Caracterització i propietats de dues endo-B-(1,4)-glucanases implicades en l'estovament del fruit de maduixa.

UNIVERSITAT DE BARCELONA

DIVISIÓ DE CIÈNCIES EXPERIMENTALS I MATEMÀTIQUES FACULTAT DE BIOLOGIA

DEPARTAMENT DE BIOLOGIA VEGETAL

CARACTERITZACIÓ I PROPIETATS DE

DUES ENDO-β-(1,4)-GLUCANASES

IMPLICADES EN L’ESTOVAMENT DEL

FRUIT DE MADUIXA

Memòria presentada per F. Xavier Palomer Tarridas i inscrita en el programa de doctorat “La fisiologia de les plantes i l’ambient” (bienni 1998/99), en el Departament de Biologia Vegetal de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona, per optar al grau de Doctor en Biologia per la Universitat de Barcelona.

Directors de la Tesi Tutora Autor

UNIVERSITAT DE BARCELONA

DIVISIÓ DE CIÈNCIES EXPERIMENTALS I MATEMÀTIQUES FACULTAT DE BIOLOGIA

DEPARTAMENT DE BIOLOGIA VEGETAL

CARACTERITZACIÓ I PROPIETATS DE DUES

ENDO-

β

-(1,4)-GLUCANASES IMPLICADES EN

L’ESTOVAMENT DEL FRUIT DE MADUIXA

XAVIER PALOMER TARRIDAS

BARCELONA, JUNY DE 2.002

CONSELL SUPERIOR D’INVESTIGACIONS CIENTÍFIQUES

DEPARTAMENT DE FISIOLOGIA I BIODIVERSITAT MOLECULAR

CARACTERITZACIÓ I PROPIETATS DE DUES

ENDO-

β

-(1,4)-GLUCANASES IMPLICADES EN

L’ESTOVAMENT DEL FRUIT DE MADUIXA

XAVIER PALOMER TARRIDAS

BARCELONA, JUNY DE 2.002

ÍNDEX TEMÀTIC

Annex. Índex de figures i taules...1

Abreviatures...3

1. INTRODUCCIÓ...9

1.1. La formació del fruit...9

1.2. La maduració dels fruits: aspectes generals...10

1.2.1. La maduració en fruits climatèrics i fruits no-climatèrics...11

1.2.2. Canvis fisiològics i bioquímics associats a la maduració de fruits...12

1.2.2.1 Canvis en la pigmentació...12

1.2.2.2 Canvis en l’aroma...13

1.2.2.3 Canvis en el gust...13

1.2.2.4 Canvis en la textura...14

1.2.3. Expressió gènica en la maduració de fruits...15

1.3. La paret cel·lular...16

1.3.1. El paper de la paret cel·lular en la vida de la planta...16

1.3.2. Tipus de paret cel·lular...17

1.3.3. Components moleculars de la paret cel·lular...18

1.3.3.1. Polisacàrids estructurals...20

1.3.3.1.1. Cel·lulosa...20

1.3.3.1.2. Hemicel·luloses...21

1.3.3.1.3. Polisacàrids pèctics...22

1.3.3.2. Proteïnes estructurals...23

1.3.3.2.1. Glicoproteïnes riques en hidroxiprolina (HRGPs)...23

1.3.3.2.2. Proteïnes riques en glicina (GRPs)...24

1.3.3.2.3. Proteïnes riques en prolina (PRPs)...24

1.3.3.2.4. Proteïnes conjugades a arabinogalactans (AGPs)...25

1.3.3.3. Proteïnes enzimàtiques...25

1.3.3.3.1. Enzims que actuen sobre les pectines: enzims pectinolítics...26

Endo-poligalacturonasa...26 Exo-poligalacturonasa...28 Pectinmetilesterasa...28 Pectat liasa...29 β-galactosidasa...30 α-galactosidasa...31

1.3.3.3.2. Enzims que actuen sobre la cel·lulosa i/o hemicel·lulosa...31

β-mananasa...31

Expansina...33

1.3.3.3.3. Endo-β-(1,4)-glucanasa o cel·lulasa...34

1.3.3.4. Compostos fenòlics...39

1.3.4. Estructura de la paret cel·lular...40

1.3.5. Formació de la paret cel·lular...41

1.3.6. Degradació de la paret cel·lular durant la maduració...42

1.4. La maduixa...43

1.4.1. Origen i posició sistemàtica...43

1.4.2. Importància econòmica...44

1.4.3. Aparell vegetatiu...44

1.4.4. Desenvolupament del fruit...45

1.4.5. Composició bioquímica del fruit...47

1.4.5.1. Sucres...47

1.4.5.2. Àcids...47

1.4.5.3. Pigments...47

1.4.5.4. Compostos fenòlics...48

1.4.5.5. Constituents aromàtics i sabor...48

1.4.6. Regulació hormonal del desenvolupament i la maduració...48

1.4.6.1. Auxines...48

1.4.6.2. Giberelines, citoquinines i àcid abscísic...49

1.4.6.3. L’etilè...49

1.5. La paret cel·lular de la maduixa...50

1.5.1. Components moleculars de la paret cel·lular de la maduixa...50

1.5.2. Degradació de la paret cel·lular en la maduixa ...51

1.5.3. Les endo-β-(1,4)-glucanases Cel1 i Cel2 de maduixa...52

2. OBJECTIUS...57

3. MATERIAL I MÈTODES...61

3.1. Tampons i solucions generals...61

3.2. Medis de cultiu...62

3.3. Antibiòtics i inhibidors de proteases...64

3.4. Material vegetal...64

3.4.1. Plantes de maduixa...64

3.4.2. Manipulació de les mostres...65

3.4.3. Tractament amb auxines...66

3.4.4. Tractament amb etilè...66

3.5. Soques bacterianes, llevats i vectors...67

3.5.2. Vectors...68

3.6. Metodologia general...68

3.6.1. Purificació de fragments de DNA a partir de gels d’agarosa/TAE...69

3.6.2. Quantificació de DNA i RNA...69

3.6.3 Transformació de cèl·lules d’Escherichiacoli competents...70

3.6.4. Preparació de DNA plasmídic...70

3.6.5. Seqüenciació de DNA...71

3.6.6. Reacció en cadena de la polimerasa (PCR)...71

3.7. Obtenció i anàlisi de RNA...72

3.7.1. Extracció de RNA total...72

3.7.1.1. Extracció de RNA total segons el protocol descrit per Domínguez-Puigjaner (1995).73 3.7.1.2. Extracció de RNA total segons el protocol basat en CTAB i 2-β-mercaptoetanol...75

3.7.2. Anàlisi de l’expressió gènica per Northern-blot...76

3.7.2.1. Marcatge radioactiu de fragments de DNA per random primer...77

3.7.2.2. Hibridació de membranes Northern-blot amb sondes de DNA...78

3.7.3. Anàlisi de l’expressió gènica per Real Time Quantitative RT-PCR...80

3.8. Sobreexpressió en Escherichia coli i purificació de proteïnes...82

3.8.1. Detecció de poli-histidines...84

3.9. Obtenció d’anticossos policlonals...84

3.10. Obtenció i anàlisi de proteïnes...85

3.10.1. Extracció de proteïnes...85

3.10.1.1. Mètode dels fenols...86

3.10.1.2. Mètode del KCl/CaCl2...86

3.10.1.3. Mètode del CTAB...87

3.10.2. Quantificació de proteïnes...88

3.10.3. Anàlisis electroforètiques de proteïnes...88

3.10.3.1. Electroforesi d’una dimensió en gels desnaturalitzants (SDS-PAGE)...88

3.10.3.2. Electroforesi de dues dimensions (NEPHGE/SDS-PAGE, IEF/SDS-PAGE)...89

3.10.3.3. Tinció amb Coomassie-Blue...90

3.10.4. Anàlisi per Western-blot i immunodetecció...90

3.10.5. Detecció de glicoproteïnes (mètode de la concanavalina A)...91

3.10.6. Traducció in vitro...92

3.10.7. IEF nadiu...93

3.11. Sobreexpressió de proteïnes en Pichia pastoris...95

3.11.1. Detecció de l’activitat EGasa in vitro...99

3.12. Transformació de plantes de maduixa via Agrobacterium tumefaciens...100

4.1. Anàlisi de l’expressió de Cel1 i Cel2 durant la maduració mitjançant Northern-blot...105

4.2. Producció d’antisèrum específic per Cel1 i Cel2...108

4.2.1. Obtenció de sèrum anti-Cel1...108

4.2.1.1. Traducció in vitro de Cel1/ORF i hibridació amb anti-Cel1/3’...112

4.2.2. Obtenció de sèrum anti-Cel2...113

4.3. Extracció d’EGases de fruit de maduixa (cv PAJARO)...117

4.4. Patró d’acumulació de les EGases Cel1 i Cel2 en maduixa...119

4.4.1. Patró d’acumulació de Cel1 en maduixa...119

4.4.2. Patró d’acumulació de Cel2 en maduixa...120

4.5. Regulació hormonal de l’expressió de Cel1 i Cel2 en maduixa...121

4.5.1. Efecte de les auxines sobre les EGases Cel1 i Cel2...122

4.5.2. Efecte de l’etilè sobre les EGases Cel1 i Cel2...124

4.6. Caracterització de Cel1 i Cel2: punt isoelèctric (pI) i N-glicosilació...125

4.6.1. Determinació del punt isoelèctric (pI) ...125

4.6.2. Detecció de llocs de N-glicosilació...128

4.7. Caracterització de l’activitat carboximetilcel·lulasa (CMCasa) associada a Cel1 i Cel2 en fruit de maduixa...130

4.7.1. IEF nadiu...130

4.7.1.1. Gels overlay d’activitat CMCasa...130

4.7.1.2. Correlació de les bandes d’activitat CMCasa amb Cel1 i Cel2...131

4.7.2. Sobreexpressió en Pichia pastoris...135

4.7.2.1. Sobreexpressió de Cel1 en Pichia pastoris...136

4.7.2.1.1. Determinació del pH òptim d’activitat CMCasa per Cel1...142

4.7.2.1.2. Cinètica d’inducció temporal de Cel1/pPic9...143

4.7.2.1.3. Especificitat de substrat de la proteïna Cel1/pPic9...144

4.8. Anàlisi de Cel1 i Cel2 en plantes de maduixa transgèniques...145

4.8.1. Construccions utilitzades per a la transformació de maduixeres...146

4.8.2. Obtenció de plantes transformades i selecció de transformants primaris...147

4.8.2.1. Plantes antisentit per a Cel1...148

4.8.2.2. Plantes antisentit per a Cel2...149

4.8.2.3. Plantes antisentit per a Cel1 i Cel2...149

4.8.3. Anàlisi de l’expressió de Cel1 i Cel2 en plantes antisentit durant la maduració del fruit...151

4.8.3.1. Plantes antisentit Cel1...153

4.8.3.2. Plantes antisentit Cel2...153

4.8.3.3. Plantes antisentit Cel1/Cel2...154

4.8.4. Acumulació de les proteïnes Cel1 i Cel2 i activitat CMCasa en les plantes transgèniques..155

4.8.4.2. Plantes antisentit Cel2...157

4.8.4.3. Plantes doble-antisentit Cel1/Cel2...158

5. DISCUSSIÓ...161

5.1. Caracterització de les EGases Cel1 i Cel2 de maduixa...161

5.1.1. Patró d’expressió i acumulació proteica durant la maduració...162

5.1.2. Regulació hormonal de les endo-β-(1,4)-glucanases Cel1 i Cel2...165

5.1.3. pI i N-glicosilació de Cel1 i Cel2...168

5.2. Activitat associada a les EGases Cel1 i Cel2 de maduixa...171

5.2.1. IEF nadiu...172

5.2.2. Sobreexpressió de Cel1 en Pichia pastoris: caracterització enzimàtica de Cel1...175

5.3. Inhibició de l’expressió de Cel1 i Cel2 en plantes transgèniques...181

5.3.1. Plantes transgèniques antisentit Cel1...182

5.3.2. Plantes transgèniques antisentit Cel2...184

5.3.3. Plantes transgèniques doble-antisentit Cel1/Cel2...184

6. CONCLUSIONS...189

ÍNDEX DE FIGURES I TAULES

!

Índex de figures

Figura 4.25...140 Figura 4.26...142 Figura 4.27...143 Figura 4.28...144 Figura 4.29...146 Figura 4.30...150 Figura 4.31...151 Figura 4.32...152 Figura 4.33...154-155 Figura 4.34...156 Figura 4.35...157 Figura 4.36...158 Figura 5.1...171

!

Índex de taules

ABREVIATURES

ABA Àcid abscísic

ACC Àcid 1-aminociclopropà-1-carboxíl·lic

ACO ACC oxidasa

ACS ACC sintasa

AGPs Proteïnes conjugades a arabinogalactans

ALF Automated Laser Fluorescent (aparell de seqüenciació)

amp Ampicil·lina

APS Persulfat d’amoni

BAP N6-benziladenina fosfat

BSA Albúmina de sèrum boví

CAPS Àcid 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfònic

CBD Domini d’unió a cel·lulosa

cDNA Àcid desoxiribonucleic complementari

CDTA Àcid trans-1,2-diaminociclohexà-N,N,N’,N’-tetraacètic

CMC Carboximetilcel·lulosa

CMCasa Carboximetilcel·lulasa (activitat enzimàtica)

cpm Comptes radioactius per minut

CTAB Cetilmetilamoni de bromidi

cv Cultivar, varietat

cw Paret cel·lular

dATP Trifosfat de desoxiadenosina

dCTP Trifosfat de desoxicitosina

dGTP Trifosfat de desoxiguanosina

DMSO Dimetil sulfòxid

DNA Àcid desoxiribonucleic

dNTP Mescla equimolar de dATP, dCTP, dGTP i dTTP o dUTP

2D-PAGE IEF nadiu primera dimensió; SDS-PAGE segona dimensió

DO Densitat òptica

DTT Ditiotreitol

dTTP Trifosfat de desoxitimidina

dUTP Trifosfat de desoxiuracil

ECL Enhanced ChemiLuminiscence

EDTA Àcid etilendiaminotetraacètic

endo/exo-PG Endo i exo-poligalacturonasa

Exp Expansina

α i β-gal α- i β-galactosidasa

GRPs Proteïnes riques en glicina

HRGPs Glicoproteïnes riques en hidroxiprolina

IAA Àcid indolacètic

IBA Àcid indolbutíric

IBMB Institut de Biologia Molecular de Barcelona

IEF Isoelectroenfoc

IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranòsid

kan Kanamicina

kb Kilobase

kD KiloDalton

kor Mutant korrigan d’Arabidopsis

β-man β-mananasa

MOPS Àcid 3-(N-morfolino)-propanosulfònic

mRNA Àcid ribonucleic missatger

NAA Àcid 1-nafatalenacètic

NC Nitrocel·lulosa

NEPHGE Electroforesi en gel amb pH no equilibrat

nm Nanòmetres

nor Mutant de tomàquet non ripening

Nr Mutant de tomàquet never ripening

o/n Durant tota la nit (overnight)

ORF Pauta oberta de lectura

PAL Fenilalanina amoniliasa

pb Parells de bases

PCR Reacció en cadena de la polimerasa

PEL Pectat liasa

PG Poligalacturonasa

PGA Àcid poligalacturònic

pI Punt isoelèctric

P.M. Pes molecular

PME Pectinmetilesterasa

PMSF Fenilmetilsulfonil de fluor

p:p Pes:pes

ppm Parts per milió

PRI Plant Research International (Wageningen, The Netherlands)

PRPs Proteïnes riques en prolina

p:v Pes:volum

PVDF Polivinilidè difluor

PVP Polivinilpirrolidona

RGI i RGII Ramnogalacturonans I i II

rif Rifampicina

RNA Àcid ribonucleic

RNAsa Ribonucleasa

RNAsin Inhibidor de ribonucleases

rin Mutant de tomàquet ripening inhibited

rpm Revolucions per minut

RT Temperatura ambient

RT-PCR Transcriptasa reversa acoblada a una reacció de PCR

SAM S-adenosil metionina

SBNT Sobrenedant

SDS Dodecil sulfat de sodi

SDS-PAGE Electroforesi en gel de poliacrilamida/SDS

sol Soluble

TCA Àcid tricloracètic

T-DNA DNA de transferència

TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina

Tris Tris (hidroximetil)-aminometà

UV Radiació ultraviolada

v:v Volum:volum

wt Wild type

XET Xiloglucan endotransglicosilasa

que han fet possible la realització d’aquest treball.

En primer lloc al Dr. Miquel Vendrell per donar-me l’oportunitat de realitzar aquesta tesi, i per la confiança que m’ha mostrat en tot moment, que m’han permès entrar en aquest -a vegades injust món-, de la investigació. Voldria agrair molt especialment a la Dra. Imma Llop la seva direcció en aquesta tesi: sense tu probablement això no hauria estat possible. Un dia hem vas deixar la teva “herència” i em vas reptar a continuar el treball. Espero no haver-te decebut!

A Carburos Metálicos, especialment al Dr. F. Javier Sánchez Molino i al Sr. Llibre, per la seva bona disposició per ajudar-me en tot moment, i per la no menys important col·laboració econòmica i logística, imprescindible en tot treball científic. A Frespol i els pagesos del Maresme, per proporcionar-me les maduixes, i fins i tot un hivernacle sencer, de forma desinteressada.

A la Dra. Elma Salentijn i el Dr. Frans Krens per acollir-me al seu laboratori del PRI. De tu Elma en guardaré un gran record sempre, doncs a part d’amistat, em vas saber brindar ajut en tot moment i entre tots em vau ensenyar “l’altra manera” de treballar en ciència.

També voldria agrair a la Dra. Dolors Ludevid, a la Dra. Salomé Prat, al Dr. Jordi Bernués, al Dr. Jaume Martínez i la Dra. Dolors Piulachs, la multitud de consells científics que m’han donat, així com la bona predisposició en compartir infraestructura. Al Dr. Pere Puigdomènech i al Dr. Xavier Bellés els voldria agrair els papers que m’han hagut de signar.

A la Dra. Alegre per haver acceptat ser tutora d’aquesta tesi.

Han sigut molts dies i mesos els que he passat a IBMB. Durant aquest temps he conegut molta gent que m’ha ajudat, d’una manera o una altra, en la realització d’aquest projecte. És per això que us dedicaré a tots vosaltres les primeres planes d’aquest treball. M’agradaria no descuidar-me ningú, però suposo que això és impossible.

la Montse Saladié. A l’Imma (i “l’Antòniu”) perquè a part de ser la meva “jefa” és una bona amiga, cosa sovint difícil de consensuar. Tu m’has ensenyat a pensar científicament i a veure les coses de forma més optimista. A l’Irmix perquè ha demostrat ser una gran persona i millor amiga. Gràcies per les teves correccions i totes les bones estones passades al lab, inclosa la nostra estada a les “magnífiques” Illes Canàries. No t’agraeixo que em mantinguis en la ignorància. La nostra amistat espero que duri més enllà de l’IBMB. I a la Montse per la seva amistat i bon humor permanent, per ensenyar-me a caminar en la biologia molecular, per animar-me quan feia falta i per acompanyar-me en els bons moments.

També a l’Andrea Trejo, amb qui les circumstàncies externes no em van permetre sintonitzar com ens mereixíem. Finalment voldria agrair a la resta de persones amb qui he compartit estones al laboratori, a l’Eva, al Pablo, el Pere, i a la infinitat d’ajudants que hem tingut: Elena Sánchez, Esther López, Roman i Esther Russo, entre molts d’altres.

A la resta de personal del laboratori del PRI també els voldria donar les gràcies perquè em van fer sentir com a casa i em van ajudar moltíssim. Gràcies al Jan i família, al Koen i al Vagner, i molt especialment a la Marjan “Sweet Dreamer”: quanta energia concentrada alliberes!

A l’Ariadna i al Xavi, perquè vam compartir molts esmorzars reconfortants, que molts cops eren el millor que passava en tot el dia. Espero fer moltes més escapades a Calella (o a la masia?) amb vosaltres. A la Marta Boter i al Jaume, per la multitud de xerrades serioses i no tan serioses que em compartit dinant i esmorzant. Marta, gràcies també per portar-me a casa tants divendres. A l’Eli, per ser també una bona amiga i perquè tens un bon humor que fins i tot fa ràbia! Al Jordi Bou i família, per fer-me més amena la meva estada a Holanda. Us en dec una. A la Mina, per el seu suport i amistat en tot moment. A tots vosaltres us desitjo molta sort.

em van permetre fer la “mili” al centre.

A la resta de gent del departament de Biologia Molecular amb qui he compartit penes i alegries, i que un moment o altre m’han ajudat: als blaus (Vicki, Judit, Anna C., Ana Paula, Clàudia, Toni), als liles (Virgi, Mariana), als negres (Pep, Fathi), als roses (Mar R.), als taronges (Carles-Air Jordan, Xavi Miró, Mónica Suelves), als verds-grisos (Torben, Miriam, Blanca), als vermells (Pau, Sabine, Marga), etc.

Als “cucaratxos” per l’ajut i bon humor que hem compartit tantes vegades. A la Lluïsa, per la seva amistat i el seu magnífic “tour” per Londres. Tinc ganes de veure’t per aquí un altre cop. Al Jose al Rafa, la Pepi i al Dani, per la seva simpatia i amistat, i els ànims donats a totes hores.

Als meus amics de tota la vida, per fer-me oblidar la feina quan no hi era, i per fer-me passar tants bons moments. Sé que puc comptar amb vosaltres. Gràcies a tots, però especialment a en Lluís, Eva, Lali, Roger, Eli i Purri-mustafà. Quantes coses ens queden encara per fer plegats!

Als meus pares els voldria agrair tot el seu amor i suport que m’han donat i em donaran sempre, tot i els mals de cap i angoixes que sovint m’emportava cap a casa. Sense el seu esforç res de tot això no hauria estat possible. Al meu germà, que tot i que ens veiem poc, sé que puc comptar amb ell. A en Niko, el millor gos-humà que hi ha sobre la capa de la terra.

I finalment, ara sí, a la Rosa Maria, el factor més decisiu en la realització d’aquest treball, i el més important de la meva vida. Gràcies per creure sempre en mi, per la teva paciència i l’ajuda incondicional que sempre m’has donat. Gràcies per suportar tots els sacrificis que la meva feina t’ha suposat. Jo també t’estimo.

A la Rosa Maria. Als meus pares i germà. Als meus amics.

*NOTA: En aquesta memòriautilitzarem el terme “maduixa” per referir-nos a les formes cultivades, més grans que les silvestres. Tot i que els mots maduixó, maduixot o fraga són en realitat més correctes, rarament són emprats a nivell popular.

1. INTRODUCCIÓ

1.1. La formació del fruit

Típicament es considera que el fruit és l’ovari transformat que conté els primordis seminals fecundats i convertits en llavors. Després de la pol·linització i fecundació dels primordis seminals, les flors sofreixen diferents transformacions. Concretament, l’ovari inicia una nova etapa de desenvolupament que pot afectar la seva dimensió, forma, consistència, pigmentació i composició química. Aquests processos condueixen a la formació del fruit, que consta d’una coberta anomenada pericarp, a l’interior de la qual s’hi troben les llavors. Tanmateix, en alguns casos la formació del fruit pot produir-se sense requerir una fecundació prèvia, donant lloc a fruits partenocàrpics que no tenen llavors (plàtan, taronja, etc.).

Els teixits carpel·lars, en transformar-se en pericarp, es desenvolupen de manera molt variada i engendren una gran diversitat de fruits. En la formació del fruit però, hi poden participar altres teixits florals a més de l’ovari, com per exemple el receptacle floral en la maduixa* o les bràctees en la pinya (Coombe, 1976).

No sempre la definició botànica de fruit coincideix amb el sentit popular del mot. Cal distingir els fruits pròpiament dits, procedents d’una sola flor, de les

infructescències, originades per un conjunt de flors agrupades en inflorescència (figues, pinya, etc.). Dins dels fruits formats a partir d’una sola flor diferenciarem els fruits simples dels fruits compostos o agregats. Els primers, que són la majoria en la nostra flora, s’originen a partir d’una flor amb un sol pistil. Destaquen entre els fruits simples la poma, la pera i el préssec. Els fruits compostos o agregats provenen de flors amb més d’un pistil. Com a exemples típics destacarem la móra i la maduixa.

Independentment de l’origen del fruit, diferenciarem els fruits carnosos o parenquimàtics, en els quals és el propi teixit del fruit l’objecte d’interès comercial, dels fruits esclerenquimatosos o dehiscents, on és la llavor individual l’objecte d’importància comercial. La majoria de fruits carnosos presenten un patró de creixement que segueix una corba sigmoïdal simple, on es distingeixen tres fases: en la fase inicial es produeix una activa divisió cel·lular, que es tradueix en un augment lent del pes sec del fruit; seguidament té lloc l’expansió cel·lular, amb un conseqüent augment ràpid del pes sec; i en la fase final la intensitat de creixement s‘alenteix i s’inicia el procés de maduració. Molts fruits assoleixen la seva grandària definitiva abans de madurar, però hi ha excepcions, com és el cas de la maduixa i l’alvocat, en què el fruit continua creixent durant la maduració.

1.2. La maduració dels fruits: aspectes generals

La maduració s’ha definit com el conjunt de canvis que es succeeixen en el fruit des de les darreres etapes del creixement, fins les primeres etapes de la senescència (Watada et al., 1984). Aquest període de diferenciació tissular és un procés controlat genèticament que implica un ampli espectre de canvis bioquímics i fisiològics en el fruit, que el condueixen a l’adquisició de les propietats organolèptiques que el fan adequat pel consum (Brady, 1987). Entre les modificacions més significatives que es produeixen destaquen els canvis de textura i coloració, el desenvolupament de substàncies volàtils aromàtiques, i els canvis en el contingut de sucres i àcids orgànics.

La maduració precedeix una fase de senescència en la qual s’incrementen les reaccions catabòliques, amb la conseqüent desestructuració cel·lular. En aquesta fase final, els fruits esdevenen més susceptibles a contaminacions per patògens i a alteracions fisiològiques.

1.2.1. La maduració en fruits climatèrics i fruits no-climatèrics

Els fruits es classifiquen en dos grans grups en funció del seu patró respiratori i de la capacitat per a sintetitzar etilè a l’inici de la maduració.

Els fruits climatèrics, com la poma, la pera, el plàtan i el tomàquet entre d’altres, es caracteritzen per presentar un pic d’activitat respiratòria al començament de la maduració, acompanyat d’un important augment de la biosíntesi d’etilè. Aquest augment en la síntesi d’etilè respon a un mecanisme de regulació autocatalític. Aquesta hormona indueix i coordina l’expressió de diferents gens implicats en el procés de maduració (Theologis, 1992; Grierson i Schuch, 1993). La magnitud i sincronització amb què apareixen els pics de respiració i etilè són característics de cada fruit, donant un patró de maduració diferent en cada cas.

En els fruits no-climatèrics, com els cítrics, la pinya, la cirera, el raïm i la maduixa, la producció d’etilè no augmenta durant la maduració del fruit (Givannoni, 2001), encara que alguns d’aquests fruits poden respondre a aplicacions exògenes d’aquesta hormona. En aquests fruits, la maduració tampoc va acompanyada d’un augment de la taxa respiratòria (Biale i Young, 1971).

El paper que té l’increment de l’activitat respiratòria en fruits climatèrics no està completament dilucidat, tot i que es creu que podria ser necessari per a subministrar l’energia requerida per acomplir els canvis associats a la maduració (Richmond i Biale, 1966). No obstant això, la demanda d’energia en la majoria de fruits durant la maduració és molt menor que la produïda durant el climateri (Solomos, 1983), i a més, els fruits no-climatèrics maduren sense cap pujada en la respiració. És possible que l’increment respiratori sigui simplement una resposta a l’etilè produït. Aquesta idea es veu confirmada pel fet que alguns fruits no-climatèrics, els quals produeixen nivells molt baixos d’etilè, també responen a l’aplicació exògena d’etilè amb un augment en la seva respiració (Tucker, 1993).

La regulació del procés de maduració en els fruits no-climatèrics ha estat poc estudiada i per tant, el mecanisme que condueix a la maduració en aquests fruits és encara desconegut. Quan aquests fruits són tractats amb etilè exogen, presenten una resposta respiratòria diferent a la dels fruits climatèrics. Així, l’activitat respiratòria augmenta proporcionalment a la concentració d’etilè aplicada i,

a diferència dels fruits climatèrics, aquesta taxa respiratòria retorna als nivells basals quan s’elimina l’hormona (Biale i Young, 1971). Tot i que es desconeix el factor que substitueix l’etilè durant la maduració en fruits no-climatèrics, hi ha evidències que indiquen que les auxines i l’àcid abscísic (ABA) hi poden tenir un paper important (Kano i Asahira, 1981; Given et al., 1988a; Goldschmidt, 1997). En l’apartat 1.4.6 s’exposen els possibles mecanismes de regulació hormonal durant la maduració de la maduixa, el fruit no-climatèric més estudiat i que ha estat l’objecte d’aquesta tesi.

1.2.2. Canvis fisiològics i bioquímics associats a la maduració de fruits

1.2.2.1 Canvis en la pigmentació

El color del fruit està íntimament relacionat amb l’estadi de maduració i representa un aspecte molt valorat pel consumidor. Els canvis de color que tenen lloc durant la maduració dels fruits són deguts a dos processos que no sempre estan sincronitzats en el temps. Per una banda s’esdevé una degradació de la clorofil·la, que emmascara pigments ja presents abans de madurar en fruits com la llimona, la taronja i el plàtan (Jacob-Wilk et al., 1999). Per altra banda es produeix una síntesi de pigments específics, normalment antocians i carotenoids, responsables de la coloració de cada fruit en concret (Tucker, 1993).

Els carotenoids són els responsables de les coloracions vermelles, taronges o grogues en fruits com els cítrics i el tomàquet. Aquests pigments, que es localitzen en els cromoplasts, són terpens derivats de l’acetil CoA per la via de l’àcid mevalònic (Bartley et al., 1994). El primer carotenoide produït en aquesta via és el fitoè, a partir del qual deriven altres carotenoids com el licopè i el β-carotè. Normalment els carotenoids es sintetitzen en el fruit immadur, essent el β-carotè el més freqüent, tot i que en molts fruits hi ha una síntesi addicional de β-carotè i licopè durant la maduració (Tucker, 1993). El control de la biosíntesi de carotenoids és poc clar, malgrat que s’han realitzat molts estudis sobre els diferents aspectes bioquímics i moleculars relacionats amb la síntesi d’aquests pigments (Bird et al., 1991; Bartley et al., 1995; Bartley i Scolnik, 1995).

Els antocians, derivats dels flavonoides i localitzats al vacúol, comprenen un ampli espectre de pigments que poden donar una coloració des del blau fins al

vermell (Timberlake, 1981). El color de molts fruits, com la poma, la cirera, el raïm i la maduixa, és degut a la producció de diversos antocians durant la maduració. La ruta biosintètica d’aquests pigments ha estat àmpliament estudiada (Holton i Cornish, 1995). Es considera que els enzims clau en la seva biosíntesi són la fenilalanina amoniliasa (PAL), calcona sintasa i flavona sintasa.

1.2.2.2 Canvis en l’aroma

La majoria de tecnologies dirigides a la conservació de fruits abans de la seva comercialització, com són l’emmagatzematge en fred o en atmosferes controlades, tenen com a efectes secundaris la pèrdua del gust i de l’aroma característics del fruit. L’aroma dels fruits és el resultat d’una gran varietat de compostos volàtils que se sintetitzen durant la maduració a partir de diferents constituents de la planta; carbohidrats, lípids i proteïnes. La naturalesa dels compostos volàtils involucrats en l’aroma dels fruits és molt diversa i inclou alcohols, aldehids, ésters i cetones, entre d’altres (Nurtsen, 1970). L’anàlisi dels volàtils que es produeixen durant la maduració de la poma indica que almenys hi ha 330 compostos diferents (Van Straten, 2001). Mentre que molts dels volàtils són comuns en diferents fruits, d’altres presenten una distribució molt més restringida.

1.2.2.3 Canvis en el gust

La nostra percepció del sabor recau sobre dos sentits, el gust i l’olfacte. En fruits, el gust està principalment determinat pel seu contingut en sucres i àcids orgànics, si bé també hi juga un paper significatiu el grau d’astringència, que ve determinat pel contingut en fenols i tanins, i els compostos volàtils responsables de l’aroma. Tant els sucres com els àcids orgànics són sintetitzats a les fulles a partir d’assimilats fotosintètics, i transportats als fruits via floema.

El contingut de sucres en el fruit tendeix a augmentar durant la maduració (Whiting, 1970), ja sigui a conseqüència d’una major aportació per part de la planta, o d’una mobilització de les reserves de midó. Alguns fruits com el plàtan, la poma i el tomàquet, contenen gran part dels sucres abans de madurar, en forma de reserva, raó per la qual poden ser recol·lectats en estat immadur sense que es vegi afectat significativament el seu gust final. En altres fruits, com la maduixa i el raïm, l’acumulació de sucres té lloc principalment durant la maduració del fruit, i per tant

cal collir-los en un estadi avançat de la maduració a fi que puguin desenvolupar el seu gust característic (Tucker, 1993).

Els principals àcids orgànics presents en els fruits són el cítric, el màlic i el tartàric. En general, el contingut en àcids orgànics del fruit augmenta durant el desenvolupament i disminueix en la maduració, presumiblement degut a la seva utilització com a substrat respiratori (Ulrich, 1970).

Encara que els sucres i els àcids orgànics constitueixen els principals components en el gust del fruit, el contingut en compostos fenòlics és també molt important degut al seu efecte astringent al interaccionar amb les proteïnes i mucopolisacàrids de la saliva (Ozawa et al., 1987). S’han aïllat diferents compostos fenòlics en fruits, molts dels quals es formen a partir de la fenilalanina, via àcid cumàric o àcid cianímic. Les seves estructures deriven dels àcids gàl·lic, cafeic, ferúlic o clorogènic.

1.2.2.4 Canvis en la textura

L’estovament dels fruits durant la seva maduració és un factor molt important que limita la seva vida post-collita. La pèrdua de textura derivada d’aquest estovament és una de les transformacions més significatives associades als fruits carnosos. Una vegada iniciat el procés d’estovament, la taxa de canvi de textura dependrà del tipus de fruit i de les condicions ambientals.

En la pèrdua de textura hi poden intervenir diferents processos, com la pèrdua de turgència cel·lular i la degradació de midó, si bé són els canvis bioquímics i en l’estructura de la paret cel·lular els que contribueixen de forma més significativa a l’estovament del fruit. Aquests canvis són deguts principalment a l’acció d’hidrolases de la paret cel·lular del fruit. Amb l’excepció d’algunes alteracions texturals produïdes per la pèrdua de turgència, l’estovament en la majoria de fruits representa un procés irreversible un cop s’ha iniciat. L’estovament no implica necessàriament la inhibició dels mecanismes de síntesi i manteniment de la paret cel·lular, sinó un acceleració dels processos catabòlics. El procés de degradació de la paret cel·lular associat a la maduració s’estudiarà amb més detall a l’apartat 1.3.6.

1.2.3. Expressió gènica en la maduració de fruits

Com ja s’ha esmentat anteriorment en l’apartat 1.2, la maduració es considera un procés especialitzat previ a la senescència. Al principi es pensava que la maduració era un procés fonamentalment catabòlic en el qual es perdia el control i l’organització cel·lular. En els darrers anys però, s’ha pogut demostrar que la maduració està sota un estricte control genètic. El fet que l’ús d’inhibidors de la síntesi de proteïnes i àcids nucleics evités la maduració normal ja va fer pensar que existien fenòmens de transcripció i/o traducció en la maduració (Sacher, 1973). Posteriorment, mitjançant el marcatge radioactiu invivo, es demostrà l’existència de processos anabòlics durant la maduració dels fruits. En concret, destaquen els primers experiments que provaren la síntesi de proteïnes (Richmond i Biale, 1966; Brady i O’Connell, 1976), la síntesi d’àcids nucleics (Richmond i Biale, 1967) i la síntesi de polímers de la paret cel·lular (Mitcham et al., 1989), durant la maduració.

Un dels objectius principals en l’estudi de la maduració dels fruits és la prevenció o retràs d’aquest procés. Fins ara s’han emprat diverses estratègies per aconseguir-ho, com són la conservació del fruit a baixes temperatures, l’aplicació d’atmosferes controlades, la ventilació de les àrees de conservació o l’ús de segrestadors o inhibidors de l’etilè. Totes aquestes tecnologies però, suposen costoses inversions i presenten problemes secundaris degut a què poden produir alteracions organolèptiques del fruit.

L’ús de diferents mutants naturals de maduració, com per exemple els mutants rin, nor i Nr de tomàquet (DellaPenna et al., 1987; Gross, 1994; Lanahan et al., 1994) ha permès ampliar el coneixement dels mecanismes de regulació de la maduració. La identificació de gens induïts durant la maduració, així com dels gens que intervenen en la biosíntesi d’etilè, també ha fet possible l’obtenció de mutants utilitzant la genètica reversa. Així, és possible inhibir l’expressió d’aquests gens en plantes transgèniques, introduint-los en el genoma en orientació antisentit. La tecnologia del RNA antisentit aplicada als fruits es mostra com una possibilitat tant per l’estudi de la regulació de la maduració, com per la seva possible aplicació comercial en el control de la maduració.

El clonatge de gens implicats en la biosíntesi d’etilè ha proporcionat un gran nombre de dades en l’estudi de la maduració. L’aproximació amb més èxit en el

control de l’inici de la maduració s’ha aconseguit per inhibició antisentit de l’expressió de l’enzim ACC sintasa (ACS), implicat en la biosíntesi de l’etilè, en plantes de tomàquet (Oeller et al., 1991). En aquestes plantes no hi ha producció d’etilè, els fruits no maduren i no s’estoven ni varien en la pigmentació. Aquest fenotip pot revertir-se mitjançant l’aplicació d’etilè exogen (Theologis, 1992).

Malgrat tots els estudis realitzats fins ara, poc es coneix sobre la maduració i la seva regulació en fruits no-climatèrics. Per això és necessari encara identificar i clonar nous gens implicats en el procés de maduració i esbrinar mitjançant les tècniques de la genètica reversa el paper funcional de cadascun d’ells.

1.3. La paret cel·lular

1.3.1. El paper de la paret cel·lular en la vida de la planta

Les cèl·lules vegetals es caracteritzen per presentar la paret cel·lular, una estructura que envolta el protoplast i es troba a l’exterior de la membrana plasmàtica. La seva composició, forma i propietats, estan subjectes a processos dinàmics que canvien en resposta al creixement de la planta i les etapes de diferenciació i desenvolupament cel·lular. La paret actua de barrera entre el medi i el contingut protoplasmàtic cel·lular, intervenint en diferents processos cel·lulars. És permeable a l’aigua i als metabolits, però resistent als canvis de pressió osmòtica interna, assegurant la turgència necessària pel manteniment de l’estructura cel·lular. Les primeres funcions atribuïdes a la paret cel·lular foren aquelles relacionades amb la seva rigidesa estructural, concretament les que conferien estructura i fortalesa a la cèl·lula. No obstant això, la paret cel·lular fa molt més que proveir la cèl·lula d’estructura i fortalesa (taula 1.1). Per exemple, la presència d’una paret rígida o semi-rígida obstaculitza el moviment de macromolècules dins i fora de la cèl·lula. A més, al tenir una càrrega neta negativa, retarda el moviment de molècules carregades positivament. Això ha condicionat el fet que la majoria de molècules senyal vegetals, a diferència dels sistemes animals, siguin petites i sense càrrega o carregades negativament (Brett i Waldron, 1996).

La paret cel·lular facilita el transport i la comunicació intracel·lular proveint una estructura de contacte entre cèl·lules adjacents: l’apoplast. També protegeix la cèl·lula de la gran majoria d’organismes potencialment patògens, ja que fins i tot els més petits no la poden traspassar. Aquest paper defensiu no és només passiu, doncs aquests microorganismes patògens, al secretar enzims hidrolítics de paret, provoquen un increment de la deposició de lignina i cal·losa com a resposta defensiva per part de la paret cel·lular. Aquesta resposta es produeix com a conseqüència de l’alliberació d’oligosacàrids derivats de la hidròlisi de la paret pels enzims d’origen patogènic. La degradació de polímers de paret també es produeix durant el creixement i desenvolupament normal de la planta, doncs la paret cel·lular està sotmesa a un procés de síntesi-degradació simultani. La degradació de la paret cel·lular s’incrementa en processos com la germinació de la llavor, la maduració del fruit, l’abscisió i la senescència.

Taula 1.1: Funcions de la paret cel·lular (Brett i Waldron, 1996).

1.3.2. Tipus de paret cel·lular

En general, la paret cel·lular està formada per dues fases ben diferenciades: una fase microfibril·lar i una fase matricial (apartat 1.3.3, taula 1.2). La fase microfibril·lar es caracteritza per tenir una composició química homogènia i una estructura cristal·lina, doncs està formada per cel·lulosa. La fase matricial, no cristal·lina, és químicament més complexa. Consta d’una gran varietat de polisacàrids, proteïnes, compostos fenòlics i elements minerals (Kohorn, 2000).

En la paret cel·lular es poden diferenciar tres capes principals: la làmina mitja, la paret cel·lular primària i la paret cel·lular secundària. La làmina mitja, de

• Provisió de força mecànica • Manteniment de la forma cel·lular • Control de l’expansió cel·lular • Control del transport intracel·lular • Protecció enfront altres organismes • Senyalització cel·lular

naturalesa pèctica, té una funció d’adherència entre cèl·lules, i és la primera estructura que es forma en la paret cel·lular després de la divisió cel·lular. La làmina mitja i la paret primària es troben a totes les cèl·lules i teixits vegetals, en canvi la paret cel·lular secundària només està present en cèl·lules de determinats teixits, com poden ser les zones lignificades. Les cèl·lules que formen la polpa del fruit contenen només la paret primària, i és en aquesta paret on es produeixen les desestructuracions més evidents durant la maduració. La composició de la paret cel·lular primària i secundària varia segons l’espècie i el tipus cel·lular, especialment pel que fa als polisacàrids matricials.

S’han descrit dos tipus de paret cel·lular primària. La paret cel·lular primària de gimnospermes, dicotiledònies i monocotiledònies no gramínies forma un grup homogeni en la composició de la fase matricial, essent la pectina i els xiloglucans els principals polisacàrids. Aquest tipus de paret es coneix com a paret primària de Tipus 1. Les gramínies i altres famílies menors d’angiospermes monocotiledònies es caracteritzen per tenir poca pectina, i arabinoxilans i β-(1,3)-β-(1,4)-glucans com a hemicel·luloses principals. Aquesta és la paret cel·lular primària de Tipus 2.

En la paret cel·lular secundària, la fase matricial és molt variable. Així, en gimnospermes trobem glucomanans com a polisacàrids principals, mentre que en angiospermes dicotiledònies aquest polisacàrid és substituït pel 4-O-metilglucuronoxilà. La composició de la paret cel·lular secundària dins de les monocotiledònies també és molt variable.

A més d’aquestes diferències generals, algunes cèl·lules especialitzades tenen una composició de la paret molt característica. Aquest és el cas de les cèl·lules de reserva, cèl·lules reproductores i cèl·lules floemàtiques, entre d’altres.

1.3.3. Components moleculars de la paret cel·lular

Els constituents de la paret primària es poden classificar en diferents tipus de molècules polimèriques (Brownleader et al., 1999): polisacàrids pèctics (~35% en pes sec), cel·lulosa (~30%), hemicel·luloses (~25%) i proteïnes (~10%). El contingut i les característiques estructurals dels polímers de la paret cel·lular varien segons l’espècie, l’estadi de desenvolupament i el grau de diferenciació cel·lular o

tissular. Segons la seva naturalesa química i funció, els diferents components que formen la paret cel·lular els dividirem en:

! Polisacàrids estructurals: cel·lulosa, hemicel·luloses i substàncies pèctiques.

! Proteïnes estructurals.

! Proteïnes enzimàtiques.

! Compostos fenòlics.

! Elements minerals, principalment ions Ca2+_.

! Aigua.

Taula 1.2: Components principals de la paret cel·lular (Brett i Waldron, 1996).

Fase Component Exemple

Microfibril·lar Cel·lulosa (β-(1,4)-glucà) Matricial* Pectines Hemicel·luloses Proteïnes Compostos fenòlics Ramnogalacturonans I Arabinans Galactans Arabinogalactans I Homogalacturonans Ramnogalacturonans II Xilans Glucomanans Manans Galactomanans Glucuronomanans Xiloglucans Cal·losa (β-(1,3)-glucà) β -(1,3)- β-(1,4)-glucans Arabinogalactans II Extensina

Proteïnes conjugades a arabinogalactans Altres, incloent-hi enzims

Lignina Àcid ferúlic

Altres; àcid cumàric, àcid truxíl·lic

1.3.3.1. Polisacàrids estructurals

1.3.3.1.1. Cel·lulosa

La cel·lulosa és un homopolímer polisacarídic no ramificat de molècules de

D-glucosa unides mitjançant enllaços β-(1,4). En cada glucosa, l’hidrogen del grup hidroxil (-OH) de l’àtom de carboni número tres (posició C3) forma un pont

d’hidrogen amb l’oxigen de l’anell de la molècula anterior, estabilitzant el complex intermolecularment (figura 1.1). El grau de polimerització de la cadena de cel·lulosa és de 3.000 a 5.000 residus de D-glucosa en la paret cel·lular primària, i de fins a 15.000 residus en la paret secundària.

Figura 1.1: Estructura de la cel·lulosa amb els ponts d’hidrogen intra i intermoleculars.

També es formen ponts d’hidrogen entre alguns grups hidroxil de diferents cadenes de cel·lulosa, formant les fibril·les elementals. Aquestes fibril·les elementals consten de fins a 32 cadenes de cel·lulosa. L’agrupació de 20 fibril·les elementals origina les microfibril·les, de 5 a 30 nanòmetres de diàmetre (Varner i Lin, 1989), que són l’estructura més complexa trobada a la paret cel·lular primària.

La formació de ponts d’hidrogen intramoleculars determina el grau de cristal·linitat de la cel·lulosa: una elevada presència de ponts d’hidrogen originarà una cel·lulosa d’estructura cristal·lina, mentre que un baix nombre de ponts d’hidrogen el trobarem en la cel·lulosa anomenada amorfa. Dins de la paret cel·lular

d’un mateix teixit poden coexistir regions de cel·lulosa cristal·lina amb regions de cel·lulosa amorfa.

1.3.3.1.2. Hemicel·luloses

Hemicel·lulosa és un terme que descriu una família de polímers rics en glucosa, manosa, arabinosa i xilosa, i que a diferència de la cel·lulosa, presenten cadenes laterals que sovint inclouen xilosa, galactosa i fucosa (Kohorn, 2000). En plantes dicotiledònies el component hemicel·lulòsic majoritari és el xiloglucà (figura

1.2), que pot arribar a constituir el 20% del pes sec total, mentre que en plantes monocotiledònies el component majoritari és el xilà. El xiloglucà està format per un esquelet de residus de D-glucosa, units mitjançant enllaços β-(1,4), que està altament substituït per residus de D-xilosa units per enllaços α-(1,6). Alguns residus de glucosa poden estar substituïts per cadenes de disacàrids o trisacàrids, formades per xilosa, galactosa i fucosa o arabinosa.

Figura 1.2: Estructura del xiloglucà segons Brett i Waldron (1996).

Les hemicel·luloses formen ponts d’hidrogen amb la cel·lulosa, i com a funcions principals tenen: manteniment de l’estructura de la paret cel·lular, control de l’expansió cel·lular, senyalització cel·lular a través de l’alliberació d’oligosacarines durant la seva hidròlisi i, emmagatzematge de substàncies de reserva.

1.3.3.1.3. Polisacàrids pèctics

Les pectines inclouen un grup de polisacàrids rics en àcid D-galacturònic, L-ramnosa, L-arabinosa i D-galactosa, en proporcions variables. Altres sucres associats són D-xilosa, 2-O-metil-L-fucosa i àcid D-glucurònic. Són abundants a la làmina mitja i la paret cel·lular primària en plantes dicotiledònies, i en menor grau, en plantes monocotiledònies. Poden estar unides covalentment a fenols, cel·lulosa i proteïnes (Melford i Prakash, 1986). L’anàlisi detallat de la fracció pèctica indica la presència de diferents polímers, que inclouen ramnogalacturonans I (RG I), ramnogalacturonans II (RG II), homogalacturonans, arabinans, galactans i arabinogalactans (Melford i Prakash, 1986; Brett i Waldron, 1996; Brownleader et al., 1999).

L’esquelet dels RG I consisteix en residus d’àcid α-(1,4)-D-galacturònic amb

residus intercalats de ramnosa units mitjançant enllaços α-(1,2), generant una estructura contorsionada i amb molts residus laterals metil-esterificats. Pot presentar múltiples ramificacions en la posició C4 de la ramnosa, que solen ser

llargues i estructuralment similars a les molècules d’arabinans, galactans i arabinogalactans, que es descriuen més endavant.

Els RG II consten d’un esquelet de 25-50 residus d’àcid α-(1,4)

D-galacturònic i 2-O-metil-D-xilosa, i són el grup minoritari de la paret cel·lular primària en dicotiledònies. Forma una estructura altament ramificada amb residus de D-galactosa, L-arabinosa, L-ramnosa i 2-O-metil-D-xilosa.

Els homogalacturonans estan formats per un esquelet de molècules d’àcid

α-(1,4)-D-galacturònic parcialment esterificades, que presenta ramificacions laterals de polisacàrids neutres, formades per galactosa i/o arabinosa. Es poden unir covalentment a la fracció dels RG I o a d’altres polisacàrids. Són molt abundants en fruits i cultius cel·lulars de plantes dicotiledònies.

Els arabinans són cadenes de α-(1,5)-arabinosa amb ramificacions

Els galactans són homopolímers de β-(1,4)-galactans amb algunes

ramificacions laterals de galactosa, que presenten una distribució reduïda en les plantes superiors.

Els arabinogalactans són polímers de β-(1,4)-galactans amb cadenes

laterals curtes de α-(1,5)-arabinosa unides a la posició C3 de la galactosa. Poden

trobar-se unides covalentment a RG I o de forma independent. La presència d’algunes molècules d’àcid ferúlic unides a residus de galactosa i arabinosa confereix un paper cohesionador a aquestes molècules.

Les pectines i les hemicel·luloses són secretades per la via del sistema d’endomembranes a l’exterior cel·lular, formant una matriu que s’intercala entre les microfibril·les de cel·lulosa. L’abundància de càrregues negatives dels polisacàrids pèctics permeten la unió de diferents pectines mitjançant cations Ca2+. El grau de polimerització d’aquests polisacàrids pèctics, les esterificacions i les interaccions amb calci condicionen la flexibilitat de la fase matricial, la porositat de la paret cel·lular, la interacció amb l’hemicel·lulosa i la mobilitat de les proteïnes estructurals de la paret (Baron-Epel et al., 1988).

1.3.3.2. Proteïnes estructurals

La naturalesa de les proteïnes de la paret cel·lular és tan variada com les múltiples funcions que porten a terme. Amb l’excepció de les proteïnes riques en glicina (GRPs), totes les proteïnes estructurals estan sempre altament glicosilades, contenen hidroxiprolina i presenten seqüències altament repetitives. La majoria d’aquestes proteïnes estan formant una xarxa a la paret, i probablement tenen una funció estructural, si bé també podrien intervenir en la morfogènesi de la paret cel·lular i en la interacció cèl·lula-cèl·lula durant el desenvolupament.

1.3.3.2.1. Glicoproteïnes riques en hidroxiprolina (HRGPs)

Les HRGPs són les proteïnes estructurals majoritàries de la paret cel·lular (Carpita i Gibeaut, 1993; Cassab, 1998), i tenen com a aminoàcid principal la hidroxiprolina (Hyp). Són importants al llarg de tot el desenvolupament de la planta, però també a l’hora de mantenir la integritat estructural en teixits madurs, així com

en la defensa enfront les adversitats ambientals i l’atac per patògens (Bradley et al., 1992). Entre aquestes proteïnes destaquen les extensines.

Extensines: Són proteïnes particularment abundants en dicotiledònies, i es

caracteritzen per ser riques en hidroxiprolina, serina (Ser) i algunes combinacions d’aminoàcids com la valina (Val), la tirosina (Tyr), la lisina (Lys) i la histidina (His). Habitualment presenten el patró aminoacídic del tetrapèptid (Ser-Hyp)4 _repetit.

Sovint els residus d’hidroxiprolina poden estar glicosilats amb una i fins a quatre molècules d’arabinosa, mentre que alguns residus de serina es glicosilen amb una molècula de galactosa. Són proteïnes molt bàsiques, amb punts isoelèctrics (pI) propers a 10, degut a l’elevat contingut en lisina que presenten. S’han descrit nombrosos cDNAs d’extensines en dicotiledònies (Cassab, 1998).

1.3.3.2.2. Proteïnes riques en glicina (GRPs)

Les GRPs fins ara trobades tenen una composició formada principalment per glicina (68-70%) i serina (12%). La glicina (gly) es sol trobar formant part de petites unitats repetides al llarg de la seqüència aminoacídica. El primer gen GRP va ser aïllat en petúnia per Condit i Meagher (1986), si bé actualment ja s’han descrit en moltes altres espècies vegetals, monocotiledònies i dicotiledònies, com tomàquet, Arabidopsis, pastanaga i blat de moro. Hi ha almenys dues classes de GRPs. Una classe es troba a la paret cel·lular i la seva abundància és regulada durant el desenvolupament, mentre que la segona classe es troba en el citoplasma cel·lular i està regulada per factors ambientals. Les GRPs semblen tenir un paper important en el desenvolupament de teixits vasculars, nòduls i flors, així com en la resposta a ferida i la tolerància a la congelació (Cassab, 1998).

1.3.3.2.3. Proteïnes riques en prolina (PRPs)

Les PRPs contenen essencialment el motiu Pro-Pro repetit, dins d’una unitat oligopeptídica major: (Pro-(Pro-Hyp)-Val-Tyr-Lys)n, destacant l’absència de serina i

la presència de residus glicosilats (Chen i Varner, 1985). Aquestes proteïnes mostren patrons d’expressió molt específics per a cada teixit i tipus cel·lular. Es troben en el xilema, epidermis, aleurona i nòduls parenquimàtics, mostrant un patró de localització similar al de les GRPs. Sembla que estan implicades en diferents aspectes del desenvolupament de la planta, des de la germinació fins a la

nodulació, així com en el desenvolupament de l’ovari i de l’embrió (Franssen et al., 1987; Averyhart-Fullard, et al., 1998; Cassab, 1998).

1.3.3.2.4. Proteïnes conjugades a arabinogalactans (AGPs)

Són glicoproteïnes amb un baix contingut proteic, inferior al 10% en pes sec, riques en hidroxiprolina, alanina, treonina, glicina i serina, amb cadenes laterals de sucres unides per O-glicosilació a un grup hidroxil de serina o hidroxiprolina. Químicament són molt estables i es pensa que tenen una paper morforegulador via inhibició de la divisió cel·lular, tot i que també intervenen en processos d’embriogènesi somàtica, pol·linització i senyalització cel·lular (Cassab, 1998; Darley et al., 2001).

1.3.3.3. Proteïnes enzimàtiques

La presència d’enzims a la paret dóna suport al fet de que la paret cel·lular primària és un compartiment cel·lular metabòlicament actiu. Ara bé, la simple existència d’aquests enzims no prova que siguin actius, doncs es requereixen evidències de que els components moleculars de la paret cel·lular sofreixen transformacions químiques in vivo (Fry, 1995). En aquest sentit, els aparents canvis de mida dels polímers de la paret cel·lular que acompanyen processos com la maduració dels fruits, impliquen l’acció d’enzims amb capacitat de degradació d’aquests components (Fischer i Bennett, 1991).

La comprensió de la bioquímica de la paret cel·lular és important degut als papers crucials que aquesta té en la determinació de cinc factors diferents: (a) la taxa i direcció de l’expansió cel·lular, (b) la intensitat de la unió cèl·lula-cèl·lula, (c) la susceptibilitat del teixit a l’atac enzimàtic per patògens, (d) la capacitat de retenció d’aigua i ions, i (e) la producció d’oligosacarines de senyalització cel·lular.

Els enzims que es relacionen amb la paret cel·lular al llarg de la vida de la planta dependran del tipus cel·lular, del teixit i de l’espècie d’estudi en cada cas. Els enzims capaços d’alterar l’estructura de la paret cel·lular inclouen (Fischer i Bennett, 1991; Brownleader et al., 1999): pectinmetilesterasa (PME), endo-poligalacturonasa (PG o endoPG) i exo-poligalacturonasa (exo-PG), α- i galactosidasa (α-gal i β-gal), endo-β-(1,4)-glucanasa o cel·lulasa (EGasa), α-L-arabinosidasa,

β-glucosidasa, β-xilosidasa, α-L-fucosidasa, α-L-ramnosidasa, arabinoxilanasa, xiloglucan endotransglicosilasa (XET), pectat liasa (PEL), β-mananasa (β-man), ramnogalacturonasa i expansina (Exp). La majoria d’enzims amb capacitat per actuar sobre la paret cel·lular presenten activitat hidrolasa i actuen sobre enllaços glucosídics, si bé n’hi ha que també hidrolitzen enllaços carboxiésters, com la PME. Aquests enzims els englobarem en dos grups diferents de proteïnes enzimàtiques: les que actuen sobre la cel·lulosa i/o l’hemicel·lulosa i les que actuen sobre les substàncies pèctiques de la paret (figura 1.3).

Figura 1.3: Classificació de les principals proteïnes enzimàtiques descrites en fruit.

A continuació es descriuen els principals enzims implicats en el procés de degradació de la paret cel·lular associat a la maduració dels fruits.

1.3.3.3.1. Enzims que actuen sobre les pectines: enzims pectinolítics

La maduració dels fruits normalment està associada a un augment en la solubilització de les pectines. Els enzims pectinolítics més importants que han estat identificats fins ara en fruits són: endo-poligalacturonasa, exo-poligalacturonasa, pectinmetilesterasa, pectat liasa, α-galactosidasa i β-galactosidasa.

Endo-poligalacturonasa: Aquest enzim catalitza la hidròlisi a l’atzar

poligalacturònic del polímer de la pectina. Està implicat en la degradació pèctica que acompanya moltes etapes del desenvolupament de la planta, especialment aquelles que requereixen de separació cel·lular o d’un ràpid creixement. Així per exemple, s’ha associat amb l’abscisió, dehiscència d’anteres, expansió cel·lular i maduració del pol·len. També és el principal responsable de la dissolució de la làmina mitja durant la maduració d’alguns fruits (Hadfield i Bennett, 1998). Ha estat caracteritzat en un gran nombre de fruits i és un dels enzims més estudiats, especialment en tomàquet, per la seva gran importància hidrolítica sobre les pectines de la paret cel·lular. La PG de tomàquet ha sigut la més estudiada, tant a nivell gènic (Grierson et al., 1986; Sheehy et al., 1987: Bird et al., 1988), com a nivell de proteïna (Ali i Brady, 1982; Sheehy et al., 1987; DellaPenna i Bennett, 1988).

Es coneixen tres isoformes diferents de l’endo-PG en fruit de tomàquet (Brummell i Harpster, 2001): PG1, PG2A i PG2B, amb un pes molecular de 115, 45 i 43 kD respectivament. PG2A i PG2B tenen la seqüència aminoacídica idèntica i només es diferencien en els residus glicosilats, i per tant es creu que són un producte del mateix gen. La PG1 és la isoforma dominant de l’enzim en els primers estadis de la maduració del fruit, mentre que PG2A i PG2B augmenten posteriorment. PG2A i PG2B estan formades només per un únic domini catalític, mentre que PG1 consta del mateix domini catalític unit a una subunitat β no catalítica. La subunitat β és una glicoproteïna i s’ha suggerit que la seva funció és la fixació de la PG a la paret cel·lular (Fischer i Bennett, 1991). També en el fruit de plàtan s’han descrit tres isoformes diferents de la PG (Pathak et al., 2000): PG1, PG2 i PG3.

L’activitat endo-PG està clarament correlacionada amb la degradació de les pectines de la paret i el començament de l’estovament del fruit (Brummell i Harpster, 2001). Malgrat això, els experiments que s’han realitzat amb plantes transgèniques antisentit on l’expressió de la PG és reduïda (Sheehy et al., 1988; Smith et al., 1988), mostren que, si bé la PG és responsable de la despolimerització de la pectina durant la maduració, la inhibició d’aquesta despolimerització en els fruits transgènics no és suficient per evitar l’estovament del fruit. No obstant això, aquests fruits sí que presenten una millora en la seva qualitat (Smith et al., 1990) i un increment en la resistència a danys mecànics i a la contaminació per organismes patògens (Schuch et al., 1991). D’altra banda, mitjançant la sobreexpressió del gen

de la PG en mutants rin, que presenten una activitat PG menor respecte els fruits wt i que no s’estoven (Brady et al., 1983; DellaPenna et al., 1987), tampoc s’ha pogut induir l’estovament, tot i que sí que s’ha observat un increment en la despolimerització i la solubilització de les pectines (Givannoni et al., 1989). En fruits de tomàquet transgènics amb l’expressió de la subunitat β reduïda s’ha observat una menor solubilització de la pectina, produïda per la disminució de la despolimerització, demostrant-se la importància d’aquesta subunitat per a l’acció de la PG in vivo (Zheng et al., 1992; Watson et al., 1994).

Malgrat la forta correlació temporal entre l’acumulació de l’enzim PG i l’estovament de fruits com el tomàquet, els treballs realitzats indiquen que almenys la PG per sí sola no és capaç de provocar l’estovament associat a la maduració, ni tampoc és l’única responsable de la degradació i solubilització de les pectines de la paret cel·lular. Això suggereix la presència d’altres enzims amb funció similar que actuïn sobre aquestes pectines i que col·laborin amb la PG en les modificacions de la paret.

Exo-poligalacturonasa: L’exo-PG catalitza l’eliminació per hidròlisi de petits

fragments oligosacarídics dels extrems de les molècules de pectina. Aquest enzim s’ha trobat en pera (Pressey i Avants, 1976), préssec (Pressey i Avants, 1973), poma (Bartley, 1978) i tomàquet (Baldwin i Pressey, 1990). Tot i que hi ha fruits com la poma en què només s’ha descrit activitat exo-PG i no endo-PG, hi ha molt poques evidències en l’actualitat que permetin donar un paper significatiu de les exo-PG en la maduració dels fruits (Hadfield i Bennett, 1998). No obstant això, treballs realitzats en préssec sí que han mostrat una certa correlació entre un augment en la quantitat d’exo-PG i l’inici de l’estovament del fruit (Downs i Brady, 1990).

Pectinmetilesterasa: Els poligalacturonans són dipositats a la paret cel·lular

en una forma altament esterificada, i són desesterificats durant el desenvolupament cel·lular (Brummell i Harpster, 2001). Durant la maduració del tomàquet el grau de metil-esterificació de la pectina de paret decreix des d’un 90% a un 35% (Koch i Nevins, 1989). Això és degut a l’acció de la PME, que desesterifica els poliurònids per eliminació del grup metil de la posició C6 dels residus d’àcid galacturònic, en

pectines d’elevat pes molecular (Brummell i Harpster, 2001; Micheli, 2001). L’eliminació dels grups metil de les pectines genera grups carboxil lliure. Això

origina un canvi de pH i de càrrega de la paret cel·lular, permet l’agregació dels poliurònids per formar una matriu gelatinosa amb el calci, i fa que els poliurònids siguin susceptibles a la degradació per la PG (Koch i Nevins, 1989; Brownleader et al., 1999; Brummell i Harpster, 2001).

En tomàquet, la PME forma una petita família multigènica de quatre gens com a mínim, alguns dels quals són altament homòlegs. Aquests gens codifiquen per proteïnes madures de 34-37 kD (Micheli, 2001), que es poden trobar en molts teixits de la planta. La proteïna i activitat corresponents a la PME són presents al fruit durant tot el desenvolupament, si bé augmenten a l’inici de la maduració, per després disminuir lleugerament.

Es desconeixen els mecanismes de regulació de l’expressió de la PME en el desenvolupament del fruit, si bé l’ús de mutants de tomàquet rin ha demostrat una clara relació amb l’etilè (Harriman et al., 1991). La reducció de l’activitat PME en plantes transgèniques antisentit provoca un increment en el grau de metil-esterificació de les pectines (Tieman et al., 1992). L’increment en el grau de metilació resulta en una menor despolimerització de les pectines per part de la PG, però no redueix l’estovament associat a la maduració. En aquests fruits s’ha vist que la supressió de l’activitat PME té un efecte negatiu en la integritat del fruit durant l’emmagatzematge posterior a la collita (Tieman i Handa, 1994). Per tant, es pot afirmar que la PME juga un paper important en el manteniment de la integritat tissular durant la vida post-collita del fruit (Brummell i Harpster, 2001).

Pectat liasa: Si bé en un principi es pensava que l’únic enzim amb capacitat

de degradació dels poligalacturonats desesterificats era la PG, la manca d’un fenotip clar en plantes antisentit amb reducció d’expressió de la PG, així com el descobriment de nous enzims com la PEL, van fer pensar en una acció coordinada d’aquests enzims en el procés d’estovament. A diferència de la resta d’enzims pectinolítics, la PEL es caracteritza per trencar per β-eliminació els enllaços α-(1,4)-glicosídics de l’extrem no reductor dels D-galacturonans desesterificats, alliberant dímers i molècules d’àcid galacturònic insaturades. Cal destacar també el requeriment indispensable d’ions Ca2+ _{per a la seva activitat.}

Les primeres pectat liases descrites foren les aïllades en bacteris fitopatògens. Aquestes PEL bacterianes actuen a nivell de la làmina mitja i la paret

cel·lular primària de la planta, solubilitzant pectines i desestabilitzant la paret. En plantes, les primeres PEL es van aïllar de teixit vegetatiu meristemàtic i pol·len (Wing et al., 1989; Budelier et al., 1990). En els darrers anys també s’ha aïllat la PEL en fruits com el plàtan i la maduixa (Domínguez-Puigjaner et al., 1997; Medina-Escobar et al., 1997). L’expressió de la PEL de plàtan es caracteritza per augmentar a l’inici de la maduració, fins arribar al màxim just en el climateri, llavors declina en el post-climateri. Aquesta PEL origina una proteïna madura de 44 kD, amb un senyal consens de N-glicosilació, un residu de cisteïna a l’extrem carboxil terminal que es creu que està implicat en la seva activitat, i tres asparragines conservades necessàries per la unió a calci (Henrissat et al., 1995). En maduixa, l’expressió de la PEL també es relaciona amb la maduració del fruit (Medina-Escobar et al., 1997; Jiménez-Bermúdez et al., 2002).

β-Galactosidasa: Un dels canvis més importants que succeeix en la paret

cel·lular durant la maduració és la pèrdua de residus galactosil dels polímers de paret (Gross i Sams, 1984). Com que no s’ha detectat activitat endo-galactanasa en plantes superiors, el més probable és que l’activitat enzimàtica responsable de la degradació dels β-galactans de paret provingui de les exo-β-galactosidases, enzims que eliminen els residus terminals β-D-galactosil no reduïts dels β-galactans (Brummell i Harpster, 2001). S’han descrit proteïnes amb activitat β-galactosidasa en alvocat (De Veau et al., 1993), maduixa (Trainotti et al., 2001b), pera (Yamaki i Kakiuchi, 1977), poma (Ross et al., 1994), i tomàquet (Carey et al., 1995), entre d’altres. En tomàquet s’han descrit fins a set gens que codifiquen per β-galactosidases, si bé només es detecten tres isoformes actives (I, II i III). Tots aquests gens s’expressen durant la maduració del fruit, encara que presenten patrons d’acumulació del mRNA diferents (Smith i Gross, 2000). En tomàquet la disminució de la galactosa polimèrica i l’increment de la galactosa lliure comença amb la maduració, i s’observa principalment en les fraccions pèctiques (Gross, 1984; Seymour et al., 1990).

La supressió en plantes antisentit dels diferents gens que codifiquen per galactosidases ha demostrat que l’increment de l’expressió i de l’activitat β-galactosidasa durant la maduració del fruit deriva de la isoforma II (Smith i Gross, no publicat). Els fruits de les plantes antisentit per a la isoforma II han mostrat una menor despolimerització dels β-galactans de la paret cel·lular, que s’ha traduït en un