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MICROBIOLOGIA
AGROINDUSTRIAL
PARTE 1
Alejandro Coloma P.
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TABLA DE CONTENIDOS
CAPITULO 1. GENERALIDADES Y DESARROLLO
HISTÓTICO DE LA MICROBIOLOGIA 1
1.1. Generalidades 1
1.2. Desarrollo histórico de la microbiología 2
1.2.1. Primeras observaciones de los microorganismos (Leeuwenhoek y sus
microscopios) 2
1.2.2. Origen de los microorganismos (Teoría de la generación espontánea) 2 1.2.3. La fermentación como proceso biológico (Pasteur y el vino francés). 4 1.2.4. Descubrimiento de la función de los microorganismos como causantes
de enfermedades (Koch y la bacteria del carbunco) 5
1.2.5. Desarrollo en la prevención de enfermedades (Lister y el fenol; Pasteur
y las gallinas; Fleming y el hongo contaminante) 6
1.2.6. Microbiología y genética (Neumococos, doble hélice e ingeniería
genética) 9
CAPITULO 2. OBSERVACION DE LOS
MICROORGANISMOS: EL MICROSCOPIO,
PREPARACION Y EXAMEN DE MUESTRAS 12
2.1. El microscopio 12
2.1.1. Microscopio óptico 12
2.1.2. Microscopio electrónico 13
2.2. Microscopia óptica 14
2.3. Observación de los microorganismos 15
2.3.1. Técnicas de tinción 15
2.4. Tinción de Gram 16
CAPITULO 3. LA CELULA PROCARIOTICA:
ESTRUCTURA Y FUNCION 19
3.1. Bacterias 19
3.2. Morfologia de las bacterias 19
3.3. Ultraestructura de las bacterias 20
3.3.1. Glicocalix 21
3.3.2. Pared celular 21
3.3.3. Membrana citoplasmática 23
3.3.4. Area citoplásmica 24
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3.3.6. Flagelos 25
3.3.7. Fimbrias o pili 25
3.3.8. Endoesporas bacterianas 26
3.4. Reproducción de las bacterias 26
3.5. Clasificación de las bacterias 27
3.5.1. Reacción Gram 27
3.5.2. Clasificación de Bacterias por Familia 27
CAPITULO 4. LA CELULA EUCARIOTICA:
ESTRUCTURA Y FUNCION 45
4.1. Cilios y flagelos 45
4.2. Pared celular 45
4.3. Membrana citoplásmica 45
4.4. Orgánulos celulares 46
CAPITULO 5. MOHOS Y LEVADURAS 50
5.1. Hongos 50
5.1.1. Mohos 50
5.1.2. Clasificación de mohos 51
5.2. Levaduras 55
5.2.1. Estructura 55
5.2.2. Reproducción de las levaduras 55
5.2.3. Clasificación 56
CAPITULO 6. NUTRICION MICROBIANA 60
6.1. Nutrición de los microorganismos 60
6.2. Nutrientes 60
6.2.1. Macronutrientes 60
6.2.2. Micronutrientes (c.a. 0,2 g / l) 61
6.2.3. Vitaminas y hormonas 61
6.2.4. Elementos traza (c.a. 25 mg / l) 62
6.3. Permeabilidad y transporte 62
CAPITULO 7. CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS:
MEDIOS DE CULTIVO 65
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7.2. Tipos de medios de cultivo 67
7.2.1. Estado: 67
7.2.2. Composición: 67
7.3. Aislamiento de microorganismos en cultivo puro 68
CAPITULO 8. CRECIMIENTO MICROBIANO 72
8.1. Tiempo de generación 72
8.2. Cálculo del tiempo de generación 72
8.3. Curva de crecimiento 74
8.4. Crecimiento sincrónico 74
8.5. Cultivo contínuo 75
8.6. Determinación del crecimiento microbiano 75
8.7. Efecto de los factores ambientales sobre el crecimiento 76
8.7.1. Temperatura 76
8.7.2. pH 76
8.7.3. Agua 76
8.7.4. Oxígeno 77
CAPITULO 9. CONTROL DE LAS POBLACIONES
MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y DESINFECCIÓN 82
9.1. Definiciones y conceptos 82
9.2. Muerte de las poblaciones microbianas y curvas de supervivencia 83
9.3. Condiciones que influyen en la accion antimicrobiana 83
9.4. Agentes esterilizantes físicos 84
9.4.1. Altas temperaturas 84
9.4.2. Bajas temperaturas 85
9.4.3. Radiaciones 85
9.4.4. Filtración 86
9.4.5. Desecación 86
9.5. Agentes esterilizantes químicos 87
9.5.1. Desinfectantes y antisépticos 87
9.5.2. Inorgánicos 87
9.5.3. Orgánicos 89
9.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana de los desinfectantes y
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CAPITULO 10. METABOLISMO MICROBIANO 93
10.1. Concepto de metabolismo 93
10.2. Clasificación de los organismos según su fuente de carbono y energía 93
10.3. La energía y el poder reductor en el metabolismo microbiano: papel
del ATP y de los piridin nucleótidos. 94
10.4. Mecanísmos de obtención de ATP 95
CAPITULO 11. MICROORGANISMOS HETEROTROFOS 100
11.1. Mecanismos de obtención de energía por microorganismos
quimioheterotrofos 100
11.1.1. Fermentación 100
11.1.2. Respiración aeróbica (Rutas de utilización del piruvato por aerobios) 101
CAPITULO 12. MICROORGANISMOS AUTOTROFOS 106
12.1. Mecanismos de obtención de energía por microorganismos
autotrofos 106
12.1.1. Síntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson 106
12.1.2. Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos 106
CAPITULO 13. BIOSÍNTESIS 111
13.1. Biosíntesis 111
13.1.1. Sustancias nitrogenadas 111
13.1.2. Carbohidratos 113
13.1.3. Lípidos 114
CAPITULO 14. ECOLOGIA MICROBIANA 116
14.1. Microbiologia del suelo 116
14.2. Microbiología del aire 116
14.3. Microbiología del agua 117
14.4. Agua de consumo humano 117
14.5. Microbiología de los alimentos 118
CAPITULO 15. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS
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15.1. Estructura 120
15.2. Clasificación y nomenclatura de los virus 120
15.3. Características generales de los virus (ii) 121
15.3.1. Replicación de los virus animales 121
15.3.2. Replicación de virus DNA (Herpes simplex virus) 122
15.3.3. Replicación de virus RNA 122
15.4. Estudio de los virus adn 124
15.4.1. Viruela 124
15.4.2. Varicela 124
15.4.3. Hepatitis B 125
15.5. Estudio de los virus ARN 125
15.5.1. SIDA 125
15.6. Agentes infecciosos no convencionales 127
15.6.1. Viroides 127
15.6.2. Priones 127
15.7. Virus oncogenicos: mecanismos moleculares de oncogenesis viral 128
CAPITULO 16. TOXIINFECCIONES ALIMENTARIAS Y
OTRAS AFECCIONES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS 136
16.1. Introducción 136
16.2. Generalidades sobre la etiología y epidemiología de las
enfermedades transmitidas por alimentos 136
16.3. Los microorganismos como agentes patógenos transmitidos por
alimentos 137
16.4. Origen de los microorganismos patogenos presentes en los
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INDICE DE TABLAS
Tabla 3.1. Principales géneros bacterianos de los alimentos ... 28 Tabla 5.1. Principales géneros de mohos de los alimentos ... 52 Tabla 5.2. Principales géneros de levaduras en los alimentos ... 56
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Capitulo 1. GENERALIDADES Y DESARROLLO HISTÓTICO DE LA MICROBIOLOGIA
1.1. Generalidades
Microbiología, el estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica.
Para mucha gente la palabra microorganismo le trae a la mente un grupo de pequeñas criaturas que no se encuadran en ninguna de las categorías de la pregunta clásica: ¿ es animal, vegetal o mineral ? Los microorganismos son diminutos seres vivos que individualmente son demasiado pequeños como para verlos a simple vista. En este grupo se incluyen las bacterias, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscópicas. Normalmente tendemos a asociar estos pequeños organismos con infecciones, enfermedades como el SIDA, o deterioro de alimentos. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos contribuyen de una forma crucial en el bienestar de la Tierra ayudando a mantener el equilibrio de los organismos vivos y productos químicos en nuestro medio ambiente: Los microorganismos de agua dulce y salada son la base de la cadena alimentaria en océanos, lagos y ríos; los microorganismos del suelo destruyen los productos de desecho e incorporan el gas nitrógeno del aire en compuestos orgánicos, así como reciclan los productos químicos en el suelo, agua y aire; ciertas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosíntesis, que es unproceso que genera nutrientes y oxígeno a partir de luz solar y CO2 siendo un proceso crítico para el mantenimiento de la vida sobre la Tierra; los hombres y algunos animales dependen de las bacterias que habitan en sus intestinos para realizar la digestión y síntesis de algunas vitaminas como son la K y algunas del complejo B. Los microorganismos también tienen aplicaciones industriales ya que se utilizan en la síntesis de productos químicos como son acetona, ácidos orgánicos, enzimas, alcohol y muchos medicamentos. El proceso de producción de acetona y butanol por bacterias fue descubierto en 1914 por Chaim Weizmann, un polaco que trabajaba en Inglaterra para Winston Churchill. Cuando estalló la primera guerra mundial en agosto de ese año, la producción de acetona era esencial en el proceso de fabricación de las municiones, por lo que el descubrimiento de Weizmann jugó un papel determinante en el desarrollo de la guerra. Después de la guerra, rehusó todos los honores que le propuso el gobierno británico. Sin embargo, utilizó su influencia para que el gobierno británico ayudara a establecer el estado judío en
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Palestina. En 1949, Weizmann fue elegido el primer presidente de Israel. La industria alimentaria también usa microorganismos en la producción de vinagre, bebidas alcohólicas, aceitunas, mantequilla, queso, yogurt y pan. Además, las bacterias y otros microorganismos ahora pueden ser manipulados para producir sustancias que ellos normalmente no sintetizan. A través de esta técnica, llamada ingeniería genética, las bacterias pueden producir importantes sustancias terapéuticas como insulina, hormona de crecimiento humana e interferón.
Actualmente sabemos que los microorganismos se encuentran en todas partes; pero hace poco, antes de la invención del microscopio, los microorganismos eran desconocidos para los científicos. Miles de personas morían en las epidemias cuyas causas no se conocían. El deterioro de los alimentos no se podía controlar siempre y muchas familias enteras morían debido a que no existían vacunas y antibióticos disponibles para combatir las infecciones. Nosotros podemos hacernos una idea de como se han desarrollado nuestros actuales conceptos de microbiología repasando los acontecimientos históricos que han cambiado nuestras vidas.
1.2. Desarrollo histórico de la microbiología
Aunque los microorganismos se originaron hace aproximadamente 4.000 millones de años, la microbiología es relativamente una ciencia joven. Los primeros microorganismos se observaron hace 300 años y sin embargo pasaron unos 200 años hasta que se reconoció su importancia
1.2.1. Primeras observaciones de los microorganismos (Leeuwenhoek y sus microscopios)
La existencia de los microorganismos no se conoció hasta la invención del microscopio. La primera persona en describir los microorganismos en detalle fue el holandés Antony van Leeuwenhoek en 1684, a los cuales denominó animáculos. Leeuwenhoek examinó el agua de lluvia, de mar, de río, saliva y otras materias. Sin embargo, estas observaciones no condujeron a ninguna investigación acerca de las posibles actividades de los microorganismos, ni como agentes de fermentaciones ni de enfermedades infecciosas ya que el desarrollo de la química y de la medicina era demasiado primitivo.
1.2.2. Origen de los microorganismos (Teoría de la generación espontánea)
Una vez descubiertos los microorganismos por Leeuwenhoek se empezó a especular sobre el origen de estos animáculos. Se formaron dos escuelas. Una de ellas admitía la existencia de estas estructuras pero apoyaban la teoría que
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provenían de la descomposición de los tejidos de las plantas o animales (eran el resultados de la descomposición y no la causa). Los que apoyaban esta teoría creían que la vida se generaba a partir de matería no viva, proceso que se denominó abiogénesis. Básicamente era el concepto de la generación espontánea. Del otro lado estaba la teoría de la biogénesis. Los animáculos se originaban, como ocurre en formas de vida superiores, a partir de animáculos padres. Hasta que se rechazó la idea de la generación espontánea se tuvieron que realizar muchos experimentos que parecen simples hoy en día, pero que en aquellos momentos llevó más de 100 años resolver dicha controversia.
La idea de la generación espontánea se remonta a la cultura griega, los cuales creían que las ranas y gusanos crecían espontáneamente a partir del lodo. Incluso existían recetas: llenando una tinaja con trapos y colocándola en un sitio apartado durante semanas al final crecían ratones a partir de los trapos. En el siglo XVII el italiano Francesco Redi demostró en 1668 que los gusanos encontrados en la carne podrida eran las larvas que provenían de los huevos que previamente habían depositado en la carne las moscas y no el producto de la generación espontánea. Sin embargo una cosa eran los huevos de moscas y otra los microorganismos que sólo se podían ver con la ayuda del microscopio. En 1745 John Needham hirvió trozos de carne para destruir los organismos preexistentes y los colocó en un recipiente abierto. Al cabo de un tiempo observó colonias de microorganismos sobre la superficie y concluyó que se generaban espontáneamente a partir de la carne. En 1769, Lazzaro Spallanzani repitió el experimento pero tapando los recipientes, no apareciendo las colonias, lo que contradecía la teoría de la generación espontánea. Pero Needham argumentó que el aire era esencial para la vida incluída la generación espontánea de microorganismos y este aire había sido excluido en los experimentos de Spallanzani.
Unos 100 años después, en 1836 Franz Schulze pasó el aire a través de unas soluciones ácidas fuertes hacia el interior de un recipiente con carne hervida. Al año siguiente Theodor Schwann pasó el aire a través de tubos calientes. Los microorganismos no aparecían en ningún caso ya que los microorganismos presentes en el aire habían sido aniquilados. Sin embargo, los que apoyaban la generación espontánea comentaban que el ácido y el calor alteraban el aire de tal manera que impedía la generación espontánea de los microorganismos. Sin embargo fue Louis Pasteur el que zanjó definitivamente la controversia en 1864 al utilizar matraces con un tubo largo y curvado llamados "cuello de cisne". El aire pasaba libremente a través del cuello, pero los microorganismos no aparecían en la solución ya que las partículas de polvo y microorganismos sedimentaban en el recodo del cuello. Estos experimentos de Pasteur promovieron el reconocimiento de la biogénesis. Posteriormente Pasteur empezó a estudiar el papel de los microorganismos en la producción de vino y como causa de enfermedades.
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1.2.3. La fermentación como proceso biológico (Pasteur y el vino francés).
Sin duda desde la Prehistoria los hombres utilizan con provecho las fermentaciones. El pan fermentado se conoce desde hace varios miles de años. Los jeroglíficos egipcios, así como representaciones gráficas en todo el Próximo Oriente atestiguan que el hombre recurría a la fermentación para fabricar bebidas alcohólicas ya varios milenios antes de Jesucristo. Al preparar el pan, vino, cerveza o sake, los egipcios, sumerios y todas las personas hasta mediados del Siglo XIX, empleaban sin saberlo, y de una manera empírica, una familia de agentes biológicos muy originales: las levaduras. Son ellas las que realizan la fermentación alcohólica.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fue reconocido hasta 1856 por Luis Pasteur. Las teorías científicas de esa época reconocían la presencia de levaduras en la fermentación alcohólica, pero estas levaduras eran consideradas como compuestos químicos complejos, sin vida. Esta era la teoría mecanística liderada por los químicos alemanes von Liebig y Wöhler. Luis Pasteur, químico francés, propuso la teoría vitalística y demostró que las células viables de levaduras causan fermentación en condiciones anaeróbicas; durante dicha fermentación el azúcar presente en el mosto es convertido principalmente en etanol y CO2. Sus ilustraciones claramente muestran auténticas levaduras vínicas y en sus escritos él las diferenciaba claramente de otros componentes.
En el verano de 1856 M. Bigo, un fabricante de alcohol en la ciudad de Lille, en el norte de Francia, sufría repetidos fracasos en las fermentaciones de sus productos. En este proceso intervenía la fermentación de la caña de azúcar para producir alcohol etílico, pero una y otra vez el contenido de las tinajas se agriaba y al final en lugar de alcohol, se obtenía una sustancia que despedía un olor parecido a la leche agria. Sucedió que el hijo de M. Bigo estudiaba en la Facultad de Ciencias cuyo decano era Pasteur. M. Bigo, a través de su hijo, preguntó a Pasteur si estaría dispuesto a investigar los fracasos que estaban ocurriendo con sus fermentaciones, a lo que Pasteur accedió iniciando el estudio en los laboratorios de la Facultad. En primer lugar sometió a análisis químico el contenido estropeado de las tinas llegando a la conclusión de que contenían una considerable cantidad de ácido láctico en lugar de etanol. El siguiente paso fue el examen de los sedimentos de las tinas en las que la fermentación había sido satisfactoria y el de aquellas que habían fallado. La comparación de los dos sedimentos reveló una clara diferencia: en los sedimentos procedentes de las tinas que habían producido alcohol había levaduras; en los procedentes de las tinas productoras de ácido láctico se veían "glóbulos mucho más pequeños que los de la levadura" con lo que ya disponía de pruebas de que los productos de estas dos fermentaciones estaban específicamente asociados con el crecimiento de dos microorganismos morfológicamente distinguibles. Tomó muestras de los sedimentos de los dos
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tipos de fermentaciones y los inoculó en tubos que contenían azúcar como fuente de carbono; en el caso de los "glóbulos mucho más pequeños que los de la levadura" pudo reproducir la fermentación láctica y observar los diminutos glóbulos en el sedimento que aparecía en los tubos. La adición del sedimento de las tinas en las que se había producido alcohol, dió una típica fermentación alcohólica apareciendo en el fondo de los tubos glóbulos de levaduras.
En 1866, Pasteur publicó la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservación y envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas había un método para aumentar la calidad de la conservación de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68° C durante 10 minutos y después enfriarlos rápidamente. Esta técnica ha venido a ser conocida como pasteurización y es ahora ampliamente utilizada en el tratamiento de la leche.
1.2.4. Descubrimiento de la función de los microorganismos como causantes de enfermedades (Koch y la bacteria del carbunco)
Ya en 1546 Girolano Fracastoro había sugerido que las enfermedades podían deberse a organismos tan pequeños que no podían verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes específicos de las enfermedades infecciosas en los animales fue realizado a través del estudio del carbunco, infección grave de los animales domésticos que es transmisible al hombre. La demostración concluyente de la causa bacteriana o etiología del carbunco la proporcionó en 1876 Robert Koch, un médico rural alemán. Kosch empezó a estudiar el mundo microbiano después de que su mujer le regalara por su 28 cumpleaños un microscopio. Seis años después Koch anunció al mundo que había encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis). Posteriormente él y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera.
Esta serie de experimentos se ajustaban a los criterios necesarios para poder establecer la relación causal entre un organismo específico y una enfermedad específica. Estos criterios se conocen como los postulados de Koch:
a. El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad.
b. El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el laboratorio.
c. La enfermedad específica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se inocula a un hospedador susceptible sano.
d. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado experimentalmente.
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del mosaico del tabaco pasaba los filtros que retenían a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los postulados de Koch.
Este trabajo sobre el carbunco condujo rápidamente a la edad de oro de la bacteriología. En 25 años la mayoría de los agentes bacterianos de las principales enfermedades humanas habían sido descubiertos y descritos.
1.2.5. Desarrollo en la prevención de enfermedades (Lister y el fenol; Pasteur y las gallinas; Fleming y el hongo contaminante)
Actualmente es difícil comprender la magnitud de la miseria y devastación causada por los microorganismos antes de 1950. En Europa, durante el período de 1347-1350 ocurrió una epidemia de peste bubónica, conocida como la "muerte negra" y causada por una bacteria (Yersinia pestis). A causa de esta enfermedad en Francia murieron de un tercio a la mitad de la población y se estimó que en toda Europa murieron 25 millones de personas. Con el conocimiento de que los microorganismos causaban enfermedades, los científicos se dedicaron a investigar la prevención y el tratamiento. Los hospitales adoptaron la antisepsia, la cual previene la diseminación de las enfermedades infecciosas mediante la inhibición o destrucción de los agentes causantes. También se descubrió la inmunización, un proceso que estimula las defensas del cuerpo frente a la infección. Se empezó a aplicar la quimioterapia, tratamiento de las enfermedades con una sustancia química, a medida que los investigadores encontrabanmedicamentos más efectivos. También influyó la sanidad pública, sobre todo la higiene relacionada con los alimentos y aguas. Antisepsia: Hacia 1860 un cirujano inglés llamado Joseph Lister investigaba la forma de eliminar los microorganismos de las incisiones realizadas en las operaciones quirúrgicas. Por esa época, las muertes por infección después de una operación quirúrgica eran muy frecuentes. El propio Lister tenía anotado en su cuaderno de notas que el 45% de sus pacientes morían a causa de las infecciones quirúrgicas. Para evitarlo utilizó una solución diluída de fenol (que ya se sabía que mataba a las bacterias) para lavar las ropas de los cirujanos y todo el marterial quirúrgico, así como en spray en el quirófano durante la operación. Estos experimentos fueron el origen de la técnica aséptica.
Inmunización: En 1880 Pasteur utilizó las técnicas de Koch para aislar y cultivar la bacteria que causa el cólera en gallinas. Para probar su descubrimiento convocó una demostración pública del experimento que había sido un éxito repetidas veces en el laboratorio. Inyectó un cultivo puro de la bacteria del cólera en gallinas sanas y esperó a que desarrollaran los síntomas y murieran. Per para su desgracia, las gallinas siguieron vivas. Revisando el
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experimento fallido descubrió que había utilizado cultivos viejos en lugar de cultivos frescos preparados especialmente para la demostración. Algunas semanas más tarde repitió el experimento usando dos grupos de gallinas: uno con gallinas inoculadas en el experimento anterior con el cultivo viejo y otro con gallinas nunca inoculadas. Ahora inyectó en ambos grupos cultivos frescos. En este experimento las gallinas del segundo grupo murieron, pero las del primero permanecían vivas. Estos resultados intrigantes pronto encontraron una explicación para Pasteur. El había descubierto que la bacteria, si se dejaba crecer durante largo tiempo, podía volverse avirulenta. Pero esta bacteria avirulenta estimulaba algo en el hospedador, en este caso las gallinas, que resistían infecciones posteriores haciéndoles inmunes a esa enfermedad. Pasteur aplicó este principio de inmunización en la prevención del carbunco en animales y funcionó. A estos cultivos avirulentos los llamó vacunas (del latín vacca). Usando este término Pasteur reconoció el trabajo de Edward Jenner que en 1798 vacunó con éxito a un niño (James Phipps) de viruela, vacuna que obtuvo de las pústulas de una vaca con viruela.
El reconocimiento internacional de Pasteur le supuso un nuevo reto ya que le encargaron que encontrara una vacuna contra la rabia. En aquel momento no se conocía el agente causante de la rabia pero Pasteur creía que era un microorganismo. Hoy sabemos que es un virus. Finalmente obtuvo una vacuna frente a la rabia que funcionaba en perros, lo cual es diferente a humanos. En Julio de 1885, un niño llamado Joseph Meister fué mordido por un lobo rabioso, la familia del niño persuadió a Pasteur para que utilizara la vacuna en el niño (la enfermedad era mortal) que resultó un éxito. Posteriormente esta vacuna salvó a un grupo de campesinos rusos que habían sido mordidos por otro lobo rabioso. Como agradecimiento, el zar de Rusia envió a Pasteur 100.000 francos que utilizó para construir el Instituto Pasteur de París.
Quimioterapia: El tratamiento de las enfermedades mediante compuestos químicos no es nuevo. En 1495 ya se utilizaban sales de mercurio para tratar la sífilis, aunque este tratamiento hizo bueno el axioma: Graviora quaedum sunt remedia periculus, es decir "Es peor el remedio que la enfermedad" ya que determinados tratamientos, como es el caso del mercurio, son tóxicos para las células animales y humanas. Para que un agente quimioterápico sea efectivo en el tratamiento de una enfermedad infecciosa no sólo debe de matar o inhibir al microorganismo causante de la infección sino que además debe ser relativamente inocuo para las células humanas al exhibir toxicidad selectiva. El primer gran descubrimiento en este sentido fue hecho por Paul Ehrlich a principios del siglo XX. Este médico alemán creía que era posible obtener un compuesto químico que pudiera curar específicamente la sífilis sin dañar al paciente. El conocía que el arsénico inhibía al microorganismo causante de la sífilis (Treponema pallidum) pero que también era tóxico para las células
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humanas. Ehrlich trabajó en la idea de que el arsénico podía incorporarse dentro de compuestos orgánicos de tal manera que perdiera su toxicidad para las células humanas manteniendo sus propiedades antimicrobianas. Después de ensayar 605 sustancias con estas características encontró un compuesto, el 606, que cumplía estos requisitos. A esta sustancia la llamó Salvarsan y fue el primer compuesto químico sintetizado en laboratorio que podía curar una enfermedad sin ser tóxico para el paciente. Gracias a este descubrimiento le concedieron el premio Nobel en 1908. Hoy en día ya no se utiliza salvarsan para tratar la sífilis ya que ha sido reemplazado por un producto mucho más efectivo, el antibiótico penicilina.
Hasta 1935 no se realizó ningún nuevo avance en quimioterapia. En ese año Gerhard Domagk trabajando en la Bayer realizó un descubrimiento importante. Después de llevar a cabo experimentos con más de 1000 colorantes sintéticos para comprobar si alguno de ellos podía curar las infecciones causadas por estreptococos en ratones sin dañar a los animales, descubrió que un colorante rojo llamado Prontosil era efectivo. Este descubrimiento le valió el premio Nobel en 1939. Curiosamente, este colorante no era capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias crecidas en laboratorio; sólamente era efectivo cuando las bacterias crecían dentro del cuerpo del animal. Esta aparente contradicción fue resuelta en el mismo año por un químico francés Jacques Tréfouël al observar que el prontosil era transformado en el cuerpo en un compuesto incoloro diferente que sí tenía actividad específica frente a bacterias. Esta nueva sustancia era la sulfonamida. En un corto período de tiempo se determinó su estructura siendo posible sintetizarla en gran escala y desarrollar nuevos compuestos que se denominaron sulfamidas que aún hoy en día se siguen utilizando.
El salvarsan y las sulfamidas son ejemplos de agentes quimioterapéuticos sintéticos obtenidos mediante síntesis química en un laboratorio. Sin embargo, existe una segunda categoría: agentes quimioterapéuticos naturales, llamados antibióticos. Un antibiótico es una sustancia producida por un microorganismo que es inhibitoria para otros microorganismos en muy pequeña cantidad. En 1928 el microbiólogo inglés Alexander Fleming observó que en una placa de agar inoculada con Staphylococcus aureus que estaba contaminada con el hongo Penicillium notatum, las colonias de Staphylococcus eran destruídas por alguna actividad de las colonias del hongo. A partir de este hongo realizó la extracción de un compuesto que era el responsable del efecto inhibitorio al que llamó Penicilina. Si bien Fleming reconoció el enorme potencial terapéutico de la penicilina, encontró serios problemas para aislarla y purificarla. El primer ensayo clínico con una preparación cruda de penicilina se llevó a cabo el 12 de Febrero de 1941. El paciente era un policía de Oxford que se estaba muriendo por una infección con Staphylococcus (septicemia). Al administrarle penicilina se observó un mejoramiento espectacular, pero 5 días después, cuando se les
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acabó la penicilina, la infección volvió a emerger y el paciente murió. Este ensayo clínico falló debido a que no se podía obtener una producción a gran escala de penicilina. En este punto (1940-1941) los británicos estaban inmersos en la II guerra mundial. Los americanos se interesaron por la penicilina y la fundación Rockefeller invitó al inglés Florey para que investigara la producción a gran escala de la penicilina junto con universidades e industrias farmacéuticas americanas. Esta cooperación hizo posible que un año después estuvieran disponibles grandes cantidades de penicilina. Muy pocos descubrimientos científicos han tenido tanto efecto en el campo de la medicina como el descubrimiento de los antibióticos.
1.2.6. Microbiología y genética (Neumococos, doble hélice e ingeniería genética)
Antes de 1940 el conocimiento del fenómeno genético provenía de las investigaciones sobre plantas y animales, pero no se sabía si estos resultados se podían aplicar a los microorganismos. En 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod y MacLyn McCarty descubrieron el papel del DNA en la genética bacteriana. Encontraron que el material de DNA de un tipo de neumococos puede transferir una característica hereditaria a otro tipo de neumococos. Posteriormente, en 1953 Watson, Crick y Wilkins descubrieron la estructura molecular del DNA. Estos descubrimientos, junto con otros, establecieron que la información genética de todos los organismos está codificada en el DNA. Esto hizo de los microorganismos un modelo muy atractivo para la investigación genética. Actualmente y utilizando la tecnología del DNA recombinante o ingeniería genética se pueden transferir fragmentos de DNA de un organismo a otro.
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PREGUNTAS DE AUTOEVALUACION
a) ¿Cuál de los siguientes hechos no formó parte de la controversia sobre la generación espontánea o abiogénesis?
a) Los hallazgos de Spallanzani (1769) sobre el calentamiento de infusiones en envases cerrados impedía la generación espontánea
b) La teoría microbiana de las enfermedades expuesta por Koch en 1876
c) Los experimentos de Pasteur en 1861 sobre infecciones estériles, microorganismos del aire y frascos con cuello de cisne d) Las observaciones de Redi (1665) sobre el crecimiento de
gusanos en la carne en putrefacción.
e) La esterilización del aire llevada a cabo por Schwann en 1837 como comprobación de ser la causa de contaminación de las infusiones estériles
b) Tuvieron un papel destacado en el desarrollo de la teoría microbiana de las enfermedades: 1=Pasteur con la demostración de que un protozoo era la causa de una enfermedad en los gusanos de seda; 2= Walter Reed con la demostración de transmisión por vectores de la fiebre amarilla; 4=Koch demostrandoque la causa del carbunco era una bacteria.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
c) Señale cuales de los siguientes son postulados de Koch sobre las enfermedades infecciosas bacterianas: 1 = El microorganismo productor tiene que estar en todos los enfermos y no en los sanos; 2= El microorganismo tiene que cultivarse en el laboratorio en cultivo puro; 4 = El microorganismo tiene que poderse ver al microscopio en fresco o teñido; 8 = Mediante la inoculación de los microorganismos tiene que producirse experimentalmente la enfermedaden los animales de laboratorio; 16 = En los animales con la enfermedad experimental hay que aislar el microorganismo causal
a)23 b)27 c)29 d)30 e)31
d) Pueden ser considerados como microorganismos acelulares: 1= Los virusfiltrables (Ivanowsky 1892); 2 = Los viroides (1967); 4= Los priones(1981).
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
e) La clasificación de organismos conta de tres Imperios : Archea, Bacteria y Eucaria. ¿Qué agrupaciones o reinos se incluyen dentro del imperio Archea?:
a)Metanógenas, Halófilas extremas y Termófilas b) Bacteria y Cianobacterias
c) Fungi d) Archezoa e)Cromista
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f) En la práctica y desarrollo de la antisepsis fueron hitos históricos: 1= Semmelweis (1843) introduciendo el Cloro en el lavado de manos; 2= Lister (1864) utilizando fenol para desinfectar habitaciones; 4= Paster (1885) introduciendo la vacuna de la rabia. Solución:
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
g) Señale cuales de los siguientes son postulados de Koch sobre las enfermedades infecciosas bacterianas: 1 = El microorganismo productor tiene que estar en todos los enfermos y no en los sanos; 2=El microorganismo tiene que cultivarse en el laboratorio en cultivo puro; 4 = El microorganismo tiene que poderse ver al microscopio en fresco o teñido; 8=Mediante la inoculación de los microorganismos tiene que producirse experimentalmente la enfermedad en los animales de laboratorio 16. En los animales con la enfermedad experimental hay que aislar el microorganismo causal Sol.
a)23 b)27 e)29 d)30 e)31
h) ¿Cuál de los siguientes microorganismos posee naturaleza celular? a) Viroides b) Arqueobacterias c)Priones
d) Virus e) Ninguno de los anteriores i) ¿Cuál de las siguientes secuencias es la correcta?
a) Reino, Variedad, Orden, Género, Especie b) Especie, Familia, Clase, Tribu, Reino c) Familia, Orden, Clase, División, Reino d) Reino, Clase, Familia, Especie, División
e) Subfamilia, Género, Subespecie, Subdivisión, Biovar
j) ¿Cuál de los siguientes acontecimientos relacionados con la Microbiología ha tenido lugar en época más reciente?
a) La teoría de la generación espontánea b) El descubrimiento de los virus
c) El descubrimiento del microscopio electrónico d) La aplicación de la taxonomía numérica e) La erradicación de la viruela
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Capitulo 2. OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS: EL MICROSCOPIO, PREPARACION Y EXAMEN DE MUESTRAS
2.1. El microscopio
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético.
2.1.1. Microscopio óptico
Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.
Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.
La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento.
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Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y es por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño.
d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ángulo de la lente objetivo; N: índice de refracción del medio; N sen a: apertura numérica.
Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir aperturas numéricas mayores que ésta, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión que se utilizan con los objetivos de inmersión obteniendo una apertura numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, al utilizarse la luz visible (longitud de onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un tamaño más pequeño de 0,25 µm no pueden distinguirse unas de otras.
2.1.2. Microscopio electrónico
Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces.
A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser
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observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan células enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen. A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).
2.2. Microscopia óptica
Además del microscopio de campo claro existen otros microscopios ópticos como son el de campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases.
Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz directa bien una bombilla bien la luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir. Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio óptico equipado con un condensador y objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a un fondo oscuro. Este método se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teñir.
Microscopio de fluorescencia: la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde). Se utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar. Esta técnica se usa en clínica.
Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula. El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
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2.3. Observación de los microorganismos
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comunmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos.
Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases.
2.3.1. Técnicas de tinción
En general, el proceso seguido en todas las tinciones con lleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.
1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:
Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste.
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2.4. Tinción de Gram
Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el danés Christian Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:
Cristal violeta (colorante azul)
Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de un colorante)
Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias) Safranina (colorante de contraste, rojo)
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según la composición de la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol después de la decoloración con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí lo retienen y aparecen teñidas de azul oscuro.
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PREGUNTAS DE AUTOEVALUACION
1. El límite de resolución de un microscopio: 1= Disminuye al aumentar la longitud de onda de la fuente de iluminación; 2= Aumenta al disminuir la apertura numérica del objetivo; 4= Aumenta al
aumentar el índice de refracción del medio; 8= Aumenta al aumentar el ángulo de la luz que entra en el objetivo
a)2 b)5 c)9 d)13 e)14
2. El límite de resolución de un microscopio: 1=Es inversamente proporcional al poder de resolución; 2=Es inversamente proporcional a la apertura numérica del objetivo; 4=Es directamente proporcional al índice de refracción del medio.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
3. Las técnicas de tinción en microscopía: a) aumentan el límite de resolución b) aumentan el contraste
c) aumentan la apertura numérica d) evitan las aberraciones esféricas e) evitan las aberraciones cromosómicas
4. Que tinción realizaría para comprobar la existencia de bacilos tuberculosos en el esputo de un paciente?:
a) Tinción de esporas b) Tinción de Gram.
c) Tinción de Ziehl-Nielsen
d) Tinción de corpúsculos metacromáticos
5. ¿Qué tipo de microscopio posee mayor poder de resolución? a) Contraste de fases b) Fluorescencia
c) Barrido d) De luz ultravioleta e) Óptico
6. Las bacterias Gram (-): 1= se decoloran por alcohol-acetona; 2=la coloración final de Gram es rojo; 4= el espesor del peptidoglicano es menor (2nm) que en las Gram + (10-20nm): 8= presentan una membrana externa con lípidos; 16= presentan ácidos teicoicos.
a) 3 b) 7 c) 15 d) 27 e)31
7. ¿Cual es el principal motivo por el que usarías un microscopio de fluorescencia?:
a) Para observar células en movimiento b) Para observar virus
c) Para observar estructuras bacterianas
d) Para apreciar la forma de un microorganismo "in vivo" e) Para realizar diagnóstico en clínica
8. Después de añadir el alcohol (como decolorante) en la tinción de Gram, las células se verían:
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a) Rojas las Gram negativas y azules las Gram positivas b) Azules las Gram negativas y rojas las Gram positivas c) Azules las Gram negativas y positivas
d) Incoloras las Gram negativas y azules las Gram positivas e) Azules las Gram negativas e incoloras las Gram positivas 9. En el microscopio electrónico de barrido: 1=Los virus no pueden
verse debido a su pequeño tamaño; 2=Se pueden observar microorganismos vivos; 4=Los microorganismos se observan en tres dimensiones.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
10. En el microscopio óptico de campo oscuro: 1= Los virus no pueden verse debido a su pequeño tamaño; 2 = Se pueden observar microorganismos vivos; 4 = Los microorganismos se observan en tres dimensiones.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
11. En el microscopio electrónico de transmisión: 1=Los virus sí pueden verse a pesar de su pequeño tamaño; 2=No se pueden observar microorganismos vivos; 4=Los microorganismos se observan en tres dimensiones.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
12. En un microscopio óptico, cuanto menor sea la longitud de onda de la fuente de iluminación:
a) Mayor es el límite de resolución b) Mator es el poder de resolución c) Mayor es el contraste
d) Mayor es el poder de ampliación e) Menor es el contraste.
13. ¿Qué lentes del microscopio de fluorescencia son de cuarzo?: a) Condesador y Objetivo b) Objetivo y Ocular c) Condensadro y Ocular d) Sólo el condensador e) Sólo el ocular
14. La tinción de Gram: 1=Permite visualizar cápsulas; 2=Se basa en la resistencia a la decoloración por alcohol de determinadas bacterias; 4=Diferencia a las bacterias en dos grandes grupos.
a)3 b)4 c)5 d)6 e)7
15. Mediante el empleo del aceite de inmersión en un microscopio óptico, conseguimos:
a) Disminuir la apertura numérica del objetivo b)Aumentar el límite de resolución del microscopio c) Aumentar el poder de resolución del microscopio d) Aumentar el contraste
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Capitulo 3. LA CELULA PROCARIOTICA: ESTRUCTURA Y FUNCION
3.1. Bacterias
Las bacterias son seres microscópicos, unicelulares, son de diversas formas y que se reproducen por simple división celular. Se necesita la ayuda del microscopio, con unos 1000 aumentos o más para poderlas contemplar, además de proceder previamente a su coloración.
3.2. Morfologia de las bacterias
A.- Tamaño: Invisibles al ojo humano, las bacterias típicas miden de 1 a 3 m de largo por 0.4 a 1 m de ancho, hay otras mayores o menores. El tamaño de las bacterias varía dependiendo de las especies. Una característica de las células bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de la superficie y el volumen de la célula. Esto significa que poseen una gran superficie a través de la cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual pueden realizar muchas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. Así, por ejemplo Escherichia coli tarda 20 minutos en dividirse mientras que una célula de mamífero en laboratorio tarda de 13 a 24 horas. B.- Forma: La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias poseen una de las tres formas fundamentales:
• Cocos: bacterias con forma esférica, pueden ser ovoides o elípticas • Bacilos: bacterias con forma cilindrica.
• Espirales: bacterias con forma espiral o helicoidal
Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen constante su forma, algunas especies pueden variar la forma por lo que se les llama pleomórficas. Arthrobacter es un ejemplo de pleomorfismo debido a que su forma cambia en función de la edad del cultivo. También exhiben pleomorfismo aquellas bacterias que no poseen pared celular como es el caso de los micoplasmas. Otro ejemplo son las formas L que son bacterias que carecen de pared celular debido a una situación de estrés (choque térmico u osmótico, antibióticos, etc.), pero cuando cesa el estrés sintetizan de nuevo la pared celular. Debido a que la forma es un carácter taxonómico, el pleomorfismo puede inducirnos a confusión ya que podemos pensar que un cultivo está contaminado con otro tipo de bacterias. Sin embargo, el pleomorfismo no suele ser lo más frecuente.
C.- Disposición: Muchas veces al mirar al microscopio se observan las células unidas unas a otras. Mientras que las bacterias de forma espiral (espirilos)
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suelen ser células separadas, otras especies suelen crecer en una disposición característica, disposición que va a depender del plano en el que se realice la división celular y si la célula hija permanece junto a la célula madre una vez realizada la división celular. Cada una de estas disposiciones es típica de una especie particular y puede usarse en identificación. Hay que tener en cuenta que raramente todas las células de una especie se disponen exactamente de la misma manera; por lo que hay que tener en cuenta la disposición predominante cuando se estudian las bacterias.
Cuando un coco se divide en un plano forma un diplococo o dos células juntas (Neisseria). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido después de varias divisiones formando una cadena se denomina estreptococo (Streptococcus). Si las células se dividen en más de un plano o dimensión la disposición es más complicada. Cuando un coco se divide en ángulo recto al primer plano de división forma tétradas o tetracocos (Pediococcus). Una posterior división en el tercer plano puede resultar en un paquete cúbico de ocho células conocido como sarcinas (Sarcina). Si la división en los tres planos es de forma irregular se forman racimos de uva (Staphylococcus). Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria tiende a agruparse en empalizada. Las células del género Caulobacter (bacilo acuático) crece en roseta sobre rocas y superficies similares. Dentro del género Bacillus algunas especies forman cadenas y se llaman estreptobacilos.
También existen bacterias ramificadas como son los actinomicetos y ya hemos descrito las formas pleomórficas.
3.3. Ultraestructura de las bacterias
Las técnicas de microscopía revelan que una célula bacteriana está formada por diversas estructuras que funcionan conjuntamente. Algunas de estas estructuras se encuentran unidas a la superficie de la pared celular, mientras que otras se encuentran dentro de la célula. Algunas son comunes a todas las células como son el citoplasma y la membrana citoplasmática; mientras que otras estructuras están presentes sólo en ciertas especies o aparecen en determinadas condiciones ambientales.
Una típica célula bacteriana contiene las siguientes estructuras:
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2.- Pared celular: separa a la bacteria del medio que la rodea. Suele ser rígida y es de naturaleza glúcido-lípido-proteica.
3.- Periplasma: espacio entre la pared celular y membrana citoplasmática. 4.- Membrana citoplasmática: separa el citoplasma de la pared celular. Está compuesta de proteínas y lípidos.
5.- Citoplasma: es una solución coloidal que contiene elementos nucleares, inclusiones citoplasmáticas (vacuolas, vesículas, etc.) y ribosomas.
6.- Flagelos: nacen en el citoplasma y son estructuras de locomoción. Están compuestos de proteína (flagelina).
7.- Fimbrias o pili: formaciones piliformes que nacen en el citoplasma. Están compuestos de proteína (pilina).
3.3.1. Glicocalix
Algunas células bacterianas están rodeadas por una capa de material viscoso llamada glicocalix. Este glicocalix está compuesto por polímeros de azúcares (polisacáridos). Si el glicocalix está organizado en una estructura definida y está unido firmemente a la pared celular se denomina cápsula. Si por el contrario está desorganizado, sin una forma definida y no está firmemente unido a la pared celular se denomina capa mucilaginosa.
Composición: polisacáridos y en menor proporción polipéptidos.
Función: Existen diferentes funciones dependiendo de la especie bacteriana: Adherencia: es la principal. Streptococcus mutans se adhiere a través
de la cápsula a la superficie de los dientes originando caries. Sin la cápsula el microorganismo se elimina fácilmente con la saliva.
Resistencia a la desecación: las cápsulas poseen muchos grupos polares que al retener moléculas de H2O protegen a la célula frente a la desecación.
Material de reserva.
Patogenicidad y virulencia: los neumococos sin cápsula son avirulentos.
3.3.2. Pared celular
La pared celular de los organismos procariotas es una estructura rígida que mantiene la forma característica de cada célula bacteriana. Dependiendo de las
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especies y de las condiciones de cultivo, la pared celular puede suponer desde el 10% al 40% del peso seco de la célula.
Composición química y propiedades de la pared celular bacteriana: las paredes celulares no son estructuras homogéneas sino que poseen distintas capas que varían según el tipo de bacteria, existiendo diferencias tanto en su grosor como composición. Estas diferencias se utilizan para identificar y clasificar las bacterias, así como diferenciarlas mediante la tinción de Gram. La pared celular de las bacterias Gram (-) es más delgada (10 - 15 nm) que la de las Gram (+) (20 - 25 nm). Tanto las bacterias Gram (+) como las Gram (-) poseen un heteropolímero conocido como peptidoglucano o mureína, responsable de la rigidez y fuerza mecánica de la pared celular, de la forma bacteriana y de la resistencia a la lisis osmótica. Es una red bidimensional que rodea a la célula a modo de saco. Existe prácticamente en todas las bacterias y es exclusivo de procariotas. Si bien existen más de 100 peptidoglucanos distintos, su estructura básica está compuesta por tres componentes:
1.- N-acetilglucosamina (NAG) 2.- Acido N-acetilmurámico (NAM)
3.- Péptido de 4 aminoácidos o tetrapéptido, algunos de los cuales son D-aminoácidos.
Para formar una estructura rígida alrededor de la célula, el tetrapéptido de una cadena se une al de otra a través de un enlace peptídico entre la D-alanina y el ácido meso-diaminopimélico. Algunas zonas del peptidoglucano son abiertas por enzimas bacterianos llamados autolisinas para que así se puedan añadir más polímeros y la célula pueda crecer y dividirse.
A parte de dar forma a la célula bacteriana, la pared celular sirve como barrera para algunas sustancias impidiendo que penetren dentro de la célula y permitiendo el paso a otras. La importancia de la pared celular se comprende en parte gracias a experimentos usando enzimas que la degradan. La pared celular de una bacteria Gram (+) se destruye completamente con el uso de estos enzimas obteniéndose unas células esféricas llamadas protoplastos. La pared celular de las Gram (-) es más resistente a este tratamiento, manteniendo restos de su pared celular originando esferoplastos. Tanto los protoplastos como los esferoplastos se lisan si los colocamos en un medio hipotónico.
Pared celular de las bacterias Gram (+): Contiene una sola capa compuesta de peptidoglucano y ácidos teicoicos que son polímeros de glicerol o ribitol fosfatos que se unen al peptidoglucano o a la membrana citoplasmática. Al estar cargados (-) pueden ayudar en el transporte de iones (+).
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Pared celular de las bacterias Gram (-): Contiene dos capas, una membrana externa y una capa de peptidoglucano. El espacio que existe entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se denomina espacio periplásmico. La capa característica de las Gram (-) es la membrana externa que actúa como barrera selectiva al paso de algunas sustancias. Su estructura básica es una bicapa lipídica que contiene fosfolípidos (capa interna), lipopolisacáridos y proteínas (capa externa). Esta bicapa está unida al peptidoglucano a través de lipoproteínas. De todos estos componentes, los lipopolisacáridos (LPS) son característicos de las bacterias Gram (-) y sólo se encuentran en la membrana externa. Los LPS están compuestos de tres partes unidas covalentemente:
a. Lípido A, localizado en la parte interna; compuesto por un disacárido de glucosamina fosforilado con ácidos grasos de cadena larga.
b. Núcleo polisacarídico, localizado en la superficie de la membrana; compuesto por azúcares y KDO (ketodeoxioctónico).
c. Antígeno O, localizado fuera de la membrana; compuesto por polisacáridos que contienen azúcares comunes como galactosa y otros exclusivos de bacterias como la abecuosa.
3.3.3. Membrana citoplasmática
Aproximadamente de 7,5 nm, está compuesta fundamentalmente de fosfolípidos (20% - 30%) y proteínas (50% - 70%). Los fosfolípidos forman una bicapa donde se intercalan las proteínas. En la bicapa lipídica, la parte polar soluble en H2O está alineada hacia afuera de la bicapa y la parte no polar hacia adentro. Estos fosfolípidos de la membrana la hacen fluída, permitiendo que las proteínas se muevan alrededor. La mayor parte de las membranas citoplasmáticas de procariotas no contienen como ocurre en los eucariotas esteroles tales como el colesterol por lo que son menos rígidas que las de los eucariotas.
Función de la membrana citoplasmática:
Actúa como barrera para la mayor parte de las moléculas solubles en H2O, siendo mucho más selectiva que la pared celular.
Contiene enzimas biosintéticos que actúan en la producción de energía y síntesis de la pared celular.
Las células bacterianas no contienen orgánulos como las mitocondrias y cloroplastos de las células eucariotas; sin embargo, la membrana citoplasmática de muchas bacterias se extiende dentro del citoplasma formando unos túbulos que se llaman mesosomas. Estos mesosomas pueden localizarse cerca de la membrana citoplasmática o más adentro en el citoplasma. A estos últimos, los mesosomas centrales, se une el material nuclear de la célula y se piensa que intervienen en la replicación del DNA y división celular. Los mesosomas periféricos parecen estar implicados en la secreción de ciertos enzimas como son las penicilinasas que destruyen la penicilina. También actúan como
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centros con actividad respiratoria o fotosintética ya que este sistema de membranas aumenta la superficie disponible para estas actividades.
3.3.4. Area citoplásmica
El citoplasma es un fluido que contiene sustancias disueltas y partículas en suspensión como los ribosomas. El 80% del citoplasma corresponde a H2O y el
resto lo componen ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, iones orgánicos, compuestos de bajo peso molecular y partículas. En este fluido espeso ocurren muchas reacciones químicas tales como la síntesis del material celular a partir de los nutrientes (anabolismo).
Ribosomas: son unas partículas donde tiene lugar la síntesis de proteínas. Se encuentran tanto en procariotas como eucariotas. Sin embargo en las células bacterianas al no existir sistemas internos de membranas, los ribosomas se encuentran libres en el citoplasma o bien asociados a la parte interna de la membrana citoplasmática. Los ribosomas están compuestos de un 60% de RNA y un 40% de proteínas. Los ribosomas bacterianos están formados por dos subunidades de diferente tamaño: 50 S y 30 S que conjuntamente forman el ribosoma bacteriano 70 S (S = Svedberg units, unidades de sedimentación donde influyen el tamaño y la forma):
- 50 S: RNA 23 S + RNA 5 S + 35 proteínas - 30 S: RNA 16 S + 21 proteínas
Inclusiones: diferentes tipos de sustancias químicas pueden acumularse y formar depósitos insolubles en el citoplasma:
Glóbulos de sulfuro que sirven de reserva de energía para bacterias que oxidan el H2S.
Gránulos de volutina o gránulos metacromáticos que son de polifosfato. Acumulan fosfato cuando la síntesis de ácidos nucleicos está impedida. Se tiñen de color púrpura con azul de metileno y se usan para identificar ciertas bacterias.
Poly-ß-hidroxibutirato (PHB) es un material lipídico que actúa como reserva de fuente de carbono y energía. Con sudam III se tiñen de negro.
Glucógeno es un polímero de glucosa que se tiñe rojo con lugol. 3.3.5. Area nuclear
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Al contrario que los eucariotas, los procariotas no poseen una membrana que englobe al núcleo. El material nuclear en una bacteria ocupa la zona central de la célula y parece estar unido a los mesosomas. Este material nuclear llamado nucleoide está formado por un único cromosoma circular. También pueden existir plásmidos que son elementos extracromosómicos compuestos de DNA.
3.3.6. Flagelos
Son filamentos helicoidales que se extienden desde el citoplasma a través de la pared celular. Los flagelos son los responsables de la movilidad de las bacterias en los líquidos, llegando a velocidades de 100 µm / segundo, lo que equivale a 3000 veces la longitud de su cuerpo por minuto. El guepardo, uno de los animales más veloces, alcanza una velocidad máxima de 1500 veces la longitud de su cuerpo por minuto.
Un flagelo consta de tres partes: cuerpo basal, gancho y filamento. El cuerpo basal que se encuentra dentro de la célula está compuesto por un cilindro central y varios anillos. Las bacterias Gram (-) tienen 2 pares de anillos, los exteriores unidos a la pared celular y los interiores a la membrana citoplásmica. En las bacterias Gram (+) sólo existe un par de anillos, uno está en la membrana citoplasmática y el otro en la pared celular. Los flagelos funcionan rotando como un sacacorcho lo que permite a la bacteria moverse en los líquidos. Los anillos del cuerpo basal, a través de reacciones químicas que consumen energía, rotan el flagelo. El filamento está compuesto de moléculas de una proteína llamada flagelina.
No todas las bacterias tienen flagelos (son raros en los cocos) pero en aquellas que los poseen (muchos bacilos y espirilos) se utilizan como criterio de clasificación la posición y el número de flagelos:
Flagelos polares: monotricos, anfitricos y lofotricos Flagelos peritricos
Las bacterias móviles se mueven en una dirección u otra por diferentes razones. Su movimiento puede ser aleatorio, o bien acercarse o alejarse de algo que hay en su ambiente como es buscar luz o alejarse del calor. También exhiben quimiotaxis que es un movimiento en respuesta a productos químicos del ambiente. Por ejemplo, las bacterias se acercan hacia niveles altos de atrayentes como son los nutrientes y se alejan de los niveles altos de sustancias inhibitorias como es el exceso de sales.
3.3.7. Fimbrias o pili
Son formaciones piliformes, no helicoidales, que no tienen nada que ver con el movimiento. Suelen ser más cortos, más delgados y más numerosos que los flagelos. Si bien surgen del citoplasma, no se conoce que posean estructuras de anclaje a la célula. Están formados por subunidades de una proteína llamada
