Unidad Curricular: Virología y Micología Veterinaria
TRABAJO PRÁCTICO No. 3 AMPLIFICACIÓN DE GENES VIRALES
Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como PCR (por sus siglas en inglés: Polimerase Chain Reaction). Fue desarrollada por el Dr. Kary Mullis en los años ochenta (1983-1985), por lo cual fue merecedor del premio Nobel en química en 1993. Es una prueba de carácter molecular cuya finalidad es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN de interés (ADN molde). A través de un ensayo de PCR es posible obtener grandes cantidades de un gen específico para clonarlo, secuenciarlo o con fines diagnósticos. Es decir, se logra sintetizar copias de ADN en el laboratorio una vez preparada la mezcla de reacción en un tubo, es un ensayo de síntesis de ADN in vitro.
La técnica de PCR se lleva a cabo en el laboratorio en un equipo automático llamado termociclador, ya que, para que se lleve a cabo el proceso completo de síntesis del fragmento de ADN, es necesario someter la mezcla de reacción a diferentes temperaturas que permitan la separación de las dos cadenas de ADN que se desea amplificar (temperatura de desnaturalización), unión de los cebadores o “primers” (temperatura de hibridación o alineamiento de cebadores) y síntesis de la cadena complementaria (temperatura de extensión o elongación), en conjunto los tres procesos constituyen un ciclo y cada uno de ellos se repite sucesivamente entre 30 y 60 veces, lo que permite obtener millones e incluso billones de copias del ADN molde(Figura 1).
La PCR es un ensayo que simula la replicación natural del ADN. De tal forma que, para lograr la amplificación de un determinado fragmento de ADN se requiere de una proteína,ADN polimerasa, la cual es la enzima encargada de polimerizar una nueva banda de ADN complementaria al ADN molde. La ADN polimerasa utilizada en PCR, es una enzima estable al calor obtenida a partir de microorganismos termófilos como Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis, Thermus termophilus. Las diferentes ADN polimerasas termoestables usadas, en la mayoría de los casos, reciben su nombre de acuerdo al microorganismo a partir del cual fue obtenida, así tendremos, Taq, Pfu, Vent, Tth, respectivamente. Una de las mas usadas es la Taq polimerasa.
tal manera que hagan posible la síntesis cada una de las dos cadenas de ADN. Así, se tendrá un cebador sentido (“sense” o “forward”) y uno antisentido (“antisense” o “reverse”) en función de la progresión de la síntesis en dirección 5' 3'.
Para que la reacción se lleve a cabo es necesario incorporar también, en la mezcla de reacción los cuatro desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTP`s), correspondientes a las cuatro bases nitrogenadas que constituyen la secuencia nucleotídica del ADN. Así, deberá incorporarse Adenosinatrifosfato (dATP), Guanosintrifosfato (dGTP), Citosinatrifosfato (dCTP) y Timidinatrifosfato (dTTP), que constituirán el sustrato a ser utilizado por la enzima ADN polimerasa. De esta manera, la enzima irá incorporando cada dNTP según su complementariedad con el ADN molde, añadiendo los dNTP`s complementarios en dirección 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP`s con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente(Figura 2).
De igual manera se incorpora en la mezcla de reacción la solución tampón en la cual la enzima mantiene su actividad de polimerización y también magnesio bajo la forma de cloruro de magnesio (MgCl2), lo cual permite que la enzima pueda unirse al sitio de inicio de la síntesis, que corresponde al sitio donde cada iniciador o cebador se ha alineado. Y por supuesto el ADN de interés que se desea amplificar.
La mezcla de reacción se somete inicialmente a un ciclo único de desnaturalización entre 94ºC y 95ºC durante 5 a 10 minutos (desnaturalización inicial) para luego comenzar con los ciclos sucesivos correspondientes a una fase dedesnaturalización cíclica, una dehibridación o alineacióny una deelongación. Una vez cumplido con el numero de ciclos seleccionado, la mezcla de reacción se somete a un ciclo único de extensión final, normalmente a 72ºC durante 5 a 15 minutos, donde se culmina la síntesis de los extremos de los productos amplificados y para que cualquier cadena sencilla de haya quedado sea amplificada.
Figura 2.Esquema de incorporación de los desoxiribonucleótidos durante la síntesis de la nueva cadena de ADN. Los dNTP`s siempre se incorporan en dirección 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP`s con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente.
Para llevar a cabo la PCR se establecen los parámetros del programa de amplificación en el termociclador:
Paso1.Desnaturalización inicial
Paso 2.Durante ladesnaturalización cíclica, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 94ºC -95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.
Paso 3. Durante lahibridación o alineación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria. La temperatura en este paso será específica para cada par de cebadores y la misma se establece en base a la temperatura de fusión de los cebadores.
P
Puunnttooddeeccrreecciimmiieennttoo ADN polimerasa Base
80 °C, normalmente se incuba a 72ºC. Paso 5.Extensión final.
Cuando se desea amplificar el genoma de un virus de tipo ARN, ARNm, ARN ribosomal (ARN molde), es necesario sintetizar ADN complementario (ADNc) a ese ARN molde. Para ello es necesario realizar un paso previo a la PCR que se denomina transcripción reversa (RT). Se requiere en este caso de una enzima que sea capaz de sintetizar una molécula de ADN a partir de una de ARN, transcriptasa reversa, la cual poseen los retrovirus y a partir de los cuales han sido clonadas y se distribuyen comercialmente.
La prueba de PCR puede ser utilizada para amplificar pequeñas cantidades de ADN presente en una muestra. Utilizando los cebadores apropiados es posible detectar un tipo especifico de virus, así estén presente otros virus diferentes, bacterias, parásitos u otro tipo de células. Se logra amplificar ADN prácticamente casi de cualquier tipo de muestra biológica: sangre, piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, heces, orina, etc.
La técnica de PCR es una poderosa herramienta para el diagnostico temprano de enfermedades infecciosas y genéticas; también se aplica para estudios de identidad y filiación humana, pedigree de animales, medicina forense, detección de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos, etc. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO
PCR para detección de Rotavirus
Dado que rotavirus posee genoma de tipo ARN, es necesaria la síntesis de ADNc previo a la realización del la amplificación por PCR. Lo cual será realizado por el profesor(a) antes de iniciar el procedimiento de PCR. Para la PCR de rotavirus se utilizará un par de cebadores denominados CON1 y CON2, los cuales amplifican una región 250pb del segmento genómico que codifica para la proteína VP4 de rotavirus.
Mezcla de reacción para PCR:
Reactivo Concentración final Volumen (ul)
Solución tampón 10X 1X 5
MgCl2(50mM) 2mM 2
dNTP´s (10mM) 0,4mM 2
CON1 (10uM) 0,5uM 2,5
CON2 (10uM) 0,5uM 2,5
Taqpolimerasa (5U/ul) 1,25U 0,25
ADNc - 5
H2O ultra pura - 30,8
Volumen total de reacción 50ul. Programa de amplificación
1. Desnaturalización inicial: 95ºC x 5 minutos 2. Desnaturalización cíclica: 94ºC x 1 minuto
3. Alineamiento de cebadores: 55ºC x 45 segundos 34 ciclos 4. Extensión: 72ºC x 1 minuto
5. Extensión final: 72ºC x 7 minutos 6. Mantener a 4ºC hasta retirar los tubos
