Certificación de Viveros de
Palma Aceitera
Consuelo Estévez de Jensen, Ph.D.
Departamento de Cultivos y Ciencias
Agroambientales
Universidad de Puerto Rico, Recinto Mayagüez
Junio 20, 2013
Antecedentes
•
Primer reporte de la pudrición del cogollo causada por
Phytophthora palmivora
en Colombia.
Gómez et al, 2010.
•
En el 2011 en plantaciones de palma aceitera en las
Provincias de San Lorenzo y Sto. Domingo de los
Tscháchilas no se logró aislar en medio selectivo ni detectar
por medio de serología a
Phytophthora
spp. desde tejido
afectado.
•
Se detectó a
Phytophthora
spp en raíces utilizando tiras
inmunológicas.
Triángulo de la enfermedad
Hospedero Susceptible
Pat
ógeno (s)
El Medioambiente
Objectivos de un Programa de
Certificación
•
Garantizar plantas sanas y de alto potencial
genético.
•
Asegurar plantas libres de patógenos
transmitidos por material vegetativo
•
Desarrollar protocolos para un programa de
saneamiento de viveros.
Componentes de un Programa de
Certificación
•
Programa de Cuarentena
asegura la
introducción segura de germoplasma.
•
Programa de Saneamiento
pruebas que detectan
la presencia de patógenos y tratamientos que
conducen a la producción de germoplasma libre de
patógenos.
•
Programa de Certificación
garantiza que las
fuentes de germoplasma esten libres de
Enfermedades de importancia
•
Patógenos transmisibles por material vegetativo
que comprenden virus, viroides, procarióticos
sistémicos, fitoplasmas y espiroplasmas.
•
Las plantas en un vivero deben estar libres de
plagas y enfermedades.
•
El substrato debe ser libre de patógenos de
suelo.
Viveros en áreas de cuarentena
•
Inspección anual de viveros por síntomas de
Phytophthora
spp
.
•
Un mínimo de 40 plantas por vivero.
•
Todas las plantas sintomáticas deben ser analizadas para
Phytophthora
spp. en un laboratorio aprobado.
•
Los métodos de detección pueden ser por serología
(DAS-ELISA) Double antibody sandwich-Enzyme linked
inmunosorbant assay DAS-ELISA.
•
En caso de resultados positivos realizar aislados en medio
selectivo e identificación por morfología.
•
Análisis molecular con PCR para la identificación de la
especie.
An
á
lisis de Nuevas Introducciones de Palma
Aceitera
Patógeno Método Tejido
Phytophthora DAS ELISA PCR
Cogollo y raíces
Erwinia spp. DAS-ELISA Cogollo
Fitoplasmas PCR Tallo
Virus RT-PCR y PCR Foliar
Fusarium solani Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis
Aislados y pruebas de patogenicidad
cogollo y raíces
Phytophthora
spp.
• Patógeno destructivo en plantas herbáceas y leñosas.
• Causa muerte repentina, pudrición de raíces y tallo.
• El inóculo de Phytophthora puede ser transportado en el aire, en el agua o en el follaje susceptible.
• Diseminación por agua y suelo contaminado
• Deficiente aereación del suelo
• Suelos saturados (>70%)
• Temperaturas 59 a 74 F.
• Sobrevive en el suelo, agua y en plantas susceptibles
Síntomas de Phytophthora palmivora
• Decoloración de la hoja más joven.
• Lesiones humedas en el follaje.
• Amarillamiento y necrosis de la hoja bandera.
• Lesiones alargadas en el interior de la hoja bandera de color miel a café.
• Pudrición de la base de la hoja.
• Caída de las hojas
• Pudrición en la base del tallo y del cogollo.
Detección de P. palmivora del agua
Aislado desde el agua
• Medio selectivo PARPH y PARP, mas benomyl (10 ppm) para suprimir crecimiento de Zygomicetes.
• Medio V8 clarificado para produccion de sporangias.
• Cultivos incubados en temperatura ambiente y luz continua ( 40 watts) por 4 -5 dias. Cultivos en la
obscuridad para observar estructuras sexuales (homotalicas).
Métodos de Identificación
DAS-ELISA
• Los anticuerpos monoclonales están adheridos a la microplaca.
• Colocar las muestras maceradas con un amortiguador.
• Durante el período de incubación si Phytophthora esta presente es capturado por el anticuerpo y capturado en el microplato.
• Luego de un enjuague se unen y los anticuerpos detectado con un substrato por un cambio de color en presencia del conjugado
enzimático
Tira inmunológica
• Macerar el tejido con un amortiguador
• Insertar la tira inmunológica
• Dejar por 3 minutos y observar la presencia de una doble
banda (+).
Aislamiento
Aislado en medio específico (PARPH).
Identificación de características culturales y morfológicas.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
Extracción del ADN
•
Kit de Qiagen
Reacción en cadena de la
Polimerasa.
•
Cebadores universales
ITS 1 y ITS4
•
Secuenciación
•
Cebadores especificos
A2 y I2 (Drenth et al,
2006).
Stock inicial Stock final Volumen 1Rx Buffer (10x) 1x 2.50 MgCl2 1.50 mM 0.75 DNTPs (2.5 mM) 0.20 mM 2.00 Primer A2 (50u/µL) 0.25 µM 0.125 Primer I2 (50u/µL) 0.25 µM 0.125 Mango Taq (5u/µL) 0.50 u 0.160 ADN 50 ng 1 Agua - 18.340 Total - 25• Para la detección preliminar en las raíces utilizar tiras inmunológicas o la técnica de Double antibody
sandwich-Enzyme linked
inmunosorbant assay DAS-ELISA.
• Para confirmación aislar en medio selectivo.
• Para suelo o substrato realizar
diluciones de suelo y utilizar medio especifico (PARPH).
Métodos de Identificación desde raíces
y suelo
Analisis de patógenos en plantas de
vivero de Palma Africana
Patógeno Método Prueba Re-Indexación
Phytophthora DAS ELISA Tira Inmunológica Polymerase Chain Reaction (PCR) palma sintomática Raíces Substrato Anual Fusarium solani Fusarium oxysporum Aislado Planta sintomática Substrato y raíces Anual
Fusarium
Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis
• Patógeno habitante del suelo
• Sobrevive en forma de
clamidósporas en el suelo y en los residuos.
• Bloqueo de las vasos del xylema y producción de tilosas y goma.
• Reducción del crecimiento
• Marchitez y muerte de la palma
Fusarium solani
• Patógeno habitante del suelo
• Sobrevive en forma de
clamidósporas en el suelo y en los residuos.
• Causa la pudrición de las raices.
Fusarium solani
• Fusarium solani (Mart.) Sacc. (teleomorph = Nectria haematococca (Berk. & Br.).
• Para aislar el patogeno del suelo, mezclar la muestra del suelo con agua destilada y mezclar vigorosamente.
• Realizar diluciones seriadas y colocar 1 alicuota de cada dilucion en el medio de cultivo Nash & Snyder’s modificad (Cho, J.H., et al, 2001).
• Incubar los platos a temperatura ambiente y luz y luego de 7 dias trasnferir las
Fusarium solani
• En papa dextrosa agar F. solani produce micelio de color blanco a crema, escaso y tambien abundante
• Las macroconidias tienen 3-4 septas y son ligeramente curvadas, tienen una pared gruesa y su parte apical es atachada.
• La microconidias son abundante, oval a arinonada y se forman en falsas cabezas en monofialidos largos
Pudrición Basal del Tronco
Ganoderma
sp.
•
Material de propagación contaminado.
•
Ganoderma boninense, G. zonatum
y
G. miniatocinctum
reportadas en Malasia como patogénicas en Palma
Africana.
•
Pudrición interna de la palma y el crecimiento externo
del hongo en el tronco.
•
Marchitez de las hojas inferiores o de toda la palma
•
Immunoassay Protein-based – ELISA (anticuerpos
policlonales).
Detección de
Ganoderma
spp.
Multiplex PCR-DNA para la detección eidentificación de las diferentes especies de Ganoderma boninense, G. zonatum y G. miniatocintum.
Primers de la region ITS del ADN ribosomal.
• 5’-TTG ACT GGG TTG TAG CTG-3’ (Forward primer)
• 5’-GCG TTA CAT CGC AAT ACA-3’ (Reverse primer).
• ADN de Ganoderma boninense
Phytoplasmas
Parasitos obligados
Amarillamiento letal del
cocotero '
Ca.
Phytoplasma
palmae'
•
Extracción de ADN
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen
modificado
•
PCR con cebadores
universales para
phytoplasmas.
Phytoplasmas
Componentes AccuPrime HF1 La Taq2
Agua Molecular 41.75μl 37.5μl
10X AccuPrime Buffer II (blue
cap)/10X Buffer 5μl 5μl
dNTP ---- 4μl
Primer 1 (20pmol/μl) 1μl 1μl
Primer 2 (20pmol/μl) 1μl 1μl
Enzyme 0.25μl 0.50μl
Template DNA (10-50nm/ul) 1-3μl 1-3μl
Master Mix para la amplificacion PCR para una reaccion
de 50μl
Programa para PCR y Nested PCR
LA-Taq DNA Polymerase P-55-38 (AccuPrime-HF)
94
oC 1 min.
94
oC 2 min.
94
oC 30 seg,
94
oC 1 min.
50
oC 1 min.
55
oC 2 min.
68
oC 5 min.
72
oC 3 min.
35 ciclos (paso 2 - 4)
38 ciclos (pasos 2-4)
72
oC 10 min.
72
oC 7 min.
Virus en palma africana
•
African oil palm Ringspot Virus (Foevovirus)
•
Chlorotic mottle
RT-PCR
•
Cebadores specificos AOPRV (Morales et al,
2009).
•
Forw165
5’-CCTTTGACTCTAGCCAAGA-3’
•
Rev936
Erwinia spp.
Erwinia carotovora
Erwinia amylovora
Prioridades
Prioridad 1 Prioridades de Investigación
Resumen 1. Determinar la presencia de Phytophthora en las zonas productoras de Palma en Ecuador.
2. Utilizar métodos moleculares para la detección de
Phytophthora palmivora desde tejido sintomático.
3. Investigar las alternativas exitosas disponibles en otros países (fertilización, prácticas culturales,
fungicidas, etc.) para el manejo de la enfermedad que se puedan validar y diseminar en Ecuador.
4. Implementar un plan de investigación a mediano plazo para la detección de otras enfermedades transmitidas por material vegetativo en Palma Africana.
Determinar la presencia de
Phytophthora
en
palma africana en Ecuador
•
Muestreo en San Lorenzo.
•
Utilizar varios metodos de aislamiento de
P. palmivora
utilizando trampas.
•
Muestreo de otros hospederos de
P. palmivora.
•
Estudiar posibles reservorios de
P. palmivora.
•
Determinar la sucesion de los patógenos asociados a la
pudrición del cogollo.
•
Estudiar la importancia de
Erwinia
en la pudrición del
cogollo.
Utilizar métodos moleculares para la detección
de
Phytophthora palmivora
desde tejido
sintomático
•
Determinar la presencia de
P. palmivora
desde el tejido
afectado utilizando PCR
•
Utilizar qPCR (PCR en tiempo real).
•
Utilizar controles (+) de
P. palmivora
para las pruebas
moleculares.
•
Mejoramiento del vigor del sistema radicular.
•
Estudiar el efecto de las prácticas de manejo de la palma
y su influencia en la enfermedad.
Prioridades
Prioridad 2
Prioridades Regulatorias
Resumen 1. Establecer un sistema de producción de material de propagación certificado de palma africana.
2. Implementar regulaciones obligatorias para la producción de material de propagación de palma africana.
3. Establecimiento de un control fitosanitario para producción de palma africana.
4. Iniciar un programa colaborativo de cuarentena y
certificación con responsabilidades compartidas entre las diferentes entidades y organizaciones públicas y privadas y los Productores de Palma.
5. Integrar las iniciativas y programas existentes o
Referencias
Broschat, T., Elliot M. 2005. SP 360 Disorders and Diseases of Ornamental Palms. University of Florida.
Drenth A., Wagels G., Smith B., Sendall B., Dwyer C., Irving G., Irwin J. 2006. Development of a DNA-based method for detection and identification of Phytophthora species. Australasian Plant Pathology Society.
Cho, J. H., Rupe, J. C., Cummings, M. S., and Gbur, E. E., Jr. 2001. Isolation and identification of Fusarium solani f. sp. glycines from soil on modified Nash and Snyder’s medium. Plant Dis. 85:256-260.
