UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia
DOCTORADO EN BIOLOGÍA
TESIS DOCTORAL
“Estudio del rol modulador de TNFRp55 en
células dendríticas: impacto en artritis reactiva
inducida por
Yersinia enterocolitica
”
Autora: Andrea Constanza Mayordomo
Directora: Dra. María Silvia Di Genaro
Co-Director: Dr. Walter Berón
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia
DOCTORADO EN BIOLOGÍA
TRABAJO FINAL
TESIS DOCTORAL
“Estudio del rol modulador de TNFRp55 en
células
dendríticas: impacto en artritis reactiva inducida por
Yersinia enterocolitica
”
Autora
Andrea Constanza
Mayordomo
Directora
Dra. María Silvia Di
Genaro
Co-Director
Dr. Walter Berón
emocional, mental y físico, durante estos cinco años. Seguramente no voy a
poder expresar en este apartado ni la milésima parte de este tiempo.
Primero, quiero agradecer a la Universidad Nacional de San Luis
no sólo por la posibilidad de formarme académicamente, sino por brindar
un lugar donde uno puede cuestionar, reflexionar y defender ideas,
posturas, causas ya sean propias o colectivas. Agradezco, inmensamente
que existan espacios dentro de la universidad donde uno pueda
problematizar su trabajo, la manera de hacerlo, la ciencia, la educación,
las conexiones con la sociedad, luchar por nuestros derechos o por los de
los otros. De alguna manera me siento una privilegiada en este aspecto ya
que si estuviera en otro lugar o situación, no tendría estas libertades o no
me replantaría las cosas.
A Silvia, no sólo por brindarme un lugar en tu laboratorio el cual me
permitió formarme, sino también por darme las posibilidades de crecer
académicamente y tener autonomía. Tengo que señalar que no soy una
persona fácil y a pesar de tener algunas diferencias con vos, voy a
extrañar la relación que hemos logrado entablar. ¡Gracias por todo!
A Walter, se que nos hemos conocido poco pero agradezco la
confianza que me has brindado, el apoyo incondicional y perdón por
hacerte trabajar tanto en tan poco tiempo. De verdad ¡muchas gracias!
Al grupo de Inmuno, lugar donde encontré amigos, con quienes
compartí muchas experiencias, como todo lugar tiene sus altibajos, pero
me llevo sólo las risas y los momentos felizmente compartidos. Todos
somos distintos, armonizar el conjunto es el quid de la cuestión y desde esa
base se aprende muchísimo. La verdad ¡gracias por todo!
A los amigos de la vida, los cuales incluyo a TODOS, la verdad no
tengo palabras que describan todo lo que me han brindado. Pero gracias a
ustedes mis días han sido siempre diferentes y he aprendido muchísimo de
cada uno. Desde el compartir unos mates, un deporte, una charla, un
asado, una cervecita, un viaje, ir a acampar, etc. Esos momentos han sido
los mejores de mi vida. ¡Muchas Gracias!
uno cuando es el del medio tiene que hacer la diferencia jajaja. Gracias a
ustedes he aprendido a nunca bajar los brazos y proponerme objetivos que
se que con perseverancia y paciencia se logran. ¡Gracias por estar
siempre!
Sólo podemos dar
lo que ya
hemos dado
.
Sólo podemos dar
lo que ya es
del
otro
… ¡
Qué misterio
es una
dedicatoria
,
una
entrega
de
símbolos
!".
Resumen ... 2 Abstract ... 4
Abreviaturas ... 6
Introducción ... 10
1) Artritis Reactiva ... 11 1.1) Definición ... 111.2) Agentes patogénicos de la enfermedad ... 11
1.3) Epidemiología ... 12 1.4) Sintomatología ... 12 1.5) Tratamiento ... 13 1.6) Fisiopatología ... 14 2) Yersinia ... 15 2.1) Generalidades ... 15 2.2) Yersinia enterocolítica ... 16 2.3) Síntomatología ... 17 2.4) Infección y patogenicidad ... 18 2.5) Factores de Virulencia ... 20
3) Factor de Necrosis Tumoral ... 23
3.1) Generalidades ... 23
3.2) Receptores y vías de señalización ... 23
3.3) Rol de TNF ... 26 4) Interleuquina 12/23p40 ... 27 4.1) Rol de IL-12/23p40 ... 28 5) Células Dendríticas ... 30 5.1) Generalidades ... 30 5.2) Rol de CDs ... 31 6) Perfil de linfocitos T CD4+ ... 32
7) Modelo de ARe. Antecedentes ... 34
Objetivos ... 35
Hipótesis ... 36
Objetivo general ... 36
1) Ratones ... 38
1.1) Corroboración del genotipo de los ratones ... 38
1.2) Modelo de expansión celular [138] ... 39
2) Bacteria... 39
2.1) Infección in vivo ... 40
2.2) Infección in vitro ... 40
3) Obtención de órganos ... 41
3.1) Obtención de esplenocitos ... 41
3.2) Obtención de células peritoneales ... 41
3.2.1) Estudio cinético ... 42
3.3) Obtención de médula ósea ... 42
3.3.1) Diferenciación a CDs ... 43
4) Citometría ... 43
4.1) Determinación de antígenos de superficie ... 43
4.1.1) Anticuerpos de superficie. ... 44
4.1.2) Fijación: ... 44
4.2) Determinación intracelular de citoquinas ... 45
4.2.1) Marcación IL-12p40/70 ... 45
4.2.2) Marcación IFN-γ y IL-17 A ... 45
4.3) Purificación de CDs ... 46
4.4) Purificación de Linfocitos T CD4+ ... 46
4.5) Marcación con CFSE (diacetato de carboxifluoresceína ester succinimidil).. 47
4.6) Viabilidad celular ... 47
5) Cultivo de células JAWS II ... 47
5.1) Control de micoplasmas mediante tinción con DAPI ... 48
6) Estimulación In Vitro ... 48
6.1) Estimulación de esplenocitos... 48
6.2) Estimulación de CD ... 49
6.2.1) Ensayo de inhibidores ... 49
6.3) CD obtenidas del modelo de expansión celular ... 50
6.3.1) Ensayo de inhibidores ... 50
6.3.2) Ensayo con TNFh e inhibidores de TNF ... 51
6.3.3) Ensayo de co-cultivo ... 51
6.4) Estimulación de las células JAWS II... 52
7) Determinación de citoquinas por ELISA ... 53
8) Análisis estadístico ... 53
Resultados ... 54
Objetivo 1 ... 55
Cinética de producción de citoquinas pro- y anti-inflamatorias en esplenocitos ... 56
Estudio del número absoluto de células del sistema inmune en bazo ... 57
CPA: candidatas de desregulación en la producción de IL-12/23p40 ... 58
Vías de señalización JNK y p38 cumplirían una función clave en la sobreproducción de IL-12/23p40 ... 61
Inhibición de vías de señalización, relación IL-12/23p40 con IL-10 ... 63
Ratones IL-10-/- permiten explicar la relación IL-12/23p40 con IL-10 ... 65
Resumen. Modelo ... 68
Objetivo 2 ... 70
Obtención de CDs a partir de peritonitis aséptica. ... 71
Diferenciación de CDs a partir de médula ósea ... 73
Estandarización de la concentración de TNFh y protocolo de co-cultivo ... 75
Obtención de CDs a partir de un modelo de expansión celular ... 77
Análisis de las vías MAPKs en la producción de IL-12/23p40 e IL-10 ... 80
Efecto regulador de TNF en la vía TNFRp55: TNF humano ... 83
Implicancia de los receptores de TNF en IL-12/23p40 ... 85
Grado de activación de CDs frente a una infección in vitro con Ye ... 87
Efecto de CDs TNFRp55-/- infectadas con Ye en la proliferación de linfocitos T CD4+ ... 89
Efectos de las CDs TNFRp55-/- sobre el perfil de citoquinas secretadas por linfocitos T CD4+ ... 91
Resumen. Modelo ... 94
Participación de las vías MAPKs en la producción de IL-12/23p40 ... 99
Estandarización y optimización de ensayos en células JAWS II ... 100
Modificación de medio de cultivo ... 101
Análisis de marcadores moleculares ... 102
Comparación de los efectos de los factores de crecimiento sobre la expresión de marcadores de superficie de células JAWS II ... 104
Comparación de los efectos de los factores de crecimiento sobre la producción de IL-12/23p40 por las vías de MAPKs por células JAWS II ... 105
Comparación de los efectos de los factores de crecimiento sobre el rol regulador de TNFh sobre la producción de IL-12/23p40 por células JAWS II ... 106
Discusión ... 108
IL-12/23p40 blanco de desregulación ... 109
Células dendríticas: rol central en la inmunopatogenia de ARe ... 110
Vías MAPKs involucradas en la producción de IL-12/23p40 ... 112
Inhibidores específicos de TNF ... 113
Subtipos de CDs ... 114
JAWS II como modelo experimental ... 117
Conclusiones ... 120
2
Resumen
Las células dendríticas (CDs) juegan una función crítica en el inicio de
la respuesta inmune. Entender su rol en la Artritis reactiva (ARe) podría
ayudar a delinear la patogénesis de esta artropatía. En estudios previos, hemos
detectado una desregulación de la Interleuquina (IL)-12/23p40 en ARe
inducida por la bacteria
Yersinia enterocolitica
(Ye) en ratones deficientes en
TNFRp55 (
TNFRp55
-/-).
En el presente estudio, ensayamos la contribución de CDs en la
sobreproducción de dicha citoquina. Primero, confirmamos en sobrenadantes
de esplenocitos de ratones
TNFRp55
-/-obtenidos el día del inicio de ARe (14
días post-infección) y estimulados con lipopolisacarido (LPS), niveles
elevados de IL-12/23p40, IFN-
γ
e IL-17A. Luego, identificamos en
esplenocitos totales un aumento en la frecuencia de CDs IL-12/23p40
+en
ratones
TNFRp55
-/-infectados con Ye, evidenciando a las CDs como una
fuente principal de IL-12/23p40. Posteriormente, aplicamos un modelo de
expansión
in vivo
de CDs mediante inyección de células de melanoma B16
transfectadas con FLT3L (de sus siglas del inglés fms-like tirosine kinasa 3
ligand). Demostramos que CDs
TNFRp55
-/-purificadas y aisladas de bazo
secretaron una mayor cantidad de IL-12/23p40, y en ensayos de co-cultivo,
favorecieron la diferenciación de linfocitos T CD4
+wild-type (WT) hacia los
fenotipos Th1 y Th17.
Un análisis realizado sobre las vías de quinasas MAPKs (de su sigla en
inglés Mitogen-Activated Protein Kinases
)
, utilizando inhibidores específicos
de las vías JNK y p38 MAPK, demostró que estas vías están involucradas en
la sobreproducción de IL-12/23p40 en CDs
TNFRp55
-/-purificadas, como así
también en la línea celular de dendríticas JAWS II. Esta desregulación fue
nuevamente atribuida a la deficiencia de TNFRp55 utilizando un inhibidor
especifico de la vía (CAY10500), el cual comprometió el control de
IL-12/23p40 mediada por TNF (factor de necrosis tumoral) en CDs WT
3
estimuladas con LPS. Simultáneamente, este inhibidor redujo la producción
de IL-10, sugiriendo su rol regulador en la producción de IL-12/23p40
mediado por la señalización por TNFRp55.
Estos resultados proveen datos experimentales sobre la existencia de un
circuito anti-inflamatorio mediado por TNFRp55 en CDs. Por lo tanto, Estas
células pueden considerarse un nuevo blanco en el tratamiento de ARe.
4
Abstract
Dendritic cells (DCs) play critical functions in the initiation of
immune responses. Understanding their role in reactive arthritis (ReA) will
help delineate the pathogenesis of this arthropathy. In early studieswe
detected IL-12/23p40 deregulation in
Yersinia
entercolitica
(Ye)-induced
ReA in TNFRp55-deficient (
TNFRp55
-/-) mice. In the present study, we
investigated the contribution of DCs in this overproduction. First, greater
levels of IL-12/23p40, IFN-
γ
and IL-17A were confirmed in supernatants
of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated
TNFRp55
-/-splenocytes obtained on
arthritis onset (day 14 after Ye infection). Later, DCs were identified as a
precise source of 12/23p40 since increased frequency of splenic
IL-12/23p40
+DCs was detected in
TNFRp55
-/-mice.
After robust
in vivo
amplification of DCs by injection of Fms-like
tyrosine kinase 3- Ligand (Flt3L)-transfected BL16 melanoma, DCs were
purified. These cells recapitulated the higher production of IL-12/23p40
under TNFRp55deficiency. In agreement with these results,
TNFRp55
-/-DCs promoted Th1 and Th17 programs by co-culture with WT CD4
+lymphocytes.
A mechanistic study demonstrated that JNK and p38 MAPK
(
Mitogen-Activated Protein Kinases
)
pathways are involved in
IL-12/23p40 overproduction in purified
TNFRp55
-/-DCs as well as in the
JAWS II cell line. This deregulation was once again attributed to TNFRp55
deficiency since CAY10500, a specific inhibitor of this pathway,
compromised TNF-mediated IL-12/23p40 control in LPS-stimulated WT
DCs. Simultaneously, this inhibition reduced IL-10 production, suggesting
its role mediating IL-12/23p40 regulation by TNFRp55 pathway.
5
These results provide experimental data on the existence of a
TNFRp55-mediated anti-inflammatory circuit in DCs. Moreover, these
cells may be considered as a novel target in the treatment of ReA.
7
ADN
: Ácido Desoxirribonucleico
Ail
: locus adhesión-ivasión (del
inglés
attachment-invasion locus)
AINE
: drogas antinflamatorias
no esteroides
AMH
: agar Mueller-Hinton
ANOVA
: Analisis de varianza
APC:
Aloficocianina
ARe
: Artritis Reactiva
ARN
: Ácido Ribonucleico
ATCC
: del inglés
American Type
Culture Collection
BDCA-1
: Antígeno-1 de células
dendríticas de sangre
CAY
: CAY10500
CDc
: CDs convencionales
CDP
: precursores comunes de
CDs
CDs
: células dendríticas
CFSE
:
diacetato
de
carboxifluoresceína
ester
succinimidil
CICUA
: Comité Institucional de
Cuidado y Uso de Animales
CL
: caldo Luria
CPA
: células presentadoras del
antígeno
CSF1-R
: receptor 1 del factor
estimulador de colonias
CTL
: linfocitos T citotóxicos
DC-SIGN
:
No
integrina
aglutinante de ICAM-3 específica
de CD
DMARD
: drogas antireumaticas
midificadoras de la enfermedad
(del
inglés
disease-modifying
antirheumatic drugs
)
DMSO
: dimetilsulfóxido
ELISA
:
ensayo
por
inmunoabsorción ligado a enzimas
ERK
: enzima quinasa regulada por
señales extracelulares
EspA
: Espondiloartropatías
FITC
:
Isotiocianato
de
Fluoresceína
FMO
: fluorescencia menos uno
GLM
:
ganglios
linfáticos
mesentéricos
GM-CSF
: factor estimulante de
colonias
de
granulocitos
y
macrófagos
hFlt3L
: de sus siglas en inglés
“human fms-like tirosine kinasa 3
ligand”
8
HLA
:
antígeno
leucocitario
humano (de las siglas en inglés
human leukocyte antigen
)
HPI
: isla de alta patogenicidad
Hsp60
:
proteínas
de
shock
térmico
i.p
: intraperitoneal
IFN
: Interferón
IL
: interleuquina
IL-10
-/-: ratón deficiente en IL-10
IL-12R
: receptor de IL-12
IP
: ioduro de propidio
JAWS II
: línea celular de CDs de
ratón
JNK
: enzima quinasa c-Jun-N
LPS
: Lipopolisacarido
LUBAC
:
del
inglés
linear
ubiquitin chain assembly complex
MAPK
:
proteínas
quinasas
activadas por mitógenos
MFI
: Intensidad de fluorescencia
media
MHC II
: complejo mayor de
histocompatibilidad clase II.
MOI
: multiplicidad de infección
mTOR
: diana de rapamicina en
células de mamíferos
MyM
: materiales y métodos
NF-
κ
κ
κ
κ
B
: factor nuclear potenciador
de las cadenas ligeras kappa de las
células B activadas
NK
: asesina natural (del inglés
Natural Killer)
p38
: proteinquinasa de la familia
MAPK
PBS
: buffer fosfato salino
pCDs
: CDs plasmositoides
PE
: ficoeritrina
PerCp
:
Proteína
Clorofila
Peridinina
PFA
: Paraformaldehido
PP
: Placas de Peyer
pYV
: plásmido de virulencia de
Yersinia
(del inglés
plasmid of
Yersinia virulence
)
RAK1
: proteína serina/treonina
quinasa 1
RIPK3
: proteína serina/treonina
quinasa 3
SF
: solución fisiológica
SFB
: suero fetal bovino
T3SS
: sistema de secreción tipo 3
Th
: células T colaboradora
TNF
: factor de necrosis tumoral
9
TNFRp55
-/-:
ratones deficientes
en TNFRp55
TNFRp55
: Receptor tipo I de
TNF
(sinónimos
del
mismo
receptor TNFRI, CD120a)
TNFRp75
: Receptor tipo II de
TNF
(sinónimos
del
mismo
receptor TNFRpII, CD120b)
TRADD
: motivos de dominio de
muerte conservados
TRF2
: factor 2 asociado a TNFR
UFC
: unidades formadoras de
colonia
WT
: Wild-Type
YadA
: adhesina A de
Yersinia
Ye
:
Yersinia enterocolitica
Yops
: proteínas externas de Ye
(del
inglés
“
Yersinia
outer
proteins
”)
11
1) Artritis Reactiva
1.1) Definición
La ARe es una sinovitis aséptica que se desarrolla como consecuencia de una infección distante, usualmente en el tracto genitourinario o gastrointestinal. La misma pertenece al grupo de artritis seronegativas conocidas como espondiloartropatías (EspA) [1].
El criterio diagnostico válido para ARe, es observar en pacientes las manifestaciones que implican una artritis asimétrica, la cual puede ser mono u oligoartritis y que involucra las extremidades bajas. La misma debe presentarse después de un periodo de días o semanas de la confirmación microbiológica de una infección entérica o genitourinaria, la cual ha sido corroborada por medio de evidencia clínica o de laboratorio [2].
Hoy en día no hay un criterio bien definido para el diagnóstico de ARe, por lo cual es necesario profundizar en la identificación de factores, tanto microbianos como del hospedador que llevan a la cronicidad de la enfermedad, los cuales permitirían identificar, definir y diagnosticar ARe [3].
1.2) Agentes patogénicos de la enfermedad
Chlamydia trachomatis se encuentra fuertemente asociada con ARe, la misma es la más frecuente luego de una infección genitourinaria. Dentro de los patógenos gastrointestinales podemos nombrar Campylobacter jejuni, Clostridium difficile,
Escherichia coli, Salmonella (varias especies), Shigella (especialmente S. flexneri), y
Yersinia (especialmente Y. enterocolitica y Y. pseudotuberculosis). Patógenos respiratorios tales como Chlamydia pneumoniae o Mycoplasma pneumoniae también están implicados en ARe. [4]
12
1.3) Epidemiología
ARe afecta a adultos jóvenes en el rango de 20-40 años de edad, es más frecuente en individuos caucásicos, posiblemente debido a la alta frecuencia del antígeno HLA-B27 en este grupo étnico. Este antígeno pertenece a las moléculas HLA (de las siglas en inglés human leukocyte antigen) clase I. Este tipo de artritis es rara en niños, y es usualmente producida por infecciones gastrointestinales [5].
Ambos sexos son afectados de igual manera luego de una infección gastrointestinal, mientras que la enfermedad producida por C. trachomatis es más frecuente en hombres en una relación 5:1 o 10:1 con mujeres [1].
La prevalencia estimada es de 30-40 casos por 100.000 adultos y la incidencia anual de esta enfermedad es de 4,6 casos/100.000 para Chlamydia, y 5/100.000 para enterobacterias. Sin embargo el número real puede ser significativamente mayor. Tomando en cuenta los números sobre el desarrollo de artritis posterior a brotes de infecciones por enterobacterias (ej. Salmonella, Campylobacter y Yersinia) la incidencia en estos casos es de 1 por cada 1.000 de la población [6].
Como se mencionó anteriormente, el factor genético fuertemente asociado a ARe es la familia de B27, que abarca 25 glicoproteínas (B*2701 a HLA-B*2725) [7]. Se han reportado pacientes positivos para este antígeno los cuales presentan ARe en un 50-80% [8]. A su vez algunos autores destacan que la presencia de este antígeno aumenta el riesgo de contraer la enfermedad en un 50% [9].
1.4) Sintomatología
El inicio de la ARe suele ir precedido de los síntomas de la infección desencadenante. Estos incluyen diarrea en el caso de infección gastrointestinal, que en algunos casos puede ser tan severa, que lleva a la sospecha de una enfermedad inflamatoria intestinal, como la enfermedad de Crohn [10]. En el caso de la infección urogenital, los síntomas urinarios incluyen disuria o poliuria, especialmente en hombres.
13
Otros problemas urogenitales que pueden surgir son prostatitis en hombres y cervicitis, salpingitis y/o vulvo-vaginitis en mujeres. Los síntomas clínicos de ARe pueden desarrollarse 1-3 semanas (pero también hasta 6 semanas) después de la infección. Sin embargo, algunas excepciones están representadas por la infección con C. trachomatis, en la cual el período de latencia hasta el desarrollo de la ARe puede ser mayor alcanzando hasta 4 semanas en sólo un tercio de los casos, y además, puede causar infecciones silenciosas en las mujeres [5].
El principal síntoma de presentación de ARe es la oligoartritis asimétrica, localizada en las articulaciones grandes de las extremidades inferiores (rodillas, tobillos y pies). La duración media de la artritis es de 4-5 meses, pero dos tercios de los pacientes pueden experimentar síntomas osteomusculares leves que pueden persistir más de 1 año. Es frecuente el desarrollo de síntomas extra-articulares como la presencia de bursitis (inflamación de las bolsas sinoviales de las articulaciones) y entesitis (inflamación de la zona de inserción en el hueso de tendones, músculos o ligamentos). Otros síntomas extra-articulares que pueden aparecer son: dolor lumbar, enfermedad ocular (conjuntivitis, uveítis anterior aguda) y manifestaciones dérmicas (queratoderma blenorrágico, eritema nudoso, úlceras orales, uñas hiperqueratósicas) [11].
1.5) Tratamiento
Para el tratamiento contra la infección bacteriana se utilizan terapias antimicrobianas basadas en el uso de azitromicina, tetraciclinas o una combinación de ambas. Una enteritis no complicada no requiere de antibióticos, los cuales no han demostrado un beneficio para prevenir el desarrollo o mejorar el pronóstico de la artritis crónica [5].
Tradicionalmente, el tratamiento de ARe ha implicado un ensayo inicial de las drogas antinflamatorias no esteroides (AINE) y las inyecciones locales de corticosteroides con la adición de un DMARD (del inglés disease-modifying antirheumatic drugs) si el paciente persiste con la sintomatología. Existe poca evidencia
14
sobre la eficiencia de los DMARDs, en parte debido a la relativa infrecuencia de su uso, ya que aproximadamente 50% de los pacientes se recuperan de ARe en los primeros 6 meses, y sólo el 4-19% de los pacientes continúan desarrollando ARe crónica, la cual puede durar más de un año [12].
Debido a la clara relación entre la infección por enterobacterias o C. trachomatis
y el desarrollo de artritis, la utilización de antibióticos ha sido propuesta como tratamiento. En un trabajo publicado recientemente se comparó el uso de diferentes antibióticos realizando un meta-análisis y se concluyó que la eficiencia de los antibióticos para el tratamiento de ARe es muy heterogénea, por lo cual no se puede concluir respecto a su utilidad. Uno de los principales problemas hallado en este estudio fueron los diferentes diseños de los ensayos clínicos realizados [13].
A diferencia de los otros tipos clínicos de EspA, no existen directrices para ARe con respeto a un tratamiento más agresivo si falla la terapia inicial. Existe escasa experiencia sobre el uso de drogas denominadas agentes biológicos tales como infliximab y etanercept, los cuales son agentes bloqueantes de TNF (factor de necrosis tumoral). Limitados datos clínicos sugieren un posible efecto beneficioso de la utilización de estos agentes biológicos para el tratamiento de ARe. En un estudio abierto en el cual se ensayó etanercep en sólo 16 pacientes con ARe o EspA indiferenciada, se informó una respuesta favorable en 9 pacientes de 10 que completaron el tratamiento de 6 meses [12]. También existen informes de casos aislados en los cuales se utilizó infliximab como tratamiento [14]. Sin embargo, se requiere mayor cantidad de ensayos que avalen la seguridad y eficacia de los agentes bloqueantes del TNF para esta patología.
1.6) Fisiopatología
ARe también puede ser definida como una artritis inflamatoria estéril, ya que los agentes causales de la enfermedad no pueden aislarse del líquido sinovial por técnicas clásicas. Sin embargo, desde el comienzo de los noventa el concepto de ARe ha cambiado por la influencia del progreso tecnológico en Microbiología y Biología Molecular, los que ha conducido a la detección de ADN o ARN bacteriano en tejido
15
sinovial, lo cual ha sido más convincente en ARe por C. trachomatis que en las ARe por enterobacterias, aunque se han informado aislamientos de material genético de Yersinia,
Salmonella y Campylobacter. De los mismos hay pocos estudios reportados, los cuales han utilizado escaso número de pacientes y en algunos no se han podido reproducir, que ha llevado a la sospecha de resultados falsos positivos [15].
También, se han detectado en las muestras sinoviales proteínas o productos bacterianos como Hsp60 (proteínas de shock térmico), ADN primasa, lipopolisacárido (LPS), etc. Los cuales son capaces de estimular la liberación de quimiocinas e inducir la secreción de proteínas pro-inflamatorias. Estas propiedades pueden ser las responsables de mantener a macrófagos activados en la sinovia, lo que llevaría a la cronicidad de la inflamación. Sin embargo, no se han esclarecido los factores que evitan la eliminación completa de estos componentes microbianos ni los mecanismos que favorecen la inflamación persistente [11].
2)
Yersinia
2.1) Generalidades
El género Yersinia pertenece a la familia Enterobacteriaceae, son bacilos Gram negativos, no esporulados que en general son más pequeños (0.5 a 0.8 µm de diámetro y 1 a 3 µm en longitud) que otros miembros de la familia y crecen lentamente [16]. Las mismas son anaerobias facultativas, oxidasa y lactosa negativas, y catalasa positivas. El crecimiento de estas bacterias ocurre en un rango de temperatura entre 4 y 43°C [17].
Actualmente el género Yersinia abarca 18 especies, de las cuales tres son patógenas para el hombre: Ye y Y. pseudotuberculosis, causantes de enfermedades entéricas; y Y. pestis, responsable de la peste bubónica [18]. Las 15 especies restantes son consideradas avirulentas o su presunta patogenicidad no ha sido estudiada o confirmada hasta el momento (aunque algunos son patógenos en otros hospedadores, como Y. ruckeri que causa enteritis de la boca roja en salmónidos [19], y Y. entomophaga que posee actividad insecticida [20]).
16
En la actualidad, los estudios genómicos poblacionales se han convertido en una herramienta importante en Microbiología mejorando considerablemente el nivel de resolución con el que se pueden investigar distintos eventos evolutivos [21]. En este sentido, el estudio del género Yersinia ha llegado a ser fundamental para la comprensión de la evolución patogénica en mamíferos. Al combinar un enfoque genómico con un análisis de rendimiento metabólico, mediante microarrays de fenotipo, ha sido posible trazar los orígenes de cada especie, comparando las especies patógenas con las no patógenas, permitiendo revelar los caminos evolutivos que dieron origen a la virulencia en humanos [22]. Así, han sido identificados genes asociados a la virulencia que podrían emplearse como marcadores para el diagnóstico. Finalmente, nuevos análisis de datos genómicos proporcionarán mayor comprensión de los mecanismos implicados en la evolución de la patogenicidad y por lo tanto brindarán herramientas para los tratamientos en caso de aparición de nuevas cepas patógenas [23].
2.2)
Yersinia enterocolítica
La especie Ye constituye un grupo altamente heterogéneo de cepas no patógenas y patógenas. Basándose en la diferencia metabólica, tradicionalmente se agrupan en seis biotipos diferentes (biotipo 1A, 1B, 2, 3, 4 o 5) [16], que se clasifican además en numerosos serotipos en base a la composición del antígeno O del lipopolisacárido (LPS) [24]. Las cepas del biotipo 1A se consideran frecuentemente avirulentas. Sin embargo, hay algunas pruebas de que al menos algunas cepas de este biotipo pueden causar síntomas gastrointestinales. Se han notificado infecciones extraintestinales esporádicas, lo que justificaría un análisis más detallado de su potencial patogénico y de su patogenicidad [25, 26]. Las cepas del biotipo 1B se describen como altamente patógenas en el modelo de infección en ratón debido a la presencia de una isla de alta patogenicidad (HPI) que codifica para el sistema sideróforo de Yersiniabactina [27, 28], mientras que los biotipos 2-5 poseen baja a moderada patogenicidad [29].
En total, sólo 11 de los 70 serotipos son perjudiciales para los seres humanos y se han asociado con diferentes manifestaciones clínicas [30]. Entre las cepas patógenas más frecuentemente aisladas en Europa se encuentran en el biotipo 1B, los serotipos O:8, 2 / O:5,27, 2 / O:9, 3 / O:3 y 4 / O:3 (en orden creciente de frecuencia) [31].
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Mientras que en Estados Unidos, el serogrupo O:8 es el más importante [32, 33]. La mayoría de los estudios sobre la patogénesis de Ye se han realizado con cepas del bioserotipo 1B, serogrupo O:8 (Ye O:8) en el modelo de infección en ratón. Sin embargo, los casos de yersiniosis humana más frecuentemente notificados y los brotes reportados en todo el mundo son causados por cepas del bioserotipo 4, serotipo O:3 (Ye O:3), que tienen un bajo potencial patógeno en ratones [34].
Respecto a hallazgos clínicos en Argentina, se ha aislado Ye 1A / O:5 (biotipo/serotipo) de un paciente asintomático y otra cepa 4 / O:3 de las heces diarreicas de un niño [35]. Más recientemente, se informó el aislamiento de Ye 1A / O:5 de un paciente con diarrea [36] y también el aislamiento de seis cepas de Ye de las heces diarreicas de seis de 181 pacientes [37]. Aunque las cepas de Ye 4 / O:3 no han sido aislados de los alimentos en nuestra región, Ye 2 / O:9 y otros bio-serotipos se han recuperado de diferentes tipos de alimentos en San Luis, Argentina [38-40].
2.3) Síntomatología
La yersiniosis es una enfermedad transmitida por alimentos. El principal reservorio es el cerdo [41], aunque también se ha aislado de vacas, ovejas, cabras y animales domésticos como perros y gatos. Asimismo se ha aislado de leche y sus derivados [42], de huevo, carnes crudas, aves de corral, verduras y diversos preparados alimenticios [43]. Ye es una preocupación particular para la seguridad de los consumidores, porque es capaz de crecer significativamente en los alimentos almacenados a temperaturas de refrigeración sin signos aparentes de deterioro [44].
Yees principalmente un patógeno gastrointestinal, sin embargo, condiciones de inmunodeficiencia del hospedador podrían favorecer la propagación extraintestinal de esta bacteria. La infección intestinal presenta mayor incidencia en niños pequeños, presentándose con diarreas autolimitadas que, en ocasiones, pueden ser sanguinolentas [45]. En niños mayores y adultos puede cursar con fiebre, dolor abdominal, diarrea y/o vómitos. Los pacientes sienten dolor en la fosa ilíaca derecha debido a la inflamación del íleon terminal y ciego con linfadenitis mesentérica. Este cuadro suele confundirse
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con apendicitis [46]. Entre las manifestaciones extraintestinales se destacan la linfadenitis, eritema nodoso, uveítis, septicemia y ARe [47].
2.4) Infección y patogenicidad
Considerando que la ruta habitual de infección con Ye es a través de alimentos contaminados, inicialmente debe apreciarse que este microorganismo debe primero adaptar sus antígenos de superficie a un aumento de temperatura (37°C) [48, 49]. Esto se logra en parte mediante la presencia de un plásmido de 70 Kb, ausente en cepas avirulentas, denominado plásmido de virulencia de Yersinia (pYV, por sus siglas en inglés plasmid of Yersinia virulence) [16]. El establecimiento de la enfermedad ocurre tras las 24 a 48 horas de la ingestión [41].
Una vez que Ye ha sido ingerida, debe poner en funcionamiento sus factores de virulencia para contrarrestar las barreras de defensa del hospedador. En una primera instancia, supera la acidez del estómago por acción de la ureasa [50]. Al llegar al intestino, Ye tiene especial afinidad por el íleon terminal y el colon proximal [16, 51]. El aumento gradual de la temperatura dentro del hospedador, induce la expresión de factores de virulencia necesarios para la colonización e infección dentro de los tejidos linfáticos y evadir el sistema inmunológico (Fig. 1) [52].
Ye establece contacto con la célula hospedadora a través de dos proteínas codificadas en el cromosoma, invasina y Ail (por sus siglas en inglés attachment-invasion locus), y la proteína YadA (adhesina A de Yersinia) codificada en el plásmido de virulencia [53]. La invasina promueve la internalización de Ye por las células del epitelio del intestino delgado mediante la unión a los receptores diana conocidas como β1-integrinas que se presentan en la superficie de la célula del hospedador [54]. Las integrinas se agrupan por la unión de la invasina, y el resultado es el reordenamiento del citoesqueleto de la célula hospedadora. Esto promueve la fagocitosis y finalmente la internalización de las bacterias por las células epiteliales [55-57].Se pensaba que YadA se limitaba a interaccionar sólo con las grandes proteínas de la matriz extracelular: colágeno, fibronectina y laminina, pero recientemente se descubrió que la adhesión mediada por YadA puede ser facilitada por una amplia gama de receptores de las células hospedadoras, inclusive en ausencia de β1-integrinas. A su vez, YadA se une al mucus
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intestinal, y además, juega un papel importante en conferir resistencia al suero [58]. La adhesina Ail media la unión a diversas líneas celulares epiteliales y proteínas de la matriz extracelular, incluyendo laminina, fibronectina, vitronectina, y proteoglicanos de heparán sulfato [59, 60]. De esta manera, se establece una fuerte adhesión e invasión a la célula hospedadora.
Una vez que las bacterias han sido internalizadas, son transportadas a través de la barrera epitelial hasta la región basal de las células M. En la región del domo subepitelial, se encuentran CDs, macrófagos y linfocitos, constituyendo la primera línea de defensa en la placa de Peyer (PP) [61]. En el interior de la PP, Ye comienza a proliferar extracelularmente e induce respuesta inflamatoria [62]. Desde las PP la bacteria disemina a los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) y otros tejidos como bazo, hígado y/o pulmón [63]. En estos tejidos, la bacteria forma microabscesos debido a la replicación extracelular. Hay evidencia de tropismo de la bacteria hacia las zonas enriquecidas en células B y T de los ganglios linfáticos, en los cuales Ye evita la fagocitosis por macrófagos y neutrófilos [64].
Ye utiliza diferentes estrategias para evitar las respuestas inmunes innata y adaptativa del hospedador. Sin embargo, en un individuo normal, una adecuada respuesta de células T colaboradora tipo 1 (Th1) permite la eficiente eliminación del patógeno [65].
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Fig.1 Expresión de factores de superficie dependientes de temperatura en Ye.Diferentes expresión y estructura
de la molécula LPS según la temperatura, y la expresión constitutiva de factores de internalización llevan a una correcta adhesión de Ye O:3 en la célula del hospedador. Adaptado de Valentin-Weigand y col [66]
2.5) Factores de Virulencia
Además de las proteínas de adhesión necesarias para la internalización, pYV codifica para una serie de proteínas efectoras llamadas Yops (proteínas externas de Ye, por sus siglas “Yersinia outer proteins”) [67]. Estas proteínas perturban la dinámica del citoesqueleto, inhiben la fagocitosis y bloquean la producción de citoquinas pro-inflamatorias, favoreciendo de este modo la invasión y supervivencia de Ye en los tejidos del hospedador [66].
Las Yops son traslocadas a través de la membrana plasmática hacia el citoplasma de las células blanco utilizando un sistema de secreción tipo 3 (T3SS). Este complejo sistema, está formado por el inyectisoma y el translocón, el cual forma un poro a través de la membrana de la célula hospedador. El inyectisoma está compuesto por una serie de proteínas que adoptan una estructura cilíndrica. El inyectisoma incorpora dos anillos de membrana denominados MS (membrana y supramembrana) y
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OM (membrana externa, por sus siglas en inglés). Estos anillos están conectados a cinco proteínas integrales de membrana que participan en la exportación de proteínas. El propio aparato de exportación está flanqueado por YscQ, que facilita la unión de la ATPasa YscN y la secreción de complejos sustrato-chaperona. YscN proporciona la fuerza protón motriz necesaria para impulsar la secreción de los efectores Yops [68-70]. El translocón consiste en un poro proteico tripartito compuesto de dos proteínas transmembranas YopB y YopD y el complejo de inyección LcrV. Esta estructura macromolecular forma un canal en la membrana de la célula hospedadora por donde ingresan las proteínas efectoras Yops (Fig. 2) [60].
Cuatro de los factores de virulencia (YopE, YopT, YopO y YopH) están involucrados en la interrupción de las actividades normales del citoesqueleto [71]. Además, YopH también dirige un importante grupo de componentes de señalización de células eucarióticas, la familia RhoA (pequeñas GTPasas) que participan en el reordenamiento del citoesqueleto necesario para la fagocitosis [72]. YopE es un imitador funcional de proteínas eucarióticas activadoras de la actividad GTPasa (GAP) que altera el citoesqueleto de actina, dando como resultado la inhibición de la fagocitosis por los macrófagos [73]. YopT suprime la señalización mediada por RhoA mediante la escisión de la modificación post-traduccional de Rho GTPasa, que en última instancia impide la formación del fagosoma inhibiendo la internalización de la bacteriana e inhibe el ensamblaje de complejos de adhesión focal requeridos para el desarrollo de pseudópodos y la migración de macrófagos [74]. YopO se asocia con proteínas de la familia RhoA e inhibe la fagocitosis por unión a la actina [75]. YopH es multifuncional e interrumpe vías implicadas en la inmunidad innata y adaptativa, inhibe la autofagia y, como ya se mencionó, bloquea la fagocitosis en macrófagos [76]. Los restantes dos efectores (YopP y YopM) regulan el sistema inmune, controlando la inflamación y el reclutamiento de leucocitos. YopP es una serina/treonina/lisina acetiltransferasa que cataliza la acetilación de quinasas, inhibiendo su capacidad para activar la liberación de NF-κB, que de otro modo induciría la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Recientemente, YopP también ha mostrado un papel importante en la inhibición de caspasa-1 en macrófagos activados [77]. YopM es translocada en macrófagos, pero no se conoce si presenta una actividad enzimática específica y/o una verdadera función. Dentro de la célula eucariota, YopM puede interactuar y estimular quinasas celulares y se cree que se localiza en el núcleo, donde puede influir en la
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expresión de una variedad de genes, regulando numerosas citoquinas pro-inflamatorias, y contrarrestando la respuesta inmune innata, promoviendo la reducción de células NK (Natural Killer) en hígado, bazo y sangre [78], como así también, previniendo la piroptosis al unirse a caspasa-1 e inhibiendo la activación del inflamasoma [79, 80].
Fig. 2: Mecanismos de acción de Yops en la señalización y supervivencia del género Yersinia en la célula del
hospedador. Las proteínas de adhesión (Invasina y YadA) se asocian a la célula del hospedador mediante la unión a
β1 integrinas, produciendo una estrecha proximidad entre las bacterias y la célula hospedadora, que facilita la inserción de la estructura inyectable de tipo aguja T3SS en la célula hospedadora. Por el inyectisoma se translocan las proteínas Yops a través de la membrana plasmática hacia el citoplasma de la célula hospedadora, donde interactúan con el citoesqueleto y las moléculas de señalización. YopO interactúa directamente con el citoesqueleto, así como con las pequeñas moléculas de señalización GTPasa (RhoA, Rac1 y Cdc42). YopE inhibe las actividades de RhoA, Rac1 y Cdc42. YopP promueve la apoptosis de la célula hospedadora inducida por LPS, favorece directamente la escisión de caspasa-1. YopP también inhibe a MAPK y la activación de NF-κB mediada por IKK, que impide la expresión de proteínas pro-inflamatorias y de genes de supervivencia celular. YopM forma un complejo con Rsk y Pkn en el núcleo de la célula hospedadora, y contribuye a la patogenia de la bacteria empleando múltiples mecanismos. Adaptado de Galindo y col[47]
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3) Factor de Necrosis Tumoral
3.1) Generalidades
Los primeros trabajos reportaron el rol del TNF en la apoptosis [81]. Actualmente, esta molécula está implicada en la regulación de numerosos procesos celulares importantes como proliferación, diferenciación, crecimiento y respuesta inmune [82]. TNF es producido por varios tipos de células incluyendo macrófagos, monocitos, neutrófilos, células T, células NK y CDs [83-85].
El gen que codifica TNF está localizado en la región clase III del complejo mayor de histocompatibilidad en el cromosoma 6 humano entre los genes HLA-B y HLA-DR [86].
TNF se une a dos tipos de receptores para favorecer la supervivencia celular y la activación pro-inflamatoria de NF-κB y MAP quinasas [87]. A su vez, TNF activa a los fagocitos para engullir y limpiar los agentes infecciosos y restos celulares [88]. También, aumenta la expresión de las moléculas de adhesión en el endotelio vascular, permitiendo que células inmunes, como neutrófilos y macrófagos, puedan trasladarse a los sitios de daño tisular [89].
Sin embargo, en algunas enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoidea y espondilitis anquilosante, se han encontrado altos niveles de TNF. Algunos reportes han asociado la sobreproducción de TNF con polimorfismos genéticos encontrados tanto dentro de los genes que regulan su efecto y producción [88], como así también, en su propio locus [90].
3.2) Receptores y vías de señalización
El TNF ejerce sus efectos biológicos a través de la unión a sus dos receptores: TNFR1(TNFRp55, CD120a) y TNFR2 (TNFRp75, CD120b) [91].
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TNFR1 se expresa en forma ubicua, lleva motivos de dominio de muerte conservados (TRADD), y se activa tanto por TNF soluble como por TNF asociado a membrana [91].
En cambio, la expresión de TNFR2 está restringida a tipos celulares específicos, tales como neuronas, células inmunes y células endoteliales. El mismo carece de un dominio de muerte y por lo tanto es incapaz de inducir la muerte celular programada directamente. Es activado preferentemente por TNF asociado a membrana [92].
Ambos receptores del TNF son proteínas transmembrana, poseen una porción extracelular con tres dominios ricos en cisteína, los cuales interactúan con los trímeros de TNF [87]. El modelo de señalización del TNFR1 actual postula la activación y formación de varios complejos denominados 1, 2a, 2b y 2c, de acuerdo al estado de ubiquitinación de RIPK1 (proteína serina/treonina quinasa 1); en cambio TNFR2 sólo induce la formación del complejo 1.
Cuando TNF se une a TNFR1 y RIPK1 se encuentra ubiquitinada se forma el complejo 1. El mismo se encuentra constituido por complejos citoplasmáticos, comprendiendo a TRADD, RIPK1, TRF2 (factor 2 asociado a TNFR), cIAP1 o cIAP2 (proteína inhibidora de apoptosis 1 o 2) y el complejo LUBAC (por su sigla en inglés
linear ubiquitin chain assembly complex) [93]. Para estabilizar y activar el complejo 1 se requiere de incorporación de ubiquitinas, proceso mediado por LUBAC [94, 95]. A su vez, este complejo permite el reclutamiento de otros complejos intermedios que conducen a la activación de MAPKs (quinasas activada por mitógeno) [93], tales como la quinasa c-Jun NH2-terminal (JNK) y p38 MAPK. Esta cascada termina con la
activación de factores de transcripción como AP1 y NF-κB. Los que llevan a la expresión de genes necesarios en la inflamación, defensa del hospedador, proliferación y supervivencia celular [96].
En la señalización de TNFR1 a través de los complejos 2a, 2b e 2c, en contraste con el complejo 1, los complejos 2a, 2b y 2c se ensamblan en el citoplasma y presentan distinta señalización y función [93, 97, 98]. Los complejos 2a y 2b conducen a la activación de una cascada de caspasas que resulta en muerte celular inducida por TNF mediante apoptosis. Las células apoptóticas son rápidamente fagocitadas por los
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macrófagos, por lo cual este proceso de muerte celular tiene efectos supresores y lleva a una disminución de la producción de citoquinas inflamatorias [93].
El Complejo 2c activa la proteína de tipo quinasa de linaje mixto, efector de necroptosis (MLKL) mediante un mecanismo dependiente de RIPK3 (proteína serina/treonina quinasa 3). En contraste con la apoptosis, la necroptosis resulta en ruptura de la membrana plasmática, liberación de contenidos intracelulares y desencadenamiento de inflamación local. Las implicaciones de la necroptosis inducida por TNF en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias son el foco de varias investigaciones y, en particular, del estudio de las quinasas RIPK1 y RIPK3 que controlan estos procesos y que se las considera potenciales dianas terapéuticas. En la actualidad no se conocen los factores que determinan si el compromiso de TNFR1 induce al complejo 1, que conduce a respuestas inflamatorias, o a los complejos 2a, 2b y 2c, que conducen a la muerte celular, [99, 100].
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Fig. 3. Diferentes vías de señalización de TNF. El complejo TNF-TNFR1 se activa tanto por TNF soluble como
por TNF de membrana, a diferencia de TNFR2 que se activa preferentemente por TNF de membrana. La unión de TNF a TNFR1 promueve el reclutamiento de TRADD y RIPK 1. De acuerdo con el estado de ubquitinación de RIPKI, se generan los complejos 1, 2a, 2b y 2c. La vía de señalización del complejo 1 de TNFR1 induce degeneración tisular, inflamación, defensa del hospedador, proliferación celular y supervivencia mediante la activación de NF-κB y MAPKs. Alternativamente, la formación del complejos 2a y 2b causa apoptosis y la del complejo 2c resulta en necroptosis e inflamación. TNFR2 carece de TRADD y se une directamente a TRAF1/2, llevando a la formación del complejo 1 y la posterior activación NF-κB y MAPKs. La vía de señalización de TNFR2 media principalmente un efecto homeostático, incluyendo la proliferación celular, supervivencia y regeneración de tejidos. Adaptado de Tseng y col[101]
3.3) Rol de TNF
El TNF es necesario para la defensa óptima contra patógenos, la adecuada organización de los órganos linfoides, la formación de centros germinales, el desarrollo de granulomas, la resolución de la inflamación y la inducción de la reparación tisular. Las funciones homeostáticas del TNF también están apoyadas por estudios en ratones que carecen de TNFRs y por ensayos funcionales [102, 103]. Un estudio demostró que TNF desensibiliza los macrófagos a los efectos deletéreos de los desafíos inflamatorios
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secundarios (tolerabilidad) [104]. Otros autores han descripto los efectos homeostáticos de TNF en la regeneración de los tejidos, como la re-mielinización neuronal, la remodelación cardíaca y la regeneración del cartílago. Asimismo, TNF tiene efectos supresores sobre los procesos inmunes adaptativos en modelos de autoinmunidad como la encefalitis autoinmune [105].
Además, TNF induce inflamación, activa el endotelio vascular y orquesta el reclutamiento de células inmunes [106]. La producción o función no controlada del TNF se ha relacionado con el desarrollo de enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, etc. En contraste con el papel bien definido de TNF en estas enfermedades, su papel en la patogénesis de la esclerosis múltiple no ha sido dilucidado [105]. Aunque los estudios iniciales sugirieron una función patogénica para el TNF en la esclerosis múltiple, los ensayos clínicos de un inhibidor global del TNF se interrumpieron debido al agravamiento inesperado de la enfermedad [107].
Este hallazgo destaca la complejidad de los sistemas biológicos y cómo la mayoría de las moléculas tienen acciones opuestas que dependen del tiempo, el nivel y la ubicación de la exposición. Se ha demostrado que TNF puede tener efectos pro-inflamatorios y actividades anti-inflamatorias [108]. Varias líneas de investigación evidencian que la terapia con anti-TNF promueve la activación de las células T autoreactivas. El tratamiento con inhibidores de TNF es eficaz para muchos tipos de artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal y, probablemente, otras condiciones inmuno mediadas. Sin embargo, estos mismos medicamentos también se han asociado con la inducción de varios fenómenos autoinmunes [109].
4) Interleuquina 12/23p40
La IL-12 es una de las citoquinas más importante del sistema inmune [110]. La molécula pro-inflamatoria de 70 kDa de IL-12 funciona como una respuesta potente a microorganismos patógenos. Células B, CDs y macrófagos son los principales productores de dicha citoquina. Estructuralmente, IL-12 se compone de dos subunidades: α (IL-12p35) y β (IL-12p40) con un peso de 35 kDa y 40 kDa,
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respectivamente. Cada subunidad está codificada en cromosomas separados, y una vez expresadas, las mismas se unen mediante un enlace covalente [111].
La subunidad p35 de IL-12 se expresa constitutivamente en bajos niveles en la mayoría de las células, pero incrementa su expresión durante la activación celular estimulada por una infección. En contraste, el gen IL-12p40 está bajo control transcripcional y se expresa sólo en células presentadoras del antígeno (CPA) activadas por productos microbianos.Por lo tanto, para formar IL-12 activa existe la necesidad de una co-expresión simultánea de IL-12p35 e IL-12p40 dentro de una misma célula. A su vez, el nivel de IL-12p40 es de hasta 1000 veces superior a la de IL-12p35 [112], por lo tanto, siempre hay una gran cantidad de moléculas libres de IL-12p40 dentro de las células [113].
La subunidad p40 es común a dos citoquinas IL-12 e IL-23 (miembro de la familia IL-12), que también tienen sus subunidades específicas p35 y p19, respectivamente. Mientras IL-12 promueve el fenotipo efector de linfocitos Th 1, productor de IFN-γ, IL-23 estabiliza e induce proliferación de células Th17 productoras de IL-17 [111]. En conjunto, estos mecanismos reguladores representan una importante conexión entre el sistema inmune innato y adaptativo, ya que promueven la diferenciación de células T. Sin embargo, este "punto de control" también ofrece un riesgo potencial significativo para la desregulación en caso de enfermedad [114] .
4.1) Rol de IL-12/23p40
Las principales células blanco de IL-12 son células T y NK, las cuales, a través de la producción de IFN-γ, activan macrófagos para producir NO sintetasa y posteriormente liberar especies reactivas de oxigeno. Como resultado de estos efectos de IFN-γ sobre macrófagos, se logra una mejor función fagocítica e inflamación local [115]. Por otra parte, IL-12 impulsa el desarrollo de células T vírgenes a células Th1 e impide la diferenciación de Th2. Sin embargo, IL-12 no es suficiente para guiar este proceso, ya que células T vírgenes no expresan la cadena β2 del receptor de IL-12 (IL-12R). En cambio, se ha observado que IL-27 (otro miembro de la familia IL-12), secretada por las CD en respuesta a la estimulación antigénica, inicia el desarrollo de
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Th1 uniéndose a IL-27R en células T vírgenes, seguido de la activación de STAT3 y STAT1. Los mismos participan en la proliferación de células T y en la inducción de T-bet, el factor de transcripción clave del linaje Th1, así como induce la represión de GATA3, la contraparte de T-bet en Th2. Después de la expresión de T-bet, las células T son capaces de producir IL-12Rβ2, de esta manera pueden detectar la IL-12 liberada por fagocitos e inducir la secreción de Interferón (IFN)-γ [112, 116, 117].
Además, IL-12 induce en las células NK y en los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) su proliferación y el aumento de su potencial citotóxico, por ejemplo mediante una mayor producción de granzimas y perforinas. Al mismo tiempo, en las células B favorece la secreción de isotipos de anticuerpos particulares asociados con la respuesta Th1[112].
Consistente con su participación en respuestas inmunes principalmente celulares, se ha observado que ratones con deficiencia en los genes IL-12p35 o IL-12p40 muestran una mayor susceptibilidad a las infecciones con patógenos intracelulares tales como
Toxoplasma gondii o Listeria monocytogenes que los ratones de tipo salvaje. Curiosamente, hay pruebas que demuestran que el defecto inmunológico en animales deficientes en p40 es más pronunciada que en los homólogos deficientes en p35, lo cual podría estar asociado con el hecho que p40 es el constituyente de IL-12 e IL-23 [115].
Por otro lado, ha sido ampliamente estudiado el papel de IL-12 en varios modelos animales de enfermedades humanas, ya que se cree que es la causa de autoinmunidad y de una respuesta excesiva de células Th1. En la psoriasis se conoce muy bien el papel que cumple IL-12 a tal punto que se ha diseñado en la práctica clínica, una terapia dirigida a bloquear esta citoquina que actualmente se está aplicando con éxito en pacientes con esta enfermedad. Asimismo, hay varios hallazgos y conceptos actuales sobre el rol de IL-12 en el contexto de colitis, diabetes autoinmune, esclerosis, artritis reumatoidea y cáncer [114].
IL-12 e IL-23 representan dos citoquinas principales que controlan la inflamación, a través del perfil de células T para cumplir funciones patogénicas. Es cada vez más evidente que los niveles desregulados de IL-23 afectan principalmente la función barrera de epitelios, y se manifiesta en patologías de la piel, el intestino y los pulmones. IL-12 por otro lado, parece controlar la inmunidad sistémica contra patógenos. En enfermedades tales como: enfermedad inflamatoria intestinal, trastornos
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artríticos y psoriasis se han realizado estudios clínicos dirigidos a neutralizar tanto IL-12 como IL-23, obteniéndose diferentes grados de éxito [118, 119].
5) Células Dendríticas
5.1) Generalidades
Las CDs fueron originalmente identificadas en bazo del ratón. En base a su morfología pudieron ser distinguidas de los macrófagos [120]. Posteriormente se las describió como los estimuladores más potentes en la reacción de los cultivos mixtos de linfocitos [121]. Estos experimentos sentaron las bases de décadas de investigaciones que demostraron la importancia de las CDs en iniciar la respuesta inmune adaptativa. Dichas células expresan altos niveles de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II y de la integrina CD11c [122, 123]. Se distinguen por su capacidad de migrar de un órgano no linfoide a uno linfoide y por estimular a los linfocitos T.
Uno de los problemas que se ha presentado en su estudio es la falta de marcadores fenotípicos que permitan una distinción inequívoca entre CDs, monocitos y macrófagos. Esto ha llevado a algunos investigadores a cuestionar la existencia de CDs como una célula independiente con propiedades funcionales únicas [124]. Para evitar estos inconvenientes, recientemente se han realizado estudios que permiten caracterizar precursores de CDs en ratón y en humanos, simultáneamente con estudios de la ontogenia de macrófagos y monocitos, los que sugirieren que las CDs pueden agruparse en una descendencia común de un grupo progenitor hematopoyético. Esta perspectiva ontogenética permite definir a CDs como un linaje hematopoyético discreto independiente de su fenotipo y función, permitiendo la exploración sin restricciones del rol de las mismas en la inmunidad y homeostasis [125].
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5.2) Rol de CDs
Las CDs son consideradas como centinelas, ya que las mismas tienen una distribución in situ para optimizar la captura del antígeno y una migración a los órganos linfoides, lo que lleva a optimizar la selección clonal. A su vez son las células iniciadoras de las respuestas inmunitarias adaptativas, permitiendo la estimulación de linfocitos T y B quiescentes, vírgenes y de memoria. Al mismo tiempo, tienen la capacidad de inducir tolerancia mediante la eliminación de timocitos auto-reactivos e inducir anergia de células T maduras [126].
Numerosas enfermedades que afectan al sistema inmunológico a menudo interfieren con la función de las CDs, como ocurre en patologías causadas por microorganismos y durante el desarrollo de tumores. Alternativamente, otras enfermedades promueven la sobre-activación de CDs como ocurre en las alergias, autoinmunidad y trasplante. También se ha estudiado el papel en la infección por HIV-1 en cultivos de tejidos, donde se encontró que las CDs transportan el virus a su sitio principal (centros germinales del tejido linfoide) para la replicación del mismo en células T. Por lo tanto, el estudio profundo de la participación de las CDs proporcionaría los medios para prevenir y combatir este tipo de enfermedades [127].
A pesar de dichos avances en el estudio de CDs, a medida que se ha profundizado en el estudio de marcadores de la superficie celular, se ha tornado más difícil distinguir CDs de macrófagos, ya que ambas células comparten estos marcadores, así como también ciertas funciones [128], las cuales se encuentran resumidas en la Fig. 4.
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Fig. 4. Diferencias y similitudes entre macrófagos y CDs. Avances recientes en el estudio tanto de las
características funcionales, como de los marcadores de las células han llevado a un aumento de la superposición entre las células consideradas "macrófagos" o "célula dendríticas". Abreviaturas: CSF1-R receptor 1 del factor estimulador de colonias; BDCA-1, Antígeno-1 de células dendríticas de sangre; DC-SIGN, No integrina aglutinante de ICAM-3 específica de CD; MHC II, complejo mayor de histocompatibilidad clase II. Adaptado de Ferenbach y col [128]
6) Perfil de linfocitos T CD4+
Las células T CD4+ desempeñan un papel central en la respuesta inmune humoral colaborando con las células B en la producción de anticuerpos, en la inmunidad celular mediante la activación de células T CD8+ y exaltando la función microbicida de macrófagos frente una amplia variedad de microorganismos. Las células T colaboradoras (Th) se pueden subdividir en diferentes linajes en base a sus propiedades inmunológicas, que se apoyan en la expresión de perfiles bien definidos de factores de transcripción, citoquinas y receptores (Fig. 5) [129].
Las células T CD4+ pueden diferenciarse en los perfiles Th1, Th2, Th9, ThF, Th17 o Treg en respuesta a señales de la inmunidad innata, interacciones co-estimulatorias con CDs, citoquinas paracrinas y a través de cambios en el metabolismo
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energético mediados por mTOR (diana de rapamicina en células de mamíferos). Las células T CD4+ resultantes son altamente plásticas, pero con estimulación continua, las mismas desarrollan patrones estables de expresión de citoquinas, promoviendo la estabilización del perfil. Sin embargo, la remodelación de la cromatina, alterada por diferentes programas de citoquinas, permite transcribir factores específicos de linaje en respuesta a las variaciones ambientales, llevando a una modificación del perfil [130]. mTOR fue recientemente identificado como un posible regulador maestro de la diferenciación celular de células T CD4+ [131].
Fig. 5. Subconjuntos de células Th y su plasticidad. Según la naturaleza del antígeno y la estimulación por células
presentadoras del antígeno, tales como CDs, y mediante citoquinas que actúan sobre las células T vírgenes, estas células se diferencian en distintos subconjuntos de linfocitos Th efectores y T reguladores, que se caracterizan por la expresión de reguladores transcripcionales, marcadores de superficie celular y por la secreción de citoquinas específicas de linaje. Debido a la plasticidad, las células Th efectoras diferenciadas, pueden modificar su fenotipo. La regulación descontrolada de la especificación y compromiso del linaje puede resultar en el desarrollo de enfermedades inflamatorias y alérgicas. En la figura se muestran los factores de transcripción, citoquinas inductoras y características de cada fenotipo Th, y la función de cada linaje. Las líneas punteadas muestran los perfiles a los que pueden convertirse cada linaje, y las líneas de bloqueo indican los linajes que inhiben otros fenotipos Th. Adaptado de Tripathi y col [132]
