INTRODUCCIÓN
El retinoblastoma es un paradigma de predis-posición genética al cáncer. Ya en 1971 Knudson anticipó, basándose en la distribución de retino-blastomas bilaterales y unilaterales en virtud de su edad de presentación, que el tumor debería ser causado por la inactivación de un gen por dos eventos mutacionales independientes (1). En 1986 se identificó y clonó el gen responsable de este tumor (denominado RB1), demostrándose que se encontraba mutado en estos tumores, y en consecuencia la hipótesis inicial de Knudson (2). En condiciones normales, la proteína codifi-cada por este gen es un regulador negativo de la proliferación celular. Su inactivación conduce, por tanto, a la eliminación de esta barrera produ-ciéndose un crecimiento celular desordenado que finalmente desemboca en la formación del tumor. A estos genes que desempeñan una regulación negativa sobre el ciclo celular se les denomina genéricamente genes supresores de tumores, ya que su inactivación aumenta la probabilidad de desarrollar un cáncer. RB1 también está implica-do en el desarrollo de otros tumores, como osteo-sarcomas, sarcomas de tejidos blandos y cáncer de pulmón microcítico, entre otros (3-5).
El modelo genético aceptado actualmente sugiere que dos mutaciones, afectando a cada una de las dos copias del gen del retinoblastoma, son suficientes y necesarias para el desarrollo del tumor (figura 1). La primera de estas mutaciones
puede aparecer en los precursores de las células de la retina y en consecuencia estar presente úni-camente en las células tumorales (retinoblasto-mas denominados no hereditarios) o estar presen-te en todas o la mayoría de las células del orga-nismo (retinoblastomas hereditarios). La segunda de las mutaciones, que inactiva la copia restante
Figura 1. Hipótesis de Knudson de los dos eventos
muta-cionales. En los retinoblastomas no hereditarios (A), el ADN constitucional presenta dos alelos normales del gen del retinoblastoma (RB1). Durante la embriogénesis, una célula de la retina adquiere la primera mutación en una de las dos copias del gen (rectángulo negro). Posteriormente, la otra copia del gen es inactivada en la misma célula por una segunda mutación. Por el contrario, en los retinoblastomas hereditarios (B), la primera mutación está presente en el ADN constitucional (heredada a través de la línea germi-nal), y por lo tanto, todas las células de la retina contienen solo una copia normal del gen. La inactivación de esta copia en cualquier célula de la retina conduce a la formación del tumor.
APORTACIÓN DE LA GENÉTICA
AL RETINOBLASTOMA
del gen, ocurre siempre en las células de la retina, conduciendo a la formación de un tumor con ambas copias del gen inactivadas.
Aproximadamente el 60% de los retinoblasto-mas son no hereditarios, correspondiendo el 40% restante a retinoblastomas hereditarios. Todos los retinoblastomas no hereditarios son unilaterales y en ellos no hay posibilidad de transmitir la enfer-medad a la descendencia, ya que las mutaciones en el gen RB1 están presentes únicamente en las células que forman el tumor. De los retinoblasto-mas hereditarios, es decir, aquellos en las que las células constitutivas del organismo son portado-ras de una mutación, un 70% son bilaterales. El 30% restante son tumores unilaterales (figura 2). Ya que los pacientes con retinoblastoma here-ditario son portadores de mutaciones constitucio-nales, estos pueden transmitir la enfermedad a la descendencia. Los niños que han heredado de sus padres una copia mutada del gen del
retinoblasto-ma tienen una probabilidad del 90% de desarro-llar el tumor, que en la mayoría de los casos será bilateral. La cuarta parte de los retinoblastomas hereditarios tienen una historia familiar de la enfermedad. El resto de los casos de retinoblasto-ma hereditario corresponden a la aparición de nuevas mutaciones en línea germinal en el paciente, las cuales no estaban presentes en sus progenitores, pero que si pueden ser transmitidos a su descendencia en el futuro (figura 2). Sin embargo, la ausencia de mutaciones en el ADN constitucional de sangre periférica de los proge-nitores —criterio habitual de no heredabilidad de la enfermedad— debe revisarse a la luz de la existencia de casos de mosaicismo. En estos, la mutación puede estar presente en las células ger-minales de los progenitores (p. ej. en los esper-matocitos del padre), y en consecuencia pueden transmitir la mutación a sus descendientes (6).
MUTACIONES EN EL GEN RB1 QUE PREDISPONEN A PADECER RETINOBLASTOMA
La mayoría, si no todas las mutaciones que predisponen al retinoblastoma, son el resultado de cambios genéticos que interfieren con la fun-ción normal del gen. En la tabla 1 se resumen los tipos de mutaciones identificadas.
Aproximadamente un 5% de las mutaciones son alteraciones cromosómicas extensas tales como deleciones, translocaciones o inversiones cromosómicas, muchas veces asociadas al deno-minado síndrome de 13q [retraso mental, micro-Figura 2. Genética del retinoblastoma y formas de
presen-tación. RETINOBLASTOMA 100% HEREDITARIO (40%) GENÉTICA FORMA DE PRESENTACIÓN CON HISTORIA FAMILIAR (10%) BILATERAL 60% UNILATERAL 30% SIN TUMOR 10% UNILATERAL 100% SIN HISTORIA FAMILIAR (esporádicos) 30% NO HEREDITARIO (60%) Tabla 1
Tipos de mutaciones en el gen RB1
Tamaño Frecuencia Tipo de mutación
Microscópico 3% - 5% deleciones, inserciones, translocaciones
Submicroscópico
macromolecular 15% - 20 % deleciones
micromolecular 75% - 80% mutaciones sin sentido
deleciones o inserciones (<20 nucleótidos) cambio de aminoácido
cefalia y otras anormalidades sistémicas (7)] que pueden ser detectadas mediante técnicas de cito-genética con microscopía convencional o mediante hibridación in situ con sondas fluores-centes (FISH) (mutaciones microscópicas).
Otros tipos de mutaciones son deleciones de relativamente grandes fragmentos de ADN, pre-sentes en el 15%-20% de los casos, pero que son lo bastante pequeñas para no poder ser detectadas mediante las técnicas citogenéticas habituales (mutaciones submicroscópicas). Estas alteracio-nes son frecuentemente detectadas mediante téc-nicas de hibridación de ADN (Southern-blot) (8). Sin embargo, la mayoría de las mutaciones corresponden a cambios sutiles en la secuencia del ADN, ésto es, a sustituciones o pequeñas inserciones o deleciones de unos pocos nucleóti-dos. Estas alteraciones sólo pueden ser detectadas mediante técnicas de biología molecular comple-jas tales como el análisis de polimorfismos con-formacionales de ADN de cadena sencilla (PCR-SSCP) y secuenciación (9-14). La consecuencia mas habitual de estas mutaciones es la formación de proteínas truncadas no funcionales debido a la aparición de codones de parada prematuros (15).
DIAGNÓSTICO MOLECULAR Y CONSEJO GENÉTICO
Los pacientes con antecedentes familiares de la enfermedad, retinoblastoma bilateral, y aproxi-madamente un 15% de los pacientes con retino-blastoma unilateral son portadores de mutaciones constitutivas en uno de los alelos del gen del reti-noblastoma que les predispone a desarrollar retinoblastoma.
Hasta la llegada de las modernas técnicas de análisis del ADN, solamente era posible determi-nar de manera empírica la probabilidad de tener descendencia con riesgo de desarrollar retino-blastoma, basándose en grandes estudios pobla-cionales (16). Por el contrario, los estudios mole-culares permiten determinar el genotipo de cada uno de los miembros de una familia, permitiendo evaluar el riesgo real de desarrollar la enferme-dad. Por tanto, el diagnóstico molecular en
pacientes con retinoblastoma y en sus familiares es de inestimable valor, especialmente en lo refe-rente al consejo genético.
A continuación se comentan brevemente los tres tipos de retinoblastoma hereditario en los que está indicado la realización de un estudio molecular.
Retinoblastoma familiar (más de un miembro de la familia afectado con retinoblastoma bilateral o unilateral).
El diagnóstico molecular en pacientes con retinoblastoma familiar y en todos los familiares en primer grado (padres, hermanos y descendien-tes) es altamente recomendable e informativo, ya que es posible identificar que miembros de la familia son portadores de la mutación que predis-pone a desarrollar retinoblastoma y cuales no (17). En estos casos, el análisis molecular consis-te en un estudio de ligamiento —una técnica que permite determinar que alelo segrega con la enfermedad y es portador de la mutación— reali-zado a partir del ADN de muestras de sangre periférica de los diferentes miembros de la fami-lia (sanos o no) (figura 3).
Retinoblastoma bilateral esporádico (sin historia familiar de la enfermedad)
Por definición, un retinoblastoma bilateral indica la presencia de una mutación germinal. El estudio del ADN constitucional de pacientes con retinoblastoma bilateral esporádico permite, en mas del 75% de los casos, identificar la mutación causante de la enfermedad (figura 4).
Estos estudios se realizan a partir de una mues-tra de sangre periférica del paciente, utilizando un conjunto de técnicas más o menos complejas de análisis de ADN (Southern-blot, polimorfismos en el tamaño de los fragmentos de restricción o RFLP, reacción en cadena de la polimerasa o PCR, secuenciación, etc.) con el fin de abarcar todas las formas diferentes de mutaciones (8-15). El interés de estos estudios estriba en la caracterización de la mutación y en la presencia o ausencia de esta en el
ADN constitucional de los progenitores, ya que se pueden dar casos de portadores asintomáticos (retinoblastomas de baja penetrancia) (18-19). Sin embargo, la ausencia de la mutación en el ADN de sangre periférica de los progenitores no permite descartar totalmente la posibilidad de transmisión de la mutación a la descendencia debido a la exis-tencia de casos de mosaicismos (individuos en los que la mutación, por ejemplo, no está presente en las células sanguíneas pero si en las células germi-nales). En estos casos puede ser de interés el estu-dio de una muestra de semen para determinar si la mutación está presente en los espermatocitos (6).
Retinoblastoma unilateral esporádico
En ausencia de historia familiar de la enfer-medad, sólo un 15% de los retinoblastomas uni-laterales son portadores de mutaciones en el ADN constitucional. En estos casos, el análisis
molecular debe ser realizado inicialmente en una muestra congelada del tumor, para caracterizar las mutaciones presentes en este, y posteriormen-te comprobar su presencia o ausencia en el ADN de sangre periférica (20).
Si una de las mutaciones del tumor es identi-ficada en el ADN constitucional, entonces el reti-noblastoma es hereditario. Como en el caso ante-rior, la mutación puede también ser estudiada en figura 3. Estudio de ligamiento en un caso de
retinoblasto-ma familiar. En este familia, tanto la retinoblasto-madre (RB122) como la paciente (RB123) fueron diagnosticadas de retinoblasto-ma unilateral. El análisis de cuatro retinoblasto-marcadores genéticos próximos al gen del retinoblastoma permitió determinar el alelo que segregaba con la enfermedad y en consecuencia, el que portaba la mutación que predisponía a desarrollar el tumor en esta familia (recuadro). La hermana menor de la paciente (RB124) heredó el alelo no mutado de la madre, y por lo tanto no tiene riesgo de desarrollar retinoblastoma.
Figura 4. Estudio molecular en un retinoblastoma bilateral
esporádico. (A) Electroforesis del exón 8 del gen del reti-noblastoma amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (padre, carril 1; madre, carril 2; pacien-te, carril 3). Obsérvese que el paciente presenta dos bandas, la mayor de las cuales corresponde al alelo mutado. El ais-lamiento de estas bandas y su secuenciación posterior (dere-cha) permitió caracterizar con exactitud la mutación, for-mada por una deleción de 5 nucleótidos y una inserción de 18. (B) Como consecuencia de la mutación se destruyó la secuencia específica reconocida por una enzima de restric-ción de ADN. Obsérvese que la enzima corta el alelo nor-mal en dos fragmentos (bandas inferiores), pero no el alelo mutado presente únicamente en el paciente (banda supe-rior). Ambos progenitores fueron portadores exclusivamen-te de alelos normales, por lo que la probabilidad de exclusivamen-tener otro hijo con retinoblastoma era la misma que la incidencia de la enfermedad en la población normal.
los progenitores, y determinar si se trata de una mutación de novo. Sin embargo, como conse-cuencia de una mejoría sustancial en los métodos de detección y tratamiento, el número de enucle-aciones está disminuyendo progresivamente, haciendo cada vez mas difícil la obtención de tejido tumoral para este tipo de estudios.
CONCLUSIONES
La realización de los análisis genéticos en pacientes con retinoblastoma hereditario presenta varias ventajas. Primero, al caracterizar las muta-ciones causantes de la enfermedad, es posible identificar que miembros de una familia son por-tadores de la mutación y tienen riesgo de desa-rrollar el tumor. Así, los niños no portadores de un gen mutado pueden librarse de los frecuentes e incómodos exámenes oftalmológicos, mientras que puede incrementarse la vigilancia en aquellos que son portadores, aumentando las probabilida-des de detección precoz y en consecuencia de conservar la visión (21). Segundo, la estrategia molecular, no solo aporta resultados de valor clí-nico, sino que también resulta menos costosa al seleccionar los pacientes de alto riesgo suscepti-bles de monitorización convencional. En un tra-bajo reciente, el estudio molecular resultó hasta cuatro veces menos costoso que los protocolos convencionales al uso (22). Por último, el diag-nóstico molecular es la base imprescindible para llevar a cabo un consejo genético documentado, el cual comienza a ser demandado por los padres, cada vez con mas insistencia.
En resumen, el diagnóstico molecular en pacientes con retinoblastoma hereditario debe ser una parte integral de su tratamiento. Sin duda, su incorporación a la práctica clínica debe incre-mentar la eficacia de los tratamientos y la calidad de vida de los pacientes y sus familiares.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado con ayudas del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS98/1349),
Comunidad Autónoma de Madrid (081/0024/1998) y Rhône-Poulenc-Rorer. Agradecemos también a P. Nebrada y a N. Gómez por la asistencia técnica prestada.
Igualmente a la Dra. García de Miguel y al Dr. Abelairas del Hospital Infantil La Paz por integrarnos dentro de la Unidad de Retinoblasto-mas de La Paz.
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