Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Cinética de Reacciones

Catalizadas por Enzimas

Ø  Las enzimas son biomoleculas que se comportan como

catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones químicas en los sistemas biológicos.

Ø Éstas biomoléculas son estables y funcionan en condiciones

muy suaves, ambiente acuoso, bajas temperaturas y en muchas ocasiones pH neutro.

Ø  La catálisis enzimática es esencial para los organismos vivos,

ya que hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones químicas, las que en ausencia de catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH.

hélice alfa

lámina plegada beta

Estructura secundaria de las

proteínas

Las enzimas son biomoléculas, típicamente proteínas, frecuentemente asociadas con moléculas orgánicas pequeñas y/o iones metálicos conocidos como cofactores

Corresponde a la forma que adopta la cadena polipeptidica y está determinada por cuatro factores principales:

Estructura terciaria de las proteínas

Enlaces disulfuro (-S-S-) entre los átomos de azufre de

dos subunidades de cisteína. _{hélice alfa}

lámina plegada beta

Atracción iónica entre grupos R con cargas positivas y negativas

Interacciones

hidrófobas derivadas de la tendencia de los grupos R no polares para asociarse hacia el centro de la estructura

globular Puentes de hidrógeno entre

grupos R de subunidades de aminoácidos en asas adyacentes de la misma

Ø La actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Ø  Si se desnaturaliza o disocia en subunidades pierde su actividad

En 1890s, Emil Fischer propuso un modelo de llave cerradura para explicar la especificidad de las enzimas.

Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan reacciones de sustratos en una configuración, pero no en otra.

Ø  Una enzima puede contener uno o más sitios activos. El sitio

activo consiste solamente de unos cuantos residuos de aminoácidos y el resto de la proteína se requiere para mantener su integridad tridimensional.

Grafica de la velocidad de una reacción catalizada

por enzima vs. concentración de sustrato

] [ ] [ 0 S b S a v + = [E]₀ = cte

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.

Cinética de Michaelis-Menten

E = enzima S = sustrato, ES = complejo enzima sustrato

Para derivar una expresión de velocidad. Michaelis and Menten inicialmente asumieron que el paso lento es la formación de P a partir del complejo enzima-sustrato, ES. La formación de ES, se considera como un proceso de equilibrio rápido.

]

[

]

[

2 0 0

k

ES

dt

P

d

v

_⎟

₌

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

=

E + S ⇄ _{ES → P + E} k₁ k_-1 k₂

] [ ] [ 2 0 0 k ES dt P d v _⎟ = ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = ] [ ] ][ [ 1 1 ES S E k k K_s = − = La constante de disociación ( ) ] [ ] [ ] [ ] [ ₀ ES S ES E K_s = − [ ] ] [ ] [ ] [ 0 S K S E ES s + = ] [ ] [ ] [ ] [ _{2 0} 0 0 S K S E k dt P d v s + = ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = E + S ⇄ _{ES → P + E} k₁ k_-1 k₂ Cuando k_-1 >> k₂

Cinética de Michaelis-Menten

A un tiempo corto después del comienzo de la reacción, la concentración total de enzima [E]₀ = [E] + [ES]

⇒

] [ ] [ ] [ ] [ _{2 0} 0 0 S K S E k dt P d v s + = ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = 0 [_[ ]_] S b S a v + =

Cinética de Michaelis- Menten

a = k₂[E] ₀ y b = K_s

Tiene la forma de la

ecuación de la hipérbola

A baja concentración de sustrato, [S] << K_s

] [ ] [ ] [ 0 2 0 0 E S K k dt P d v s = ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = _{La velocidad depende de la [S]}

Esta ley de velocidad corresponde a la porción lineal de la gráfica de v₀ vs. [S]

A alta concentración de sustrato, [S] >> K_s

max 0 2 0 0 [ ] ] [ V E k dt P d v _{⎟ = =} ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ =

Bajo estas condiciones, todas las moléculas de enzima están en la forma del complejo ES. Consecuentemente, la velocidad es de orden cero en [S]

Representa la transición de baja a alta concentración

Cinética de Michaelis-Menten

Cuando todas las moléculas de enzima están complejadas con el sustrato, formando ES, la velocidad alcanza su máximo

max 0

2

0 k [E] V

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.

Cinética del estado estacionario.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_{P + E}

k_-1

k₂

En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan pronto como la enzima y el sustrato se mezclaban, la concentración del complejo ES alcanzaba un valor constante, de tal manera que la aproximación del estado estacionario podía aplicarse.

tiempo conc ent ra ci ón

Cinética del estado estacionario

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_{P + E}

k_-1 k₂ 0 ] [ ] [ ] ][ [ ] [ 2 1 1 − − = = k E S k₋ ES k ES dt ES d 2 1 1 0 1 ] [ ] [ ] [ ] [ k k S k S E k ES + + = − [E]₀ = [E] + [ES] 2 1 1 0 2 1 2 0 0 ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ k k S k S E k k ES k dt P d v + + = = ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = −

(

)

/ [ ] ] [ ] [ 1 2 1 0 2 0 _{k k k S} S E k v + + = − [E] = [E]₀ - [ES] 0 2 0 [ ] [ ] d P v k ES dt ⎛ ⎞ =_{⎜ ⎟} = ⎝ ⎠

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_{P + E}

k_-1 k₂ ] [ ] [ ] [ ₀ 2 0 _{K S} S E k v M + = 1 2 1 k k k K_M = − +

Este tratamiento define la velocidad máxima exactamente como el modelo de Michaelis –Menten, V_max = k₂[E]₀

] [ ] [ max 0 S K S V v M + = ] [ ] [ ] [ ₀ 2 0 _{K S} S E k v s + = 1 1 k k K_{s =} − K_M ≠ K_s

Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Estado estacionario: Equilibrio:

(

)

/ [ ] ] [ ] [ 1 2 1 0 2 0 _{k k k S} S E k v + + = −

Significado de

K

_M

Ø  K_M es un parámetro de afinidad con el sustrato. Mientras

mayor sea K_M la unión es más débil.

Ø  El valor de K_M varía considerablemente de una enzima a otra.

Ø  K_M depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH,

fuerza iónica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema enzima-sustrato en particular.

Ø  Para la mayoría de las enzimas, K_M está entre 10-1 M y 10-7 M.

1 2 1 k k k K_M = − +

Significado de V

_max

y

k

₂

Ø  Como su nombre lo indica, V_max representa la máxima

velocidad que puede alcanzarse.

Ø  De acuerdo con la ecuación, V_max = k₂[E]₀, si se conoce la

concentración de enzima, se puede determinar también la constante k₂.

Ø  k₂ es una constante de primer orden y tiene unidades de

tiempo-1_{. En cinética enzimática k}

2 se conoce también como

número de recambio de la enzima ó constante catalítica, k_cat.

Ø  El número de recambio de una enzima que está relacionada

con el número máximo de moléculas (o moles) de sustrato que se convierten a producto por unidad de tiempo. La mayoría de las enzimas tienen números de recambio entre 1 y 106 _s-1 _en

Anhídrasa Carbónica

CO

₂

+ H

₂

O HCO

₃–

_{+ H}

+

A 25 o_{C la anhídrasa carbónica tiene uno de los números de}

recambio mas altos que se conocen, k₂ = 1×106 _s-1_.

Esto indica que una solución 1×10-6 _{M de enzima puede}

catalizar la formación de 1 M de HCO₃‒ a partir de CO₂ (producido por metabolismo) y H₂O por segundo.

V_max = k₂[E]₀

V_max = (1×106 _s-1_)(1×10-6 _{M) = 1 M s}-1

En ausencia de la enzima, la constante de pseudo-primer orden es 0.03 s-1

Cinética de Michaelis-Menten

Determinación de la velocidad máxima (V_max) y de la constante catalítica (k₂) a partir de la gráfica de v₀ vs [S]

max 0

2

0 k [E] V

] [ ] [ 2 max max 0 S K S V V v M + = = Ø  Cuando la velocidad

inicial es la mitad del máximo de la velocidad K_M = [S] ] [ 2 ] [S ₊ K_{M =} S

K_M pueden también determinarse a partir de un gráfico de v₀ vs [S]

[S]

v₀

] [ ] [ max 0 S K S V v M + =

Muchas veces resulta complicado localizar el valor de V_max a altas concentraciones de sustrato. Lineweaver y Burk, propusieron un método mas fácil que consiste en hacer una gráfica de 1/v₀ vs. 1/[S].

max max 0 1 ] [ 1 V S V K v M ₊ = M K 1 − Vmax K m M = 0 1 v ] [ 1 S

Gráfica Linewaver-Burk

max 1 V

Eadie-Hofstee propusieron otro método para graficar los datos cinéticos, éste método consiste en multiplicar ambos lados de la ecuación del recíproco por v₀V_max

max max 0 1 ] [ 1 V S V K v M + = Vmax M K m _{= −} 0 v ] [ 0 S v 0 0 max ] [S v K v V M + = ] [ 0 max 0 S K v V v M − =

Gráfica Eadie-Hofstee

Rearreglando: _KM V_max

Anhídrasa Carbónica

CO

₂

+ H

₂

O HCO

₃–

_{+ H}

+

Ejercicio:

De Voe y Kistiakowsky (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 274) estudiaron la

cinética de hidratación de CO₂ catalizada por la enzima anhidrasa carbónica

En esta reacción, el CO₂ se convierte en ión bicarbonato. El bicarbonato es

transportado por el flujo sanguíneo y se vuelve a convertir en CO₂ en los

pulmones, ésta reacción está catalizada por la anhidrasa carbónica. Cuando la

concentración de enzima es 2.3 nM y T = 0.5 o_{C se midieron las siguientes}

velocidades iniciales. Velocidad (M s-1_{) [CO} 2] / mM 2.78 × 10-5 _1.25 5.00 × 10-5 _2.5 8.33 × 10-5 _5.0 1.67 × 10-4 _20.0

Determina K_M y k₂ para la enzima a esta

s V K m M ₄₀ max = = 0 1 v ] [ 1 S s M V 1 − = 4000 1 max V_max = 2.5 × 10-4 _{M s}-1 V_max = k₂[E]₀ Respuesta: 1 5 9 1 4 0 max 2 1.1 10 10 3 . 2 10 5 . 2 ] [ − − − − × = × × = = s M s M E V k

(

s

)

V

(

s

)

(

M s

)

mM K_{M =} 40 _{max =} 40 2.5_×10−4 −1 ₌10 max max 0 1 ] [ 1 V S V K v M + =

Inhibición de las enzimas

La inhibición de algunas enzimas por metabolitos específicos constituye un elemento importante en la regulación del metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibición reversible de las enzimas son:

Ø  Competitiva.

Ø  Acompetitiva

Ø  No competitiva

Los tres tipos de inhibición se pueden distinguir experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cinética de reacción.

Inhibición Competitiva.

Tanto el sustrato, S, como el inhibidor, I, compiten por el mismo sitio activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor, EI, análogo al complejo enzima sustrato.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_P

k_-1 k₂

+

I

⇄

EI

K_I Mecanismo:

El complejo EI no forma productos

ES

EI E

Debido a que la interacción del inhibidor con la enzima es reversible:

Ø  Una disminución en la concentración del inhibidor

desplazará el equilibrio hacia la regeneración de la enzima libre.

Ø  Dado que tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el

mismo sitio de unión, un aumento en la concentración de sustrato, provee una segunda manera de revertir la inhibición competitiva. Mientras mayor sea la concentración de sustrato mayor será la cantidad de complejo ES.

Inhibición Competitiva.

E + S ⇄ ES → P + I ⇄ EI

] [ ] [ 1 ] [ max 0 S K I K S V v I M _⎟⎟ + ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + =

Inhibición Competitiva.

E + S ⇄ ES → P k₁ k_-1 k₂ + I ⇄ EI K_I EI I E K_I ] [ ] ][ [ =

Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

max max 0 1 ] [ 1 ] [ 1 1 V S K I V K v _I M + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + − = ] [ 1 I K K K intercepto I I M 0 1 v ] [ 1 S max 1 V [I] = 0 [I] ] [ ] [ 1 ] [ max 0 S K I K S V v I M _⎟⎟ + ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = m x y b

Excepto que el término K_M está modificado por:

ésta ecuación tiene la misma forma que la ec. de Michaelis-Menten ] [ ] [ 1 ] [ max 0 S K I K S V v I M _⎟⎟ + ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + =

Inhibición Competitiva.

E + S ⇄ ES → P k₁ k_-1 k₂ + I ⇄ EI K_I

Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la concentración total de enzima está dada por: [E]₀ = [E] + [EI] + [ES]

] [ ] [ max 0 S K S V v M + = EI I E K_I ] [ ] ][ [ = ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + I K I] [ 1

Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I M K I V K m 1 [ ] max max V K_M -K_I I M M K V I K V K m max max ] [ + = [I] m I M K V K m max '₌

Inhibición No Competitiva.

Un inhibidor no competitivo no se une al sitio activo de la enzima.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_P

k_-1 k₂

+

I

⇄

EI

K_I Mecanismo:

+

I

⇄

ESI

K_I

+ S

⇄

EI y ESI no forman productos

ES

EI E

ESI

⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I I M M I K I S K I K S V S K S K I V v ] [ 1 ] [ ] [ 1 ] [ ] [ ] [ ] [ 1 max max 0

Inhibición No Competitiva.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_P

k_-1 k₂

+

I

⇄

EI

K_I

+

I

⇄

ESI

K_I

+ S

⇄

Ø  Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el

mismo sitio de unión, un incremento en la concentración de sustrato no puede revertir la unión porque también se incrementaría el número de complejos que contienen inhibidor (ESI).

Ø  El efecto de un inhibidor no competitivo es reducir la

concentración de complejos ES que pueden dar lugar a producto.

Ø  Puesto que V_max = k₂[E]₀ y la concentración de enzima total

disminuye debido a la formación de ESI, se espera que un inhibidor no competitivo disminuya la V_max.

Inhibición No Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

M K 1 − 0 1 v ] [ 1 S [I] = 0 [I] ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I I M K I V S K I V K v ] [ 1 1 ] [ 1 ] [ 1 1 max max 0 ] [ ] [ ] [ 1 max 0 S K S K I V v M I + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I K I V intercepto 1 1 [ ] max

Inhibición Acompetitiva.

Un inhibidor acompetitivo no se une a la enzima libre, sino al complejo enzima-sustrato, ES. La unión del sustrato modifica la estructura de la enzima, de tal manera que la unión del inhibidor es posible.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_P

k_-1 k₂ Mecanismo:

+

I

⇄

ESI

K_I ESI no forman producto

ES

E ESI

La adición de más sustrato no revierte el efecto inhibitorio

⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + + = + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I M I M I K I S K S V S K I K S K I V v ] [ 1 ] [ ] [ ] [ ] [ 1 ] [ ] [ 1 max max 0

Inhibición Acompetitiva.

E + S

⇄

k1

_ES

_→

_P

k_-1 k₂

+

I

⇄

ESI

K_I

Inhibición Acompetitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

M K 1 − 0 1 v ] [ 1 S [I] = 0 [I] ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = I K I V intercepto 1 1 [ ] max ] [ ] [ 1 ] [ ] [ 1 max 0 S K I K S K I V v I M I + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + = ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ + + = I M K I V S V K v ] [ 1 1 ] [ 1 1 max max 0 max V K m M =

Ejercicio:

Un químico midió la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima tanto en ausencia como en presencia de inhibidor A, en un experimento separado estudio el efecto del inhibidor B. En ambos casos la concentración del inhibidor fue 8.0 mM

[S]/ M v_o / M s-1 No inhibidor v_o / M s-1 Inhibidor A v_o / M s-1 Inhibidor B 5.0 × 10-4 _{1.25 × 10}-6 _{5.80 × 10}-7 _{3.80 × 10}-7 1.0 × 10-3 _{2.00 × 10}-6 _{1.04 × 10}-6 _{6.30 × 10}-7 2.5 × 10-3 _{3.13 × 10}-6 _{2.00 × 10}-6 _{1.00 × 10}-6 5.0 × 10-3 _{3.85 × 10}-6 _{2.78 × 10}-6 _{1.25 × 10}-6 1.0 × 10-2 _{4.55 × 10}-6 _{3.57 × 10}-6 _{1.43 × 10}-6

a) Determina los valores de K_M y V_max de la enzima. b) Para cada uno de los

inhibidores ( A y B ), determina el tipo de inhibición y calcula el valor de KI en cada caso.