INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ
EVALUACIÓN DE LA SOBREEXPRESIÓN DE
GENES DEL METABOLISMO CENTRAL DE
Escherichia coli ETANOLOGÉNICA USANDO
XILOSA COMO FUENTE DE CARBONO
OPCIÓN III
PROYECTO DE INVESTIGACIÒN
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOQUÍMICO
P R E S E N T A
JOSÉ UTRILLA CARRERI
METABOLISMO XILOSA COMO
El presente trabajo se realizó bajo la dirección del
Dr. Alfredo Martínez Jiménez
en el Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis
del Instituto de Biotecnología
de la Universidad Nacional Autónoma de México.
Para la realización del mismo se contó con el financiamiento
del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
A mi Familia por su apoyo en todos los sentidos.
A Mara por estar conmigo y el apoyo en todo momento.
Al Dr. Alfredo Martínez Jiménez por aceptarme en su laboratorio para realizar esta estancia, por su asesoria y por todas sus atenciones.
Al M.C. Gerardo Huerta Beristain por toda su ayuda en la realización de este trabajo. A la M.C. Lucia Maria Cristina Ventura Canseco por darme la oportunidad de participar en el VIII Verano de la Investigación del Pacifico
A mi comité de Evaluación:
Dr. Federico Antonio Gutiérrez Miceli M.C. Julio Evaristo Ballinas Díaz IBQ. Javier Ramírez Díaz
Por sus consejos para la realización de presente trabajo.
A mis compañeros de Generación por su apoyo y amistad durante la realización de la carrera.
ÍNDICE DE FIGURAS. ...viii
ÍNDICE DE TABLAS. ... ix
NOMENCLATURA. ... x
Resumen... 1
1.-INTRODUCCIÓN ... 2
1.1 Energía a partir de fuentes renovables... 2
1.2 Etanol ... 3
1.3 Potencial para la producción de Etanol a partir de residuos agroindustriales. .. 5
2.- ANTECEDENTES... 8
2.1 Organismos etanologénicos silvestres. ... 9
2.1.1 Saccharomyces cerevisiae ... 9
2.1.2 Zymomonas mobilis ... 9
2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli... 10
2.2.1 Escherichia coli KO11 ... 11
2.2.2 Evaluación de E.coli B y KO11 en medio mínimo-glucosa... 13
2.3 Puntos de Regulación de la Glucólisis ... 15
2.4 Comparación de la expresión de genes glicolíticos en KO11... 15
2.5 Sobreexpresión de genes del metabolismo central de carbono como una estrategia para aumentar el flux glicolítico en E. coli etanologénica... 18
2.6 Evaluación de la sobreexpresión de genes usando glucosa como fuente de carbono... 19
3.-PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO ... 20
4.- HIPÓTESIS... 21 5.- OBJETIVOS... 22 OBJETIVO GENERAL... 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ... 22 6.- METODOLOGÍA ... 23 6.1 Cepas ... 23
6.2.3 Condiciones de cultivo. ... 24
6.3 Métodos analíticos... 26
6.3.1 Concentración celular ... 26
6.3.2 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos... 26
6.3.3 Determinación de etanol. ... 27
6.3.4 Determinación de proteínas y actividades enzimáticas... 27
6.4 Evaluación de parámetros. ... 28
6.5 Análisis de resultados... 28
7.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 29
7.1 Evaluación de E. coli B y KO11 en medio mineral-xilosa y de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. ... 29
7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos entre E. coli B y KO11 creciendo en medio mineral-xilosa ... 29
7.1.2 Valores de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm en cepas transformadas de KO11. ... 35
7.2 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en la fase de crecimiento exponencial ... 37
7.2.1 Efecto sobre la velocidad específica de crecimiento... 37
7.2.2 Efecto sobre la velocidad específica de consumo de Xilosa... 39
7.2.3 Efecto sobre la velocidad especifica de producción de etanol y ácidos orgánicos. ... 41
7.3 Efecto de la sobreexpresión de galPEc, pfkEc, pgkEc, pykBs y pdcZm en E. coli KO11 durante la fase estacionaria ... 43
7.3.1 Efecto sobre la velocidad especifica de consumo xilosa, de formación de etanol y sobre la producción de ácidos acético, fórmico y láctico. ... 43
7.4 Análisis de flujos y balance de carbono... 46
7.5 Efecto sobre el rendimiento de conversión de xilosa en etanol ... 49
8.- CONCLUSIONES ... 50
11.1 Método de Azúcares reductores (DNS) ... 60
11.2 Ensayos Enzimáticos... 60
11.3 Evaluación de parámetros ... 64
11.3.1 Corrección por factor de dilución... 64
11.3.2 Calculo de la velocidad específica de crecimiento... 64
11.3.3 Cálculo de rendimientos y de formación de productos... 65
11.3.4 Cálculo de la velocidad específica de consumo de azúcar y de formación de productos. ... 65
11.3.5 Cálculo de flujos y balance de carbono... 66
11.4 Datos de curvas de calibración... 66
11.5 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar, producción de etanol, y ácidos orgánicos. ... 67
Figura 1.3.1 Proceso para obtener etanol a partir de residuos agroindustriales con el
uso de microorganismos mejorados genéticamente. ... 6
Figura 2.1 Composición de la lignocelulosa. ... 9 Figura 2.2.1Metabolismo de pentosas y hexosas en E. coli KO11 en condiciones
anaeróbicas... 12
Figura 2.3.1 Esquema de la glicólisis y la desviación de piruvato a etanol, incluyendo
la regulación enzimática, consumo y generación de ATP y NAD, y cambios de ∆G´°. ... 16
Figura 2.4.1 Análisis de sobreexpresión de genes de la vía glicolítica en condiciones
anaeróbicas con la cepa etanologénica KO11 en xilosa... 17
Fig. 6.2.1 Sistema de Minifermentadores o Fleakers... 25 Figura 7.1.1 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y producción de etanol y
ácidos orgánicos para E. coli B y KO11, cultivadas en condiciones anaeróbicas en medio mineral 4% xilosa. ... 31
Figura 7.1.3 Comparación de actividades enzimáticas de las construcciones
evaluadas con la cepa control... 36
Figura 7.2.2 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la
cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm... 40 Figura 7.2.3 Comparación de velocidades específicas de producción de etanol,
acético, láctico y fórmico en la cepa KO11 (Ec B: E. coli B y C: cepa control) sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm ... 41 Figura 7.3.1 Comparación de la velocidad especifica de consumo de xilosa en la
cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm... 45 Figura 7.3.2 Comparación de la velocidad especifica de producción de etanol en la
cepa KO11 sobreexpresando GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm... 45 Figura 11.5.1 Cinéticas de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la
cepas; A) control KO11/pTrcA, B) KO11/pTrcgalPEc, C) KO11/pTrcpfkEc, D)
KO11/pTrcpgkEc... 68 Figura 11.5.2 Cinética de Consumo de xilosa, producción de etanol y biomasa de la
cepas: A) KO11/pTrcpykBs, B) KO11/pTrcpdcZm, C) KO11, y D) E. coli B... 69 Figura 11.5.3 Cinética de producción de ácido acético y ácido láctico para las cepas
evaluadas... 70
Figura 11.5.4 Cinética de producción de ácido fórmico y ácido succínico para las
Tabla 1.2.1 Ventajas de la utilización del etanol como oxigenante y combustible ... 4 Tabla 2.2.1 Productos de fermentación reportados para KO11 y E. coli B bajo
diferentes condiciones. ... 13
Tabla 2.2.2 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E.
coli B y KO11 en medio mineral - glucosa. ... 14
Tabla 7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E.
coli B y KO11. ... 32
Tabla 7.5.1 Rendimiento de conversión de xilosa en etanol respecto al teórico,
resultado de la sobreexpresión de genes del metabolismo de E. coli etanologénica. Los datos mostrados son el promedio de dos replicas con su respectivo error estándar ... 49
Tabla 11.4.1 Curva de calibración de azúcares, glicerol y etanol. ... 66 Tabla 11.4.2 Curvas de calibración de ácidos orgánicos... 67
Símbolo Definición
Amp Ampicilina
cat Gen que codifica la enzima cloramfenicol acetiltransferasa
Cm Cloramfenicol
CmR Cloramfenicol resistente
DOnm Densidad óptica a determinada longitud de onda E. coli Escherichia coli
HPLC Cromatografía líquida de Alta Resolución (por sus siglas en ingles: High Performance Liquid Chromatography)
IPTG Inductor gratuito de la expresión del operón de lactosa (isopropil ß-D-tiogalactopiranósido)
KOH Hidróxido de potasio
Km Constante de Michaelis-Menten
lacIq Gen que codifica la proteína del operón de lactosa. El promotor de este gen lleva una mutación puntual en la caja – 35 que cambia una C por una T en la posición 5; lo cual provoca un incremento en la expresión a partir de este promotor, que se traduce en aproximadamente 10 veces más concentración del represor
LB Medio de cultivo Luria-Bertani
P Promotor ó Producto
p Plásmido
PTS Sistema de la fosfotransferasa
S Sustrato, fuente de carbono, azúcares: glucosa o xilosa trc promotor híbrido que contiene la región regulatoria –35 de trp
y la región correspondiente a la caja –10 del promotor lacUV5 TCA ciclo de los ácidos tricarboxílicos
:: Inserción
Enzima Gen Definición
ACK ack Acetatocinasa
ADH y ADH II adh y adhB Alcohol deshidrogenasa
homóloga y heteróloga
ALDH aldh Acetaldehído
deshidrogenasa
ENO eno Enolasa
FBA fbaA Fructosa-1,6-bis-fosfato
aldolasa
FHL fhl Formato hidrogenoliasa
FRD frd Fumarato reductasa
FUM fum Fumarasa
Gal P galP Galactosa permeasa
GAPDH gapdh Gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa GLK glk Glucocinasa GPDH Gpdh Glicerol fosfato deshidrogenasa LDH ldh Lactato deshidrogenasa MDH mdh Malato deshidrogenasa PDC pdc Piruvato decarboxilasa PDH pdh Piruvato deshidrogenasa PFK pfk Fosfofructo cinasa
PFL pfl Piruvato formato liasa
PGI pgi Fosfoglucosa isomerasa
PGK pgk Fosfoglicerato cinasa
PGM yip Fosfogliceratomutasa
PPC ppc Fosfoenolpiruvato
carboxilasa
PTA pta Fosfotransacetilasa
PYK pykA, pykF Piruvato cinasa
RPE rpe Ribosafosfato epimerasa
TPI tpiA Triosafosfato isomerasa
Metabolito Definición
AcAld Acetaldehído
ADP Adenosin difosfato
AMP Adenosin monofosfato
ATP Adenosin trifosfato
CoA Coenzima A DHAP Deoxiarabinoheptolosona to-7-fosfato EtOH Etanol F-6-P Fructosa-6-fosfato F-1,6-BP Fructosa-1,6-bifosfato GA1,3DP Gliceraldehído-1,3-difosfato GA3P Gliceraldehído-3-fosfato G6P Glucosa-6-fosfato Glc Glucosa Lac Lactato NAD+ Nicotin-adenin dinucleotido oxidado NADH+H Nicotin-adenin dinucleotido reducido PEP Fosfoenolpiruvato Pi Fosfato inorgánico 2PG 2 fosfoglicerato 3PG 3 fosfoglicerato PTA Fosfotransacetilasa PIR Piruvato Xil Xilosa
Símbolo Definición Unidades
µ Velocidad específica de
crecimiento. h
-1
DG´° Energía libre de Gibbs KJ/mol
DCW Peso seco de células (por sus siglas en inglés: Dry Cellular Weight).
gDCW/l qP Flux (velocidad específica) de
formación de producto. g
P/gDCW.h qS Flux (velocidad específica) de
consumo de sustrato. g
S/ gDCW .h UI Unidades internacionales de
actividad enzimática µmoles
SUSTRATO transformados/min XMAX Biomasa máxima alcanzada
durante la fase de crecimiento exponencial.
gDCW/l YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/ gS YX/S Rendimiento biomasa / sustrato. gDCW/ gS YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/ gS
SUBINDICES Bs Bacillus stearothermophilus Ec Escherichia coli Glc Glucosa Xyl Xilosa Zm Zymomonas mobilis
Resumen.
El futuro agotamiento del petróleo plantea la necesidad de producir combustibles a partir de materiales renovables. Los hidrolizados de residuos agroindustriales proporcionan grandes cantidades de azúcares que pueden ser convertidos en etanol por cepas de Escherichia coli modificadas por ingeniería metabólica. Después de la glucosa, la xilosa es el azúcar más abundante en dichos hidrolizados, por tal razón en este estudio se llevó a cabo empleando xilosa como fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Se evaluó el efecto de sobreexpresar genes del metabolismo central de E. coli etanologénica KO11 (la cual contienen los genes pdc y adhII de Zymomonas mobilis integrados al cromosoma), sobre la velocidad específica (flux) de formación de etanol. K011 se transformó con derivados del vector pTrc99A conteniendo genes homólogos (Ec= E. coli) y heterólogos (Bs= Bacillus stearothermophilus, Zm= Z. mobilis), que codifican para las enzimas: permeasa de galactosa (GALPEc), fosfofructo cinasa (PFKEc), fosfoglicerato cinasa (PGKEc), piruvato cinasa (PYKBs) y piruvato decarboxilasa (PDCZm).
Los resultados obtenidos muestran que en KO11: 1) la sobreexpresión de galpEc o pgkEc no afecta su comportamiento fisiológico; 2) la sobreexpresión de pfkEc o pykBs ocasiona decrementos en el flux de formación de consumo de xilosa y de formación de etanol; 3) como respuesta a un incremento en la disponibilidad de piruvato y actividad limitante de PdcZm en la formación de etanol, el incremento en la actividad de pykBs origino un aumento en la producción de ácido láctico; y 4) de manera relevante con la sobreexpresión de PdcZm se lograron incrementar los flujos de consumo de xilosa y de
formación de etanol, así como una marcada reducción en los flujos de síntesis de ácidos orgánicos, como consecuencia se logró incrementar el rendimiento teórico de conversión de xilosa en etanol de 60% a 80%. Los resultados obtenidos permiten plantear la sobreexpresión simultánea de pdcZm con pfkEc o pykBs para mejorar el rendimiento de etanol y los flujos glicolítico y de formación de etanol en KO11.
1.-INTRODUCCIÓN
1.1 Energía a partir de fuentes renovables
En el contexto actual de incrementos de precios, disminución de reservas y falta de certeza en el suministro del petróleo; la necesidad de conservar y buscar nuevas fuentes de energía se ha convertido en una necesidad para las principales actividades de la humanidad. Entre las posibles opciones para obtener fuentes alternas de energía, destaca la obtención de energía a partir de biomasa (residuos agroindustriales o energía almacenada en forma de carbohidratos en material vegetal) es una opción que ha recibido atención especial en varias partes del mundo. La biomasa es una fuente de energía que tiene varias ventajas, no obstante su característica renovable es el punto clave. Los equipos y sistemas diseñados por los humanos para colectar y almacenar energía solar son costosos e ineficientes si se les compara con el almacenamiento de energía en la biomasa mediante la fotosíntesis. La biomasa también tiene una versatilidad única, la lista de especies de plantas, sub-productos y materiales de desecho que pueden ser utilizados es casi interminable. Con las tecnologías que actualmente se encuentran en desarrollo, se podrán producir combustibles renovables, que sustituyan a los combustibles fósiles en gran parte de sus roles actuales (Martínez et al., 2002).
Los intentos para utilizar a la biomasa como fuente de energía no es nueva, los combustibles tales como madera, carbón, rastrojos etc., han sido empleados como fuente de calor durante miles de años. De hecho en nuestros días, en los países en vías de desarrollo, una gran parte de las personas usan formas de energía relacionadas con la biomasa, siendo ésta la principal fuente de energía que consumen.
1.2 Etanol
Probablemente uno de los retos más difíciles de la presente búsqueda de sustitutos de combustibles derivados del petróleo son los carburantes líquidos alternos. La producción de etanol a partir de la biomasa es una de las pocas opciones que es viable actualmente (Mielenz, 2001). Existen tecnologías que están en proceso de maduración; se pueden utilizar una gran variedad de materias primas; y el etanol producido es un compuesto valioso y versátil, ya que puede ser utilizado como oxigenante, carburante, solvente o ser transformado, mediante tecnologías ya establecidas, en otros combustibles (p. ej. biodiesel) (Bungay, 2004).
El programa más grande de producción de etanol por tecnologías biológicas sustentables ha sido desarrollado por Brasil. La producción de etanol ha sido promovida desde 1975, cuando el Programa Nacional de Alcohol (Pro-alcohol) fue establecido con el fin de reducir el déficit generado por las compras de petróleo y por las alzas del precio de éste durante la década de los setentas. En ese país en 1981 mas de 450 000 automóviles funcionaban con etanol anhidro o etanol al 96% (Vergara y Castello-Branco, 1981). Hoy en día, Brasil produce más de 15 mil millones de litros de etanol al año y el 40% de los automóviles que circulan emplean mezclas de gasolina-etanol que contienen 95% (v/v) de gasolina-etanol (combustible conocido como E95), el resto utiliza mezclas que contienen 22% (v/v) del mismo alcohol.
El etanol puede ser usado para una gran variedad de aplicaciones, la principal aplicación discutida en esta tesis es la de carburante líquido que permita oxigenar, sustituir o complementar a los combustibles fósiles que actualmente se utilizan en los motores de combustión interna. Otras aplicaciones del etanol son como combustible en calderas industriales, lámparas, estufas, turbinas, etc.
Comparados en términos volumétricos, el contenido energético del etanol es de aproximadamente dos tercios de la energía contenida en la gasolina o diesel. Sin
embargo, el etanol tiene un alto valor de número de octano, lo cual ocasiona que los motores que usan mezclas gasolina-etanol tengan una mejor eficiencia. Las mezclas que contienen hasta un 22% (v/v) de etanol pueden ser usadas exitosamente en los motores a gasolina actuales, esto es sin la necesidad de realizar modificaciones a los motores de combustión interna.
Otra alternativa de uso del etanol es la de oxigenante. Con el fin de mejorar la combustión y reducir los niveles producidos de monóxido de carbono, las gasolinas necesitan elevar su octanaje sin utilizar plomo, para ello se han venido usando alcoholes y ésteres. Actualmente en México se usan los éteres de terbutilo, de los cuales el metil terbutil éter (MTBE) es el más utilizado. No obstante, hoy día se sabe que estos compuestos se pueden acumular en los mantos freáticos, que son recalcitrantes a la degradación química o biológica, y que en concentraciones de partes por millón son cancerígenos para los humanos. Cabe señalar que en el año 2000 el gobierno del estado de California (EUA) prohibió su uso y su completa sustitución en el 2003, y que dicha prohibición fue prolongada para el año 2005. El uso de etanol en mezclas con gasolina ha sido evaluado por investigadores del Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) y cumple con los requisitos de un oxigenante de alta calidad (Schifter et al., 2001). En la Tabla 1.2.1 se muestran las ventajas que el etanol tiene como oxigenante de la gasolina con respecto al MTBE.
Tabla 1.2.1 Ventajas de la utilización del etanol como oxigenante y combustible
•Mayor octanaje que la gasolina
•Biodegradable
•En mezclas gasolina-etanol sustituye el uso de oxigenantes
•No es cancerígeno
•Alto contenido de oxígeno (34.8%) •Reducción de emisiones de CO2 •Renovable
1.3 Potencial para la producción de Etanol a partir de residuos agroindustriales.
El etanol puede ser obtenido de materiales renovables como la sacarosa de caña, de remolacha, melazas, suero de leche, almidones, cereales (maíz, trigo, sorgo o cebada) en los cuales, previo tratamiento de la materia prima, la glucosa es la fuente de carbono que las levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizar a manera de sustrato para crecer, obtener energía y producir etanol. Otra alternativa es la utilización de materiales lignocelulósicos (residuos agroindustriales) que constituyen una fuente barata y viable, en los que se incluyen, entre otros, rastrojo de maíz, paja de arroz, papel, residuos de madera y bagazo de caña (Ingram et al., 1999).
En el caso de México, a diferencia de otros países como EUA, la obtención de Etanol a partir de maíz u otros cereales no es una alternativa viable, ya que además de que algunos son utilizados en el consumo humano no se producen en cantidades suficientes para cubrir las necesidades de alimentación del país. Tampoco la sacarosa proveniente de la caña de azúcar, y que en Brasil es utilizada en el programa ProAlcohol, constituye una materia prima alterna para nuestro país, debido a que la demanda requerida de etanol carburante es elevada (Martínez et al., 2002). Sin embargo, la biotecnología moderna posee herramientas que ofrecen alternativas, como la utilización de microorganismos mejorados genéticamente, que pueden degradar los desechos agroindustriales. Por esta razón se están planteando proyectos para aplicar y desarrollar tecnologías que permiten incorporar los residuos agroindustriales.
Figura 1.3.1 Proceso para obtener etanol a partir de residuos agroindustriales con el
uso de microorganismos mejorados genéticamente.
SSF: Sacarificación y Fermentación Simultánea. L/S: Líquido/Sólido.
Los residuos agroindustriales están constituidos por una gran cantidad de azúcares almacenados en forma de polímeros, los cuales al ser hidrolizados potencialmente pueden ser fermentados a etanol. La lignocelulosa esta compuesta de celulosa, hemicelulosa y lignina, en la figura 1.3.1 se muestra el proceso propuesto para la obtención de etanol a partir de residuos agroindustriales. En este diagrama, primero se genera un jarabe de hemicelulosa mediante la hidrólisis con ácido diluido. En el caso particular del bagazo de caña –residuo agroindustrial que es abundante en nuestro país-, éste está compuesto de 30-40% de hemicelulosa y de 30-50% de celulosa (Ingram et al., 1999). Específicamente, la hemicelulosa contiene, además de glucosa y manosa, un 85% de pentosas (Martínez et al., 2000; Martínez et al., 2001),
principalmente xilosa y pequeñas cantidades de arabinosa. Dicho jarabe no puede ser fermentado por los organismos etanologénicos silvestres como S. cerevisiae o Zymomonas mobilis, dado que estos microorganismos no tienen la capacidad de metabolizar pentosas (Hahn-Hagerdal et al., 1993). Por tal razón se ha hecho uso de la ingeniería de vías metabólicas para diseñar organismos que sean capaces de metabolizar pentosas y producir etanol con rendimientos cercanos al teórico.
Actualmente en México la industria azucarera tiene como subproducto 14.1 millones de toneladas de bagazo de caña al año, los cuales pueden ser convertidos con el uso de herramientas biotecnológicas en 7.05 millones de litros de etanol al día, que representaría aproximadamente el equivalente energético del 4.7% del mercado de gasolina consumida al día (Martínez et al., 2002). En consecuencia, en el Departamento Ingeniería Celular y Biocatálisis de la Universidad Nacional Autónoma de México se trabaja en un proyecto para producir etanol carburante a partir del bagazo de caña. En este proyecto se pretenden desarrollar biotecnologías y procesos químicos para convertir de manera eficiente ese residuo en etanol y aprovechar de forma integral la caña de azúcar. Además, dentro de este contexto, el uso del bagazo de caña podría ayudar a revitalizar la industria azucarera nacional y, por otro lado, a futuro se evitaría una crisis energética en México, pues ayudaría a aplazar el agotamiento de las reservas de petróleo en México, las cuales están estimadas para agotarse en el año 2025 – 2030 (PEMEX, 2002).
2.- ANTECEDENTES
La lignocelulosa representa aproximadamente el 90% del peso seco de la mayoría del material vegetal, es un recurso renovable en el cual se almacena la energía solar en forma de carbohidratos (celulosa, hemicelulosa, pectina, etc.; Figura 2.1.) o polímeros aromáticos (lignina) (Ingram et al., 1999). La celulosa, que constituye del 20 – 50 % del peso seco, es un homopolímero de celobiosa que a su vez es un dímero de glucosa. La hemicelulosa constituye del 20 – 40 % del peso seco, es un heteropolímero complejo que esta formado por una mezcla de pentosas (xilosa, arabinosa), hexosas (glucosa, manosa, galactosa), y grupos acetilo, entre otros. La pectina que constituye del 2 - 20% del peso seco es un homopolímero metilado del ácido poligalacturónico. Estos tres polímeros de carbohidratos son fuentes potenciales de azúcares que pueden ser fermentados para la producción de etanol. La lignina es un termoplástico biológico compuesto por residuos aromáticos que no puede ser fermentado a etanol, pero puede ser usado como combustible o bien como plástico biodegradable. Los polímeros de carbohidratos primero deben ser hidrolizados en azúcares solubles para poder ser fermentados. En contraste con el almidón, el cual es términos relativos es fácilmente despolimerizado (por calor y bajas cantidades de amilasas), la lignocelulosa ha evolucionado para proveer a la célula de una mejor protección contra bacterias u hongos, de esta forma se explica la dificultad para ser hidrolizada de forma eficiente por enzimas. Este hecho plantea la necesidad de realizar algún tratamiento químico o físico para facilitar la hidrólisis enzimática de la celulosa y hemicelulosa. No obstante la hidrólisis enzimática de la hemicelulosa es muy compleja y poco eficiente, pero se sabe que la hidrólisis con ácidos diluidos es el tratamiento que tiene mejores rendimientos. De esta manera, de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido (1-2%) a temperaturas de 120 – 200 oC se obtienen jarabes con concentraciones totales de azúcar en el intervalo de 70 – 110 g/l (Grohmann et al., 1985; du Prezz, 1994; Mc Millan, 1994). En estos jarabes se obtiene una mezcla de pentosas y hexosas, siendo la xilosa la más abundante (hasta un 85%) (Martínez et al., 2000).
Hemicelulosa 20-40% Celulosa 20-50%
Pectina 2% Otros 8%
Lignina 10-20%
Figura 2.1 Composición de la lignocelulosa.
(Ingram et al., 1999).
2.1 Organismos etanologénicos silvestres. 2.1.1 Saccharomyces cerevisiae
Es el organismo que tradicionalmente se usa para la producción de etanol a partir de glucosa, proveniente de la hidrólisis del almidón de granos y de sacarosa, proveniente de caña de azúcar o remolacha. Este microorganismo carece de la habilidad para metabolizar pentosas (Hahn-Hagerdal et al., 1993).
2.1.2 Zymomonas mobilis
Es una bacteria Gram negativa, tiene la habilidad nativa para producir etanol con buenos rendimientos, debido a sus características metabólicas, entre las que destacan dos actividades enzimáticas muy eficientes: piruvato decarboxilasa (Pdc) y alcohol deshidrogenasa (Adh), que convierten el piruvato en acetaldehído y etanol,
respectivamente. Sin embargo, como también sucede con S. cerevisiae, Z. mobilis está limitada en los azúcares que puede metabolizar; únicamente puede utilizar sacarosa, glucosa y fructosa, y no utiliza a la xilosa. Se han hecho intentos para lograr que Z. mobilis metabolize pentosas, cuatro genes de E. coli necesarios para el metabolismo de xilosa fueron introducidos a Z. mobilis usando promotores glicolíticos para dirigir la expresión (Zang et al., 1995). El resultado fue exitoso pero no se han lograron obtener los altos rendimientos esperados, ni las elevadas velocidades, en la conversión de xilosa a etanol, de hecho, la cepa recombinante resultante produjo niveles inferiores de etanol a partir de xilosa que los logrados anteriormente con las cepas modificadas de E. coli. Además las cepas modificadas de Z. mobilis todavía carecían de la habilidad para fermentar otros azúcares presentes en los hidrolizados de hemicelulosa y son particularmente sensibles a los inhibidores presentes en dichos hidrolizados.
2.2 Ingeniería de vías metabólicas para la producción de etanol con E. coli.
La ingeniería de vías metabólicas permite el mejoramiento directo de las propiedades celulares a través de la modificación de reacciones bioquímicas específicas o la introducción de nuevas usando tecnología de ADN recombinante (Stephanopoulos, 1999). El mejoramiento de las técnicas de biología molecular para la recombinación de ADN introduce una nueva dimensión para la modificación de vías metabólicas. La ingeniería genética permite la introducción de genes que codifican para enzimas que habilitan la modificación de reacciones específicas en las vías metabólicas. Estas herramientas han sido usadas para crear cepas etanologénicas capaces de metabolizar los azúcares presentes en los hidrolizados de los residuos agroindustriales y convertirlos en etanol.
Escherichia coli es una enterobacteria que tiene la habilidad de metabolizar una amplia variedad de hexosas (glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros) y pentosas (xilosa, arabinosa, ribosa, entre otros), adicionalmente tiene una ruta para producir etanol de manera silvestre, sin embargo la cantidad de alcohol que se produce por esta vía es muy baja: Además produce una mezcla de productos de fermentación, entre los
que se encuentran los ácidos acético, fórmico, succínico, y láctico (Tao et al., 2001; Gonzales et al., 2002; Dien et al., 2003; Lawford y Rousseau 1996; Lawford y Rousseau, 1997), y mediante el uso de la Ingeniería de vías metabólicas se ha logrado desviar el flujo de carbono hacia una vía heteróloga de producción de etanol en E. coli B, obteniendo cepas capaces de dar buenos rendimientos en la fermentación de glucosa o xilosa a etanol (Otha et al, 1991).
2.2.1 Escherichia coli KO11
La cepa KO11, es la cepa etanologénica derivada de E. coli B, obtenida por integración en cromosoma del operon pet, el cual contiene los genes pdc y adhB de Z. mobilis bajo el control de la región de regulación de la piruvato formato-liasa (pfl). (Ingram, et al. 1999, Ohta et al. 1991). El operon pet fue integrado interrumpiendo el gene pfl, de manera que la cepa KO11 produce etanol expresando los genes pdc y adhII integrados en cromosoma, (Ingram et al. 1998). Además, la cepa KO11 contiene una interrupción en el gen que codifica para la fumarato reductasa (frd), lo cual permitió disminuir la producción de ácido succínico (Ingram et al. 1999).
En la figura 2.2.1 se observan los productos de fermentación que se han obtenido al cultivar a E. coli KO11 bajo diferentes condiciones. La redirección del flujo de carbono hacia la formación de etanol se lleva a cabo por varias razones en KO11: PDC tiene un valor de Km casi 18 veces más bajo que LDH y más bajo que cualquier otra enzima que compita por el piruvato en condiciones anaeróbicas; además esta enzima se produce en grandes cantidades junto con ADHII (Ingram et al., 1999). Cabe aclarar que la expresión del complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH), la cual tiene una alta afinidad por el piruvato, está regulada por los niveles de oxígeno y su expresión, y por consiguiente actividad enzimática, es reducida en condiciones no aireadas. En KO11 el principal producto de fermentación es el etanol y en condiciones no aireadas y medio rico suplementado con glucosa o xilosa el rendimiento de conversión de xilosa o glucosa a etanol es mayor al 90% del teórico (0.51 gEt-OH/gAZÚCAR) y se reduce drásticamente la producción de ácidos orgánicos (Ver Tabla 2.2.1). Este cambio en los
productos de fermentación y en el flujo de producción de etanol conduce a un incremento en el flujo glicolítico. En comparación con su cepa progenitora (E. coli B), en KO11 se observan incrementos del 34%, 30% y 30% en la producción de biomasa, velocidad específica de crecimiento y flux glicolítico (Tao et al., 2001).
Fumarato
E. coli KO11
Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas
PIRUVATO Lactato Acetato Acetil-CoA CO2 H2 Etanol PDH (0.4 mM) LDH (7 mM ) PFL (2 mM) PDC (0.4mM ) Acetaldehído +CO2 ADHII (0.012mM) Vía heteróloga proveniente de Zymomonas mobilis
Formato
Etanol
HEXOSAS + PENTOSAS
KO11:
E. coli B: pfl::pdc adhB cat, Dfrd
Otha et al, 1993; Böck y Sawers 1996; Ingram et al., 1998; Ingram et al., 1999 M alato M DH FUM FRD Oxalacetato FOSFOENOLPIRUVATO TCA PPC Succinato Citrato Citrato ACK PTA ADH FHL Fumarato E. coli KO11
Embden-Meyerhof-Parnas Entner-Doudoroff Vía de las Pentosas
PIRUVATO Lactato Acetato Acetil-CoA CO2 H2 Etanol PDH (0.4 mM) LDH (7 mM ) PFL (2 mM) PDC (0.4mM ) Acetaldehído +CO2 ADHII (0.012mM) Vía heteróloga proveniente de Zymomonas mobilis
Formato
Etanol
HEXOSAS + PENTOSAS
KO11:
E. coli B: pfl::pdc adhB cat, Dfrd
Otha et al, 1993; Böck y Sawers 1996; Ingram et al., 1998; Ingram et al., 1999 M alato M DH FUM FRD Oxalacetato FOSFOENOLPIRUVATO TCA PPC Succinato Citrato Citrato ACK PTA ADH FHL
xxx
Figura 2.2.1Metabolismo de pentosas y hexosas en E. coli KO11 en condiciones anaeróbicas
Km (en milimoles, valores entre paréntesis) de las enzimas que compiten por el piruvato en KO11 y productos de fermentación (en recuadros).
Nomenclatura: ACK, acetato cinasa; ADH, alcohol deshidrogenasa homóloga; ADHII, alcohol deshidrogenasa heteróloga; FHL, formato hidrógeno liasa; FUM, fumarasa; FRD, fumarato reductasa; LDH, lactato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa;
PDC, Piruvato decarboxilasa; PDH, piruvato deshidrogenasa; PFL, piruvato formato liasa; PPC Fosfoenolpiruvato carboxilasa; PTA, fosfotransacetilasa.
Tabla 2.2.1 Productos de fermentación reportados para KO11 y E. coli B bajo
diferentes condiciones.
(CSL: Sólidos de licor de maíz).
Medio/Cepa Concentración de Producto (mM) Referencia
Luria-Glc 20% Etanol Acético Fórmico Láctico Succínico
E. coli B 87 66 16.7 266 2.9 Ohta et al. 1991; Lawford y Rousseau, 1996
KO11 1148 4 11 32.1 2 Ohta et al., 1991; Lawford
y Rousseau, 1997
Luria-Xil 10%
E. coli B 38.6 12.6 13.6 3 2.2 Gonzalez et al., 2003
KO11 904 6 18 3 0 Gonzalez et al., 2003
CSL-Xil 10%
E. coli B 71 90.4 94.3 18.1 53.1 Underwood et al., 2002a
KO11 150 23 18.6 2.6 0.2 Underwood et al., 2002a
2.2.2 Evaluación de E.coli B y KO11 en medio mínimo-glucosa.
Como ya se ha mencionado KO11 presenta rendimientos de conversión de xilosa o glucosa mayores al 90% del teórico, y la producción de ácidos orgánicos se reduce drásticamente, cuando es cultivada en condiciones no aireadas y en medios ricos suplementados con glucosa o xilosa; sin embargo en términos económicos no es factible el uso de medios ricos para la producción industrial de etanol (Martinez et al., 1999). La tabla 2.2.2 muestra la comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli B y KO11 en medio mineral con aproximadamente 4% de glucosa (Huerta-Beristain, 2004). En dichas condiciones, durante la fase exponencial de crecimiento KO11 presenta velocidades específicas de crecimiento, de consumo de
glucosa, de producción de etanol y de consumo de base 2, 6, 6.8 y 2.3 veces mayores con respecto a E. coli B. Durante la fase estacionaria los flujos de consumo de glucosa y base son similares para ambas cepas, sin embargo el de formación de etanol es 4.3 veces mayor para KO11. A diferencia del rendimiento previamente reportado para KO11 en medio rico (mayor a 90%), donde los componentes del medio son utilizados para que la célula crezca y la fuente de carbono es usada para formar los productos de fermentación y energía, el rendimiento global de conversión de glucosa en etanol para KO11 fue únicamente del 71% en medio mineral con glucosa (Huerta-Beristain, 2004).
Tabla 2.2.2 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli
B y KO11 en medio mineral - glucosa.
Los datos son el promedio de dos réplicas con su respectivo error estándar (Tomado de: Huerta-Beristain, 2004).
Parámetro Fase exponencial
E. coli B KO11 Fase estacionaria E. coli B KO11 µ (h-1) 0.23 ± 0.01 0.49 ± 0.02 --- ---- qS (gGlc/ gDWC.h) 0.76 ± 0.01 4.64 ± 0.61 0.82 ± 0.10 0.87 ± 0.10 qP (gEt-OH/gDWC.h) 0.15 ± 0.01 1.02 ± 0.11 0.085± 0.03 0.36 ± 0.06 qKOH (mlKOH/.h) 2.05 ± 0.06 4.77 ± 0.84 0.40 ± 0.03 0.57 ± 0.13
Rendimiento global de conversión de glucosa a etanol
(% del teórico) E. coli B = 25.1% KO11 = 70.5% Adicionalmente en las mismas condiciones indicadas en el párrafo anterior, Huerta-Beristain (2004) encontró que incrementando la actividad de Pdc o Pdc-AdhII en KO11 se logra incrementar en rendimiento de conversión de glucosa en etanol hasta 85%. Este dato sugiere que la actividad de Pdc aún es limitante en KO11 para convertir glucosa en etanol y que es necesario evaluar que comportamiento se presenta cuando se evalúa la producción de etanol en medio mineral suplementado ahora con xilosa.
2.3 Puntos de Regulación de la Glucólisis
Se ha sugerido que el control del flujo glicolítico está en los puntos de la utilización de azúcar, o de las reacciones que catalizan enzimas tales como la hexo cinasa, la fosfofructo cinasa (Pfk) o la piruvato cinasa (Pyk) (Galazzo y Bailey 1990, Cortassa y Aon 1994, Stryer, 1999). Las enzimas fosfofructo cinasa, fosfoglicerato cinasa y piruvato cinasa son enzimas que intervienen en el consumo y generación de ATP, catalizan las reacciones que presentan los mayores valores absolutos de ∆G′° exergónicos de la glicólisis y dos de estas enzimas están reguladas alostéricamente (Figura 2.3.1). La fosfofructo cinasa, cataliza la reacción irreversible de fructosa 6 fosfato a fructosa 1,6 difosfato: es inhibida por ATP y por fosfoenolpiruvato y es estimulada por AMP, ADP y fructosa6-fosfato, además tiene una ∆G′ de –14.2 kJ·mol-1. La piruvatocinasa, genera ATP a través de la reacción que forma piruvato a partir de fosfoenolpiruvato: es activada por AMP y ribosa 5 fosfato y tiene el valor mas alto de ∆G′° (-31.4 kJ/mol). La fosfoglicerato cinasa cataliza la conversión de glicerato 1,3 difosfato en 3 fosfoglicerato y ATP, reacción que es parcialmente reversible y que tiene una ∆G′ de –18.5 kJ·mol-1.
2.4 Comparación de la expresión de genes glicolíticos en KO11
Los estudios de microarreglos genéticos permiten cuantificar los niveles de expresión de muchos genes a la vez y ofrecen, entre otra información, una oportunidad única para investigar las consecuencias de la ingeniería metabólica. Su análisis provee información respecto al nivel de expresión genética en comparación con una condición de referencia, lo cual permite postular, p. ej. cómo está regulado un gen, cómo afecta una mutación la expresión de otros genes, cómo afecta la sobreexpresión de uno a varios genes los niveles de expresión de muchos genes del metabolismo central del carbono, etc. En un estudio de microarreglos genéticos de KO11 creciendo en condiciones anaeróbicas en medio rico suplementado con xilosa, en comparación con la cepa progenitora E. coli B, se observó que se sobreexpresan significativamente 14 genes de la vía de xilosa a piruvato y seis de estos corresponden a la glucólisis (pfkA,
fbaA, tpiA, gapA, pgk y pykF) (Tao et al., 2001), esto sugiere que uno o más de estas enzimas puede potencialmente limitar el flujo glicolítico en KO11 (Figura 2.4.1).
GLUCOSA G6P F6P F-1,6-DP GA2P PEP PYR pyk pfkA pgk ATP ADP ADP ATP yib eno DHAP GA1,3DP GA3P GA3P tpiA ATP ADP NAD+ + Pi NADH+ + H+ gapA fbaA AcAld CO2 pdc NADH+ + H+ 4.4 7.5 -18.5 -31.4 +AMP +F1,6DP -ATP 1.7 ∆G’0 (kJ/mol) -14.2 23.8 6.3 -16.7 7.5 +AMP +ADP -PEP -G6P adhB
Etanol
NAD+ + Pi pgi -ATPFigura 2.3.1 Esquema de la glicólisis y la desviación de piruvato a etanol, incluyendo la
regulación enzimática, consumo y generación de ATP y NAD, y cambios de ∆G´°.
Los símbolos en las elipses indican; (+) activadores e (–) inhibidores (Nelson y Cox 2000, Fraenkel, 1996).
GLUCOSA GLUCOSA- 6-P FRUCTOSA-6-P FRUCTOSA-1,6-DP 1,3-DIFOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO PIRUVATO *pykF *pfkA E T A N O L *pdc adhB XILULOSA XILULOSA-5-P RIBULOSA-5-P XILOSA *pgk ACETALDEHIDO *tpiA ATP ATP ADP ADP ATP ADP NAD+ + Pi ATP NADH + H+ PIR ADP PEP PTS *gapA yib eno xylB rpe CO2 Tao, et al. 2001 *GENES SOBREEXPRESADOS VÍA DE LAS PENTOSAS *fbaA NADH+H+ NAD+ DIHIDROXI- ACETONA-FOSFATO GLICERAL-DEHIDO-3P XylE XylDGH GLUCOSA GLUCOSA- 6-P FRUCTOSA-6-P FRUCTOSA-1,6-DP 1,3-DIFOSFOGLICERATO 3-FOSFOGLICERATO 2-FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO PIRUVATO *pykF *pfkA E T A N O L *pdc adhB XILULOSA XILULOSA-5-P RIBULOSA-5-P XILOSA *pgk ACETALDEHIDO *tpiA ATP ATP ADP ADP ATP ADP NAD+ + Pi ATP NADH + H+ PIR ADP PEP PTS *gapA yib eno xylB rpe CO2 Tao, et al. 2001 *GENES SOBREEXPRESADOS VÍA DE LAS PENTOSAS *fbaA NADH+H+ NAD+ DIHIDROXI- ACETONA-FOSFATO GLICERAL-DEHIDO-3P XylE XylDGH XylDGH
Figura 2.4.1 Análisis de sobreexpresión de genes de la vía glicolítica en condiciones
2.5 Sobreexpresión de genes del metabolismo central de carbono como una estrategia para aumentar el flux glicolítico en E. coli etanologénica
La sobrexpresión de genes de la vía glicolítica ha sido una estrategia bastante estudiada para incrementar el flujo de carbono en varios microorganismos,. En el caso de E. coli etanologénica se han hecho estudios con células en reposo (resting cells: células en las cuales se detiene la síntesis de proteínas y por ende el crecimiento por la adición de cloramfenicol u otro agente químico, manteniendo activas las enzimas) (Emmerling et al., 1999, Emmerling et al., 2000). En esos trabajos se ha estudiado la sobreexpresión individual y simultánea de genes de la glicólisis en diferentes condiciones. Los resultados más relevantes por estos investigadores los obtuvieron con las cepas etanologénicas de E. coli cosechadas en la fase exponencial de cultivos aeróbicos e incubadas en anaerobiosis. Al sobreexpresar la piruvato cinasa heteróloga de Bacillus stearothermophilus (PykBs) se observan incrementos del 10% en el consumo de glucosa y 15% en la producción de etanol, además de una reducción del 50% del flujo hacia la producción de D-Lactato. La sobreexpresión simultánea de la fosfofructo cinasa (PfkEc) y piruvato cinasa (PykEc) homólogas de E. coli dieron como resultado un aumento del 25% y 35% de consumo de glucosa y producción de etanol respectivamente, sin afectar la producción de D-Lactato (Emmerling et al.,2000). No obstante es importante aclarar que cuando las células de E. coli son incubadas en anaerobiosis a partir de células cosechadas en la fase exponencial de cultivos aeróbicos, la expresión del gen de la lactato deshidrogenasa es prácticamente nula y en consecuencia la sobreexpresión de los genes indicados permite que los incrementos de actividad enzimática obtenidos generen mayores flujos de producción de etanol debido a que el flujo de carbono no se desvía hacia la producción de ácido láctico. Adicionalmente, dichos estudios con células en reposo permiten comprender parcialmente desde el punto de vista de control de flujo que sucede con las reaciones dentro de la célula, sin embargo para la utilización de E. coli etanologénica en la producción comercial de etanol, el uso de cultivos aeróbicos para generar inóculos presenta una desventaja económica en comparación con las levaduras, y el uso de
células en reposo no es factible, dado el uso de cloranfenicol y las elevadas cantidades a producir de etanol
2.6 Evaluación de la sobreexpresión de genes usando glucosa como fuente de carbono.
Al evaluar la sobreexpresión de genes de la vía glicolítica pfkEc, pgkEc y pykBs, de transporte de azucares galPEc, y de conversión de piruvato en acetaldehído pdcZm en cultivos en medio mineral-glucosa 4% (Huerta-Beristain, 2004), se observó que la sobreexpresión de pfkEc ypykBs redujeron las velocidades específicas de producción de etanol y de consumo de glucosa, sin afectar la velocidad específica de consumo de base para la fase exponencial. Para la fase estacionaria se observaron los mismos efectos con excepción de que la velocidad específica de consumo de base se incremento con la sobreexpresión de pykBs, demostrando con esto un aumento en el flux de carbono hacia la producción de ácidos orgánicos. Al sobreexpresar pdcZm se observó un aumento del 41% y 37.4% en la velocidad específica de de producción de etanol y de consumo de glucosa en fase estacionaria, respectivamente y una reducción del 51.7% en la velocidad específica de consumo de base. También se obtuvo un incremento del 70% al 84% en el rendimiento de conversión de glucosa a etanol.
3.-PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
En el presente proyecto se plantearon las siguientes preguntas relacionadas con el crecimiento y producción de etanol por KO11 en medio mineral suplementado con xilosa:
¿Cuáles son los principales productos de fermentación de KO11 en condiciones no aireadas?
¿Es posible incrementar el flujo glicolítico y/o el flux de formación de etanol en KO11 mediante la sobre-expresión individual de alguna de las enzimas de la glicólisis y/o de la conversión de piruvato en etanol?
Si se incrementa el flux de formación de etanol, ¿es posible disminuir el flux de formación de ácidos orgánicos?
¿Cuál es la reacción del metabolismo central o fermentativo que podría estar limitando el flux hacia la formación de etanol?
¿Es posible incrementar el rendimiento de conversión de xilosa cuando se incrementa el flux de formación de etanol en medio mineral?
4.- HIPÓTESIS
En este trabajo se propone como hipótesis que incrementos individuales en la actividad de enzimas clave involucradas en el transporte de xilosa (GalPEc), y/o del metabolismo
en la glicólisis (PfkEc, PgkEc y PykBs) de E. coli KO11, podrían modificar –incrementar o
disminuir- el flux de carbono hacia la formación de etanol, mediante modificaciones en el flujo glicolítico. También se plantea que incrementos en la actividad de piruvato decarboxilasa permitirían aumentar el flux de carbono de piruvato hacia la formación de etanol, incrementando a la vez el flujo glicolítico y de consumo de xilosa en E. coli KO11, en condiciones similares a las que se podría llevar a cabo la producción comercial de etanol a partir de hidrolizados de la fracción hemicelulósica de los residuos agroindustriales, es decir utilizando medios minerales simples suplementados con xilosa y células activas en cultivos lote.
5.- OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
Evaluar el efecto de la sobreexpresión de genes del metabolismo de Escherichia coli etanologénica, relacionados con la conversión de piruvato en acetaldehído y el consumo y generación de ATP, sobre la velocidad específica de formación de etanol usando xilosa como fuente de carbono en condiciones anaeróbicas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
- Evaluar y caracterizar el efecto del incremento individual de las siguientes actividades enzimáticas: galactosa permeasa (GalPEc), fosfofructo cinasa (PfkEc), fosfoglicerato
cinasa (PgkEc), piruvato cinasa (PykBs) y piruvato decarboxilasa (PdcZm), sobre
parámetros cinéticos y estequiométricos de crecimiento, consumo de xilosa, producción de ácidos orgánicos y etanol, durante las fases de crecimiento exponencial y estacionaria de cultivos no aireados en medio mineral-xilosa 40 g/l.
- Determinar los incrementos de actividad enzimática en las construcciones evaluadas. - Cuantificar la producción de ácidos orgánicos por cromatografía de líquidos de alta resolución.
- Realizar análisis de flujos y balances de carbono para cada una de las cepas evaluadas.
6.- METODOLOGÍA
6.1 Cepas
En el presente trabajo se utilizaron las cepas de E. coli B (ATCC 11303) y su derivada etanologénica KO11, la cual tiene integrada en el cromosoma los genes que codifican para la piruvato decarboxilasa (pdcZm) y la alcohol deshidrogenasa B (adhBZm) de Zymomonas mobilis (Zm), esta cepa tiene como marcador de selección un gen que le confiere resistencia a cloramfenicol (Ohta et al. 1991). Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de los genes selectos KO11 fue transformada con derivados del vector pTrc99a (Pharmacia), conteniendo de manera individual diferentes genes homólogos (Ec= E. coli) o heterólogos (Bs= Bacillus stearothermophilus, Zm= Z. mobilis), los cuales codifican para las enzimas GalPEc, PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm. Estos plásmidos
fueron construidos y transformados en KO11 previamente en el laboratorio de Ingeniería de Vías Metabólicas del Instituto de Biotecnología de la UNAM (Huerta-Beristain, 2004). El promotor que contiene pTrc99A, trc es inducible por IPTG, además este vector tiene como marcador de selección un gen que le confiere resistencia a ampicilina a las cepas que son transformadas con el mismo.
6.2 Condiciones y medios de cultivo 6.2.1 Inóculos para cultivos
A partir de las células congeladas en glicerol (40%) se estriaron placas conteniendo agar (15 g/L), medio Luria, 20 g/l de Glucosa, Cm 40 mg/l y Amp 200 mg/l, se incubaron a 35°C de 20 – 24 h y se resembraron de manera sucesiva por 2 días. A partir de estas células se toman tres colonias grandes, se resuspenden en un tubo de vidrio con 3 ml de medio LB y se adicionan al matraz que contiene el medio de cultivo para el inóculo. El crecimiento del inóculo se realizó en matraces de 500 ml, conteniendo 200 ml de medio mínimo (M9), con 20 g/l de xilosa como fuente de carbono, temperatura de 35°C y con una agitación de 120 rpm. Los inóculos se
incubaron durante 14 h, hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 1.3. Todos los cultivos fueron inoculados centrifugando (5000 rpm, 10 min y temperatura ambiente) la cantidad suficiente de inóculo para obtener una DO600 inicial de 0.1 (0.037 gDCW/l), las células fueron transferidas a cada cultivo resuspendiéndolas en el medio respectivo (la variación de la concentración inicial celular en todos los cultivos se debe al error experimental).
6.2.2 Medios de cultivo.
La composición del medio mínimo M9 (Maniatis et al., 1982) para cultivo en mini-fermentadores, contiene por litro: 6 g Na2HPO4; 3 g KH2PO4; 1 g NH4Cl; 0.5 g NaCl; 2 ml de MgSO47H2O 1M; 0.1 ml de CaCl4 0.1M; 0.1 ml de Tiamina 1 mg/ml (esterilizada por filtración); 40 g de glucosa o xilosa como fuente de carbono; y ampicilina (para mantener la presión de selección de los plásmidos) 50 mg/l. El medio Luria (Maniatis et al., 1982) contiene por litro: 10 g Bactotritpona; 5 g extracto de levadura; y 5 g NaCl.
6.2.3 Condiciones de cultivo.
Los cultivos anaeróbicos se realizaron en sistemas de fermentadores o mini-fleakers (Beall et al., 1991), con un volumen de trabajo de 200 ml. La temperatura se controló a 35°C y el pH a 7.0 mediante la adición automática de KOH 2N. Para garantizar el mezclado de los nutrientes, los cultivos se mantuvieron a una velocidad de agitación de 100 rpm. Las actividades enzimáticas fueron verificadas en extractos celulares cosechados durante el crecimiento exponencial (8 h). Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado. En los resultados se muestran valores promedio y su error experimental.
El sistema de mini-fermentadores o Fleakers consta de (Ver figura 6.2.1):
a) Un control de temperatura, el cual está integrado por un baño de agua, un sensor de temperatura y un termo-circulador de agua.
b) Un control de pH, el cual está integrado por 6 electrodos, 6 controladores y 6 válvulas (solenoides) para la adición de base.
c) Un sistema de agitación o parrilla magnética para 6 magnetos (rango de 100-850 rpm)
d) 6 Mini-fermentadores o fleakers con un volumen nominal de 250 ml y de trabajo de 200 ml, cuyo sistema de agitación consiste en un agitador magnético en forma de cruz de 1 pulgada.
6.3 Métodos analíticos.
6.3.1 Concentración celular
La densidad óptica fue medida a 600 nm en un espectrofotómetro Beckman (DU-70) y convertida a peso seco de células (DCW: dry cellular weigth), de acuerdo a una curva de calibración: 1 DO600 = 0.37 gDCW/l. Todas las muestras fueron centrifugadas (5,000 rpm y temperatura ambiente); el paquete celular se desechó y el sobrenadante se congeló para su posterior análisis.
6.3.2 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos.
La determinación de xilosa se llevó a cabo mediante el método de azúcares reductores del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS; Chaplin y Kennedy, 1987) (Apéndice 9.1). Los resultados fueron confirmados por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Los productos de fermentación, ácidos orgánicos (acético, fórmico, succínico, láctico, pirúvico, etc.) y glicerol también fueron determinados por HPLC.
Las determinación por HPLC, se llevaron a cabo por cromatografía isocrática con H2SO4 5 mM como fase móvil a un flujo de 0.5 ml/min en una columna Aminex HPX-87H (Biorad) a 50°C. La detección de los compuestos separados, se llevó a cabo simultáneamente con un detector de arreglo de diodos (Waters 996) y un detector de índice de refracción (Waters 410). El análisis y procesamiento de datos se realizó con el sistema Milenium (Versión 3.01 Waters). Las temperaturas interna y externa de la columna fueron ajustadas a 45 y 50ºC respectivamente. Los sobrenadantes de las muestras a analizar se filtraron con membranas de 0.45 µm y se inyectaron automáticamente con ayuda del autoinyector (Waters 717). Para la confirmación de los azúcares y los productos analizados por HPLC se inyectaron estándares de xilosa, ácidos orgánicos, alcoholes e intermediaros metabólicos. En las tablas 11.4.1 y 11.4.2 del apéndice se muestran los datos de las curvas de calibración que se obtuvieron para
calcular la concentración de dichos compuestos. Los datos obtenidos de las concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un método de calibración-Interpolado del mismo software.
6.3.3 Determinación de etanol.
La determinación de etanol se realizó por cromatografía de gases (Cromatógrafo de Gases Agilent, Serie 6850, Wilmington, D.E.) utilizando como estándar interno 1-butanol. Se utilizó He como fase móvil (5.0 ml/min, 19.05 psi y 65 cm/s) a través de una columna capilar (Innowax 19091N-133E, de 30 m de longitud 0.25 mm de diámetro interno y con un espesor de película de 0.25 µm, J&W Scientific), y 0.2 µl de sobrenadante inyectados automáticamente. La detección de los compuestos separados, se lleva a cabo con un detector de ionización de llama (FID-1A) a 250oC. El análisis y procesamiento de datos se realizó con el programa Agilent Cerity QA/QC. Las temperaturas del horno fueron ajustadas con rampas de temperatura de 80°C hasta 200°C y la del detector a 250°C.
6.3.4 Determinación de proteínas y actividades enzimáticas.
La determinación de proteínas se llevó a cabo por el método de Lowry (Lowry et al. 1951). Los ensayos enzimáticos fueron realizados mediante métodos descritos anteriormente (Maitra y Lobo 1971; Bergmeyer y Gawehn 1974; Hoppner y Doelle 1983; Sakai et al., 1986; Martínez et al. 1999) (Apéndice 11.2). Después de 8 horas de cultivo en los mini-fermentadores, las células se ajustan a una DO600 de aproximadamente 1, se cosechan por centrifugación, se lavan una vez en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, estas células se resuspenden en 1 ml del mismo amortiguador; las preparaciones libres de células fueron obtenidas por sonicación (4 pulsos de 14-16 micrones cada uno separados por 1 min) manteniendo al tubo que contiene las preparaciones en hielo con etanol, para finalmente por centrifugación (10 min, 4°C) obtener un extracto de proteína que se utiliza para llevar a cabo las determinaciones enzimáticas, Estas determinaciones se llevan a cabo mediante
reacciones oxido-reducción acopladas a otras enzimas, monitoreando la oxidación o reducción de NADH+H+ o NAD a 340 nm durante 3 min a 30°C en el espectrofotómetro Beckman DU-70 (Beckman instrument, Inc. Fullerton, CA.).
6.4 Evaluación de parámetros.
Los parámetros evaluados fueron: velocidad específica de crecimiento (µ); rendimiento biomasa/sustrato (YX/S); velocidad específica de consumo de azúcar-xilosa (qS); productos de fermentación formados, así como la velocidad específica de formación de productos (qP), los cuales se determinaron, por separado durante las fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Las concentraciones fueron corregidas por factor de dilución en función de la base o ácido adicionado a los cultivos para el control de pH (Apéndice 11.3.1)
6.5 Análisis de resultados.
Para evaluar si existe una diferencia estadísticamente significativa se llevó a cabo un análisis de datos aplicando una prueba t de Students no apareada y considerando distribución de una cola. En la sección de resultados se indican únicamente los valores de variables que fueron significativamente diferentes a un nivel de confianza del 95%.
7.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta sección se resumen y analizan los resultados obtenidos en el presente trabajo, en el apéndice (sección 11) se muestran las cinéticas (con el promedio de dos replicas y su correspondiente error estándar) de: crecimiento, consumo de xilosa, producción de etanol y producción de ácidos orgánicos para cada una de las construcciones evaluadas. Esta evaluación incluye a la cepa no etanologénica (E. coli B), la cepa etanologénica con los genes pdcZm y adhBZm integrados en cromosoma (KO11); y
KO11 transformada con los siguientes plásmidos: a) pTrc99A (vector control sin inserto); b) pTrcgalPEc; pTrcpfkEc, pTrcpgkEc, pTrcpykBs y pTrcpdcZm. Los efectos
estudiados se comparan con experimentos control llevados a cabo con la cepa KO11 transformada con el vector pTrc99A sin inserto alguno.
7.1 Evaluación de E. coli B y KO11 en medio mineral-xilosa y de actividad enzimática de PfkEc, PgkEc, PykBs y PdcZm.
7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos entre E. coli B y KO11 creciendo en medio mineral-xilosa
Como se cita en los antecedentes, KO11 es capaz de convertir concentraciones elevas de glucosa o xilosa (por ej. 100 g/L) en etanol con rendimiento mayores al 90% respecto al teórico (>45 g/L de etanol) cuando se emplean medios de cultivo ricos, además la producción de ácidos orgánicos se reduce drásticamente en comparación con su cepa progenitora. No obstante, en términos económicos el uso de medios ricos no es factible para la producción industrial de etanol carburante (Martínez et al., 1999). Además, no existen reportes donde se evalúe el desempeño de KO11 en medio mineral metabolizando xilosa.
Por consiguiente como parte inicial del presente trabajo, se caracterizó el catabolismo de xilosa por E. coli B y KO11 en medio mínimo conteniendo 4% de xilosa. Bajo estas condiciones, se puede observar (Figura 7.1.1 y Tabla 7.1.1) que durante la fase de
crecimiento exponencial (de 0 – 12 h del cultivo), la cantidad de biomasa formada y las velocidades de crecimiento, de consumo de xilosa, de producción de etanol y de ácidos orgánicos (excluyendo el succínico, el cual es producido en cantidades mínimas en KO11 ya que tiene interrumpido el gen que codifica para la fumarato reductasa, Figura 2.2.1) son similares para ambas cepas. Este hecho contrasta con los resultados reportados para la utilización de xilosa en medio rico, para los cuales con KO11 se incrementan en promedio un 33% la formación de biomasa, la velocidad específica de crecimiento y el flux consumo de xilosa, además de que la velocidad volumétrica de producción de etanol se incrementa en 1 orden de magnitud en comparación con su cepa progenitora (Tao et al., 2001). El comportamiento obtenido en el presente trabajo -con medio mineral-xilosa-, también -contrasta -con los resultados obtenidos cuando KO11 es cultivada en medio mineral 4% glucosa, donde durante la fase de crecimiento exponencial: la velocidad específica de crecimiento es del doble; el flux de consumo de glucosa es 6 veces más elevado; y, en proporción, el flux de formación de etanol es 6.8 veces mayor con respecto a E. coli B. Estos resultados sugieren que existe una diferencia importante en cuanto a los flujos metabólicos en la glicólisis, y por supuesto en la vía de las pentosas, cuando se utiliza xilosa como fuente de carbono para cultivar, en condiciones no aireadas, a E. coli B y KO11, en comparación cuando se utiliza glucosa en medios minerales.
Los datos de la tabla 7.1.1 muestran que en valores absolutos la velocidad específica de crecimiento es similar para la cepa silvestre (E. coli B) cuando crece utilizando xilosa o glucosa, sin embargo la velocidad específica de consumo de azúcar es 3.6 veces mayor (en términos másicos o de milimoles de carbono por g de biomasa por hora) cuando se usa xilosa. Este resultado indica que E. coli B necesita consumir xilosa a mayor velocidad para lograr una velocidad de crecimiento similar a la que obtiene cuando utiliza glucosa como fuente de carbono.
0.01 0.1 1 0 10 20 30 40 B io m as a ( g /L ) X ilo sa (g /L ) 0 4 8 12 16 E ta n o l (g /L ) 0 2 4 6 8 A cé tic o ( g /L ) 0.0 2.5 5.0 Fó rm ic o ( g /L ) 0 12 24 36 48 60 0.0 1.5 3.0 Tiempo (h) Lá ct ic o ( g /L ) 0 12 24 36 48 60 0.00 0.75 1.50 Tiempo (h) S u cí n ico ( g /L )
Figura 7.1.1 Cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y producción de etanol y
ácidos orgánicos para E. coli B y KO11, cultivadas en condiciones anaeróbicas en medio mineral 4% xilosa.
Símbolos vacíos KO11, Símbolos llenos E. coli B.
Tabla 7.1.1 Comparación de parámetros cinéticos y rendimiento de etanol entre E. coli
B y KO11.
Este trabajo -.xilosa: datos en la parte superior de cada panel en negritas. Huerta-Beristain (2004).- glucosa: datos en la parte inferior de cada panel. Los datos son el promedio de dos réplicas con su respectivo error estándar.
Parámetro Fase exponencial
E. coli B KO11 Fase estacionaria E. coli B KO11
µ (h-1) 0.28 ± 0.004 0.23 ± 0.01 0.30 ± 0.01 0.49 ± 0.02 --- ----qS (gGlc/ gDWC.h) 2.72 ± 0.07 0.76 ± 0.01 2.57 ± 0.52 4.64 ± 0.61 0.43 ± 0.01 0.82 ± 0.10 0.49 ± 0.04 0.87 ± 0.10 qP (gEt-OH/gDWC.h) 0.39 ± 0.01 0.15 ± 0.01 0.45 ± 0.06 1.02 ± 0.11 0.062 ± 0.02 0.085 ± 0.03 0.20 ± 0.02 0.36 ± 0.06 qKOH (mlKOH/ gDCW.h) 3.97 ± 0.12 2.05 ± 0.06 3.82 ± 0.36 4.77 ± 0.84 0.62 ± 0.07 0.40 ± 0.03 0.22 ± 0.04 0.57 ± 0.13 qAcético(gAcet/gDCW.h) 0.12 ± 0.02 0.06 ± 0.02 0.02 ± 0.00
Rendimiento global de conversión de glucosa a etanol
(% del teórico) E. coli B = 30.2 KO11 = 60.0 (% del teórico) E. coli B = 25.1 KO11 = 70.5
La figura 7.1.2 muestra un esquema de la glicólisis y de la vía de las pentosas en E. coli, así como un balance de ATP generado hasta la formación de piruvato para ambos casos. Tomando en consideración que: por cada mol de xilosa consumida se producen 0.67 moles de ATP, y 2 moles de ATP por cada mol de glucosa; el peso molecular de ambos azúcares y las velocidades de crecimiento reportadas en la tabla 7.1.1, se obtiene que el rendimiento de formación de biomasa (gDCW) por cada mol de ATP sintetizado en estas condiciones es de 23 y 27 para xilosa y glucosa, respectivamente, los cuales en términos prácticos son equivalentes y muestran que la mayor velocidad de consumo de xilosa se justifica desde el punto de vista energético, es decir que el microorganismo necesita metabolizar xilosa a una mayor velocidad para lograr aproximadamente la misma eficiencia de generación de biomasa por moléculas de ATP generado.
