UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
BIODIVERSIDAD MICROBIANA ASOCIADA A LOS
PROCESOS FERMENTATIVOS DE LA BEBIDA
CHAGUARMISHQUI
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
MAR 2014 – JUL 2014
JIMENA SALOMÉ TRÁVEZ TAPIA
DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA
DECLARACIÓN
Yo, Jimena Salomé Trávez Tapia, declaro que el trabajo descrito aquí es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.
_____________________________ Jimena Salomé Trávez Tapia.
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Biodiversidad microbiana asociada a los procesos fermentativos de la bebida
Chaguarmishqui”, que, para aspirar al título de Ingeniera en Alimentos fue desarrollado por Jimena Salomé Trávez Tapia, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
___________________ Ing. Nubia Grijalva
DIRECTORA DEL TRABAJO
DEDICATORIA
Dedico el presente trabajo a mis padres, Jimena y Washington quienes me apoyaron en todo el transcurso de mis estudios hasta culminar mi carrera profesional.
A mis hermanas Arleth y Sofía y a mi hermano Ian, ya que ellos fueron mi inspiración para dedicarme y esforzarme cada día y así ser un ejemplo para ellos.
AGRADECIMIENTO
A mi madre Jimena Tapia por confiar en mí y ser un apoyo incondicional en mi vida, por su esfuerzo y sacrificio para darme un mejor futuro, por sus consejos y sabias palabras para no caer y enfrentar la vida con fuerza y madurez.
A mi padre Washington Coyago por todos sus esfuerzos, su preocupación, sacrificio y por ser mi sustento siempre.
A mi hermano Ian y mis hermanas Arleth y Sofía por su preocupación y palabras de aliento.
A mi querida amiga Nancy Gallegos por apoyarme y ser indispensable a lo largo de mi trabajo y a mi querido amigo Edison Matute por sus palabras y apoyo incondicional.
A mi Abuelita Amelia Tapia quien siempre ha estado pendiente de mis estudios y a quien le tengo un inmenso cariño.
A mi tutora Nubia Grijalva por su paciencia, motivación y por brindarme todos sus conocimientos para culminar satisfactoriamente mi trabajo de tesis.
i
ÍNDICE DE CONTENIDO
PÁGINA
RESUMEN Vii
ABSTRACT ix
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 4
2.1 HISTORIA DE LA FERMENTACIÓN 4
2.2 FERMENTACIÓN 4
2.3 MICROBIOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES 5
2.4 TIPOS DE FERMENTACIÓN 6
2.4.1 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA 6
2.4.2 FERMENTACIÓN ACÉTICA 6
2.4.3 FERMENTACIÓN BUTÍRICA 7
2.4.4 FERMENTACIÓN LÁCTICA 8
2.5 PRINCIPALES MICROORGANISMOS DE LA FERMENTACIÓN
8
2.5.1 ENTEROBACTERIAS 8
2.5.2 COLIFORMES TOTALES 9
2.5.3 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS 10
2.5.4 MOHOS 11
2.5.5 LEVADURAS 12
2.6 BEBIDAS FERMENTADAS 13
2.6.1 BEBIDAS FERMENTADAS DEL MUNDO 14
2.6.2 BEBIDAS FERMENTADAS DEL ECUADOR 15
2.6.3 CHAGUARMISHQUI 16
ii 2.7 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS PARA
RECUENTOS, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS
PÁGINA
19
2.7.1 RECUENTOS 19
2.7.2 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 19
2.7.3 IDENTIFICACIÓN A PARTIR DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
20
2.7.3.1 Pruebas IMVIC 21
2.7.3.2 Pruebas Enzimáticas 22
2.8 MÉTODOS ACTUALES DE IDENTIFICACIÓN MICROBIANA
25
2.8.1 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR 25
2.8.1.1 Extracción de ADN 25
2.8.1.2 PCR 25
2.8.1.3 Electroforesis 26
2.8.1.4 Secuenciación 26
2.8.2 CARACTERIZACIÓN SEROLÓGICA 27
2.8.3 METAGENÓMICA 27
2.8.4 MARCADORES MOLECULARES 27
3. METODOLOGÍA 29
3.1 TOMA DE LA MUESTRA 29
3.2 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 29
3.2.1 RECUENTO DE MICROORGANISMOS 29
3.2.1.1 Preparación de diluciones seriadas 29 3.2.1.2 Siembra en placa para recuento de
microorganismos
30
3.2.2 OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS 31
3.2.2.1 Bacterias 31
3.2.2.2 Levaduras 31
3.2.2.3 Mohos 32
iii
3.3.1 BACTERIAS
PÁGINA
32
3.3.2 LEVADURAS 34
3.3.3 MOHOS 34
3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 35
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36
4.1 RECUENTOS MICROBIOLÓGICOS A LO LARGO DE LAS TRES ETAPAS DE PRODUCCIÓN DEL
CHAGUARMISHQUI
36
4.2 IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE BACTERIAS 38
4.3 CEPAS FÚNGICAS 41
4.4 DIVERSIDAD DE POBLACIONES MICROBIANAS A LO LARGO DE LAS ETAPAS DE FERMENTACIÓN
45
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 47
5.1 CONCLUSIONES 47
5.2 RECOMENDACIONES 48
BIBLIOGRAFÍA 49
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Medios de cultivo y condiciones de incubación. ... 30
Tabla 2. Pruebas bioquímicas realizadas a las bacterias. ... 32
Tabla 3. Recuentos microbianos de la bebida chaguarmishqui en las tres etapas de fermentación de la bebida. ... 36
Tabla 4. Especies de bacterias identificadas a los largo de las tres etapas fermentativas de la bebida chaguarmishqui. ... 38
Tabla 5. Cepas Identificadas de Levaduras y Mohos a lo largo de las tres etapas fermentativas de la bebida chaguarmishqui. ... 41
v
ÍNDICE DE FIGURAS
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Figura 1. Escherichia coli del género Enterobacteriaceae. ... 9
Figura 2.Psychrobacter. ... 11
Figura 3. Saccharomyces cerevisiae. ... 13
Figura 4. Ejemplar maduro del Agave americana ... 17
Figura 5. Extracción del chaguarmishqui………18
Figura 6. Inoculación en estría. ... 31
Figura 7. Especies Identificadas. ... 41
vi
ÍNDICE DE ANEXOS
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ANEXO I
PREPARACIÓN DEL PENCO (Agave americana) ... 59 ANEXO II
DIAGRAMA DE FLUJO DE LA OBTENCIÓN DEL CHAGUARMISHQUI .... 60 ANEXO III
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS ... 61 ANEXO IV
RECUENTOS DE COLIFORMES TOTALES, ÁCIDO LÁCTICAS, MOHOS Y LEVADURAS EN LA BEBIDA CHAGUARMISHQUI ... 62 ANEXO V
PRUEBAS BIOQUÍMICAS APLICADAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES, BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS, MOHOS Y
LEVADURA………..63 ANEXO VI
TINCIÓN DE ESPORAS ... 64 ANEXO VII
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS KIT DE IDENTIFICACIÓN API 20 C AUX………65 ANEXO VIII
vii
RESUMEN
“Chaguarmishqui” es el nombre que se le da a la bebida fermentada nativa de la sierra ecuatoriana obtenida a partir de la fermentación de la savia del penco (Agave americana). En esta investigación se analizaron muestras de plantas, recolectadas en el sector de Caizán (parroquia de Tumbaco - provincia de Pichincha). Se realizaron recuentos, aislamientos e identificaciones de microorganismos propios de la bebida fermentada (bacterias ácido lácticas, coliformes, mohos y levaduras) en las 3 etapas del proceso de fermentación: inicial, fermentativa y final. Las muestras se recolectaron según la norma INEN (NTE INEN 1 529-2:99); para la cuantificación se aplicó la técnica de recuento en placa en medios selectivos, para los aislamientos se aplicó la técnica de siembra por estría hasta obtener cultivos puros, tomando en cuenta criterios morfológicos y fenotípicos. La identificación de bacterias ácido lácticas y coliformes se realizó mediante pruebas bioquímicas, para mohos se realizó tinción con azul de metileno para la comparación con el manual de Identificación; y, para levaduras se usó kits de identificación Api 20 C AUX. En relación a los recuentos microbiológicos, en la etapa final no se detectó presencia de coliformes; el recuento de levaduras se mantuvo a lo largo de todo el proceso siendo en promedio de 8 logUFC/ml, mientras que la carga más alta de bacterias ácido lácticas fue en la etapa fermentativa ya que en la fase final presentó un descenso considerable. Se identificaron 2 cepas de enterobacterias: Proteus
penneri y Yersinia mollareti, 18 cepas de bacterias ácido lácticas siendo las
más destacadas las del género Lactobacillus: Lactobacillus casei y
Lactobacillus delbruecki, 2 cepas de mohos: Penicillum y Byssochlamys
nívea westling y 17 cepas de levaduras (Rhodotorula mucilaginosa, Candida
inconspicua, Saccharomyces cerevisiae 1, Kloeckera spp , Rhodotorula minuta, Candida krusei, Candida Kefyr, Candida famata, Cryptococcus
laurentii y Rhodotorula mucilaginosa 1). Se reconoce una amplia diversidad
ix
ABSTRACT
1
1.
INTRODUCCIÓN
Las bebidas fermentadas tradicionales se realizan en países sudamericanos como Ecuador, Colombia, Perú y Bolivia (Rodríguez et al., 2005). En Ecuador se produce una variedad de bebidas fermentadas, entre las que se destacan las chichas, aguardientes, vinos de frutas exóticas y el Chaguarmishqui (Aguirre, 2009; Recalde, 2010). El Chaguarmishqui es una bebida dulce fermentada, que se obtiene a partir de la cabuya negra (Agave americana), producida por la exudación del tronco del agave al realizar un orificio en su base (Ullari, 1993).
La cabuya negra es conocida también como penco; planta perteneciente a la familia Agavaceae (Agaváceas) originaria de México de las regiones desérticas occidentales; su nombre procede del griego agave que significa admirable (Allauca, 2011).
La planta de penco fue traída al Ecuador desde México en la época de la colonia. Principalmente era utilizado como lindero, dividiendo las propiedades de las haciendas. El cultivo de la cabuya se localiza en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha, Tungurahua, Chimborazo, Azuay, Cañar, Loja, Guayas y Manabí. Se la utiliza como planta ornamental y para la obtención de fibras, no obstante su principal función en la industria alimenticia es la obtención de bebidas fermentadas y destiladas como el tequila y mezcal. Desde siempre ha sido utilizado para satisfacer y complementar una serie de necesidades básicas como alimento, forraje, medicamento, conservación de suelos y producción de insectos comestibles para la industria gastronómica. Se destaca por la importancia que tiene desde el punto de vista agroecológico y socioeconómico (García, Méndez, & Talavera, 2010).
2 diferentes cepas de bacterias acido lácticas, mohos y levaduras; Ramírez (2010) y Escalante (2014) han encontrado cepas de Lactobacillus delbrueckii
y Lactobacillus casei en el aguamiel de maguey; conformando la flora nativa
de esta bebida. También se ha encontrado la levadura Saccharomyces
cerevisiae en bebidas como aguamiel y pulque (Herrera, Lappe, & Wacher,
sf).
La principal característica de las bebidas fermentadas tradicionales en el Ecuador es que se realizan únicamente de forma artesanal o semicomercial, destinadas a grupos humanos particulares en algunas regiones del país, es decir que no existe una producción industrial a gran volumen (García et al. 1993).
Por esta razón es necesario realizar investigaciones referentes a los microorganismos asociados directamente con el proceso de fermentación, para sustituir procesos fortuitos o espontáneos de fermentación de alimentos por cultivos iniciadores.
El proceso de obtención del Chaguarmishqui se realiza de forma empírica. No se utiliza en su proceso de elaboración un inóculo microbiano iniciador y tampoco se sigue un procedimiento estándar. Por ello este trabajo de investigación busca identificar las principales cepas de levaduras, mohos y bacterias ácido lácticas asociados al proceso de fermentación de la bebida Chaguarmishqui.
Objetivo General
3
Objetivos Específicos
Realizar recuentos de coliformes, bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras presentes en las tres etapas de fermentación de la bebida Chaguarmishqui.
4
2.
MARCO TEÓRICO
2.1. HISTORIA DE LA FERMENTACIÓN
La fermentación es un proceso enzimático que ha sido utilizado por el hombre de forma empírica desde hace 6000 años (Yufera, 1995). Se creía que este fenómeno y otros similares eran reacciones espontáneas (Navarro, 2009).
Fue estudiada por el biólogo Luis Pasteur, quien determinó que sin la presencia de células de levaduras no se producía la fermentación. En 1897 Buchner obtuvo un extracto de levadura, que fue triturado en agua para luego filtrarlo, el resultado de este extracto sin células fue capaz de transformar la glucosa en CO2 y también en alcohol; concluyendo que enzimas resultantes de la filtración fueron las causantes de la fermentación (Yufera, 1995). Este estudio abrió paso a la curiosidad de otros científicos, los cuales ahondaron en el tema para descubrir más acerca de la fermentación.
2.2. FERMENTACIÓN
5 La especie más utilizada en este proceso es la levadura Saccharomyces
cerevisiae, principalmente aplicada en la industria cervecera para la
elaboración de cervezas a gran escala (Sigifredo & Stroppiano, s,f).
El comportamiento de los microorganismos depende de varios factores que intervienen en la fermentación, como el pH, cantidad de nutrientes y la temperatura (Padilla & Santamaría, 2003).
En la actualidad la fermentación es muy usada para obtener bacterias deseadas o subproductos que mejoran los procesos de manera eficiente. En un estudio realizado por (Carreño, Caicedo, & Martinez, 2012) se utilizaron técnicas de fermentación como el cultivo estático y agitado, para la producción de celulosa bacteriana. Esta celulosa bacteriana es un polisacárido que resulta de la síntesis de muchos microorganismos. Este polisacárido tiene funciones importantes, como la protección mecánica, química y biológica dentro del hábitat natural del microorganismo.
2.3. MICROBIOLOGÍA DE LAS FERMENTACIONES
Las fermentaciones producen varios subproductos de interés para las industrias y ciencias como la Microbiología (Castillo & Roldán, 2005).
Gracias a la fermentación, la Microbiología pudo abrirse campo a investigaciones acerca de los microorganismos asociados directamente con este proceso. Se puede lograr sustituir procesos fortuitos o espontáneos de fermentación de alimentos por cultivos iniciadores (Instituto Politécnico Nacional. Academia del área de plantas piloto de alimentos., 2003).
6
2.4. TIPOS DE FERMENTACIÓN
2.4.1. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Según Hernández & Martínez (2012), la fermentación alcohólica es un proceso en el que se transforma el zumo azucarado en un líquido con un determinado contenido de alcohol etílico; este proceso tarda una semana a temperatura de 20°C. En la fermentación alcohólica el oxígeno necesario para oxidar carbono y obtener dióxido de carbono junto con el etanol está contenido en la propia molécula de glucosa y esta conversión no requiere de oxígeno atmosférico. Gracias a las levaduras presentes en el mosto, los azúcares son transformados mediante un cierto número de etapas en etanol y anhídrido carbónico según la ecuación de Gay Lussac.
C6H12O6 2 CH3-CH2-OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.4 kcal La fermentación alcohólica es muy usada en la industria alimenticia para la elaboración de bebidas fermentadas como vino, cerveza, aguardientes, entre otros. Ferreira et, al. (2009) utilizaron la levadura S. cerevisiae para la elaboración de vinos fermentados pasteurizados a partir de jugo de naranja. Aplicando la fermentación alcohólica como proceso principal para la elaboración del vino.
2.4.2. FERMENTACIÓN ACÉTICA
7 La fermentación acética es un proceso aerobio por el cual se obtiene ácido acético y agua a partir del etanol. Para desarrollarla a escala industrial se emplean bacterias acéticas, las más utilizadas son las del género
Acetobacter por su alta capacidad de producción de este metabolito. Las
especies que se han detectado en mayor proporción son Acetobacter aceti,
Acetobacterrancens y Acetobacter oxydans. Los factores esenciales para su
crecimiento varían según su temperatura: 5 - 42°C y pH entre 5.4 a 6.3 (Hernández, 2003).
En un estudio realizado por Leuroux & Rivera (2011) se utilizó la fermentación acética para la obtención de vinagre a partir de frutas exóticas como el mangousando como fruta base el rechazo de banano, Acetobacter
aceti actuó como microorganismo principal en el proceso de fermentación.
2.4.3. FERMENTACIÓN BUTÍRICA
La fermentación butírica es un proceso anaerobio en el que se degradan los hidratos de carbono a partir del ácido láctico para la producción de ácido butírico y gas. Esta fermentación se puede dar en condiciones de temperatura entre 20-25 °C y un pH inferior a 4. Las principales bacterias asociadas a este proceso fermentativo son las del género Clostridium (Urbano, 1995).
8
2.4.4. FERMENTACIÓN LÁCTICA
Generalmente la fermentación láctica se aplica en industrias lácteas utilizando microorganismos como levaduras y bacterias. Durante esta fermentación el piruvato se reduce por acción del NADH para formar lactato que es la forma ionizada del ácido láctico (Campbell & Reece, 2007).
Algunos microorganismos pueden convertir durante la fermentación hasta el 98% de los azúcares en ácido láctico.
Las bacterias que se encargan de producir ácido láctico se pueden dividir en dos subgrupos: las fermentadoras homolácticas y las fermentadoras heterolácticas.
En el caso de las fermentadoras homolácticas, las bacterias descomponen la glucosa exclusivamente mediante la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), con mínimas cantidades de otros productos finales. Mientras tanto las bacterias fermentadoras heterolácticas o también llamadas fermentadoras mixtas del ácido láctico pueden catabolizar la glucosa por tres vías diferentes de degradación: EMP, Shunt de la pentosa y procesos Entner-Doudoroff, para dar los productos característicos finales que son el ácido láctico más ácido acético, ácido fórmico, etanol, CO2 y en algunos casos en compuesto glicerol (MacFaddin, 2003).
2.5.
PRINCIPALES
MICROORGANISMOS
DE
LA
FERMENTACIÓN
2.5.1. ENTEROBACTERIAS
9 estas bacterias siempre están asociadas a enfermedades. Mientras que
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus mirabilis, son
pertenecientes a la flora saprófita normal.
La clasificación de las Enterobacterias se realiza por determinación de la presencia o ausencia de ciertas enzimas; para ello se cultivan en medios que contienen sustratos específicos (García & Zamudio, 1998).
Las Enterobacterias forman parte de varias investigaciones; recientemente se ha estudiado a las Enterobacterias productoras de β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), entre ellas Echerichia coli (Figura
1), Enterobacter aerogenes y Klebsiella pneumoniae, las cuales se
caracterizan principalmente por ser resistentes a penicilinas y cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación, siendo algunas de las especies de Enterobacterias un problema a nivel mundial en distintos ámbitos industriales por ser microorganismos alterantes en la fermentación (Oliver & Cantón, s.f.; García, Astocondor & Banda, 2012).
Figura 1. Escherichia coli del género Enterobacteriaceae.
(Armora & Gómez, 2012)
2.5.2. COLIFORMES TOTALES
10 Estos microorganismos se distingue entre coliformes fecales los cuales se encuentran en el tracto digestivo del hombre o animales y coliformes totales que pueden vivir en otrosambientes (Camacho, y otros, 2009).
2.5.3. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
Según Parra (2010) las bacterias ácido lácticas (BAL) desde hace mucho tiempo han sido muy importantes en los alimentos por ser parte del proceso fermentativo y dar las características organolépticas a los productos. Las BAL tienen muchas aplicaciones, entre ellas, la fermentación de leche, carne y vegetales para obtener como resultado yogurt, embutidos y conservas (Ramiro, Rosas, Velazquéz, Ulloa, & Romero, 2011).
Las BAL están compuestas por un grupo grande de géneros como Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc y
Pediococcus. Estos microorganismos contribuyen a la mejora de las
características organolépticas como: sabor, olor textura, propiedades terapéuticas y valor nutricional de varios productos de la industria alimenticia.
11
2.5.4. MOHOS
Los mohos comprenden un grupo heterogéneo de hongos multicelulares y con forma de hifas. Están formados por estructuras ramificadas llamadas micelio. La reproducción de mohos se da por medio de esporas de diferentes tipos; tienen el metabolismo similar al de las levaduras y bacterias ya que contienen contienen enzimas que sirven para la descomposición de sustancias orgánicas (Benítez & Gutierrez, 2003).
Los mohos son responsables de la contaminación fúngica de los alimentos. Estos microorganismos no solo deterioran el alimento, también tienen un alto potencial para producir micotoxinas y provocar infecciones, las cuales son perjudiciales para el ser humano (Pascual & Calderón, 1999).
Los hongos se clasifican en psicrófilos, mesófilos y termófilos según su temperatura de crecimiento. Los psicrófilos, como el Psychrobacter, presente en la Figura 2, crecen desde -5 a 20 °C , siendo su rango óptimo entre 0 a 17 °C; los de carácter mesófilo tienen una temperatura óptima entre los 15-40 °C, mientras que los termófilos tienen resistencia a temperaturas más altas, entre 25-30 °C (Toro, Sulca, & Miñaño , 2010).
12 En un estudio elaborado por Herrera (2007) se realizó la descripción y análisis acerca de las bebidas fermentadas como el pulque, mezcal, tequila, pozol y alimentos fermentados por hongos. Además, se realizaron estudios respecto a las especies del género Psilocybe (que son hongos alucinógenos), los cuales son de gran importancia para la cultura mexicana, por su intervención en el proceso de fermentacion de las bebidas y alimentos.
2.5.5. LEVADURAS
Las levaduras se caracterizan por ser hongos unicelulares no filamentosos, cuya morfología es esférica u ovalada. Son microorganismos heterótrofos, por lo que necesariamente requieren de carbón orgánico para elaborar su propia fuente de energía y sintetizar sus compuestos orgánicos. Estos microorganismos utilizan el azúcar constituyente de muchos alimentos como su alimento energético.
La mayoría de las levaduras pueden catabolizar la glucosa mediante el proceso de respiración o en ausencia de oxígeno mediante la fermentación (Santamaría, García, & Rosello, 1998).
13
Figura 3. Saccharomyces cerevisiae.
(Calzada, Bueno, & Sánchez, 2000)
En un estudio realizado por López & Ramirez (2010) acerca de la diversidad de levaduras asociadas a chichas tradicionales de Colombia, se aislaron e identificaron diferentes poblaciones de levaduras nativas en procesos fortuitos de fermentación de bebidas como la chicha de maíz, piña y arracacha. Encontraron veinte especies de levaduras en las diferentes etapas de fermentación inicial, tumultuosa y final. Entre las levaduras encontradas sobresalen: Candida tropicalis, Pichia kluyveri, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa, Torulaspora
delbrueckii, Candida pseudointermedia y Yarrowia lypotílica.
2.6. BEBIDAS FERMENTADAS
14 estudios acerca de las bebidas alcohólicas. Estas bebidas se obtienen a partir de la fermentación alcohólica por acción de las levaduras que transforman el azúcar contenido en frutos o granos a alcohol. Se clasifican en bebidas fermentadas, bebidas destiladas y las tradicionales no comerciales (Berruecos, 2007).
2.6.1. BEBIDAS FERMENTADAS DEL MUNDO
Las bebidas fermentadas existen en todo el mundo. En los continentes americano y africano se destacan, ya que forman parte de la cultura ancestral y son típicas de diferentes tribus o grupos indígenas.
Entre las diferentes bebidas fermentadas que existen a nivel mundial las más destacadas son el pozol, el tejuino, el tepache y la tuba. La tuba es una bebida fermentada proveniente de la palma de coco, se extrae del líquido que exuda al cortar sus ramas y se consume en muchas partes del mundo como Ghana, Filipinas, Malasia, Sudáfrica. En África se conoce esta bebida fermentada con el nombre de legmi, que es una bebida alcohólica lechosa y dulce que se obtiene a partir de la yema apical de la palmera datilera (Del Canizo, 2011). Esta bebida fermentada se conoce en India del Sur como ¨kallu¨, mientras que en Borneo se la llama ¨goribón¨ (Meléndez & Rodriguez, 2011).
El tepache es una bebida fermentada refrescante, consumida generalmente en México, que se obtiene a partir de la fermentación del maíz. No obstante, se utilizan otras materias primas, entre estas, guayaba, manzana, naranja. La manera más conocida de preparar tepache es a partir de cáscaras de piña, junto con azúcar de caña y agua, que se deja fermentar a una temperatura de 20 °C por un periodo de 4 a 6 días (Ramos, Corona, Pelayo, Guatemala, & Arriola, s,f).
15 puede consumir recién elaborada o fermentada. Generalmente se la consume sola pero también es muy común agregarle cacao o coco (Jiménez, González, Magaña, & Corona, 2010).
El tejuino es una bebida fermentada que se elabora de forma artesanal; proviene de diferentes estados de México como: Jalisco, Oaxaca, Nayarit y Chihuahua. Esta bebida se obtiene mediante la fermentación del nixtamal de maíz, mediante un proceso en el que se retira la cáscara del maíz hirviéndolo en agua con cal (Guerra, Solís, Camarillo, Reyes, González, & Aguilar, s,f).
2.6.2. BEBIDAS FERMENTADAS DEL ECUADOR.
Existe una gran variedad de bebidas fermentadas elaboradas en el Ecuador, producidas por comunidades en diferentes provincias del país, según su cultura y tradiciones. En el Ecuador se producen varios tipos de chicha elaborada por los indios quichuas que se encuentran en el territorio andino. Se elabora a partir de diferentes materias primas, entre las más representativas se destacan la chicha de jora, chicha de yuca, chicha de maíz, chicha de uva y chicha de arroz. Estas bebidas son consumidas generalmente en celebraciones y festividades tradicionales.
16 El consumo del jugo de caña en la región costa es muy común; esta bebida se deja fermentar y se extrae mediante la trituración de la caña, utilizando un trapiche (Aguirre M. , 2010).
La producción del Chaguarmishqui se produce de forma empírica, siendo una práctica ancestral, elaborada hace muchos años atrás, en las provincias del Azuay, Carchi, Imbabura, Pichincha, Tungurahua, Cañar, Chimborazo, Bolívar, Loja, Guayas y Manabí (Ayora & Quito, 2013).
2.6.3. CHAGUARMISHQUI
El Chaguarmishqui es una bebida muy dulce de sabor agradable con 40 GL, perteneciente a la serranía ecuatoriana. Para su extracción se requieren plantas de Agave maduras de entre 9 a 12 años para que produzca agua miel, esta producción dura aproximadamente entre 3 a 4 meses (Allauca, 2010).
La cabuya negra (Agave americana) o también llamado penco negro, produce savia dulce, generada a partir de la exudación de las hojas, la cual se recoge y fermenta para producir la bebida alcohólica llamada chicha de penco o Chaguarmishqui. Además, durante el proceso se puede extraer la fibra que resulta del raspado en el interior de la cavidad del agave (Ramírez & Williams, 2003).
17
2.6.3.1. Maguey (Agave americana)
Los agaves son plantas perennes, con hojas dispuestas en espiral y arregladas en rosetas en el ápice de un tallo, que pueden medir hasta los 3 metros de altura. Tienen una gran importancia en el aspecto económico y cultural. Se utilizan como fuente de alimento y bebida, para la construcción de viviendas, elaboración de implementos agrícolas, entre otros. En la Figura 4 se puede apreciar un ejemplar maduro de Agave americana.
Figura 4. Ejemplar maduro de Agave americana (Jurado & Sarzosa, 2009)
Las especies grandes consiguen llegar a su madurez entre los 10 y 25 años, a diferencia de las especies pequeñas que lo hacen después de crecer cuatro y cinco años. Los agaves o también conocidos con el nombre de magueyes o pencos, son plantas xerófitas, que se adaptan y pueden vivir en condiciones climáticas drásticas, con largos periodos de sequía y altas temperaturas (García, 2007).
18
2.6.3.2. Proceso de Elaboración
Según Allauca (2010) el proceso de obtención de Chaguarmishqui consta de tres pasos importantes, los mismos que se pueden observar en la Figura 5 y su diagrama de flujo en (Anexo II).
El añejamiento
Es el proceso que se le da a la planta de agave después de haber sido cortada para lograr su maduración, y así dar paso a la producción de la savia, que toma aproximadamente siete días.
Picado y acondicionamiento
El picado y acondicionamiento consiste en retirar el meyolote (parte central de la planta) y cavar el centro para obtener una cavidad en forma de olla en la que se adiciona agua y donde se almacenará la savia de forma natural para ser extraída en los 3 días siguientes.
Raspado
Cosiste en retirar pequeñas capas de las paredes de la cavidad que anteriormente se había formado; esto se lo realiza con una especie de cuchara llamada raspador.
Figura 5. Extracción del chaguarmishqui.
19
2.7.
TÉCNICAS
MICROBIOLÓGICAS
BÁSICAS
PARA
RECUENTOS, AISLAMIENTO E INDENTIFICACIÓN DE
CEPAS MICROBIANAS
2.7.1. RECUENTOS
Los métodos de recuento en placa se utilizan generalmente para determinar la magnitud de la población y medir el número de células viables por gramo o mililitro del alimento que se va a estudiar. Se basa en la suposición de que
cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Para realizar los recuentos es necesario obtener una serie de diluciones
decimales y mediante el empleo de técnicas de siembra en placas de agar: estría, extensión y en profundidad. Los resultados de los recuentos se reportan como unidades formadoras de colonias (UFC) y el rango óptimo
para recuento en una placa de agar oscila entre 30 y 300 UFC. Una desventaja de este método es que requiere 24 h para contar las
colonias visibles (Tortora, Funke, & Case, 2007).
Otra técnica de recuento es la del número más probable (NMP). Según Soler (2006) es una técnica eficiente de estimación de densidades poblacionales cuando una evaluación cualitativa de células individuales no es factible. El crecimiento se verifica con la presencia o no de turbidez en el medio y la generación de ácido y gas, el cual se presencia en las campanas de fermentación.
2.7.2. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
20 Los métodos de siembra en placa suelen utilizarse para el aislamiento de bacterias y hongos debido a su crecimiento eficaz en medios sólidos (Stanier, 1996).
En un estudio realizado por Martín (2011) se aisló eficientemente utilizando la técnica de siembra en superficie, levaduras propias de la uva, capaces de tener una acción antagónica frente al hongo fitopatógeno filamentoso
Botrytis cinerea, el cual es causante de la podredumbre gris. El aislamiento
de bacterias, mohos o levaduras no solo permite encontrar un microorganismo benéfico o patógeno, también ayuda a la identificación de nuevas cepas asociadas al microorganismo aislado.
2.7.3. IDENTIFICACIÓN A PARTIR DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Las pruebas bioquímicas se realizan con el objetivo de identificar el nombre de la especie de diferentes microorganismos. Son muy utilizadas las pruebas del metabolismo bacteriano, donde intervienen enzimas, que son características para cada microorganismo.
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2.7.3.1. Pruebas IMVIC
Constan de cuatro pruebas (Rojo de metilo, Indol, Voges Proskauer, citrato) que se emplean principalmente para la identificación de enterobacterias; bacilos Gram negativos y anaerobios facultativos con metabolismo fermentador.
Prueba Rojo de Metilo
Es una prueba que se fundamenta en la capacidad que poseen algunos microorganismos positivos de actuar sobre la glucosa y a través del ácido pirúvico producir una fermentación ácido mixta (Koneman & Allen, 2008).
Indol
Esta prueba bioquímica se fundamenta en la capacidad que tienen algunos microorganismos para hidrolizar el triptófano, y formar otros productos como el indol, debido a que poseen en su sistema la enzima triptofanasa. La determinación del indol se puede evidenciar con el reactivo de Kovacs (p-dimetilamino benzaldehído), que al tener contacto con el indol forma un producto de color fucsia (Rodríguez, 2005).
Prueba de Voges Proskauer
Se basa en la capacidad que poseen determinados organismos de producir acetil-metil-carbinol a partir de la degradación de la glucosa. En presencia de oxígeno y de una solución de KOH al 40 %; el acetil-metilcarbinol se convierte en diacetilo, el cual, en contacto con alfa-naftol produce el color rojo (Tortora, Funke, & Case, 2007).
Citrato
22 si el microorganismo ha utilizado el citrato se utiliza medios como el de Simmons; que cual contiene azul de bromotimol como indicador de pH, citrato y sales de amonio. El cambio de color de verde pH 6.9 a azul pH 7.7 se da cuando la bacteria crece (Rodríguez, 2005).
2.7.3.2. Pruebas Enzimáticas
Prueba de la Ureasa
Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo para hidrolizar la urea en dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa con la resultante alcalinidad (MacFaddin, 2003).
Oxidasa
El principio de esta prueba bioquímica se basa en la identificación de bacterias que producen la enzima oxidasa, diseñada originalmente para identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae, oxidasa negativos. La interpretación de resultados se determina positiva si tiene un cambio de color rosa y negativo al presenciarse un cambio de color negro purpúreo (MacFaddin, 2003).
Catalasa
Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias especialmente
Bacillus y Streptococcus para la formación de enzimas catalasas o
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Coagulasa
El principio de esta prueba bioquímica se fundamenta en la identificación de algunos microorganismos capaces de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa libre y ligada. Esta prueba es utilizada especialmente para especies del género Staphylococcus. La interpretación de los resultados es positiva cuando existe una agregación o granulación y de ser negativa no hay presencia de la misma (MacFaddin, 2003).
Reducción de Nitratos
La prueba de reducción de nitratos/nitritos se utiliza para la determinación de microorganismos capaces de reducir los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre. Si el resultado es positivo existe presencia de gas y si es negativo hay ausencia del mismo (MacFaddin, 2003).
β - D – Galactosidasa
Esta prueba bioquímica se utiliza para determinar la presencia o la ausencia de la enzima que degrada la lactosa β-galactosidasa por medio del uso de los compuestos orgánicos o-nitrofenil- β-D-galactopiranósido (ONP) o p-nitrofenil- β-D-galactósido (PNPG). El resultado positivo de esta prueba se refleja en el cambio de color amarillo entre los 20 minutos y 24 horas, mientras que en el resultado negativo es incoloro (MacFaddin, 2003).
Descarboxilasas
24 positivo ocurre un cambio de color de púrpura turbio a amarillo púrpura apagado, esto quiere decir que el microorganismo produjo aminas, pero si el resultado es negativo el color a presenciarse es amarillo brillante se interpreta que el microorganismo únicamente fermentó glucosa (MacFaddin, 2003).
Prueba de la DNAsa
Con esta prueba se puede investigar la capacidad que tienen los microorganismos para producir enzimas capaces de hidrolizar el DNA (Tortora, Funke, & Case, 2007).
Pruebas API
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2.8. MÉTODOS
ACTUALES
DE
IDENTIFICACIÓN
MICROBIANA
2.8.1. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
Las técnicas actuales de biología molecular permiten conocer y caracterizar el contenido genético de organismos; para estimar la diversidad y las relaciones genéticas entre ellos.
2.8.1.1. Extracción de ADN
Se basa en la molécula de ADN estableciendo que es única en cada individuo, y contiene toda la información necesaria para el desarrollo de los microorganismos. La extracción del ADN ha sido una herramienta muy valiosa para la determinación de diferentes especies. Para la extracción es necesario separar el ADN del resto de los componentes celulares así como también del material no biológico. El objetivo de la extracción es eliminar o diluir componentes inhibidores de reacciones de amplificación como grupos hemo, RNAsas, ADNsas entre otros, que dificultan el análisis. Para el proceso de aislamiento se siguen tres pasos: lisis de la membrana, degradación de las proteínas, extracción del ADN y su precipitación (Fonseca, Mateus, & Contreras, 2010).
2.8.1.2 PCR
26 Las enzimas polimerasas son las encargadas de llevar a cabo la replicación del ADN, para esto están conformadas por una molécula de ADN de cadena sencilla que actúa como molde, un par de cebadores de secuencia complementaria a la cadena a sintetizar y nucleótidos activados para ser incorporados en la cadena naciente. La técnica de la PCR está conformada por 3 pasos: la desnaturalización (donde se separa la doble hélice), anillamiento (en el que actúan los cebadores reaccionando con la hebra sencilla de ADN y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases), y por último la polimerización o extensión (Sabán, 2009).
2.8.1.3. Electroforesis
La electroforesis es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio, relacionada con el trabajo con ácidos nucleicos y una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética. La electroforesis permite separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo eléctrico (García H. , 2000), ésta técnica se realiza en geles de agarosa o poliacrilamida. Mediante la electroforesis se puede separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y posteriormente determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra. Además se puede extraer del gel algunos fragmentos de ADN de interés (Yábar, 2003).
2.8.1.4. Secuenciación
27 repetición de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradación que produce una serie de fragmentos de polinucleótidos que reemplazan el punto de corte en la primera fase (De Necochea & Canul, 2004).
2.8.2. CARACTERIZACIÓN SEROLÓGICA
En la actualidad existen procedimientos serológicos y moleculares para el diagnóstico de: virus, viroides, bacterias y fitoplasmas que ocasionan severas enfermedades en frutas.
La caracterización serológica es una técnica de la genética molecular utilizada para la detección de anticuerpos contra parásitos y hongos. Esta técnica permite varias posibilidades y ventajas para diagnosticar la causa de una enfermedad, y así identificar y caracterizar los fitopatógenos. Para esto se debe detectar los antígenos presentes en estos patógenos (Bonet & Martínez, 2004).
2.8.3. METAGENÓMICA
La metagenómica es una tecnología de secuenciación del ADN a bajo costo. Se puede estudiar genomas de un determinado entorno a partir de muestras de ese ambiente recolectadas directamente, sin necesidad de aislar y cultivar esas especies. Esta técnica se aplica a diferentes ecosistemas acuáticos, minas, suelos agrícolas y forestales, entre otros. Así se puede descubrir el verdadero potencial genético de estos sistemas (Hernández, Orozco, Velázquez , & Santoyo, 2010).
2.8.4. MARCADORES MOLECULARES
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3. METODOLOGÍA
3.1. TOMA DE LA MUESTRA
Se utilizaron muestras de agua miel de tres plantas diferentes de Agave
americana, ubicadas en la provincia de Pichincha, en la parroquia de
Tumbaco sector Caizán, en cada etapa del proceso de fermentación: inicial (día cero), fermentativa (día 2) y final (día 4). Estas fueron recolectadas en frascos estériles de vidrio boca ancha protegidos de la luz y se transportaron en condiciones de refrigeración hasta el laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica Equinoccial donde se realizaron los análisis.
3.2. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
3.2.1. RECUENTO DE MICROORGANISMOS
3.2.1.1. Preparación de Diluciones Seriadas
La preparación de las diluciones para el recuento de bacterias ácido lácticas, coliformes, mohos y levaduras se realizó según el método establecido por Kivanc, Meral, & Erdogan (2011).
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3.2.1.2. Siembra en placa para recuento de microorganismos
Para el recuento de los microorganismos estudiados (bacterias ácido lácticas, coliformes, mohos y levaduras) se utilizó el método establecido por Yousef & Carlstrom (2003).
Se realizó la siembra de cada grupo microbiano por triplicado a partir de 3 diluciones seriadas. Para el recuento de las bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras se utilizó la técnica por extensión; se tomó 0.1 ml de cada dilución y se depositó en la placa Petri con el medio solidificado, utilizando perlas de vidrio previamente esterilizadas.
Para la siembra de coliformes se utilizó la técnica por vertido, se transfirió a cada placa Petri 1 ml de cada dilución; añadiendo 20 ml del agar correspondiente (Tabla 1).
Las placas se colocaron en el agitador y se transfirieron a la incubadora a diferentes condiciones de incubación según el tipo de microorganismo.
Tabla 1. Medios de cultivo y condiciones de incubación
Microorganismo Medio de cultivo Condiciones de Incubación
Coliformes Agar VRB 37ºC; 24h
Mohos y Levaduras Agar Sabouraud Dextrosa con Cloranfenicol
25ºC; 3 a 5 días
Bacterias ácido lácticas Agar MRS Cámara de anaerobiosis; 30ºC; 48h
El recuento en placa de colonias se realizó de manera visual y con la ayuda de un contador de colonias. Para determinar el número de microorganismos se utilizó la ecuación # 2.
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3.2.2. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
3.2.2.1. Bacterias
Para el aislamiento de las bacterias se utilizó la técnica de siembra en estría en agar MRS (Figura 6), que fue descrita por Yousef & Carlstrom (2003). Para confirmar la obtención del cultivo puro se realizó tinción Gram.
Figura 6. Inoculación en estría.
(Yousef & Carlstrom, 2003)
3.2.2.2. Levaduras
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3.2.2.3. Mohos
Para el aislamiento de los mohos se realizó la técnica de depósito. Con el asa de aguja previamente esterilizada en el mechero se hizo una punción en el centro del moho y mediante picadura se depositó en la placa.
3.3. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
3.3.1. BACTERIAS
De acuerdo a los resultados obtenidos en la tinción Gram (forma y coloración), las bacterias fueron separadas en grupos y se realizó una marcha microbiológica para su identificación de acuerdo a lo recomendado por Bergey, Krieg & Holt (1984). En la Tabla 2 se resumen las principales pruebas bioquímicas realizadas en función de la clasificación previa a nivel de morfología.
Tabla 2. Pruebas Bioquímicas realizadas a las bacterias.
Bacterias Morfología Tinciones Pruebas Bioquímicas
Descripción
Gram +
Cocos Tinción
Gram
Catalasa Determina la presencia de enzima catalasa.
NaCl Determina la capacidad de los microorganismos para sobrevivir en medios salinos.
Hemólisis Determina la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos.
Bacilos Tinción
Gram Tinción para endospora s Prueba de Anaerobiosis
Determina si los microorganismos son anaerobios estrictos o no.
Catalasa Determina la presencia de enzima catalasa.
TSI Determina la capacidad de los microorganismos para: Fermentar la
glucosa, lactosa y sacarosa. Producción de gas y ácido sulfúrico.
33 Manitol Determina la capacidad de los
microorganismos para sobrevivir en medios salinos.
Hidrólisis de Almidón
Determina la capacidad de hidrolizar el almidón.
Gram -
Cocos Tinción
Gram
Catalasa Determina la presencia de enzima catalasa.
Manitol Determina la capacidad de los microorganismos para sobrevivir en medios con altas concentraciones de sal.
Hemólisis Determina la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos.
Bacilos Tinción
Gram
Oxidasa Determina presencia de citocromo C oxidasa.
Rojo de metilo Determina la capacidad de formación de ácido a partir de la glucosa.
V.P Determina la formación de acetoína a partir de la fermentación de la glucosa.
Uso del citrato Determina la capacidad de los microorganismos para usar citratocomo única fuente de carbono y energía
Indol Determina la capacidad de producción de la enzima triptofanasa.
H2S Determina la capacidad de
producción de ácido sulfhídrico.
Motilidad Determina la movilidad de cada microorganismo.
Lisina
descarboxilasa
Determina la presencia de las enzimas decarboxilasa y desaminasa en los microorganismos para el consumo de la glucosa. Ureasa Determina la capacidad para
hidrolizar la urea con la producción de amoníaco.
Fermentación
de azúcares
Determina la capacidad de los microorganismos para: Fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa. Producción de gas y ácido sulfúrico.
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3.3.2. LEVADURAS
Para la Identificación de levaduras se utilizó el kit de identificación API 20C AUX. Se siguieron las recomendaciones del proveedor como se detalla a continuación:
Se realizó una suspensión de cada levadura en un tubo con 3 ml de NaCl al 0,85 % hasta obtener un grado de turbidez de McFarland 2, a esta suspensión se le dio el nombre de API Suspensión Medium, luego con ayuda de una micropipeta se depositó 100 µl de API Suspension Medium en una ampolla de API C Medium. Se llenó las cúpulas del kit con API C Medium, y para obtener un ambiente húmedo en la cámara, se llenó las cúpulas adversas con agua destilada, se tapó la cámara y se incubó a 30 ºC por un tiempo de 72 horas. Para la interpretación de los resultados se comparó las cúpulas con la cúpula control. Si las cúpulas se reflejaban turbias el resultado era positivo (+) y negativo si las cúpulas no tuvieron ningún cambio. Estas interpretaciones colocaron en la hoja de resultados y se sumó todas las pruebas que dieron positivas dando al final un código para cada colonia. Este código se insertó en el programa proporcionado por BIOMÉRIEUX y de esta manera se determinó el nombre de la levadura.
3.3.3. MOHOS
Se colocó una gota del colorante azul de metileno en un portaobjetos, la muestra se tomó de la superficie de una colonia de moho con ayuda de un trozo de cinta adhesiva, se colocó la cinta en la gota de colorante añadido previamente y se examinaron las placas en el microscopio.
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3.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
36
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. RECUENTOS MICROBIOLÓGICOS EN LAS TRES
ETAPAS DE PRODUCCIÓN DEL CHAGUARMISHQUI
En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos en los recuentos microbianos de coliformes, bacterias ácido lácticas y levaduras en las etapas inicial, fermentativa y final de elaboración de la bebida.
Se encontraron diferencias significativas para cada uno de los indicadores microbiológicos evaluados en las tres etapas. Para bacterias ácido lácticas y levaduras los valores más altos se encontraron en la etapa fermentativa mientras que en el caso de los coliformes totales el valor más alto se reportó en la etapa inicial.
Tabla 3. Recuentos microbianos de la bebida Chaguarmishqui en las tres etapas de fermentación de la bebida.
Microorganismo
Recuentos en cada etapa fermentativa (log UFC/ml)
Inicial Fermentativa Final
Coliformes 6.1 ± 0.27c 2.87 ± 0.48b <10a
Acido Lácticas 7.66 ± 0.13a 8.33 ± 0.12b 8.30 ± 0.12b
Levaduras 5.82 ± 0.13b 6.42 ± 0.25c 0.81 ± 0.02a
37 En la etapa fermentativa se observó una disminución significativa de coliformes; según Abegaz (2007) la desaparición de coliformes se debe a la disminución del pH en la bebida alcohólica, provocada por la formación de ácido láctico en el proceso de fermentación. En la etapa final de fermentación se observó una inhibición total de coliformes, esto se atribuye a la presencia de bacteriocinas producidas por algunas bacterias ácido lácticas que actúan como inhibidores activos frente a microorganismos patógenos, evitando su crecimiento (Yousef & Carlstrom, 2003).
La presencia de bacterias ácido lácticas fue muy alta en las tres etapas de fermentación, los recuentos obtenidos en la etapa inicial fueron significativamente diferentes a los obtenidos en la etapa fermentativa y final. En la etapa inicial se obtuvo una alta presencia de bacterias ácido lácticas, y claramente se atribuyó esto a que dichas bacterias son ácido tolerantes y viven naturalmente en medios con pH bajos y altos y ricos en azúcares (Ramírez, Rosas, Velásquez, Ulloa, & Romero, 2011). Por último se obtuvieron concentraciones altas y muy similares de bacterias ácido lácticas en las últimas etapas (fermentativa y final).
En relación a los recuentos de levaduras en la etapa inicial y fermentativa se obtuvieron valores medios de concentración; existiendo una diferencia de 0.5 Log UFC/ml entre las dos etapas, esto se atribuye a que las levaduras son microorganismos que viven en medios ricos en azúcares y utilizan este sustrato como fuente principal de energía; por esta razón en la primera etapa de fermentación en la cual hay una gran variedad de azúcares es donde se producen más levaduras (Ajay & Sanjay, 2008).
38 especie Saccharomyces cerevisiae (López, Ramírez, Mambuscay, & Osorio, 2010).
Según Verapinto (2009) la poca presencia de levaduras se debe a una graduación alcohólica alta, ya que el alcohol a partir de los 13ºGL tiene un efecto tóxico sobre las levaduras inhibiendo su crecimiento. Además pierden la viabilidad celular en presencia de etanol, esto inhibe el consumo de azúcares y altera el pH del medio (Villar, 1992).
4.2. IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE BACTERIAS
A lo largo de las tres etapas se encontraron 53 cepas de bacterias que se especifican en la Tabla 4. Las especies dominantes fueron Corinebacterium
y Bacillus y bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus, que
correspondieron a las especies: Lactobacillus casei y Lactobacillus
delbruecki; en cuanto a bacilos negativos, de las 7 cepas aisladas se
encontraron microorganismos como: Yersinia mollareti, Proteus penneri,
Pseudomonas spp y Aeromonas spp. Por otro lado se encontraron 11 cepas
de cocos positivos, entre estos: Streptococcus spp. Enterococcus spp. y
Staphylococcus aureus.
Tabla 4. Especies de bacterias identificadas a los largo de las tres etapas fermentativas de la bebida Chaguarmishqui.
Bacterias Nº de cepas Especies identificadas
Bacilos
Gram + 35
Lactobacillus casei Lactobacillus delbruecki Corinebacterium Bacillus Gram - 7 Pseudomonas spp Aeromonas spp Yersinia mollareti Proteus penneri
Cocos Gram + 11
39 Con respecto a Lactobacillus delbruecki, su presencia en la bebida fermentada Chaguarmishqui es muy común. En estudios realizados por Ramírez (2010) se han encontrado cepas de Lactobacillus delbrueckii utilizadas para el estudio del efecto prebiótico en el aguamiel de maguey; así como también en bebidas fermentadas como el pozol de maíz (Nabil & Ampe, 2000); y en la bebida fermentada ¨Borde¨ originaria de Etiopía (Abegaz, 2007). Este microorganismo es un iniciador potencial para la fermentación del Chaguarmishqui por ser parte de la microflora nativa de esta bebida. Lactobacillus delbruecki se ha utilizado para la producción a de ácido láctico a gran escala, sometido también a mutagénesis para aumentar su tolerancia a este compuesto (Cock & Rodríguez-de Stouvenel, 2005) así como también es utilizado en la industria de lácteos por su termoresistencia al lograr sobrevivir a los 41 ºC (Gouesbet, Jan, & Boyaval, 2001). Por otro lado, se ha encontrado Lactobacillus casei en bebidas probióticas originarias de México como el agua miel, formando parte de la flora nativa de esta bebida (Escalante, 2014). Este microorganismo permanece viable en rangos de pH de 3.0 a 7.0, su presencia es natural en la leche, carne y vegetales fermentados, así como también se encuentran en el ambiente y en el intestino humano (Villavicencio, 2006).
40 presentes en ecosistemas dulceacuícolas, en el agua, el suelo y los alimentos, especialmente en la carne, pescado y la leche. Su presencia en la bebida no es deseable ya que generan infecciones en el ser humano (González, Torres, Chiroles, Valdés, & Domínguez, 2004). El género de las
Pseudomonas spp viven en ambientes acuáticos y pueden encontrarse en
las heces, el suelo y aguas residuales, puede ser esta la razón por la que estos microorganismos se encuentran en la bebida, sin embargo su presencia se dio en la etapa fermentativa y final por lo que puede causar diversos tipos de infecciones pero rara vez causa enfermedades graves en personas sanas (Ruiz, 2007).
41
Figura 7. Especies Identificadas en las tres etapas fermentativas (100x).
a) Lactobacillus delbruecki b) Yersinia mollareti c)Enterococcus spp y
d) Staphylococcus aureus.
4.3. CEPAS FÚNGICAS
En la Tabla 5 se puede observar las levaduras encontradas en las diferentes etapas de fermentación de la bebida Chaguarmishqui, siendo las principales: Candida krusei, Candida inconspicua, Saccharomyces cerevisiae 1, Kloeckera spp, Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa 1, Candida
kefyr, Candida famata y Cryptococcus laurentii.
Tabla 5. Cepas Identificadas de Levaduras y Mohos a lo largo de las tres etapas fermentativas de la bebida Chaguarmishqui.
Grupo Nº cepas Especies Identificadas
Rhodotorula mucilaginosa Candida inconspicua
Saccharomyces cerevisiae 1 Kloeckera spp
a b
c d
42
Levaduras 17 Rhodotorula minuta
Candida krusei Candida Kefyr Candida famata Cryptococcus laurentii Rhodotorula mucilaginosa 1
Mohos 2 Penicillum
Byssochlamys nivea westling
Saccharomyces cerevisiae se ha encontrado en bebidas como: aguamiel y
pulque; posee enzimas que transforman los azúcares en etanol y otros metabolitos secundarios que son responsables del perfil sensorial de la bebida (Herrera, Lappe, & Wacher, sf) , así como también suele metabolizar varios sustratos como granos (maíz húmedo, soja, entre otros). Su presencia es muy conocida y común en las bebidas fermentadas espontáneas o inoculadas; siendo una de las levaduras de mayor interés a nivel comercial en la industria alimentaria, ya que produce y tolera altas concentraciones de etanol y sintetiza compuestos volátiles a los cuales se les atribuye el sabor y aroma del producto final (López, Ramírez, Mambuscay, & Osorio, 2010). En un estudio realizado por Estrada y otros (2011); se aislaron e identificaron levaduras como Saccharomyces cerevisiae y varias especies de Candida spp en dos bebidas fermentadas: agua miel y el pulque, como levaduras propias de la flora natural que actúa como iniciador de la fermentación de estas bebidas.
Según estudios realizados por Caballero, López, Rodríguez, Zajonskovsky, & Van Broock (1998) y Querol & Fleet (2006), Saccharomyces cerevisiae desempeña un papel muy importante en la transformación del mosto de uva en vino y en la fermentación de sidra de manzana, proporcionándoles el sabor y aroma característico; existiendo varias especies de levaduras asociadas a los procesos fermentativos en los mostos de uvas y manzanas; entre estas Saccharomyces cerevisiae, Kloeckera spp y varias especies de
43 Levaduras como Kloeckera spp estuvieron presentes en investigaciones realizadas en diferentes especies de guayabas procedentes de un área forestal y una rural en Río de Janeiro; se determinó que la presencia de esta levadura se da en frutos caídos en ambientes tropicales y con mayor frecuencia en las uvas (Abranches, Vital, Starmer, MendonÇa-Hagler, & Hagler, 2000), la presencia de este tipo de levaduras (Figura 8) se podría atribuir a la contaminación externa de diversas plantas frutales presentes en la zona.
Rhodotorula y Cryptococcus se encuentran en frutas no maduras como la
piña, ubicadas en zonas forestales (Robbs, Hagler, & Mendoca-Hagler, 1989). Según estudios realizados en Brasil por Aragão Insuellas , Gomes, Mendonça-Hagler, & Hagler (1998) levaduras como Cryptococcus laurentii,
Rhodotorula mucilaginosa y Rhodotorula minuta se han encontrado aislados
en fuentes ricas en azúcares como las hojas de caña de azúcar, tallos y rizosfera durante las diferentes etapas de crecimiento de la planta. Así como también se ha identificado Candida krusei, Candida famata, Saccharomyces
cerevisiae 1 como microorganismos nativos de la microflora implicada en la
fermentación del Tapai(Chiang, 2008).
Las especies Candida spp. se encuentran comúnmente en verduras frescas, procesadas, y ensaladas (Martorell, 2006). Candida inconspicua,
Saccharomyces cerevisiae y Candida kefyr son levaduras encargadas de la
fermentación de la lactosa, levaduras específicas que juegan un papel importante en la formación del sabor y aroma del kéfir (Beshkova, y otros, 2002).
También se encontraron levaduras como Cryptococcus laurentii, Candida spp. Saccharomyces cerevisiae, Candida, Rhodotorula minuta y Rhodotorula
mucilaginosa, en estudios microbiológicos de la bebida fermentada Cauim,
44 filosfera de numerosos ecosistemas y en la materia fecal de aves sanas (Ramos, 2008).
Byssochlamys nivea se encuentran en frutos y bebidas ricas en azúcares así
como también en jugos y néctares de piña, tiene gran resistencia a altas temperaturas, a la presencia de azúcares, grasas, ácidos y sobreviven a pH muy bajos (Beuchat & Toledo, 2009; Rocha Ferreira, y otros, 2005). Por otro lado, las especies de Penicillum spp están distribuidas en la naturaleza encontrándose en el suelo, la vegetación caída, el aire y el suelo, siendo el contaminante mayoritario de frutas, verduras y cereales. Sin embargo se establece que tanto Penicillum spp como Byssochlamys nivea contaminan principalmente las manzanas y los productos a base de manzanas (Carbajo, 2004).
Figura 8. Especies de Mohos y levaduras encontradas en las tres etapas fermentativas (100x)
a) Penicillum sppb) Byssochlamys níveac) Candida kefyr d) Kloeckera spp.
a b
45
4.4. DIVERSIDAD DE POBLACIONES MICROBIANAS EN LAS
ETAPAS DE FERMENTACIÓN
En la Tabla 6 se pueden observar las especies de levaduras, bacterias ácido lácticas y mohos identificadas en todas las etapas de fermentación (inicial, fermentativa y final); Lactobacillus delbruecki y la levadura Candida kefyr estuvieron presentes a lo largo de todo el proceso fermentativo.
Tabla 6. Especies identificadas a lo largo de cada etapa fermentativa de la bebida Chaguarmishqui.
Tipo de
microorganismo
Nº de cepas aisladas totales
Nº de cepas por etapa fermentativa
Especies Identificadas
Levaduras 17 Etapa 1 3 Candida kefyr
Candida krusei
Saccharomyces cerevisiae 1
Etapa 2 6 Candida kefyr Kloeckera spp Rhodotorula minuta Cryptococcus lauretii Candida famata Etapa 3 8 Candida kefyr
Candida inconspicua Rhodotorula
mucilaginosa 1 Candida krusei Cryptococcus laurentii
Ácido Lácticas 18 Etapa 1 10 Lactobacillus casei
Lactobacillus delbruecki
Etapa 2 1 Lactobacillus delbruecki
Etapa 3 7 Lactobacillus casei Lactobacillus delbruecki
Mohos 2 Etapa 1 2 Penicillum
Byssochlamys nívea westling
46 En la etapa inicial se obtuvo la presencia de levaduras como Candida kefyr
Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae 1, en la etapa de fermentación se
encontró a Candida kefyr, Kloeckera spp, Rhodotorula minuta, Cryptococcus lauretii y Candida famata y por último en la etapa final se encontró a
Candida kefyr, Candida inconspicua, Rhodotorula mucilaginosa 1, Candida
krusei, y Cryptococcus lauretii. La presencia de especies como Candida
kefyr en las tres etapas se atribuye a que son levaduras resistentes a niveles
altos de acidez al ser utilizado en la producción de alimentos ácidos como bebidas de leches fermentadas (Zumbado, 2005).
En cuanto a las bacterias ácido lácticas identificadas se encontró
Lactobacillus delbruecki en las tres etapas y únicamente Lactobacillus casei
