TRABAJO PRÁCTICO No. 5
METABOLISMO BACTERIANO:
ACTIVIDAD SOBRE CARBOHIDRATOS Y PROTEINAS
OBJETIVOS
1. Explicar el fundamento de las pruebas bioquímicas utilizadas en el estudio del metabolismo bacteriano.
3. Señalar el sustrato, enzimas degradadoras y el producto final en las diferentes pruebas realizadas, así como el indicador o reactivo que se utiliza para cada medio de prueba.
2. Interpretar los resultados de las pruebas metabólicas utilizadas para la identificación y clasificación de las bacterias.
Primer Periodo
GENERALIDADES
El estudio del comportamiento fisiológico y metabólico de las bacterias representa uno de los pasos más importantes a seguir para la identificación bacteriana a través de métodos bacteriológicos.
Para poder caracterizar adecuadamente las especies bacterianas es indispensable determinar si las bacterias tienen la propiedad de degradar un sustrato determinado y cuales son los productos finales que se generan a consecuencia de la degradación. Es frecuente encontrar dos cultivos bacterianos con características morfológicas y de cultivo muy similares pero que exhiben diferencias notables en sus reacciones metabólicas.
Las bacterias modifican el medio de cultivo en el que se desarrollan a medida que degradan los sustratos y en la medida que se generan productos finales a partir de los sustratos iniciales. La capacidad para utilizar un sustrato dado y las diferentes rutas metabólicas seguidas por las bacterias, son la expresión de actividades enzimáticas específicas propias de cada especie bacteriana. Es por ello que, la determinación de la presencia de estas enzimas son un punto clave en la identificación y clasificación de una especie bacteriana.
Para evidenciar cualquiera de las actividades bioquímicas se realizan pruebas cualitativas, en las cuales es de suma importancia tener en cuenta el sustrato, las enzimas que actúan y los productos finales que se generan. En la realización de estas pruebas se utilizan medios de cultivo diferenciales que contienen sustratos específicos. Las transformaciones que sufre el sustrato y la
aparición de productos finales, permiten conocer la acción metabólica llevada a cabo por la bacteria.
El medio puede contener además un"indicador" para la identificación de algún producto formado en el curso de la reacción enzimática. En ciertas pruebas los productos metabólicos se detectan añadiendo un “reactivo” al finalizar el periodo de incubación. En otros casos los cambios en la naturaleza física del medio pueden ser una evidencia para determinar la degradación de un sustrato, como por ejemplo, en la prueba de la hidrólisis de la gelatina la acción enzimática conduce a una licuación del medio.
1. ACCIÓN SOBRE LOS CARBOHIDRATOS Y OTROS COMPUESTOS CARBONADOS
Muchos microorganismos utilizan los carbohidratos como fuente de energía. Sin embargo, las vías metabólicas seguidas varían, así, algunos microorganismos son capaces de romper las largas moléculas de polisacáridos mediante enzimas hidrolizantes y las reacciones intracelulares pueden seguir una vía oxidativa o fermentativa, dependiendo de la especie bacteriana. Asimismo, los productos finales varían según la especie bacteriana que degrada el sustrato, de manera que pueden producirse ácidos orgánicos, gases, sustancias alcalinas, etc. Algunos microorganismos pueden utilizar también otros compuestos carbonados diferentes a los azúcares como única fuente de carbono, lo que hace que estas pruebas sean la clave para su identificación.
1.1. Prueba de Oxido - Fermentación (Test O/F):
Esta prueba está relacionada con la degradación de la glucosa. Permite conocer si la acción de la bacteria sobre la glucosa sigue una vía metabólica oxidativa o fermentativa o si por el contrario la bacteria no utiliza este carbohidrato. Esta prueba se caracteriza porque se realiza utilizando dos tubos con el mismo medio de cultivo, solo que a uno de los tubos se le agrega una capa de parafina líquida en la superficie del medio, esto genera un ambiente en el cual no hay oxígeno; al otro tubo no se le agrega parafina y el medio de cultivo queda en contacto directo con el oxígeno del aire; esto permite generar condiciones en el medio de cultivo que conlleva a la identificación de una vía metabólica fermentativa u oxidativa, respectivamente. Esta es una de las pruebas más importantes en las primeras etapas de la identificación de las bacterias, sobre todo para las Gram negativas.
El medio de cultivo utilizado se llama Hugh Leifson, en este medio el sustrato es la glucosa y además contiene un indicador, azul de bromotimol, el cual permite determinar mediante un cambio de color, si la bacteria sigue una vía metabólica oxidativa (O) o fermentativa (F), durante la degradación de la glucosa; sin embargo en ambos casos los productos finales que se generan
son de carácter ácido. Algunas especies bacterianas no utilizan la glucosa como fuente de energía, ni como fuente de carbono, en estos casos el color del medio permanece inalterado y se considera a esa bacteria como inactiva. Otras bacterias pueden crecer en ese medio pero no utilizan la glucosa para crecer sino los otros componentes del medio de cultivo y tienden a producir un efecto alcalinizante.
Elindicador azul de bromotimol le confiere al medio de cultivo un color verde. Cuando el medio se torna ácido (pH bajo), el indicador cambia al color amarillo; cuando el medio se torna alcalino (pH alto), el indicador cambia al color azul. Los cambios de color del indicador son visibles en todo el medio de cultivo.
MATERIAL
a) 2 tubos de agar Hugh-Leifson.
b) Cultivo de Escherichia coli (E. coli)en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)en caldo nutritivo.
d) Aguja de inocular.
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar por punción E. coli o P. aeruginosa (solo una de las cepas) en los dos tubos de agar de Hugh-Leifson.
2. Cerrar completamente la tapa del tubo que contiene parafina; no ajustar por completo la tapa del tubo sin parafina para permitir la entrada de aire.
3. Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48 horas.
4. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar de acuerdo a los siguientes criterios:
Bacteria Oxidante: Viraje del color del medio al amarillo solamente en el tubo sin parafina (condiciones aeróbicas).
Bacteria Fermentativa: Viraje del color del medio al amarillo en ambos tubos.
Bacteria Inactiva: No hay alteración del color del medio en ningún tubo.
Bacteria Alcalinizante: Viraje del color del medio al azul en la superficie o en todo el tubo sin parafina.
1.2. Fermentación de los Hidratos de Carbono
La mayoría de los microorganismos utilizan los hidratos de carbono como fuente de energía, pero las diversas especies emplean azúcares diferentes y proceden a su degradación por vías
diferentes; así algunos microorganismo son capaces de fermentar estos azúcares produciendo ácido y gas, otras son capaces de producir ácido, pero no gas, y finalmente otros no fermentan ningún carbohidrato; características de valor considerable en la identificación y clasificación de los microorganismos. Estas propiedades pueden determinarse inoculando una especie bacteriana en un medio que contiene el sustrato de prueba (Ej.glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, etc.).
Esta prueba se realiza utilizando caldos de cultivo (caldo lactosado, caldo glucosado, etc.) dispensados en tubos de ensayo, además se le coloca un pequeño tubo invertido (tubo de fermentación de Durham) sumergido en el caldo de cultivo. Este pequeño tubo invertido tiene como finalidad retener el gas que puede formarse durante la fermentación. Además el medio de cultivo contiene un indicador, rojo de fenol, el cual le confiere un color rojo al medio de cultivo estéril, que cambia al color amarillo en presencia de ácido. Durante la fermentación de los carbohidratos, algunas bacterias pueden producir compuestos ácido acompañados con gas, sin embargo otras bacterias pueden generar solo compuestos ácidos pero sin producción de gas.
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli (E. coli) en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Staphylococcus aureus (S. aureus) en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Proteus vulgaris (P.vulgaris) en caldo nutritivo.
d) Tubos con caldo de glucosa, lactosa, manitol, sacarosa, maltosa, al 1%; más el indicador rojo de fenol. Con un tubo de fermentación de Durham en el interior.
e) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Inocular una serie de los diferentes azúcares con el cultivo de E. coli, S. aureus o P. vulgaris 2. Incubar todos los tubos a 37ºC por 24 - 48 horas.
3. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar.
1.3. Prueba del Rojo de Metilo (RM)
La degradación de la glucosa por algunas bacterias, conduce a la formación de importantes cantidades de ácidos orgánicos de cadena corta de carbono (ácido fórmico, acético, láctico), los cuales se encuentran fuertemente disociados. La formación de estos ácidos orgánicos le confiere una fuerte acidez al medio, pudiendo alcanzar el pH valores de 4,5. La fuerte acidez del medio se
evidencia cuando se añade elreactivo rojo de metilo, ya que ocurre un cambio del color del caldo al rojo intenso. En aquellos casos en los que no se producen ácidos orgánicos de cadena corta, el medio de cultivo permanecerá inalterado después de agregar el reactivo rojo de metilo.
MATERIAL
a) Cultivo de Enterobacter aerogenes en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
c) 1 tubo de caldo de Clark y Lubs (caldo glucosado) d) Reactivo rojo de metilo.
e) Asa de inocular.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular el tubo de caldo de Calrk y Lubs (caldo glucosado) con el cultivo de E. aerogenes o E.
coli
3. Incubar el tubo a 37ºC durante 24 - 48 horas.
4. Al final de la incubación, agregar a cada tubo 0,5 ml del reactivo rojo de metilo, agitando el tubo.
5. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar.
1.4. Producción de Acetoina o Reacción de Voges-Proskauer (VP)
Esta prueba se fundamenta en la propiedad que tienen algunas especies bacterianas para formar durante la degradación de la glucosa un producto llamado acetil-metil-carbinol o acetoina, el cual puede ser detectado por una reacción de oxidación. Bajo condiciones alcalinas y por exposición al aire, la acetoina producida durante la degradación de la glucosa, es oxidada a diacetil, el cual forma un compuesto rojo al combinarse con aminoácidos formados a partir de la peptona que formaba parte del medio. El medio de cultivo utilizado para esta prueba es el mismo que se utiliza para la prueba de rojo de metilo (medio Clark y Lubs), en el cual el sustrato principal es la glucosa. La diferencia fundamental entre estas dos pruebas (RM y VP) es la vía metabólica que siguen las bacterias en la degradación del mismo sustrato; por lo tanto si una especie bacteriana resulta positiva a la prueba de RM, resultará negativa a la pruebe de VP y viceversa. La reacción positiva para la prueba de VP o producción de acetoina se evidencia por un cambio del color del medio, al rojo rubí, cuando se le agrega el reactivo de Barrit.El reactivo de Barrit esta
compuesto por alfa naftol e hidróxido de potasio al 40%, los cuales se agregan separadamente al cultivo. El hidróxido de potasio actúa como agente alcalinizante del medio y el alfa naftol es una catalizador o acelerador de la reacción.
MATERIAL
a) Cultivo en Enterobacter aerogenes en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
c) 1 tubo de caldo de Clark y Lubs.
d) Reactivo de Barrit.
e) Asa de inocular.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular un tubo de caldo de Clark y Lubs con cultivo de E. aerogenes o E. coli.
2. Incubar el tubo a 37ºC por 24 - 48 horas.
3. Al finalizar el período de incubación, agregar al tubo 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio al 40% y 0,6 ml. de solución de alfa naftol (Reactivo de Barrit). Destapar los tubos y agitarlos fuertemente, dejarlos en incubación durante 2 a 4 horas adicionales.
4. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar.
1.5. Hidrólisis del Almidón
El almidón es un polímero de la glucosa encontrado ampliamente distribuido en todo el reino vegetal. El almidón es insoluble en el agua, por lo tanto no es muy accesible para las bacterias;
sin embargo algunas bacterias son capaces de elaborar una enzima extra celular conocida como amilasa, que hidroliza la molécula de almidón coloidal a maltosa y ésta luego es transformada en glucosa, la cual es metabolizada internamente por las bacterias.
MATERIAL
a) Cultivo en caldo nutritivo de Bacillus subtilis.
b) Cultivo en caldo nutritivo de Escherichia coli.
c) 1 placa de agar almidón.
d) Solución de Lugol.
e) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar sobre la superficie de la mitad del agar B. subtilis y en la otra mitad E. coli.
2. Incubar las placas a 37ºC por 24 - 48 horas.
3. Al final de la incubación añadir sobre la superficie del cultivo unas gotas de la solución yodada de Gram (Lugol). El yodo en presencia de almidón da un color azul, entonces, si ocurrió hidrólisis del almidón, una vez agregado el lugol, se evidenciará unazona traslúcida alrededor del crecimiento bacteriano, lo cual indica que el almidón fue degradado. Si la bacteria no hidrolizó el almidón, al agregar el lugol, el medio se tornará de color azul.
5. Observar la reacción en los alrededores de los crecimientos bacterianos e interpretar.
1.6. Utilización del Citrato
Algunas bacterias son capaces de utilizarel citrato de sodio cuando como única fuente de carbono para la síntesis protoplasmática. Esta prueba se realiza en el medio agar citrato de Simmons, el cual está compuesto por citrato de sodio, sales de amonio y el indicador azul de bromotimol; este último le confiere un color verde al medio sin sembrar (estéril). El indicador es sensible a cambios de pH, en condiciones ácidas este cambia el color del medio al amarillo pero en condiciones alcalinas vira al color azul. La utilización del citrato produce siempre alcalinización del medio que se evidencia por el viraje del color del agar, al azul.
MATERIAL
a) Cultivo de Enterobacter aerogenes en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutrtitivo.
c) 1 tubo de agar citrato de Simmons.
d) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Inocular el tubo de agar citrato de Simmons, con el cultivo de E. coli o E. aerogenes.
2. Incubar a 37ºC durante 24 - 48 horas.
4. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar. El viraje del medio a un color azul indica la reacción positiva.
2. ACTIVIDAD SOBRE PROTEINAS Y OTROS COMPUESTOS NITROGENADOS Muchas especies bacterianas sintetizan enzimas que tienen la propiedad de degradar las proteínas, es decir que presentan una actividad proteolítica. Esta actividad proteolítica puede ponerse de manifiesto a través del cultivo de las bacterias en medios específicos, como gelatina y leche. Las bacterias proteolíticas también pueden utilizar los péptidos y aminoácidos resultantes de la degradación proteica inicial, para sintetizar de novo proteínas celulares; en algunos casos las bacterias incluso, pueden utilizar las proteínas como una fuente de energía. Algunas especies bacterianas al degradar aminoácidos forman diversos productos finales que varían dependiendo de la ruta metabólica seguida para la degradación de estos aminoácidos. Estos productos finales pueden ser nitritos, amoníaco, indol, ácido sulfhídrico, etc.
2.1. Hidrólisis de la gelatina
La capacidad de un microorganismo para hidrolizarla gelatina es debida a la producción de la enzima gelatinasa. Generalmente esta prueba se toma como evidencia para poner de manifiesto la actividad proteolítica de una bacteria. El medio utilizado para realizar esta prueba, es un medio semisólido a base de gelatina (sustrato proteico), este medio a temperatura de laboratorio o en frío mantiene su consistencia semisólida. Cuando una bacteria hidroliza la gelatina el medio semisólido se transforma en líquido, el cual no solidificará aún cuando sea sometido a bajas temperaturas.
MATERIAL
a) 1 tubo de gelatina nutritiva.
b) Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
d) Aguja de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Inocular por punción el medio de gelatina nutritiva con el cultivo de S. aureus o E. coli 2. Llevar la siembra a incubación a 37ºC, durante 24 - 48 horas.
3. Finalizado el periodo de incubación, colocar los tubos con los cultivos en la nevera durante 10 minutos.
4. Hacer la lectura de los resultados inmediatamente después de retirar los tubos de la nevera.
2.2. Hidrólisis de la Caseína
La caseína es una fosfoproteína y el principal constituyente proteico de la leche. Se encuentra en estado coloidal y le confiere el color blanco y opaco a la leche. Algunas bacterias son capaces de hidrolizar la caseína produciendo fracciones solubles y transparentes. La enzima responsable de la hidrólisis de la caseína es llamada caseasa y es un tipo de enzima extracelular.
Esta prueba suele realizarse en agar leche, dispensado en placas de petri. Una vez que la bacteria ha crecido sobre la superficie del medio, se observará una halo claro o transparente alrededor del crecimiento bacteriano si la caseína ha sido hidrolizada; en caso de no haber hidrólisis de la caseína el medio de cultivo permanecerá inalterado alrededor del crecimiento bacteriano.
MATERIA
a) Cultivo de Pseudomonas aeruginosa en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo nutritivo.
c) 1 placa de agar leche.
d) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar en la mitad da la superficie del agar P. aeruginosa y en la otra mitad S. aureus.
2. Llevar las placas a la incubadora a 37ºC por 24 - 48 horas.
4. Hacer la lectura de los resultados e interpretar. Alrededor del crecimiento de las bacterias que hidrolizan la caseína (bacterias proteolíticas) se observará una zona clara o transparente en el medio de cultivo. Alrededor del crecimiento de las bacterias que no hidrolizan la caseína (no proteolíticas) el medio de cultivo permanece de color blanco opaco.
2.3. Acción sobre la leche
La leche representa un excelente medio de cultivo para los microorganismos, esto conlleva a que las bacterias que crecen en la leche realicen procesos de degradación de los diferentes sustratos disponibles. Pueden ocurrir procesos proteolíticos y/o fermentativos, dependiendo del sustrato que degraden (proteínas y/o carbohidratos); asimismo, los productos de esa degradación variarán de acuerdo a la vía metabólica que lleve a cabo la bacteria. El principal componente proteico de la leche es la caseína y el principal componente hidrocarbonado es la lactosa.
La acción de las bacterias sobre la leche se determina a través del cultivo de la bacteria de interés, en un medio líquido llamado leche tornasolada. Este medio contiene un indicador, púrpura de bromocresol, que le confiere a la leche del medio un color azul tornasol. Si las reacciones que ocurren acidifican el medio, el indicador se hace incoloro y por lo tanto el medio se ve de color blanco. Si las reacciones que ocurren en la leche tienden a ser alcalinizantes, el indicador tornará a un color azul más intenso y por lo tanto el medio tomará ese color.
Los procesos fermentativos que ocurren en la leche, son llevados a cabo por bacterias principalmente fermentadoras de lactosa; la utilización de la lactosa determina la producción de ácidos, lo cual se evidencia por un cambio de color del medio de azul tornasol al blanco. Cuando la producción de ácido es fuerte puede formarse un coágulo, muchas veces con burbujas de gas.
Este comportamiento es propio de las bacterias fermentadoras.
Las proteínas de la leche pueden ser coaguladas por acción de enzimas proteolíticas pero debido a que estas reacciones ocurren a pH neutro, el medio no cambio de color. Si la bacteria produce además caseasa, ésta puede hidrolizar la caseína precipitada convirtiendo la leche en un líquido pardusco transparente, proceso conocido comopeptonización. Finalmente, algunas bacterias producen alcalinización al liberar amoníaco a partir de otras sustancias nitrogenadas presentes en leche, esta liberación de amoníaco se evidencia por un cambio de color en el medio hacia un azul más intenso (reacción alcalina).
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Bacillus subtilis en caldo nutritivo.
c) Cultivo de Pseudomonas aeroginosa en caldo nutritivo.
d) 2 tubos de leche tornasolada.
e) Asa de inocular.
PROCEDIMIENTO
1. Inocular cada tubo de leche tornasolada con un cultivo bacteriano diferente.
2. Incubar los tubos a 37ºC durante 24 - 48 horas.
3. Hacer la lectura de los resultados e interpretar.
2.4. Producción de Indol (Método de Kovacs).
La hidrólisis de proteínas conlleva a la descomposición de ésta, en sus componentes básicos péptidos y/o aminoácidos. Con el término peptona se denominan a los polímeros de aminoácidos (péptido: cadena de aminoácidos) y/o aminoácidos libres solubles en agua, que se han producido por hidrólisis de proteínas. Algunas bacterias tienen la propiedad de hidrolizar el aminoácidotriptófano, por acción de laenzima triptofanasa. Como producto final de la hidrólisis de triptófano se genera indol. Este proceso solo ocurre sobre las peptonas con alto contenido del aminoácido triptófano. No todas las bacterias son capaces de degradar el triptófano a indol, por lo cual la prueba es de valor en la identificación y clasificación de bacterias. Para realizar esta prueba, las bacterias son cultivadas en un medio de cultivo denominado“agua peptonada” el cual posee un alto contenido del aminoácido triptófano; en caso de utilizarse caldos peptonados que no contengan triptófano o que éste se encuentre en muy bajas concentraciones, la prueba no tiene ningún valor desde el punto de vista de producción de indol. La detección de indol en el cultivo se realiza por adición de unas gotas del reactivo de Kovacs el cual reacciona con el indol y se forma un compuesto de color rojo.
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) en caldo nutritivo.
c) 1 tubo de agua peptonada.
d) Reactivo de Kovacs para indol (Para-dimetil-amino-benzaldehido) e) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Inocular 1 tubo de agua peptonada con el cultivo de E. Coli o E. aerogenes.
2. Incubar todos los tubos a 37ºC por 24 – 48 horas.
4. Terminado el período de incubación adicionar al cultivo unas gotas del reactivo de Kovacs para indol. La aparición de un anillo de color rojo intenso en la superficie del cultivo indica la producción de indol.
5. Hacer la lectura de los resultados e interpretar.
2.5. Producción de Sulfuro de Hidrógeno
Muchos microoganismos al degradar aminoácidos sulfurados, como la cistina o cisteina, desprenden ácido sulfhídrico en cantidades considerables. Para evidenciar la producción de ácido
sulfhídrico, se incorporan al medio de cultivo sales de metales pesados como acetato de hierro o acetato de plomo. Al producirse el ácido sulfhídrico, éste se combina con la sal (acetato de hierro o acetato de plomo) incorporada al medio y entonces, se produce el sulfuro de hidrógeno, los sulfuros tienen la particularidad de poseer un color oscuro, que va del pardo al negro. Por lo tanto, la determinación de la producción de ácido sulfhídrico se realiza de una manera indirecta a través de la producción de sulfuros; se evidencia por un viraje de color del medio de cultivo al marrón oscuro.
MATERIAL
a) Cultivo de Proteus vulgaris en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo.
c) 1 tubo de agar acetato de plomo (agar taco).
d) Aguja de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Inocular con el cultivo de P. vulgaris o E. coli el tubo de agar acetato de plomo.
2. Incubar a 37ºC durante 24 - 48 horas.
3. Efectuar la lectura de los resultados e interpretar. La formación de sulfuro de hidrógeno se evidencia porque el medio de cultivo cambia a un color pardo oscuro a lo largo de la línea de crecimiento.
2.6. Hidrólisis de la Urea
La urea es un compuesto nitrogenado no proteico, que puede ser hidrolizado por algunas especies bacterianas que poseen la enzima ureasa. Como producto de la hidrólisis de la urea se generaamonio y dióxido de carbono con la posterior producción de carbonato de amonio. La prueba de hidrólisis de la urea normalmente se realiza en un medio denominado “agar urea de Christensen” el cual contiene como indicador rojo de fenol. La producción de carbonato de amonio por hidrólisis de la urea se evidencia por el cambio de color del indicador al color rosado o fucsia. El carbonato de amonio alcaliniza el medio de cultivo y como consecuencia de ello el indicador cambia de color.
MATERIAL
a) Cultivo de Proteus vulgaris (P. vulgaris) en caldo nutritivo.
b) Cultivo de Salmonella thyphimurium (S. thyphimurium) en caldo nutritivo.
c) 1 tubo de agar urea de Christensen.
d) Asa de inocular
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar un tubo de agar urea de Christensen con el cultivo de P. vulgaris o S. thyphimurium.
2. Incubar los tubos a 37ºC por 24 a 48 horas.
3. Hacer la lectura de los resultados e interpretar. El cambio de color del medio a un color rosado o fucsia indica que hubo hidrólisis de la urea con formación de carbonato de amonio.
INDICADORES UTILIZADOS EN LAS PRUEBAS Y LOS CAMBIOS QUE SUFREN DE ACUERDO A LAS VARIACIONES EN EL PH
Cambio según pH
INDICADOR pH ácido pH alcalino
Rojo de Fenol amarillo rojo o rosado
Azul de bromotimol amarillo azul
Púrpura de bromocresol incoloro azul
REACTIVOS UTILIZADOS Y LOS CAMBIOS QUE DETERMINAN LA POSITIVIDAD DE LA PRUEBA
REACTIVO PRUEBA POSITIVA
Rojo de Metilo Rojo en presencia de ácido Barrit Rojo en presencia de diacetil Kovacs para indol Anillo rojo en presencia de Indol
Lugol Incoloro en ausencia de almidón
