por apoyarme en todas mis decisiones, por enseñarme a perseverar y hacer que hoy sea quien soy.. 9.

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(11) Índice. Índice I. RESUMEN ............................................................................................................ 15 II. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 21 II.1. Glaucoma. .............................................................................................................23 II.1.1. Definición. ................................................................................................................. 23 II.1.2. Epidemiología: impacto y prevalencia. ..................................................................... 23 II.1.3. Características clínicas............................................................................................... 24 II.1.4. Diagnóstico del glaucoma. ........................................................................................ 26 II.1.5. Clasificación del glaucoma. ....................................................................................... 28. II.2. Glaucoma Congénito Primario. .............................................................................31 II.2.1. Definición. ................................................................................................................. 31 II.2.2. Desarrollo embrionario de la red trabecular. ........................................................... 31 II.2.3. Clasificación. .............................................................................................................. 34 II.2.4. Epidemiología: impacto y prevalencia. ..................................................................... 35 II.2.5. Características clínicas............................................................................................... 35 II.2.6. Genética del glaucoma congénito primario. ............................................................. 38. II.3. El gen FOXC1. ........................................................................................................39 II.3.1. La familia de genes FORKHEAD. ................................................................................ 39 II.3.2. Estructura y localización cromosómica del gen FOXC1. ............................................ 41 II.3.3 Identificación del gen FOXC1...................................................................................... 43 II.3.4. Expresión durante el desarrollo embrionario. .......................................................... 44 II.3.5. Mutaciones del gen FOXC1. ...................................................................................... 45 II.3.6. Modelos animales y mutaciones en genes ortólogos. .............................................. 48 II.3.7. Papel del gen FOXC1 en el desarrollo ocular............................................................. 50. III. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 51 IV. OBJETIVOS ........................................................................................................ 55 V. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 59 V.1. Sujetos. .................................................................................................................61 V.1.1. Diseño del estudio..................................................................................................... 61 V.1.2. Criterios de inclusión................................................................................................. 61 V.1.3. Consentimiento informado y confidencialidad......................................................... 62 11.

(12) Índice V.1.4. Recogida de datos y muestras. ................................................................................. 63. V.2. Análisis de ADN. ....................................................................................................63 V.2.1. Extracción de ADN genómico.................................................................................... 63 V.2.2. Electroforesis en geles de agarosa............................................................................ 64 V.2.3. Amplificación de ADN mediante PCR. ....................................................................... 64 V.2.4. Secuenciación automática de ADN mediante el método de Sanger. ....................... 67. V.3. Análisis de las variaciones de la secuencia. ..........................................................68 V.3.1. Genotipado mediante secuenciación automática según el método de Sanger. ...... 68 V.3.2 Genotipado mediante sonda Taqman. ...................................................................... 68 V.3.3. Genotipado de la variante polimórfica p.G447dup mediante análisis de la longitud de los fragmentos amplificados. ......................................................................................... 68 V.3.4. Análisis de las mutaciones no polimórficas mediante comparación de secuencias de aminoácidos ........................................................................................................................ 69 V.3.5. Análisis de asociación de los polimorfismos genéticos............................................. 69. V.4. Construcciones de ADNc. .....................................................................................70 V.4.1. Clonación del ADNc del gen FOXC1........................................................................... 70 V.4.2. Mutagénesis dirigida. ................................................................................................ 71 V.4.3. Obtención de variantes del gen FOXC1 a partir del ADN genómico de pacientes. .. 73 V.4.4. Síntesis química de variantes del gen FOXC1............................................................ 74 V.4.5. Clonación del promotor del gen CXCR4. ................................................................... 75 V.4.6. Obtención de los haplotipos no polimórficos. .......................................................... 76. V.5. Expresión transitoria y análisis de las proteínas recombinantes en la línea celular humana HEK-293T. ......................................................................................................77 V.5.1. Cultivo de células. ..................................................................................................... 77 V.5.2. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida e inmunodetección por transferencia Western. ....................................................................................................... 78 V.5.3. Ensayo de la actividad transcripcional de FOXC1. .................................................... 79 V.5.4. Ensayo de la actividad enzimática de la proteína CYP1B1. ....................................... 81 V.5.5. Ensayo de estabilidad de la proteína FOXC1. ........................................................... 82 V.5.6. Localización subcelular de las proteínas recombinantes mediante microscopía de fluorescencia. ...................................................................................................................... 83 V.5.7. Identificación de sitios de unión de miRNA. ............................................................. 84 V.5.8. Preparación de extractos nucleares y análisis de la unión de proteínas al ADN mediante ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética. .............................. 85 V.5.9. Tratamiento de FOXC1 con fosfatasa alcalina .......................................................... 86 12.

(13) Índice V.5.10. Análisis bioinformático. .......................................................................................... 86 V.5.11. Nomenclatura de las variaciones de secuencia. ..................................................... 87 V.5.12. Análisis estadístico .................................................................................................. 87. VI. RESULTADOS ..................................................................................................... 89 VI.1. Fenotipo de los pacientes. ...................................................................................91 VI.2. Identificación de variaciones de la secuencia del gen FOXC1. ............................92 VI.3. Segregación de las mutaciones del gen FOXC1. ..................................................96 VI.3.1. Variantes raras. ........................................................................................................ 96 VI.3.1.1. Glaucoma de herencia autosómica dominante. ............................................... 96 VI.3.1.2 Glaucoma de herencia no dominante................................................................ 99 VI.3.1.2 A) Mutaciones localizadas en regiones reguladoras no codificantes. ........... 99 VI.3.1.2 B) Mutaciones localizadas en la región codificante. .................................... 102 VI.3.1.3 Glaucoma de herencia oligogénica. ................................................................. 102 VI.3.1.3 A) Glaucoma de herencia digénica. ............................................................. 103 VI.3.1.3 B) Posible herencia digénica trialélica.......................................................... 105 VI.3.1.3 C) p.G447dup como posible factor modificador del fenotipo. .................... 108 VI.3.2. Variantes polimórficas....................................................................................... 108. VI.3.2.1 Análisis de asociación de los polimorfismos del gen FOXC1 con GCP y con GIT. ....................................................................................................................................... 109 VI.3.2.2 Análisis de asociación de los haplotipos del gen FOXC1 con GCP y con GIT.... 112. VI.4 Análisis funcionales de la proteína FOXC1. ........................................................113 VI.4.1.Evaluación de la patogenicidad de las variantes raras. .......................................... 113 VI.4.1.1 Análisis in silico del efecto funcional. .............................................................. 113 VI.4.1.2 Análisis de la conservación evolutiva de las variantes..................................... 116 VI.4.1.3. Análisis de la actividad transcripcional in vitro mediante ensayo quimioluminiscente de luciferasa. ................................................................................ 118 VI.4.1.4. Análisis de la estabilidad proteica de las variantes de FOXC1. ....................... 122 VI.4.1.5 Análisis de unión de proteínas al ADN mediante ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética de ADN (EMSA). ............................................................... 125 VI.4.1.6. Identificación de dianas de miRNA. ................................................................ 126 VI.4.1.7. Localización subcelular de las variantes de FOXC1 mediante microscopía de fluorescencia. ................................................................................................................ 130 VI.4.1.8. Análisis del estado de fosforilación de FOXC1. ............................................... 132 VI.4.2. Evaluación de la patogenicidad de las variantes polimórficas............................... 136. 13.

(14) Índice VI.4.2.1. Análisis de la actividad transcripcional mediante ensayos de expresión con luciferasa. ...................................................................................................................... 136 VI.4.2.2. Análisis de la estabilidad proteica de las variantes polimórficas del gen FOXC1. ....................................................................................................................................... 138 VI.4.2.3. Análisis de unión al ADN mediante la detección del complejo proteína-ácido nucleico (EMSA). ........................................................................................................... 140. VII. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 143 VII.1. Genética del glaucoma congénito primario. ....................................................145 VII.2. Papel del gen FOXC1. ........................................................................................146 VII.3. Patogenicidad de las mutaciones dominantes del gen FOXC1. .......................147 VII.4. Patogenicidad de las mutaciones no dominantes del gen FOXC1. ..................151 VII.5. Herencia oligogénica. .......................................................................................155 VII.5.1. Herencia digénica.................................................................................................. 155 VII.5.3. El polimorfismo p.G447dup como factor modificador del fenotipo..................... 158 VII.5.3. Asociación del polimorfismo p.G447dup con GCP y con GIT................................ 159. VII.6. Relación entre la actividad transcripcional de FOXC1 y la herencia del glaucoma. ...................................................................................................................160 VII.7. GCP y GIT como modelo de enfermedad compleja. ........................................162 VII.8. Futuras investigaciones. ...................................................................................163 VIII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 165 IX. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................. 169 X. MATERIALES SUPLEMENTARIOS........................................................................ 181 X.1. Reactivos. ............................................................................................................183 X.1.1. Reactivos y productos químicos. ............................................................................. 183 X.1.2. Tampones y soluciones. .......................................................................................... 184 X.1.3. Marcadores de peso molecular............................................................................... 185 X.1.4. Medio de cultivo. .................................................................................................... 185 X.1.5. Vectores. ................................................................................................................. 186. XI RESULTADOS SUPLEMENTARIOS ....................................................................... 189 XI.1. Frecuencia de las mutaciones y análisis de asociación con glaucoma.................. 191. XII ANEXO (PRODUCCIÓN CIENTÍFICA) .................................................................. 195 XII.1. Publicaciones en revistas científicas. ................................................................... 197 XII.2. Comunicaciones a congresos. .............................................................................. 197 XII.3. Premios recibidos. ................................................................................................ 198 14.

(15) I. RESUMEN. 15.

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(17) Resumen. El glaucoma congénito primario (GCP) es una enfermedad ocular grave y poco frecuente, producida por un desarrollo anómalo del ángulo iridocorneal. Ello origina la obstrucción del drenaje del humor acuoso y la elevación de la presión intraocular (PIO), que conduce a la lesión irreversible del nervio óptico. La enfermedad puede llegar a producir ceguera si no es tratada a tiempo. Las bases genéticas y moleculares de la patología no son todavía bien conocidas. Se han descrito casos de herencia recesiva, de herencia dominante y también esporádicos, con una incidencia de aproximadamente 1:10.000-1:30.000 nacimientos en poblaciones occidentales. Se conocen 3 loci (1p36, 2p22.2 y 14q24), y dos genes (CYP1B1 y LTBP2, localizados en 2p22.2 y 14q24.3, respectivamente) implicados en este tipo de glaucoma. CYP1B1 origina la enfermedad en un porcentaje variable de los pacientes, que puede oscilar entre el 10% y el 50% según las poblaciones. LTBP2 sólo es responsable de la patología en un pequeño número de familias paquistaníes. También se ha descrito la presencia de mutaciones del gen FOXC1 en un porcentaje reducido de pacientes indios. Por lo tanto, las causas genéticas de esta enfermedad permanecen desconocidas en la mayor parte de los casos. El objetivo principal de este trabajo ha sido identificar variaciones de la secuencia del gen FOXC1 en pacientes con glaucoma congénito primario (0-3 años) y en pacientes con glaucoma de inicio temprano (GIT) (4-35 años) para analizar su relación con la enfermedad. Se rastreó el gen mediante secuenciación por el método de Sanger en 133 familias afectadas de GCP y en 16 familias afectadas de GIT en las que se había descartado la existencia de mutaciones en los genes CYP1B1 y MYOC que pudieran explicar la enfermedad. Además, se analizó el posible papel como factor de riesgo genético de algunas variantes de secuencia que no mostraban una segregación mendeliana. Para ello, se realizó un estudio de casos y controles en el que se analizaron un total de 133 casos índice que presentaban GCP y 233 individuos control. Con la finalidad de evaluar el defecto funcional de las variantes identificadas en los pacientes, éstas fueron clonadas y expresadas transitoriamente en una línea celular humana (HEK-293T) y se analizó su efecto sobre la actividad transcripcional, capacidad de unión al ADN, estabilidad de la proteína o del ARNm y traducción.. 17.

(18) Resumen. Se detectaron 9 mutaciones raras en heterocigosis en 14 probandos diagnosticados con GCP (10,5%). Cuatro de ellas (c.-430G>C, p.Y47X, p.G379fsX144 y p.H446_G447insGD) no habían sido descritas previamente. Las mutaciones p.Y47X, p.Q106X, p.I126S-c.2396A>T y p.H446_G447insGD han sido identificadas en 3 familias con glaucoma de herencia dominante y expresividad variable (2,25%). Las variantes p.P297S, c.-430G>C, c.-244C>T, p.G379fsX144 y c.2396A>T se detectaron en 10 casos de GCP con una herencia no mendeliana (7,5%) y han mostrado una menor alteración de la transcripción que las variantes dominantes. La mayor parte de las mutaciones afectan a la región codificante del gen y predicen cambios de aminoácidos, inserciones y deleciones que perturban a aminoácidos y regiones de la proteína evolutivamente muy conservadas, lo que apoya su patogenicidad. Los ensayos funcionales revelaron una disminución de la actividad transcripcional de aproximadamente un 40% para los mutantes p.I126S y p.P297S (alelos hipomorfos). Las mutaciones raras p.Y47X, p.Q106X y p.G379fsX144 mostraron un incremento de la actividad transcripional de casi el 200%, por lo que se clasificaron como variantes hipermorfas. El polimorfismo p.GD447dup presentó una actividad transcripcional de aproximadamente el 160% de la forma silvestre. Estos datos apoyan la patogenicidad de las tres variantes. Según los datos disponibles, esta es la primera descripción de alelos hipermorfos del gen FOXC1. Tres de las mutaciones raras (c.-430C>G, c.-244C>T, c. 2396A>T) se localizaron en regiones reguladoras no traducidas (UTR). Los análisis bioinformáticos y funcionales revelaron que las variantes c.-430C>G y c.2396A>T alteran dos secuencias que potencialmente pueden tener un efecto regulador negativo sobre la traducción del ARNm de FOXC1, una secuencia de oligopirimidinas terminales (TOP, Terminal OligoPyrimidine) y una diana reconocida por el hsa-miR-548l, respectivamente. Las dos mutaciones produjeron un aumento de la traducción del ARNm, incrementando la cantidad de proteína y por tanto su actividad, por ello también han sido consideradas variantes hipermorfas. Estos datos, revelan por primera vez la existencia de secuencias reguladoras de la traducción en las regiones UTR de FOXC1.. 18.

(19) Resumen. Se han identificado tres familias con GCP no dominante (2,25%) (GCP84, GCP111 y GCP104) en las que el estudio de segregación indica una posible herencia digénica, debida a mutaciones del gen FOXC1 en combinación con mutaciones de los genes PITX2, BMP4 o CYP1B1. Finalmente, mediante estudios de asociación se demostró que las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo p.G447dup eran significativamente mayores en los pacientes con glaucoma respecto a los individuos control (13,9% vs 21,2%, respectivamente; p=0,015; O.R.=1,63; IC 95%= 1,08-2,56). Los estudios funcionales mostraron que este polimorfismo presenta una mayor actividad transcripcional (138%) comparado con la proteína silvestre. Estos datos sugieren que la variante p.G447dup constituye un factor de riesgo de GCP. Además, la presencia del polimorfismo cosegregando con mutaciones en raras de FOXC1 o CYP1B1 (familias GCP68 y GCP84 respectivamente) nos permiten proponer que la herencia conjunta de este polimorfismo con una variante hipermorfa de FOXC1 anticiparía la edad de aparición del glaucoma, mientras que en combinación con un genotipo nulo para CYP1B1 podría agravar el fenotipo dando lugar al síndrome de Axenfeld-Rieger. En conclusión, los resultados obtenidos muestran que las mutaciones, tanto hipermorfas como hipomorfas, del gen FOXC1 tienen un papel relevante en el desarrollo del GCP en población española. La actividad de la proteína FOXC1 es un factor importante que influye en la amplia variabilidad fenotípica relacionada con este gen. Además, los datos obtenidos también revelan por primera vez la existencia de secuencias reguladoras de la traducción del ARNm de FOXC1, cuya alteración puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. Estos hallazgos contribuyen a desentrañar la base genética del glaucoma, facilitando el diagnóstico precoz, el asesoramiento genético y la identificación de posibles dianas terapéuticas.. 19.

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(21) II. INTRODUCCIÓN. 21.

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(23) Introducción. II.1. Glaucoma.. II.1.1. Definición. El glaucoma constituye un grupo heterogéneo de neuropatías ópticas que evolucionan con la pérdida progresiva por apoptosis de axones de las células ganglionares de la retina. Este proceso provoca la excavación de la papila óptica, disminución del campo visual, y si no es tratado adecuadamente, puede concluir con la pérdida irreversible de la visión. La mayoría de las formas de glaucoma son asintomáticas hasta que la lesión del nervio óptico avanza y comienza la pérdida del campo visual, inicialmente periférica, provocando la denominada visión en túnel (Fig. II.1). Muchos tipos de glaucomas están asociados a un aumento de la presión intraocular (PIO) [Leydhecker, 1958] aunque también es posible la existencia de la lesión del nervio óptico y la alteración del campo visual con una PIO normal. Como en la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, la fisiopatología del glaucoma es poco conocida, reflejando su etiología compleja y multifactorial [Whitmore et al., 2005].. Figura II.1. Reconstrucción simulada de la alteración visual característica del glaucoma.. II.1.2. Epidemiología: impacto y prevalencia. El glaucoma es la segunda causa de ceguera irreversible en los países desarrollados después de la retinopatía diabética. Un estudio reciente indica que uno. 23.

(24) Introducción. de cada 40 adultos mayores de 40 años tiene glaucoma, estimando que hay 60 millones de personas afectadas en todo el mundo, de las cuales 8,4 millones presentan ceguera bilateral [Quigley, 2011]. Incluso en los países desarrollados, la mitad de los casos de glaucoma están sin diagnosticar. Se calcula que en 2020 la cifra ascenderá a unos 80 millones de afectados [Friedman et al., 2004]. Un estudio epidemiológico de base poblacional realizado en España observó una prevalencia de un 2,1% de afectados en población de entre 40 y 80 años [Anton et al., 2004]. Por otro lado, el impacto social y económico del glaucoma es enorme y difícil de cuantificar. El coste directo por cada caso de glaucoma de nuevo diagnóstico fue estimado en 2.109 dólares en Estados Unidos y el coste anual de todos los casos de glaucoma se estimó en en 3,9 billones de dólares en 2001 [Allingham et al., 2005]. Sin embargo, el coste es mayor cuanto más avanzada esté la enfermedad y menor sea su control. Uno de los grandes retos sanitarios es disminuir el coste económico de la patología ocular. El arma más eficaz para evitar las graves consecuencias del glaucoma es anticiparse al daño que produce la patología. Para ello, es necesario el establecimiento de un diagnóstico precoz por el oftalmólogo, iniciar el tratamiento correcto lo antes posible y establecer las pautas de seguimiento más adecuadas.. II.1.3. Características clínicas. La característica común en un examen del fondo de ojo afectado de la patología glaucomatosa es la aparición de una excavación en la papila del nervio óptico, que toma forma de copa. Aunque en condiciones fisiológicas existe una leve excavación, en los pacientes con glaucoma es más acentuada (Fig. II.2). La lesión del nervio óptico se estima mediante la relación excavación/papila (E/P). El resultado es un número comprendido entre 0 y 1 de manera que los valores obtenidos por encima de 0,3 son considerados como patológicos.. 24.

(25) Introducción. Figura II.2. Excavación de la cabeza del nervio óptico asociada al desarrollo de glaucoma. (A y B) Sección de un ojo normal (C y D) y de un ojo con glaucoma. (B y D) Esquema en sección de las papilas mostradas en A y B respectivamente. Se observa la atrofia del anillo neurorretiniano, la distorsión de la lámina cribosa y un aumento de la excavación. Modificado de Danyluk y Panton, 1992.. La papila es el lugar por el que el haz de axones de las células ganglionares de la retina sale del ojo constituyendo el nervio óptico. La papila óptica también contiene células gliales, un esqueleto de colágeno y vasos sanguíneos. La excavación papilar suele estar relacionada con un incremento de la PIO, siendo éste el principal factor de riesgo y otro de los síntomas a tener en cuenta en el diagnóstico de glaucoma. Sin embargo, esta excavación no siempre se desarrolla con presiones intraoculares elevadas. Las dos hipótesis principales que intentan explicar el origen de la lesión del nervio óptico son la teoría mecánica y la vascular. La hipótesis mecánica propone que la PIO elevada provoca la compresión de los axones de las células ganglionares contra la lámina cribosa; esta compresión afecta al flujo axoplasmático y conduce la muerte apoptótica de estas neuronas (Fig. II.3 A y B).. 25.

(26) Introducción. B. A. Figura II.3. Esquema del daño axonal mecánico producido por la elevación de la presión intraocular. Se muestra la lámina cribosa de un ojo normal (A) y la de un ojo con elevación de la presión intraocular (B) en la que se observa la compresión de los axones producida por el desplazamiento de esta lámina. Modificado de [Whitmore et al., 2005; Aroca-Aguilar, 2009].. La hipótesis vascular propone que el flujo sanguíneo de la papila óptica se encuentra disminuido en el glaucoma. La isquemia resultante puede dificultar la nutrición de los axones y el flujo axoplasmático. En el nervio óptico normal los vasos se autorregulan para acomodarse a las variaciones de presión de perfusión, una anormalidad en esta autorregulación puede desempeñar un papel en la lesión glaucomatosa [Whitmore et al., 2005]. Parece que ambos mecanismos tienen una función en esta enfermedad, de manera que los efectos mecánicos pueden tener un papel más importante con PIO altas, mientras que los efectos vasculares podrían estar más implicados en lesiones glaucomatosas que cursan con PIO normal [Alward, 2001].. II.1.4. Diagnóstico del glaucoma. Las revisiones oftalmológicas periódicas que habitualmente se realizan con carácter anual para la detección del glaucoma incluyen las siguientes exploraciones: •. TONOMETRÍA O MEDIDA DE LA PRESIÓN INTRAOCULAR:. El procedimiento que se utiliza para medir la PIO (en mmHg) consiste en igualar la presión dentro del ojo con la que se ejerce mediante el tonómetro sobre la superficie de la córnea. Puede utilizarse el tonómetro de aire, cuyo valor es orientativo y es útil como cribado en la población general. Sin embargo, el que proporciona las medidas más exactas es el tonómetro de aplanación, que puede estar incluído en la. 26.

(27) Introducción. lámpara de hendidura o ser manual, aunque para realizar este procedimiento se requiere anestesiar la superficie de la córnea. El valor medio de PIO en un ojo sano es de unos 15 o 16 mmHg, y el límite superior normal se ha fijado en aproximadamente 21 mmHg. No se debe olvidar que hay casos de glaucoma sin elevación anormal de la PIO, lo que se denomina glaucoma normotenso o de baja tensión. En estos casos, la PIO no es el único dato importante para el diagnóstico, sino también el aspecto de la papila y la afectación del campo visual. •. EXPLORACIÓN DEL FONDO DE OJO:. Para comprobar si existe algún tipo de daño en el nervio óptico, se explora la papila óptica analizando la relación excavación/papila, que indica el grado de atrofia óptica glaucomatosa, es decir, el número de axones de las células ganglionares que no son funcionales (Fig. II.4).. Figura II.4. Esquema de fondo de ojo normal (A) y fondo de ojo glaucomatoso (B). La flecha señala la papila. Modificado a partir de Dunyluk y Panton, 1992.. •. GONIOSCOPÍA:. Es el estudio del ángulo de la cámara anterior o iridocorneal, por donde se evacua el humor acuoso. Sirve para determinar, en caso de sospecha de glaucoma, si el ángulo está abierto o cerrado. La amplitud del ángulo suele evaluarse con valores de 0 a 4. La existencia de adherencias (sinequias), pigmento (glaucoma pigmentario) y 27.

(28) Introducción. alteraciones congénitas (glaucoma congénito) permiten diferenciar entre algunos tipos de glaucoma. •. CAMPIMETRÍA O EXPLORACIÓN DEL CAMPO VISUAL:. Es una prueba imprescindible para confirmar el diagnóstico y establecer el daño. Se realiza cuando la enfermedad está en su fase inicial y para confirmar el diagnóstico. Asimismo, es útil en el seguimiento de la enfermedad para valorar la progresión del daño y, lógicamente, la eficacia del tratamiento. La pérdida del campo visual está en relación directa con la lesión de las células glanglionares y, por consiguiente, del nervio óptico. La pérdida es irreversible y la evolución del paciente sin tratamiento suele terminar con una reducción concéntrica del campo y, más adelante, con el resto de campo visual temporal. •. PAQUIMETRÍA DE LA CÓRNEA:. Esta exploración mide el grosor de la cornea. Al disminuir el grosor corneal, disminuye la resistencia y, por consiguiente, variará la medida de la PIO, dado que el tonómetro aplana la córnea hasta igualar la PIO. Por todo ello, si la pared corneal es delgada pueden realizarse diagnósticos falsos de hipertensión ocular o incluso no diagnosticar glaucomas existentes.. II.1.5. Clasificación del glaucoma. Los glaucomas pueden clasificarse de varias formas dependiendo de las características consideradas. Entre estas características se encuentran: la edad de comienzo (congénito, infantil, juvenil y adulto), la morfología del ángulo iridocorneal (glaucoma de ángulo cerrado o de ángulo abierto), la presión intraocular (glaucomas hipertensivos o normotensivos), etc. En la figura II.5 se muestra una de las clasificaciones clínicas más utilizadas [Shields MB. et al., 1996]. CLASIFICACIÓN CLÍNICA: Aunque el glaucoma implica una afectación del nervio óptico, los diferentes tipos se clasifican según los cambios que suceden en la cámara ocular anterior y que 28.

(29) Introducción. asimismo conllevan un aumento de la PIO. Las tres categorías principales de glaucoma son el del desarrollo, el de ángulo abierto y el de ángulo cerrado. Estas tres categorías se subdividen a su vez en formas primarias y secundarias. En las formas primarias el glaucoma aparece sin una causa aparente. En el apartado de glaucoma de ángulo abierto se encuentra el glaucoma primario de ángulo abierto y el normotensivo. Estas tres patologías primarias no tienen una causa subyacente identificable. El glaucoma secundario, como su nombre indica, aparece como consecuencia de otras patologías (dispersión del pigmento, exfoliación, traumatismos, inflamación, cataratas, tumores, etc.). El término glaucoma primario del desarrollo abarca ampliamente todos los glaucomas resultantes del desarrollo anormal del sistema de salida acuosa del humor acuoso, que puede o no estar asociado con una anomalía sistémica. El glaucoma del desarrollo incluye el glaucoma congénito primario y una serie de síndromes en los que éste es una característica principal. Estos síndromes se clasifican a su vez de acuerdo a la presencia o ausencia de anomalías sistémicas u otros defectos oculares.. 29.

(30) Introducción. Glaucoma congénito primario. Del desarrollo. Síndrome de Axenfeld-Rieger. Anomalía de Peters. GPAA. Glaucoma. Primario. Abierto. Normotensivo Secundario. Primario. Cerrado Secundario. Figura II.5. Clasificación clínica de distintos tipos de glaucoma. Modificado de Shields, 1996.. CLASIFICACIÓN GENÉTICA: Desde el punto de vista genético, se puede establecer otra clasificación de los glaucomas según el tipo el patrón de herencia. Esto nos permite diferenciar dos grandes grupos, aquellos que presentan una herencia mendeliana o monogénica, y los que presentan una herencia compleja. Las formas más comunes de glaucoma, incluyendo el glaucoma primario de ángulo abierto del adulto (también denominado glaucoma crónico), son multifactoriales presentando patrones de herencia complejos, resultantes de la interacción de múltiples factores genéticos y posiblemente ambientales. Normalmente, los glaucomas de inicio precoz se heredan como caracteres mendelianos autosómicos dominantes, como el glaucoma juvenil de ángulo abierto (GJAA) [Johnson et al., 1993; Wang et al., 2001; Sheffield et al., 1993; Richards et al., 1994; Wiggs, 1995], o recesivos como el glaucoma congénito primario [Gencik, 1989]. Diversos glaucomas del desarrollo, como el asociado al síndrome de AxenfeldRieger, también se heredan como caracteres monogénicos.. 30.

(31) Introducción. II.2. Glaucoma Congénito Primario.. II.2.1. Definición. El glaucoma congénito primario (MIM# 231300) es el glaucoma infantil más común en el periodo neonatal o infantil, y es una causa importante de pérdida visual en los niños. Es una enfermedad grave que generalmente se manifiesta en el nacimiento o durante el primer año de vida, pero puede aparecer hasta los tres años de edad. El término GCP está reservado para los casos con defectos anatómicos causados por anomalías en el desarrollo del ángulo de la cámara anterior y de la red trabecular. Estos defectos conducen a su vez a la obstrucción del drenaje del humor acuoso y a una elevada presión intraocular. Se presenta acompañado de lagrimeo, aumento del tamaño del globo ocular (buftalmos), fotofobia y edema corneal (Fig. II.8). El glaucoma no tratado tiene, como ya hemos indicado, graves consecuencias, como daño en el nervio óptico que puede desembocar en una pérdida permanente y completa de la visión. Como la fisiopatología de la enfermedad no es bien conocida el diagnóstico precoz, el tratamiento médico/quirúrgico adecuado y el asesoramiento genético son necesarios para mejorar el pronóstico del paciente.. II.2.2. Desarrollo embrionario de la red trabecular. El tejido trabecular tiene su origen en la cresta neural (Fig. II.6) [Johnston et al., 1979]. Durante el desarrollo embrionario se desplaza hacia atrás y en el momento del nacimiento se localiza en el espolón escleral. La migración posterior continúa después del nacimiento hasta aproximadamente el primer año de vida. Las células de la cresta neural también contribuyen a formar numerosas estructuras no oculares como por ejemplo, craniofaciales y cervicales. En el GCP, sin embargo, las anomalías que se observan están restringidas al ángulo de la cámara anterior, lo que indica que los defectos moleculares de esta enfermedad afectan a las etapas más precoces de diferenciación celular de la cresta neural.. 31.

(32) Introducción. segmento anterior del ojo,, con indicación de su origen embrionario. embrionario Figura II.6. Esquema del segmen En la izquierda se aprecia un corte del ángulo iridocorneal destacando las distintas capas de la malla trabecular. En el centro se ilustra la imagen gonioscópica del ángulo normal obtenida mediante la lámpara de hendidura. En la derecha se muestra el origen embrionario de las estructuras que forman el segmento anter anterior del ojo. Cep: epitelio corneal. Cen: endotelio corneal. Cstr: estroma corneal. *: línea de Schwalbe. Ss: espolón escleral. CB: B: cuerpo ciliar. ciliar Cp: prolongación ciliar.. Cm: músculo ciliar. PCE; epitelio ciliar pigmentado. SC: canal de Schelmm. TM: malla trabecular. L: lente. Z: ligamento suspensorio de la lente. Modificado de Idrees, 2006.. A partir de la sexta semana del desarrollo humano se forma la bicapa óptica embrionaria. En esta etapa el ojo esta rodeado de células mesenquimales, principalmente de origen neural neural, que posteriormente migrarán hacia la parte anterior. Durante los procesos de morfogénesis y diferenciación diferenciación,, esas células, junto con las que recubren la región anterior más periférica de la copa óptica, dan lugar a la córnea, al iris y a las estructuras de drenaje del ángulo iridocorneal. La correcta migración y diferenciación de las células progenitoras del me mesénquima sénquima son críticas para el desarrollo del segmento anterior. En el quinto mes de gestación, se desarrolla el iris, la córnea y se define bien la cámara anterior. Hasta el séptimo mes de gestación la cresta neural forma una capa contínua que se extiende desde la córnea a la malla trabecular. Sin embargo, se ha demostrado que existen huecos intercelulares entre las células endoteliales que cubren el ángulo iridocorneal [Kaiser-Kupfer, Kupfer, 1989]. 1989] Esto se correlaciona con la evidencia fisiológica de la existencia de un cierto grado de drenaje del humor acuoso en las primeras semanas de vida fetal, que aumenta 32.

(33) Introducción. progresivamente durante el desarrollo [McMenamin, 1989]. En el momento del nacimiento la malla trabecular se localiza delante de la raíz del iris y está expuesta al humor acuoso. Estudios histológicos recientes de las mallas trabeculares de individuos con GCP muestran un ensanchamiento de las trabéculas y una disminución de los espacios intertrabeculares, contribuyendo al bloqueo de la salida del humor acuoso (Fig. II.7) [Rojas et al., 2006].. A. B. C. D. Figura II.7. Microscopía electrónica de transmisión de la malla trabecular. (A y B) Malla trabecular de un individuo sano adulto. Se observan lamelas pequeñas (flecha) que forman la malla de filtración. (C y D) Malla trabecular de un ojo afectado de glaucoma congénito. Se observa claramente la presencia de trabéculas engrosadas con espacios intertrabeculares disminuidos (flecha). Modificado de Rojas, 2013.. 33.

(34) Introducción. II.2.3. Clasificación. Los criterios de clasificación de los glaucomas pediátricos son complejos y arbitrarios ya que se trata de un grupo muy heterogéneo. La clasificacicación más utilizada de los glaucomas del desarrollo es la de Shaffer-Weiss [Shaffer and Weiss D.I., 1970], que los divide desde el punto de vista etiológico en: glaucoma congénito primario, glaucomas asociados con anomalías congénitas del resto de ojo o del cuerpo y glaucomas adquiridos (Tabla II.1): I. II.. III.. Glaucoma congénito primario Glaucoma asociado con anomalías congénitas a. Glaucoma infantil primario de desarrollo tardío (glaucoma congénito primario de desarrollo tardío) b. Síndrome de Sturge-Weber c. Neurofibromatosis d. Síndrome de Marfan e. Microcórnea f. Goniodisgenesia (Síndrome de Axenfeld-Rieger) g. Anomalía de Peters h. Síndrome de Lowe Glaucomas secundarios en la infancia a. Retinopatía del prematuro b. Tumores c. Inflamación d. Traumatismos. Tabla II.1. Clasificación de Shaffer-Weiis del glaucoma congénito (1970).. La edad de aparición de la enfermedad es el principal criterio de clasificación que se usa en los glaucomas pediátricos. Los 3 años son considerados como la edad de división entre el glaucoma infantil y el glaucoma congénito, ya que es aproximadamente a esta edad cuando el ojo deja de expandirse en respuesta a una elevada presión intraocular [deLuise and Anderson, 1983].. 34.

(35) Introducción. II.2.4. Epidemiología: impacto y prevalencia. El glaucoma congénito es el tipo más frecuente dentro de los glaucomas pediátricos, representando aproximadamente el 55% de ellos. La incidencia total del glaucoma congénito en poblaciones occidentales es aproximadamente de 1 caso por cada en 10.000 nacidos [Miller, 1966; Garcia-Sanchez et al., 1982; Taylor et al., 1999; Ho and Walton, 2004]. El 75% de los casos son bilaterales y es más frecuente en el sexo masculino (65%) [Kolker AE and Hetherington J, 1983](Fig. II.8). En más del 80% de los casos la aparición de la enfermedad se produce durante el primer año de vida. Alrededor del 25% se diagnóstica en el momento del nacimiento, y más del 60% aparece durante los primeros 6 meses de edad [Becker and Kolker, 1976].. Figura II.8. Ojo de niño afectado de glaucoma congénito primario unilateral. Se aprecia el enturbiamiento, edema corneal y buftalmos [Piñero Butamante A., 2005].. II.2.5. Características clínicas. Los glaucomas congénitos y/o de inicio temprano son un grupo raro y heterogéneo de enfermedades que, al igual que el glaucoma adulto, pueden tener consecuencias que amenacen la visión. El diagnóstico, el tratamiento y el manejo clínico de los glaucomas pediátricos son primordiales para evitar el progreso de la enfermedad. En muchos casos, los padres son los primeros en reconocer estos síntomas, y por ello, es crucial que estén familiarizados con sus características clínicas, aunque esto exige una labor de educación sanitaria que no es fácil de llevar a cabo. Los niños, al contrario que los adultos, suelen presentar signos clínicos evidentes del glaucoma, aunque varían según los niveles de presión intraocular y la edad de inicio. 35.

(36) Introducción. Además, el examen oftalmológico en niños y el diagnóstico clínico en niños pequeños puede ser difícil que en audultos.. Figura II.9. Ojos de un niño de 8 meses afectado de glaucoma congénito primario bilateral. Se aprecian signos evidentes como abultamiento y edema corneal [Sampaolesi et al., 2006].. La mayoría de los casos no manifiestan la enfermedad en el momento del nacimiento porque el ojo produce una escasa cantidad de humor acuoso durante los primeros meses de vida. Aquellos ojos que desarrollan un aumento de la PIO en los primeros meses de vida (sólo ocurre en el 25%-30% de los casos) tienen un drenaje del humor acuoso tan alterado que ni siquiera pueden evacuar eficientemente la pequeña cantidad de líquido producido en el neonato. El globo ocular del recién nacido es distensible y a menudo aumenta notablemente de tamaño con la elevación de la PIO [deLuise and Anderson, 1983]. La denominada triada clásica de la enfermedad consta de epífora (lagrimeo excesivo), fotofobia (hipersensibilidad a la luz) y blefarospasmo (espasmo de los parpados) (Fig. II.9). La epífora se puede malinterpretar como una obstrucción del conducto nasolagrimal o como una conjuntivitis, lo que puede conducir a un mayor retraso en el diagnóstico. El edema corneal puede ser un resultado directo de una elevada presión intraocular, produciendo un enturbiamiento corneal que se corrige con la normalización de la presión. En casos más avanzados puede persistir una densa opacificación en el estroma corneal a pesar de reducir la PIO. Junto a la opacificación y al enturbiamiento corneal, pueden aparecer roturas en la membrana de Descemet, también llamadas “estrías de Haab”. Se trata de finas líneas curvilíneas horizontales, que pueden ser únicas o múltiples, localizadas en la cara posterior de la córnea, que 36.

(37) Introducción. suelen manifestarse en casos buftalmos (Fig. II.10). Pueden ser asintomáticas o provocar un astigmatismo irregular que afecte en mayor o menor medida a la visión. A nivel del limbo y de la córnea periférica se produce un crecimiento compensatorio del tejido epiescleral y conjuntival, que adopta la forma de una semiluna blanquecina evidente sobre todo en el limbo superior. Si la hipertensión ocular no se controla, la clínica empeorará y el aumento de tamaño de la córnea y las roturas en la membrana de Descemet darán lugar a la cicatrización, erosiones y finalmente, ulceraciones de la córnea.. A. B. C. Figura II.10. Estrías de Habb en las córneas de 3 pacientes distintos con glaucoma congénito primario (www.onjoph.com). Estas estrías aparecen como líneas curvilíneas verticales (A y B) y horizontales (C) causadas por roturas de la membrana de Decemet que pueden asociarse con edema agudo de la córnea.. A partir de los 3-4 años, suele detenerse el crecimiento del globo ocular, pero la esclera sigue conservando su elasticidad (se estima que hasta los 10-11 años) pudiendo dar lugar a una miopía rápidamente progresiva, que debe considerarse como un signo sospechoso de glaucoma [Wong PC, 1995]. La aparición de un nistagmus (movimiento involuntario de los ojos) es poco frecuente en el glaucoma congénito y su existencia es la expresión de un déficit visual grave.. 37.

(38) Introducción. II.2.6. Genética del glaucoma congénito primario. El glaucoma congénito primario presenta una gran heterogeneidad genética. En la mayoría de los casos es transmitido con un patrón de herencia autosómico recesivo con expresividad variable y penetrancia incompleta [Francois, 1980; Sarfarazi and Stoilov, 2000] aunque también se han descrito casos esporádicos. Se han identificado mediante análisis de ligamiento tres loci implicados en la enfermedad: GLC3A [Sarfarazi et al., 1995], GLC3B y GLC3C [Akarsu et al., 1996; Stoilov et al., 2002]. Con la abreviatura GLC se designan los loci de glaucoma y el número 3 hace referencia a la forma congénita. Además se asigna una letra mayúscula a cada uno de los loci, según el orden en el que se van identificando. El locus GLC3A se localiza en la región 2p21 [Sarfarazi et al., 1995], y en él se localiza el gen CYP1B1 (MIM# 601771), cuyas mutaciones originan la enfermedad. Se trata de un gen miembro de la superfamilia de los citocromos P450. Las mutaciones de este gen son responsables del 20-30% de los casos según la población estudiada [Bejjani et al., 1998; Reddy et al., 2004; Mashima et al., 2001; Colomb et al., 2003]. En población española se han detectado mutaciones de este gen en aproximadamente el 33% de los casos [LopezGarrido et al., 2009; Lopez-Garrido et al., 2013]. Por otro lado, en una pequeña proporción de casos de GCP que no tienen mutaciones en CYP1B1 se han identificado mutaciones en heterocigosis del gen MYOC (MIM# 601652). Este gen también está implicado en glaucoma juvenil y en glaucoma primario de ángulo abierto [Kaur et al., 2005; Campos-Mollo et al., 2007; Lopez-Martinez et al., 2007; López-Garrido MP, 2013]. Recientemente se ha identificado el gen LTBP2 (MIM# 602091) como responsable de GCP en unas pocas familias paquistaníes que presentan ligamiento con el locus GLC3C [Ali et al., 2009], mientras que todavía no se ha identificado ningún gen relacionado con la enfermedad en el locus GLC3B. Además, se han identificado mutaciones del gen FOXC1 en un pequeño porcentaje de individuos con GCP en población india [Chakrabarti et al., 2009].. 38.

(39) Introducción. II.3. El gen FOXC1.. II.3.1. La familia de genes FORKHEAD. El primer gen de la familia forkhead, denominado fkh3, fue identificado en 1989 al analizar las variantes genéticas que producían alteraciones homeoticas en Drosophila [Weigel et al., 1989]. El mutante homeótico que reveló su existencia presentaba la sustitución de porciones ectodérmicas del intestino anterior y posterior por estructuras ectópicas situadas en la cabeza, que dieron el nombre fork head (cabeza de tenedor) al mutante (Fig. II.11).. A. B. Figura II.11. Fenotipo del mutante homeótico forkhead de Drosophila. Comparación de los fenotipos de las larvas silvestre (A) y amorfa (mutante nulo) para el gen fkh3 (B). La flecha señala la protuberancia producida por el fallo en la involución de la cabeza, dando nombre al fenotipo forkhead “cabeza de tenedor”. cs: esqueleto cefalofaríngeo. tf: tracto anal. Modificado de Weigel et al., 1989.. En 1990 se identificó el segundo gen de esta familia, HNF-3α (hepatocyte nuclear factor-3α) [Lai et al., 1990], que codifica un factor de transcripción necesario para la expresión de varios genes específicos del hígado. Ambos contenían una región de 110 aminoácidos a la que se le llamo forkhead, en referencia al primer fenotipo mutante. Desde entonces se han identificado más de 100 genes pertenecientes a la familia de proteínas forkhead, en la actualidad renombrada como Fox (Forkhead box) [Kaufmann and Knochel, 1996]. Todos ellos son factores de transcripción, que actúan como activadores o represores de la transcripción. Se han utilizado ratones knockout para estudiar el papel de cada gen en el desarrollo embrionario, y además, mediante clonación posicional se han identificado varios genes forkhead como causantes de 39.

(40) Introducción. trastornos hederitarios. Estos datos indican que los genes Fox desempeñan un papel importante en la regulación de la proliferación celular, determinación del destino celular y diferenciación celular durante el desarrollo embrionario tanto humano como de otros organismos [Kaufmann et al., 1996]. Además, algunas proteínas FOX tienen una actividad transcripcional pionera al unirse a la cromatina condensada durante los procesos de diferenciación celular [Zaret and Carroll, 2011]. Los factores de transcripción forkhead están caracterizados por la presencia del dominio forkhead (FHD). Se trata, como se ha mencionado anteriormente, de una región de 110 aminoácidos conservada evolutivamente, cuya función es la unión al ADN regulando el proceso de transcripción [Berry et al., 2002; Saleem et al., 2001; Berry et al., 2002]. El dominio de unión al ADN presenta una organización que es una variante de la estructura hélice-giro-hélice, consistente en tres hélices-α, dos hojas-β y dos grandes bucles que forman una estructura denominada hélice alada (“wingedhelix”), debido a su parecido con las alas de una mariposa [Lai et al., 1993; Saleem et al., 2004] (Fig. II.12). La conservación de la secuencia de aminoácidos del dominio forkhead entre los miembros del grupo varía entre el 30% y el 95%. El grado de conservación del dominio permite establecer el orden filogenético de las proteínas.. Hélice 3. Hoja β 2. Hélice 1. Ala 1. Hoja β 1. B. A. Hélice α 2. Hélice α 1. Hélice α 3 Ala 2 Figura II.12. Modelo molecular del dominio forkhead de la proteína FOXC1. A) Esquema tridimensional de la estructura hélice-giro-hélice. B) Se indica la disposición de las 3 hélices-α, las 2 hojas-β y los extremos N- y C-terminales. Los bucles que forman la estructura wingedhelix se indican como ala 1 y ala 2. Modificado a partir de Saleem, 2004. 40.

(41) Introducción. Los potenciadores y promotores a los que regulan, están compuestos por múltiples elementos en cis, a los cuales, los factores de transcripción se unen en forma de monómeros o multímeros. La actividad transcripcional está determinada por la acción sinérgica de estos elementos. La combinación de los elementos en cis y la acción cooperativa de los factores de transcripción dirigen la regulación transcripcional. Las alteraciones de los genes de la familia FOX producen enfermedades hederitarias humanas por su papel crítico en la regulación de la embriogénesis, incluyendo alteraciones del desarrollo ocular [Lehmann et al., 2003].. II.3.2. Estructura y localización cromosómica del gen FOXC1. El gen Forkhead Box C1 (FOXC1 MIM# 601090) humano está localizado en el cromosoma 6p25.3 y (Fig. II.13) tiene un único exón. También se ha denominado FREAC3 (FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 3) [Pierrou et al., 1994; Nishimura et al., 1998]. La. región codificante está formada por 1659 pares de bases que codifican una proteína de 553 aminoácidos de longitud. La proteína se localiza en el núcleo y contiene varios dominios funcionales necesarios para realizar su función transcripcional [Saleem et al., 2001; Berry et al., 2002; Berry et al., 2006b].. FOXC1. Figura II.13. Localización del gen FOXC1 en el cromosoma 6. Modificado a partir de GeneCards (http:/www.genecards.org/).. El dominio forkhead de FOXC1 contiene una secuencia de aminoácidos consenso (RTAAAYA) cuya función es la unión de la proteína al ADN [Pierrou et al., 1994]. Además contiene dos secuencias de aminoácidos necesarias para su correcta localización nuclear NLS, Nuclear Localization Signal [Berry et al., 2002]. La primera señal de localización nuclear se extiende desde los aminoácidos 77 al 93 (NLS-1: VKPPYSYIALITMAI) y la segunda, muy conservada entre las proteínas de la familia FOX, 41.

(42) Introducción. contiene una región rica en aminoácidos básicos, comprendida entre las posiciones 169 y 176 (NLS-2: RRRRRFKK) [Pierrou et al., 1994; Saleem et al., 2004]. FOXC1 es una fosfoproteína que actúa como activador transcripcional [Saleem et al., 2001] gracias a los dominios de activación (AD-1 y AD-2) localizados en las regiones N- y C-terminales [Berry et al., 2002]. El dominio de inhibición de la transcripción (ID) se encuentra situado en la región central de la proteína (Fig. II.14) Esta región es capaz de reducir el potencial de transactivación de los dominios N- y Cterminales. Por tanto, la actividad de FOXC1 esta regulada por múltiples dominios funcionales que, a su vez, modulan la regulación de la transcripción. NLS-1 NLS. 5’. Dominio forkhead. AD-1 1. 51. NLS-2 NLS. 69. 178. Dominio de inhibición 216. 366. 3’. AD-2 466. 553. Figura II.14. Esquema de los dominios funcionales de la proteína FOXC1. NLS: señal de localización nuclear. AD-1: dominio de activación 1 (N-terminal); AD-2: dominio de activación 2 (C-terminal). En la parte inferior del esquema se indica la posición de los aminoácidos correspondientes a cada dominio.. El ARNm de FOXC1 se identificó por primera en una extracción de ARN craneoencefálico fetal humano y en iris de adulto [Mears et al., 1998]. Tiene una longitud de unas 4,5 kb y se expresa en múltiples tejidos adultos y fetales, tales como riñón adulto, corazón, leucocitos de sangre periférica, próstata y riñón fetal (Fig. II.15). Se ha detectado un transcrito alternativo con un tamaño de aproximadamente 3,4-4,0 kb en riñón fetal, seguramente generado por poliadenilación alternativa [Mears et al., 1998; Nishimura et al., 1998].. 42.

(43) Introducción. Figura II.15. Análisis de la expresión del gen humano FOXC1 mediante northern blot. Diferentes tejidos fueron hibridados con una sonda de FOXC1. La flecha indica un transcrito de FOXC1 de 4,5 kb. Se indica con una punta de flecha un transcrito alternativo de 4 kb que aparece en riñón fetal [Mears et al., 1998].. II.3.3 Identificación del gen FOXC1. El gen FOXC1 humano fue identificado gracias al estudio genético de pacientes portadores de una deleción de la región telomérica del cromosoma 6 que presentaban defectos oculares tales como hipoplasia del iris y glaucoma, junto con alteraciones dentales y cardíacas [Zurcher et al., 1990; Palmer et al., 1991]. Estos datos indicaron que esta región del cromosoma 6 contenía un gen importante para el desarrollo ocular. Por otro lado, el análisis de ligamiento de dos familias que presentaban hipoplasia de iris, goniodisgénesis y una alta frecuencia de glaucoma juvenil demostró la importancia del locus de 6p25 para el desarrollo ocular, y permitio identificar a FOXC1 como un gen candidato [Mears et al., 1996]. Además, tras el análisis de ligamiento de una familia diagnosticada con la anomalía de Axenfeld-Rieger se demostró que el fenotipo de la enfermedad también se asigna a una región crítica situada en el cromosoma 6p25 [Gould et al., 1997]. Finalmente, el análisis directo de los genes candidatos en esta región permitió identificar mutaciones del gen FOXC1 en familias diagnosticadas con la anomalía de Axenfeld-Rieger [Mears et al., 1998; Nishimura et al., 1998].. 43.

(44) Introducción. II.3.4. Expresión durante el desarrollo embrionario. Foxc1 es el homólogo muríno de FOXC1 humano. Los aminoácidos del dominio forkhead de ambos genes son idénticos, y en el resto de la proteína existe una similitud de secuencia del 92%. La expresión de Foxc1 en tejidos adultos de ratón se localiza en los mismos tejidos que en humano [Hiemisch et al., 1998]. Durante el desarrollo embrionario, Foxc1 se detecta en el mesénquima periocular, que dará lugar a los futuros tejidos oculares de drenaje (apartado II.2.2) [Sowden, 2007]. Los análisis inmunohistoquímicos muestran que en el embrión de ratón de 9,5 días postcoito, se produce un aumento progresivo de los nieveles de Foxc1 en la parte anterior del mesodermo [Kume et al., 1998] (Fig. II.16). Foxc1 se expresa en las células del mesénquima de la copa óptica entre la lente y la retina, en el mesénquima periocular, en la esclera, en el ectodermo y en el futuro epitelio conjuntivo [Kidson et al., 1999]. La regulación de la expresión de FOXC1 en el ojo es poco conocida, aunque se están produciendo avances importantes en su comprensión. Algunos trabajos recientes sugieren que el ácido retinoico podría tener un efecto en la regulación de la expresión de FOXC1 durante la embriogénesis [Matt et al., 2005]. Además, la expresión de Foxc1 en el mesénquima periocular se reduce en un ratón doble knockout [Matt et al., 2005].. 44.

(45) Introducción. Figura II.16. Expresión de los genes Foxc1 y Pitx2 durante el desarrollo embrionario del segmento anterior del ojo de ratón. (a) Etapa de la copa óptica en un embrión de ratón de 10,5 días, que equivale a 5 semanas en el desarrollo humano. (b) Formación del segmento anterior en el embrión de ratón de 15,5 días, que equivale al quinto mes de la gestación humana. (c) Segmento anterior maduro donde se representa la lente, el iris, el ángulo iridocorneal y la córnea. La leyenda (key) muestra el código de colores usado para representar las estructuras y el patrón de expresión de los genes Foxc1 y Pitx2, desde la etapa embrionaria hasta la madura [Sowden, 2007].. II.3.5. Mutaciones del gen FOXC1. Las mutaciones de este gen causan diversos fenotipos incluyendo disgenesia del segmento anterior, síndrome de Axenfeld-Rieger y la anomalía de Peter. El 50-75% de estos pacientes presentan glaucoma congénito o de aparición temprana, mientras que otros desarrollan glaucoma secundario por anomalías del segmento anterior. La 45.

(46) Introducción. Tabla II.2 resume las mutaciones encontradas en el gen FOXC1, el fenotipo al que dan lugar, el dominio en el que se encuentran y la alteración funcional de la proteína. Tabla II.2. Mutaciones del gen FOXC1 con los efectos en la función de la proteína y el fenotipo asociado. Mutación. Fenotipo. Dominio. Efecto en la función de la proteína. Referencia. Mutaciones de cambio de sentido p.Pro79Arg. Ojo+micrognatia. FH. p.Pro79Leu. Ojo. FH. p.Pro79Thr. ARS. FH. p.Ser82Thr. Ojo+pérdida audición+ defecto corazón. FH. p.Ala85Pro. Ojo+defecto corazón. FH. p.Leu86Phe. Ojo+obesidad+ baja estatura +anomalías dentales. FH. p.Ile87Met. Ojo. FH. p.Ile91Ser. Ojo. FH. p.Ile112Ser p.Tyr115Ser. Ojo+defecto corazón+ASR+S. de Peters Ojo+pérdida audición. [Saleem et al., 2003b] [Mears et al., 1998; Strungaru et al., 2007; Saleem et al., 2004] [Fuse et al., 2007] [Saleem et al., 2003a; Saleem et al., 2003b; Saleem et al., 2004] [Mears et al., 1998; Strungaru et al., 2007] [Kawase et al., 2001a; Saleem et al., 2003b]. FH FH. [Weisschuh et al., 2006]. FH. [Weisschuh et al., 2006]. Ojo. FH. p.Arg127His. Ojo+hiperteloris mo. FH. p.His128Arg. GCP. FH. p.Leu130Phe. Ojo. FH. p.Leu131Leu. Hipertelorismo+ ojo. FH. p.Met161Lys. Reducción estabilidad proteína. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación.. FH FH. p.Met161Val. Transactivación.. [Nishimura et al., 2001] [Saleem et al., 2003b]. GCP Ojo+defecto corazón Ojo+ombligo+ pérdida audición. FH. Ojo. p.Gly149Asp. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Capacidad de unión al ADN Transactivación. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación.. [Nishimura et al., 1998; Swiderski et al., 1999; Saleem et al., 2001] [Honkanen et al., 2003; Weisschuh et al., 2006] [Nishimura et al., 1998; Saleem et al., 2003b; Saleem et al., 2004] [Kawase et al., 2001b; Saleem et al., 2003a; Saleem et al., 2004] [Chakrabarti et al., 2009] [Strungaru et al., 2007; Ito et al., 2007] [Nishimura et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Saleem et al., 2001] [Chakrabarti et al., 2009]. p.Ile126Met. p.Cys135Tyr. [Weisschuh et al., 2006]. Localización nuclear Capacidad de unión al ADN Transactivación Localización nuclear Capacidad de unión al ADN Transactivación Importante deterioro de la localización nuclear. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación.. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación.. [Panicker et al., 2002; Komatireddy et al., 2003]. 46.

(47) Introducción. Efecto en la función de la proteína. Mutación. Fenotipo. Dominio. p.Gly165Arg. Ojo+anomalías dentales. FH. p.Arg169Pro. Ojo+pérdida audición. FH. p.Pro297Ser. Ojo. FH. p.Gln2X. Ojo. AD-1. p.Gln23X. ARS. AD-1. p.Ser48X. Ojo ARS+Anomalía de Peters Ojo Ojo. AD-1. [Komatireddy et al., 2003] [Mirzayans et al., 2000; Strungaru et al., 2007] [Weisschuh et al., 2006]. FH. [Weisschuh et al., 2008]. FH FH. [Komatireddy et al., 2003] [Cella et al., 2006]. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación. Localización nuclear. Capacidad de unión al ADN. Transactivación.. Referencia [Murphy et al., 2004; Strungaru et al., 2007; Saleem et al., 2004] [Murphy et al., 2004; Strungaru et al., 2007; Saleem et al., 2004] [Strungaru et al., 2007]. Mutaciones sin sentido. p.Gln120X p.Gln123X p.Trp152X. Deleciones/inserciones C.26_47ins22. Ojo. AD-1. [Nishimura et al., 2001; Kawase et al., 2001b]. c.81_89del9. GCP+CYP1B1 (R368H). FH. [Chakrabarti et al., 2009]. c.93_102del10. Ojo. FH. c.99_108del10 c.116_123del8 c.153_163del11. Ojo Ojo Ojo Ojo+pérdida c.210delG audición o defectos corazón c.264_265insC Ojo Ojo+ c.286_287insG hipertelorismo c.363delC Ojo Ojo+ c.437_453del17 hipertelorismo+ pérdida audición c.718_719delCT Ojo c.848_871dup25 GCP GCP+CYP1B1 c.1086delC (R368H) c.1511delT Ojo c.1512delC Ojo. FH FH FH. [Mears et al., 1998; Strungaru et al., 2007] [Nishimura et al., 2001] [Nishimura et al., 2001] [Nishimura et al., 1998] [Swiderski et al., 1999]. ID. [Nishimura et al., 2001]. ID. [Kawase et al., 2001b] [Strungaru et al., 2007] [Fuse et al., 2007] [Cella et al., 2006] [Chakrabarti et al., 2009] [Chakrabarti et al., 2009] [Weisschuh et al., 2008] [Weisschuh et al., 2006]. Ojo: solo síntomas oculares. Dominio de la proteína a la que pertenece la mutación; FH: dominio forkhead; ID: dominio de inhibición; AD: dominio de activación.. El análisis bioquímico de 14 mutaciones graves de FOXC1 identificadas en pacientes con síndrome de Axenfeld-Rieger, localizadas en el dominio FHD, ha demostrado que afectan a la actividad transcripcional debido a la disminución de la estabilidad proteica, a la alteración de la localización subcelular y a cambios en la 47.

(48) Introducción. especificidad de unión al ADN [Saleem et al., 2001; Saleem et al., 2003a; Murphy et al., 2004]. La consecuencia funcional indirecta de estas mutaciones es la reducción de la expresión de los genes diana de FOXC1. Los pacientes portadores de mutaciones que derivan en un aumento de la actividad transcripcional de FOXC1 pueden tener un defecto fenotípico más grave que los pacientes con mutaciones que producen pérdida en la capacidad de unión al ADN [Saleem et al., 2001]. Además, las duplicaciones del gen FOXC1 causan el Síndrome de Axenfeld-Rieger acompañado de glaucoma, lo que indica una sensibilidad muy precisa del ojo a la dosis y a la actividad del gen [Lehmann et al., 2000; Nishimura et al., 2001; Borges et al., 2002]. Los pacientes con duplicaciones en el gen tienen una alta incidencia de glaucoma, lo que sugiere que un aumento en la dosis del gen FOXC1 podría tener un efecto más deletéreo que una reducción de la dosis. En base a estos datos se ha propuesto la existencia de unos umbrales superiores e inferiores específicos de actividad de FOXC1, requeridos para una correcta función y desarrollo ocular (Fig. II.17) [Lehmann et al., 2000; Walter, 2003]. Incremento actividad FOXC1 (%) 0. Disgenesia segmento 80 anterior S. Axenfeld-Rieger. 150. Disgenesia segmento anterior Iridogoniodisgénesis. Figura II.17. Relación de los fenotipos producidos por mutaciones del gen FOXC1 con la actividad de la proteína. Las mutaciones que producen menos del 80% de la actividad normal de FOXC1 o más del 150% producen disgenesias del segmento anterior. Modificado de Walter, 2003.. II.3.6. Modelos animales y mutaciones en genes ortólogos. La ausencia completa de función del gen FOXC1 en ratones mutantes condicionales (Foxc1-/-) produce la muerte en fase prenatal con hemorragias, hidrocefalia y defectos cardiovasculares y oculares graves (Fig. II.18) [Kume et al., 2001]. El rango de defectos encontrados en el homocigoto nulo mutante de Foxc1 demuestra el importante papel de este gen como regulador del desarrollo cardiaco, esquelético, ocular y urogenital. Sin embargo, los ratones heterocigotos (Foxc1+/-) 48.