Instituto Tecnológico de Tijuana
-Unidad Tomas Aquino.
Materia: Bioquímica.
Practica de laboratorio # 5.
Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la
reacción de la invertasa.
-Catedrático: Dra. María del Socorro Heredia
Equipo de Laboratorio # 9:
Huerta Gallardo Jesús Antonio.
Solis Solís Ivan Gilberto.
Gómez Cabrera Héctor.
Carrera:
Ingeniería Bioquímica
Grupo B
Resumen
En esta quinta práctica de bioquímica llamada efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción de la invertasa, preparamos 4 soluciones, la primera; solución de sacarosa al 0.3 M. Solución de 3.5 DNS. Solución de invertasa y solución reguladora de acetatos a 0.05 M y pH 4.7. Posteriormente preparamos en 7 tubos de ensaye, a cada tubo le agregamos un volumen específico de sacarosa 0.3 M, Reguladora de acetatos y agua destilada que habíamos preparado anteriormente para después preincubarlos tubos. A cada tubo le adicionamos una solución específica, por ejemplo; al tubo testigo le añadimos 2.0 mL de 3.5 DNS y después 0.1 mL de la solución de invertasa.
Índice
Resumen………..2
Introducción……..4
Antecedentes……5
Objetivo………….6
Metodología……..7
Resultados………
Cuestionario…….
Conclusiones…….
Bibliografía………
Antecedentes
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la concentración del sustrato hasta un punto en el cual ya no existe incremento, aún con la adición de más sustrato. En esta fase, el sustrato satura los sitios activos de la enzima y logra la velocidad máxima de la reacción, la cual depende de la afinidad de la enzima y el sustrato correspondiente.
Un aumento de sustrato, manteniendo fija la concentración de la enzima produce al principio un incremento considerable en la velocidad de la reacción. Sin embargo a medida que se va aumentando la concentración del sustrato la aceleración de la velocidad de la reacción empieza a decrecer hasta que finalmente, cuando la concentración del sustrato es elevada; no se observa cambio en la velocidad.
A medida que aumenta el número de las moléculas del sustrato, dichos sitios se van cubriendo cada vez en mayor grado hasta que, en el punto de la saturación, no quede ninguno disponible. La enzima trabaja a su máxima capacidad y, en estas condiciones, la velocidad resulta independiente de la concentración de sustrato. (1)
La invertasa, también conocida como sacarasa, es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructuosa. Está presente en el intestino delgado, en el borde del cepillo de las vellosidades intestinales. La ausencia de sacarasa provoca una enfermedad denominada intolerancia a la sacarosa, de difícil diagnóstico, muchas veces se confunde con la intolerancia a la lactosa. Pertenece a la familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan de romper los disacáridos en los monosacáridos que los forman. (1)
Objetivos
Determinar cuál es el efecto que le causa las diferentes
concentraciones de sustrato sobre la velocidad de la reacción de
la invertasa.
Material y Reactivos
Materiales
Reactivos
Equipo
6 tubos de ensaye de
15x180 mm Solución de sacarosa 0.3 M. Espectrofotómetro Spectronic 20 con dos
celdas. 3 Pipetas de 1.0 mL Solución de 3.5 DNS
1 Pipeta de 10 mL Solución de invertasa 1 Gradilla de reja Agua destilada
2 Baño de agua hirviendo Solución reguladora de acetatos 0.05 M a pH 4.7 1 Baño de agua con
Preparación de Reactivos
-Solución de sacarosa 0.3 M. Disolver 20.5 g de sacarosa en aproximadamente 150 mL de agua destilada y aforar a 200 mL con agua destilada.
-Solución de 3.5 DNS. Disuelve a ebullición 1 g de ácido 3.5 DNS en 20 mL de una solución de 2 N de NaOH (1.6 g de NaOH en 20 mL de agua destilada). Adicionar 30 g de tartrato doble de sodio y potasio a 50 ml de agua destilada y caliéntese para disolver. Finalmente mezcle las dos soluciones y afore a 100 mL con agua destilada.
-Solución de Invertasa. Se pesan 5 mg de invertasa y se disuelven en 150 ml de regulador de acetatos 0.05 M de pH 4.7. Conservar la solución enzimática para los siguientes ensayos.
-Solución reguladora de acetatos 0.05 M y pH 4.7. Mezclar 100 mL de ácido acético 0.05 M (0.30 mL de ácido acético glacial aforados a 100 mL con agua destilada) con 100 mL de solución de acetato de sodio trihidratado 0.05 M (0.680 mg de acetato de sodio trihidratado aforando a 100 mL con agua destilada). Ajustar el pH si fuera necesario con ácido acético glacial o con NaOH hasta pH de 4.7.
Metodología
-Procedimiento
Se preparan una serie de 7 tubos de ensaye con los volúmenes de las soluciones que se indican en la tabla siguiente:
Preincubar todos los tubos a una temperatura de 25°C (baño María) durante 5 minutos, añadir al tubo testigo 2.0 mL del 3.5 DNS y después 0.1 mL de la solución de invertasa.
A los demás tubos deberá adicionarse en riguroso orden 0.1 mL de la solución de invertasa a intervalos de tiempo de 15 segundos. A continuación se incuban todos los tubos durante 5 minutos a 25°C para, finalmente, detener la reacción adicionando a cada tubo (1-6) 2.0 mL de 3.5. DNS en el mismo orden e intervalo que el usado cuando se adicionó la invertasa a los tubos. Colocar todos los tubos en el bao de agua hirviendo durante 5 minutos y después transferirlos al baño de agua con hielo. Adicionar 20 mL de agua destilada a cada tubo y leer la absorbancia de cada uno de ellos a 540 nm en el espectrofotómetro.
Resultados de la absorbancia
0 1 2 3 4 5 6 7
-0.1 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3
Longitud de onda =
𝝀 𝟓𝟒𝟎𝒏𝒎
0.065
Dra. María Del Socorro Heredia, Página 9
Absorbancia
Cubetilla Longitud de ondaλ =540nm
Longitud de onda
λ=570nm
Con H2O 0.000 0.000
Con
Testigo
0.065-1
>2.882 1.7952
>2.871 1.6803
>2.736 1.2964
1.211-5
0.465-Resultados de absorbancia, utilizando testigo como blanco
Longitud de onda.
λAbsorbancia
Testigo
-
-Tubo 1
540 nm
-Tubo 2
540 nm
2.457
Tubo 3
540 nm
2.654
Tubo 4
540 nm
1.180
Tubo 5
540 nm
0.586
Cuestionario
1. ¿Qué comportamiento cinético se observa si la
concentración del sustrato es mayor al de la enzima?
2. ¿Qué comportamiento cinético se observará si la
concentración del sustrato es menor al de la enzima?
3. ¿Qué comportamiento cinético se observará si la
concentración del sustrato es igual al de la enzima?
4. ¿Por qué razón se le agrega primero DNS al tubo de testigo
y no después?
5. ¿Cuál es la razón por la cual la invertasa se agrega en
intervalos de 15 segundos?
Conclusiones
Huerta Gallardo Jesús Antonio. 12211007.
