ESTUDIO DE UN METODO DE SECUENCIACION DE OLIGONUCLEOTIDOS POR FRAGMENTACION QUIMICA ANALIZABLE POR MALDI TOF

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Instituto Politécnico Nacional

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA

UNIDAD QUERÉTARO

POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA

Estudio de un método de secuenciación de oligonucleótidos por fragmentación química,

analizable por MALDI-TOF

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA

PRESENTA

Ma. Guadalupe Arredondo Vázquez

Directores:

Dr. Reynaldo Carlos Pless Elling Dra. Eva González Jasso

Querétaro, Qro. Abril de 2008

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A mis asesores,

por sus enseñanzas, paciencia y por haber hecho posible este proyecto.

A mis maestros, por sus enseñanzas.

A Pedro Martínez Arteaga, por su colaboración.

A Sandra Luz Canchola Magdaleno,

por sus enseñanzas y apoyo.

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´Indice general I

´Indice de tablas III

´Indice de figuras IV

1. Introducci´on 5

2. Antecedentes 7

2.1. Desarrollo del conocimiento del ADN . . . 7

2.2. Metodolog´ıas de secuenciaci´on de los ´acidos nucleicos . . . 11

2.2.1. Comienzos de la secuenciaci´on de los ´acidos nucleicos . . . 12

2.2.2. M´etodo de la mancha itinerante . . . 15

2.2.3. M´etodo del m´as y del menos . . . 17

2.2.4. Secuenciaci´on con terminadores . . . 21

2.2.5. Secuenciaci´on por cercenamiento qu´ımico . . . 27

2.2.6. Pirosecuenciaci´on . . . 34

2.2.7. Secuenciaci´on por hibridaci´on . . . 35

2.3. S´ıntesis qu´ımica de oligonucle´otidos . . . 36

2.4. Usos de los oligonucle´otidos . . . 40

2.5. Espectrometr´ıa de masas MALDI-TOF . . . 41

3. Justificación 45 4. Objetivos 47 5. Materiales y métodos 49 5.1. Evaluación de los autorradiogramas . . . 50

5.1.1. Estimaci´on visual de las intensidades de las bandas . . . 50

5.1.2. Evaluaci´on de bandas electrofor´eticas por densitometr´ıa . . . 51

5.1.3. An´alisis de movilidades de las bandas . . . 51 i

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5.2. Cálculos . . . 51 5.3. Reacciones de aminólisis de oligonucleótidos . . . 52

6. Resultados 53

6.1. Secuenciación de oligonucleótidos radiomarcados en su terminal 5’ . . . . 53 6.2. Simulaciones . . . 67 6.2.1. Cinética de descomposición de un d´ımero d-*pTpT . . . 69 6.2.2. Cálculo de la distribución de los fragmentos de d-*pT₃₂ tras difer-

entes tiempos de aminólisis . . . 69 6.2.3. Cálculo de las distribuciones esperadas tras amonólisis del oligonu-

cleótido I . . . 73 6.2.4. Fragmentos internos del oligonucleótido I . . . 78 6.3. Consideración de la heterogeneidad isotópica . . . 81

7. Discusi´on 83

8. Conclusiones 87

9. Recomendaciones 89

Bibliograf´ıa 91

A. Perfiles densitom´etricos 105

B. C´alculo de valores de pH para soluciones acuosas de aminas a 25°C y de valores de pK_a para aminas en soluci´on acuosa a 110°C 109

C. C´alculo de distribuciones 113

D. Publicaciones 119

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6.1. Susceptibilidad diferencial de las bases heteroc´ıclicas con diferentes aminas . 57 6.2. Basicidad de las diferentes aminas . . . 60 6.3. Evaluación numérica de la separación entre bandas de la simulación MALDI-

TOF . . . 77 C.1. C´alculo de la distribuci´on de fragmentos alineados en la terminal 5’, derivados

de la amonólisis del oligonucleótido I . . . 116 C.2. Cálculo de la distribución de los fragmentos alineados en la terminal 3’, deriva-

dos de la amonólisis del oligonucleótido I . . . 117 C.3. Cálculo de la distribución de fragmentos derivados del oligonucleótido I por

dos cortes amon´oliticos en posiciones G . . . 118

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2.1. Secuenciaci´on con la t´ecnica de la mancha itinerante. . . 16

2.2. Principio del m´etodo del m´as y del menos. . . 18

2.3. Ejemplo de una secuenciación por el método del más y del menos. . . 20

2.4. Principio del m´etodo de secuenciaci´on con terminadores didesoxi. . . 21

2.5. Ejemplo de una secuenciaci´on por el m´etodo de terminadores didesoxi. . . 23

2.6. Secuenciaci´on con detecci´on por fluorescencia en un solo carril. . . 26

2.7. Secuenciaci´on por el m´etodo de Maxam y Gilbert. . . 28

2.8. Mecanismo del cercenamiento para posiciones G en el ADN. . . 29

2.9. Mecanismo del cercenamiento para posiciones C y T en el ADN. . . 29

2.10. Método de secuenciación por cercenamiento qu´ımico con análisis en un solo carril. . . 32

2.11. S´ıntesis qu´ımica de oligonucle´otidos . . . 39

6.1. Autorradiograma obtenido tras solv´olisis del oligonucle´otido I en presencia de NaCl 0.3 M o 1 M. . . 54

6.2. Autorradiograma obtenido tras solv´olisis del oligonucle´otido I en presencia de LiCl 3 M. . . 56

6.3. Autorradiograma obtenido tras solv´olisis del oligonucle´otido I en varias condiciones diferentes . . . 61

6.4. Perfil densitom´etrico del carril 5 de la Figura 6.1. . . 62

6.5. Perfiles densitom´etricos de los autorradiogramas correspondientes a la solv´olisis con: amoniaco, dietilamina y piperidina . . . 63

6.6. Autorradiograma obtenido tras solv´olisis de los olig´omeros SP6 y T7 . . . . 65

6.7. Correlaci´on entre movilidad electrofor´etica y longitud de fragmentos . . . 66

6.8. Correlaci´on entre la inversa de la movilidad y longitud de fragmentos . . . 66

6.9. Gr´afica de la desaceleraci´on por banda . . . 67

6.10. Espectro MALDI-TOF del oligonucle´otido I . . . 68

6.11. Cin´etica de la descomposici´on del d´ımero d-*pTpT . . . 70

6.12. Distribuci´on de los fragmentos obtenidos de d−T₃₂tras diferentes tiempos de amin´olisis . . . 71

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6.13. Cinéticas para el d-*pT₃₂inicial, el producto 19-mero, y el monómero 5’ terminal 73 6.14. Distribuciones calculadas para la piperidinólisis del oligonucleótido I radiomar-

cado . . . 74 6.15. Distribuciones calculadas para los conjuntos anidados 5’ y 3’ obtenidos del

oligonucle´otido I, presentadas por separado . . . 75 6.16. Distribuciones calculadas para los conjuntos anidados 5’ y 3’ obtenidos del

oligonucle´otido I, presentadas en conjunto . . . 75 6.17. Distribuci´on de los fragmentos internos delimitados por dos posiciones G, tras

amon´olisis por t = 0. 03t_1/2 . . . 79 6.18. Distribuci´on de los fragmentos internos delimitados por dos posiciones G, tras

amonólisis por t = 0. 01t_1/2 . . . 79 6.19. Distribución de los fragmentos internos delimitados por dos posiciones G, más

los conjuntos anidados . . . 80 6.20. Distribución de isotopoisómeros calculada para d-G₂₀ . . . 82 A.1. Perfiles densitométricos de las aminólisis obtenidas en presencia NaCl al 0.3 M106 A.2. Perfiles densitométricos para las aminólisis obtenidas en presencia de NaCl al

1 M . . . 108

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Abreviaci´on Descripci´on ADN Acido Desoxirribonucleico´

A Adenina o adenosina

ATP Adenosina 5’-trifosfato

BPB Azul de bromofenol

C Citosina o citidina

dATP 2’-Desoxiadenosina 5’-trifosfato dCTP 2’-Desoxicitidina 5’-trifosfato dGTP 2’-Desoxiguanosina 5’-trifosfato DNasa Desoxirribonucleasa

dTTP 2’-Desoxitimidina 5’-trifosfato EDTA Acido etileno-diaminotetraac´etico´

FAB Fast atom bombardment (bombardeo por ´atomos r´apidos)

G Guanina o guanosina

MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight MS Espectrometr´ıa de masas

Pi Fosfato inorg´anico

PCR (Polymerase chain reaction) Reacci´on en cadena de la polimerasa RNA Acido ribonucleico´

RNasa Ribonucleasa

T Timidina o timina

tRNA RNA de transferencia

XC Xileno cianol

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S´ımbolo Descripci´on cal Calor´ıa

µCi Microcurie cm Cent´ımetro

g Gramo

h Hora

K Kelvin

L Longitud del oligonucle´otido, en unidades nucle´otidicas ln Logaritmo de base e

log Logaritmo de base 10 µl Microlitro

M Concentraci´on molar

m Movilidad electrofor´etica de un oligonucle´otido mm Mil´ımetro

mol Mol

nm Nan´ometro

pH Potencial del i´on hidronio

V Volt

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Este proyecto de investigación evalúa un método de secuenciación de oligonucleóti- dos por fragmentación qu´ımica, que tiene un alto potencial de ser analizable por espectrometr´ıa de masas MALDI-TOF.

La secuenciación del ADN es la determinación de la sucesión precisa de las bases que componen un ADN o un polinucleótido u oligonucleótido. Los oligodesoxirribonucleótidos son tramos cortos (con 50 bases o menos) de ADN de secuencia espec´ıfica, que tienen gran importancia en los ámbitos de la biolog´ıa molecular, del diagnóstico molecular, de pruebas forenses y de estudios filogenéticos. Actualmente, estos oligómeros se sintetizan a pedido en máquinas automatizadas, lo que garantiza un alto grado de confiabilidad de la secuencia. Sin embargo, dada la importancia central de los oligonucleótidos en ciertas

áreas cr´ıticas, es de sumo interés disponer de métodos rápidos, confiables y automati- zables, para determinar de manera confirmatoria la secuencia de estos oligómeros. Tales métodos redundar´ıan en mejoras en los campos de la salud humana, seguridad pública y econom´ıa agropecuaria, entre otros.

En la bibliograf´ıa se ha reportado que polinucleótidos provistos de una marca (ra- dioisotópica o fluorescente) en uno de sus extremos pueden ser secuenciados mediante un tratamiento qu´ımico de fragmentación, que consiste en una aminólisis, seguida de una electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida, y finalmente la evaluación de la distribución en el gel de las bandas marcadas. Sobre esta base se llevó a cabo la interpretación de los autorradiogramas obtenidos por aminólisis de varios oligodesoxi- rribonucleótidos con diferentes aminas (primarias, secundarias y terciarias), amoniaco y NaOH, utilizando métodos cualitativos (visual) y cuantitativos (densitometr´ıa). En general, se obtuvo como resultado que las aminas más fuertemente básicas reaccionan más rápido con el ADN, prefiriendo cortes en posiciones A sobre cortes en posiciones G.

En contraste, las aminas de baja basicidad cortan en G en preferencia sobre A. Cortes en posiciones G son parcialmente suprimidos si la amin´olisis se lleva a cabo en altas concentraciones de sal.

Este abordamiento, ahora comprobado con oligonucleótidos con marca radioisotópi- ca y resolución de la mezcla de fragmentos por electroforesis en gel, promete ser extra- ordinariamente simplificado si se conjunta con la técnica de espectrometr´ıa de masas en la modalidad de MALDI-TOF, que permite la resolución de las mezclas de fragmen-

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tos con gran rapidez y precisión en cuanto a la determinación de masas. Este método también aportar´ıa la ventaja de prescindir de la necesidad de un marcaje especial del oligonucleótido para su secuenciación.

Para evaluar la posibilidad de conjuntar estas dos metodolog´ıas, se realizaron simulaciones de la cinética de fragmentación amonol´ıtica de un 32-mero, considerando los datos experimentales obtenidos de las electroforesis en gel y autorradiograf´ıa, con la finalidad de obtener espectros como los esperados en un análisis de espectrometr´ıa de masas con la técnica de MALDI-TOF. Para estas simulaciones se realizó el cálculo de las distribuciones de los fragmentos del 32-mero, considerando tanto los fragmentos que contienen la terminal 5´ original, como los fragmentos que contienen la terminal 3´ original, as´ı como los fragmentos internos, derivados de múltiples cercenamientos en una misma cadena.

Estas simulaciones indican que la interpretación de las bandas pertenecientes a los dos conjuntos anidados (terminados en 5´ y 3´, respectivamente), que se presentarán de forma intercalada dentro del mismo espectro de masas, será factible, y que la incidencia de fragmentos internos no interferirá en este análisis, siempre y cuando se utilicen tiempos de aminólisis relativamente cortos.

También se evaluó la problemática del ensanchamiento de las bandas, en el espectro de masas, debido a la presencia de isotopoisómeros, obteniéndose como resultado que este tipo de ensanchamiento no dificultará el análisis.

Se concluye que la fragmentación qu´ımica por aminólisis presenta una metodolog´ıa viable para la secuenciación confirmatoria de oligonucleótidos sintéticos, que tiene buenas perspectivas para ser adaptable al análisis por espectrometr´ıa de masas MALDI-TOF, con un alto potencial de permitir una interpretación de la secuencia mediante algoritmos automatizados.

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The present research project evaluates a sequencing method for oligonucleotides based on chemical fragmentation, with a high potential for being analyzable by MALDI-TOF mass spectrometry.

DNA sequencing consists in determining the exact succession of bases which make up a DNA or a polynucleotide or oligonucleotide. Oligodeoxyribonucleotides are short stretches (containing 50 bases or less) of DNA with a specific sequence, which are of great importance in the areas of molecular biology, of molecular diagnostics, of forensic testing, and of phylogenetic studies. At present, these oligomers are synthesized on demand by automatic machines, thus assuring a high degree of reliability of the sequence. Nonethe- less, in view of the central importance of oligonucleotides in certain critical areas, it is of great interest to have rapid, reliable, and automatizable methods to determine, in a confirmatory sense, the sequence of these oligomers. These methods would redound in improvements in the areas of human health, public safety, and in agriculture and animal husbandry, among others.

It has been reported in the literature that polynucleotides labeled (radioisotopically or fluorescently) in one of their ends can be sequenced by a chemical fragmentation treatment which consists in an aminolysis followed by electrophoresis through a denatu- ring polyacrylamide gel, and finally evaluation of the distribution of the labeled bands in the gel. On these grounds, the interpretation of autoradiograms obtained after aminolysis of various oligodeoxyribonucleotides with different amines (primary, secondary, and tertiary) or with ammonia or sodium hydroxide was undertaken, using qualitative (visual inspection) and quantitative (densitometry) methods. It was found that, in general, the more strongly basic amines react more rapidly with the DNA, preferring cuts at A-positions over cuts at G-positions. In contrast, amines of low basicity cut at G in preference over A. Cuts at G-positions are partially suppressed when the aminolysis is performed at high salt concentration.

This approach, which has now proven useful with radioisotopically labeled oligonucleotides and electrophoretic resolution of the fragment mixture, holds out the hope of being vastly simplified if used in conjunction with mass spectrometry in the MALDI-TOF modality, which allows a very rapid resolution of fragment mixtures, with great mass pre- cision. This method would also obviate the need to specially label the oligonucleotide

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prior to its sequencing.

In order to assess the possibilities of combining these two methodologies, simulations of the kinetics of ammonolytic fragmentation were performed for a 32-mer, taking into account the experimental data obtained with gel electrophoresis and autoradiography, to calculate spectra similar to those expected from an analysis by MALDI-TOF mass spectrometry. In these simulations the fragment distributions calculated considered both the fragments containing the original 5’ terminus and the fragments containing the original 3’ terminus, as well as the internal fragments which arise from repeated cleavages within the same chain. These simulations indicate that the interpretation of bands belonging to the two nested sets (terminating in the original 5’ and 3’ terminus, respectively), which will be present in an intercalating manner within the same mass spectrum, will be fea- sible, and that the formation of internal fragments will not interfere with the analysis, as long as aminolysis times are kept relatively short. The problem of band broadening in the mass spectrum caused by the presence of isotopoisomers was also evaluated, with the result that this type of band broadening will not cause problems in the analysis.

It is concluded that chemical fragmentation by aminolysis constitutes a workable methodology for confirmatory sequencing of synthetic oligonucleotides, with good prospect for being amenable to analysis by MALDI-TOF mass spectrometry, with a high potential for allowing sequence interpretation by automatic algorithms.

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Introducci´ on

El ADN es una macromolécula esencialmente lineal, que está compuesta por una secuencia de grupos fosfato y 2-desoxirribosa en estricta alternancia, donde cada uno de los grupos 2-desoxirribosa además está covalentemente ligado a una de las cuatro bases heteroc´ıclicas del ADN, que se conocen como adenina, guanina, citosina y timina. El descubrimiento de este material en los tejidos de animales y plantas fue relativamente tard´ıo, como también lo fue la elucidación de su estructura qu´ımica y su identificación como el material que contiene la información genética y, con eso, la definición de los seres vivientes como especie y como individuos. Desde el momento en que se reconoció su papel central para todos los aspectos de la vida, el ADN ha recibido una atención especial, que llevó hasta la secuenciación total del genoma humano, es decir, la determinación exacta de la secuencia lineal de todas las bases en el ADN humano. En nuestros d´ıas, el análisis del ADN constituye una actividad importante en áreas tan diversas como lo son la secuenciación de diferentes especies de importancia económica, estudios filogenéticos, análisis para predisposición para ciertas enfermedades, estudios forenses, control de con- taminación por microorganismos, entre otras.

En todas estas aplicaciones, un papel sumamente importante es desempeñado por los oligonucleótidos, pequeñas moléculas que comparten, a excepción del tamaño, las ca- racter´ısticas qu´ımicas del ADN. La posibilidad de qu´ımicamente sintetizar estos oligonu- cleótidos con cualquier secuencia estipulada las hace útiles para su aplicación exacta en un sinnúmero de situaciones diferentes, ya que su funcionamiento espec´ıfico está pre- cisamente definido por su secuencia. En nuestros d´ıas esta s´ıntesis de oligonucleótidos es rutinaria, y se realiza de manera rápida en máquinas automatizadas, lo cual garantiza en gran medida la secuencia correcta del producto; sin embargo, en vista de su importancia cr´ıtica en varias de las aplicaciones de los oligonucleótidos, es de interés tener una metodolog´ıa rápida, confiable y económica para confirmar la secuencia de determinado oligonucleótido sintético. Hoy en d´ıa tales metodolog´ıas no existen, ya que los proce- dimientos conocidos para esta tarea en general implican la necesidad de introducir una marca terminal en el oligonucleótido a analizar o son de ejecución relativamente compli-

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cada. En el presente trabajo se evaluó el efecto de las diferentes condiciones de aminólisis de oligodesoxirribonucleótidos sobre la distribución de los fragmentos obtenidos, para fa- cilitar y optimizar la interpretación de estas distribuciones en términos de la secuencia del oligonucleótido inicial, con miras a un futuro uso de la técnica anal´ıtica de espectrometr´ıa de masas MALDI-TOF para el análisis rápido y automatizado de tales mezclas de frag- mentación, para la secuenciación confirmatoria de oligodesoxirribnucleótidos sintéticos.

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Antecedentes

2.1. Desarrollo del conocimiento del ADN

El material genético hoy d´ıa conocido con el nombre de ADN (ácido desoxirribonucleico) fue descrito y caracterizado qu´ımicamente por primera vez en 1869 por el biólogo suizo Johann Friedrich Miescher [Dahm, 2005]. Miescher aisló este material partiendo de las células de pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados, concretamente de los núcleos de estas células. Inicialmente obtuvo una suspensión de leucocitos mediante un lavado de las vendas con una solución acuosa de sulfato de sodio. Después de asentar los leucocitos por gravedad, estos fueron lavados con alcohol y luego digeridos con una enzima proteol´ıtica (pepsina preparada a partir de estómago de porcino) para eliminar prote´ınas que se adher´ıan a la superficie exterior de los núcleos. Los restos de l´ıpidos fueron eliminados con agua/éter, obteniéndose as´ı una suspensión pura de núcleos, la cual fue extra´ıda con una solución alcalina, liberándose un material soluble que se pod´ıa precipitar por adición de ácido. Miescher llamó a este material originario de los núcleos

nucle´ına. Lo analizó en cuanto a su composición qu´ımica elemental, demostrando que se trataba de un nuevo tipo de sustancia celular: por su alto contenido de fósforo y por la ausencia de azufre, la nucle´ına se distingu´ıa claramente de las prote´ınas. Hoy en d´ıa los materiales preparados por Miescher se conocen como nucleoprote´ına.

Otro tipo de ácido nucleico polimérico, originalmente denominado ácido nucleico de levadura por el organismo de preferencia para su obtención, y hoy comúnmente conocido como ARN (ácido ribonucleico), fue analizado en cuanto a las unidades monoméricas que lo constituyen, por Phoebus Aaron Levene, en 1919, quien realizó una purificación y caracterización qu´ımica de los mononucleótidos que se obtienen del ARN de levadura mediante su hidrólisis en solución acuosa de amoniaco. Este trabajo se benefició del hecho que, a diferencia del ADN, el ARN se desintegra rápidamente en medio acuoso básico, con formación de los 2’(3’)-monofosfatos de los nucleósidos que lo componen. Levene logró de esta manera aislar el AMP, el CMP, el GMP y el UMP (es decir, los 2’(3’)-monofosfatos

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de la adenosina, citidina, guanosina y uridina, respectivamente), demostrando con ese trabajo que el biopol´ımero ARN consiste casi exclusivamente de unidades repetidas de adenilato, citidilato, guanilato y uridilato [Levene, 1919]. El hecho de que los cuatro com- ponentes monoméricos del ARN se dieran en proporciones aproximadamente equimolares condujo a Levene a plantear su teor´ıa del tetranucleótido, que postulaba que el ácido nucleico consiste de secuencias tetranucleot´ıdicas monótonamente repetidas, donde cada uno de estos cuartetos contiene una unidad aden´ılica, una citid´ılica, una guan´ılica y una urid´ılica. La idea subyacente era que los ácidos nucleicos sólo desempeñan un papel modesto de andamio sobre el cual se estructuran las prote´ınas, es decir, los biopol´ımeros de verdadera importancia en el sistema biológico. Hoy se sabe que los ácidos nucleicos, lejos de consistir de una monótona repetición de alguna secuencia tetranucleot´ıdica, presentan una variedad prácticamente infinita de secuencias, y lejos de ser meros elementos estructurales, desempeñan funciones complicadas y centrales como son la codificación de la secuencia primaria de otros ácidos nucleicos, as´ı como de las prote´ınas, el manejo del empalme alternativo de transcritos iniciales del ARN, para formar ARN mensajeros alternativos, y la designación de ciertas secuencias de ácidos nucleicos invasores para su posterior degradación.

Mientras se estaban elucidando las propiedades qu´ımicas y la estructura de los ácidos nucleicos, proced´ıan trabajos paralelos que finalmente culminaron en la clarificación de la naturaleza qu´ımica del material que contiene la información genética de las células.

Los primeros experimentos que permitieron establecer que el material genético es el ácido desoxirribonucleico (ADN) se dieron con las investigaciones de Griffith, en 1928, de una enfermedad infecciosa mortal, producida por Pneumococcus [Griffith, 1928]. Utilizó dos cepas de este microorganismo, una que produc´ıa la enfermedad en ratas de laboratorio y otra que no la causaba. Esta última cepa, no virulenta, que en el medio de cultivo produc´ıa colonias de aspecto rugoso, se denominó R (de rough, o sea rugoso), mientras que la cepa virulenta, que produc´ıa colonias de apariencia lisa en la placa de Petri, se denominó S (de smooth, o sea liso). La virulencia del Pneumococcus está dada por la presencia del polisacárido de la cápsula, la cual es diferente dependiendo de la cepa.

Cuando se produce este polisacárido, la colonia se presenta con aspecto liso. Las bacterias de la cepa R, que Griffith inyectó a ratones, no produjeron la enfermedad mientras que la cepa S, s´ı produc´ıa la enfermedad. Al inyectar los ratones con la cepa S previamente muerta por calentamiento a 65°C no se presentaba la enfermedad; sin embargo, cuando se inyectaba una mezcla de Pneumococci de la cepa S muertos por calentamiento y Pneumococci vivos de la cepa R, los ratones contra´ıan la enfermedad y mor´ıan. Las bacterias que Griffith aisló de los ratones muertos eran S; esto los llevó a concluir que las cepas muertas por calor pod´ıan transformar a la cepa (R) y convertirlas en tipo (S).

Griffith postuló la existencia de un factor de transformación al que denominó principio transformador.

Este principio fue aislado posteriormente por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, en 1944, quienes sugirieron que el ADN podr´ıa ser el principio transformador.

Esta idea la cimentaron al a˜nadir ADN purificado a partir de cepas S a un cultivo de

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bacterias R aglutinadas por antisuero, observando que con este tratamiento las c´elulas R se volv´ıan capaces de producir el polisac´arido t´ıpico en la forma S [Avery et al., 1944].

El experimento definitivo de que ADN es el material genético fue realizado por Alfred Hershey y Martha Chase, quienes delucidaron si el ADN o las prote´ınas eran el material hereditario [Hershey and Chase, 1952]. Ellos infectaron bacterias E. coli con bacteriófa- gos T2 previamente marcados con isótopos radioactivos de fósforo ³²P y de azufre ³⁵S para marcar diferenciadamente el ADN y las prote´ınas del virus. Después de un tiempo suficiente para que los virus infectaran las bacterias, éstas fueron agitadas en una mezcladora y sometidas a centrifugación, para as´ı separar las bacterias de los fagos ad- heridos a su superficie: el sobrenadante conten´ıa las cápsides de los fagos y el precipitado las bacterias infectadas. El sobrenadante obtenido de esta centrifugación conten´ıa casi todo el³⁵S, mientras que la mayor´ıa del³²P quedaba asociada a la pastilla de bacterias, indicando que el material que infectaba a las bacterias era ácido nucleico, y no prote´ına.

Habiéndose establecido la función hereditaria del ADN, desde las postrimer´ıas de la década de los 1940s se entabló la búsqueda para la estructura conformacional del ADN. [Pauling and Corey, 1953], propusieron una estructura helicoidal para el ácido desoxirribonucleico, pero su modelo padec´ıa de notables deficiencias, ya que postulaba grupos neutros de fosfato, idea que estaba en contra de la naturaleza ácida y no neutra del ADN. Fue en ese mismo año de 1953 que James Watson y Francis Crick, propusieron su modelo para la estructura del ácido desoxirribonucleico, que en sus rasgos principales sigue siendo aceptada como correcto en la actualidad [Watson and Crick, 1953a]. Estos investigadores se apoyaron en los datos obtenidos de dos grupos de investigadores. El primero era el grupo de Erwin Chargaff, el cual en 1949 estableció para los ADNs ais- lados de varios organismos que las bases adenina (A) y timina (T) estaban presentes en cantidades equimolares, y que tal equivalencia también se daba entre las bases guanina (G) y citosina (C), lo que se conoce como las reglas de Chargaff. El segundo era del grupo de investigación de Maurice Wilkins en Londres, donde su colaboradora Rosalind Franklin produjo, en 1951, patrones de rayos X de muestras fibrosas de ADN de la forma A (cristalina) de suficiente calidad para dar información sobre de la estructura molecular del ADN en tres dimensiones.

Basándose en estos datos cristalográficos y teniendo en cuenta los detalles de la estructura qu´ımica del ADN que hab´ıan sido determinados previamente, ante todo las formas tautoméricas preferenciales de las bases heteroc´ıclicas en el ADN, Watson y Crick en abril de 1953 publicaron en la revista Nature un art´ıculo titulado A Structure for Deoxyri- bose Nucleic Acid, en el que se describ´ıa por primera vez la estructura tridimensional del ADN [Watson and Crick, 1953a].

El trabajo conjunto del grupo de Wilkins en Londres y de Watson y Crick en Cam- bridge permitió establecer al ADN como una molécula de doble hélice conformada por dos largas hebras polinucleot´ıdicas en disposición antiparalela, en el sentido de que la direccionalidad de 5’-3’ en una de las hebras está opuesta a esta direccionalidad en la otra hebra. Cada una de las dos cadenas tiene en el espacio tridimensional la conformación de una hélice con sentido torsional de mano derecha. Estas dos hélices están topológi-

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camente entrelazadas. La doble hélice define un cilindro extendido con un diámetro de aproximadamente 2.0 nm. Los grupos fosfato de los polinucleótidos definen la superficie exterior de este cilindro; están a una distancia aproximada de 1.0 nm del eje central de la doble hélice. Al interior del cilindro se encuentran las bases nitrogenadas del ADN, dispuestas en pares de bases donde cada una de las dos hebras contribuye con una base.

Estos pares de base definen planos que están orientados en posición casi normal respecto al eje central de la hélice. Los pares de base siempre contienen una base pirim´ıdica y otra púrica, de lo que resulta que todos los pares de base tengan prácticamente las mis- mas dimensiones. De ah´ı se explica la regularidad pronunciada de la estructura. Además de esto, los pares de base siempre están formados por el apareamiento adenina:timina y guanina:citosina, debido a las limitantes que imponen, dentro de la estructura general de la doble hélice, los requerimientos de oposición correcta de dadores y aceptores de puentes de hidrógeno entre las bases. En el interior de la doble hélice, los pares de base están estibados en contacto directo, con una distancia de traslación de 0.34 nm en la dirección del eje de la doble hélice; este valor coincide con la distancia repetitiva de 0.34 nm que se hab´ıa determinado como parámetro fundamental en el trabajo de [Franklin and Gosling, 1953]. El traslado de un par de bases al siguiente implica, además de este corrimiento de 0.34 nm a lo largo del eje central de la doble hélice, un giro de 36° alrededor de este eje, de tal manera que los pares de bases presentan el aspecto de una escalera de caracol formada por peldaños de 0.34 nm de altura, con diez peldaños por piso, ya que 36° es la décima parte de 360°. La distancia de repetición de 3.4 nm ya se hab´ıa manifestado en los patrones cristalográficos de [Franklin and Gosling, 1953].

Watson y Crick notaron que la estructura propuesta por ellos, con los grupos fosfato hidrof´ılicos en la superficie exterior de la hélice en contacto con el agua, y con las bases nitrogenadas hidrofóbicas resguardadas en el interior de la estructura, era congruente con los imperativos de la f´ısica. Además, en su siguiente publicación, [Watson and Crick, 1953b] recalcaron que la oposición exclusiva de adeninas con timinas, y de guaninas con citosinas, en los pares de base, prove´ıa una explicación molecular convincente de las reglas de Chargaff.

Como repositorio del patrimonio genético que es, el ADN requiere de un mecanismo eficiente y confiable para traspasar la información genética de una generación celular a la siguiente. Esto implica una replicación en alta fidelidad de la molécula del ADN. La primera enzima a ser reconocida en este papel fue la polimerasa I de Escherichia coli, aislada a partir de extractos de este microorganismo por el grupo de Arthur Kornberg [Bessman et al., 1958]. Esta enzima consiste de un solo polipéptido de 103 kilodaltones, que contiene sitios activos para las funciones de polimerasa y 3’-5’- exonucleasa en una región cercana a la terminal carbox´ılica, y otro sitio con actividad de 5’-3’-exonucleasa en la parte cercana a la terminal am´ınica. Digestión parcial de esta enzima [Klenow and Henningsen, 1970] resulta en la formación de dos fragmentos activos, uno de tamaño mayor con las actividades de polimerasa y 3’-5’-exonucleasa, conocido como el fragmento de Klenow, el otro de tamaño menor, que contiene la 5’-3’-exonucleasa.

La estructura molecular del fragmento de Klenow ha sido elucidada por cristalograf´ıa

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de rayos X a buena resoluci´on [Ollis et al., 1985]. Por sus propiedades enzim´aticas de polimerasa y 3’-5’-exonucleasa, la polimerasa I de E. coli ha encontrado usos impor- tantes en varios protocolos de la biolog´ıa molecular.

Trabajo posterior indicó que la polimerasa I no es la replicasa de la bacteria Escherichia coli, sino que está encargada de s´ıntesis de tramos cortos de ADN en el contexto del ensamblado de los fragmentos de Okazaki, as´ı como de procesos de reparación de lesiones en el ácido nucléico. El papel de replicasa es desempeñado por una enzima más compleja, la holoenzima polimerasa III [McHenry and Kornberg, 1977];

[Wickner et al., 1973], compuesta de varias subunidades, con un peso molecular total de 382 kdal. Esta enzima tiene la rapidez de s´ıntesis, la procesividad y el alto grado de fidelidad que la consagran para su función de replicasa. Aparte de la función de su repli- cación, el ADN sirve como molde para la s´ıntesis correcta y oportuna de los ARNs de transferencia, de los ARNs ribosomales y de los ARNs mensajeros; estos últimos son a su vez las moléculas instructivas para la s´ıntesis precisa de las prote´ınas. La s´ıntesis del ARN sobre el molde de ADN, proceso conocido como transcripción, es catalizado por la ARN polimerasa [Burgess, 1971].

El proceso final de traducción, es decir la s´ıntesis de determinada prote´ına basa- da en la información contenida en el ARN mensajero que corresponde, se lleva a cabo en los ribosomas, con la participación de los ARNs de transferencia cognatos de los diferentes aminoácidos. En este proceso, tripletes de nucleótidos en el ARN mensajero codifican de manera inequ´ıvoca para uno de los 20 aminoácidos canónicos que se usan en nuestro mundo biológico. El código genético, es decir, la correspondencia entre los tripletes de nucleótidos y los aminoácidos, se elucidó en los trabajos del grupo de Marshall Nirenberg en los 1960s [Nirenberg and Matthaei, 1961];[Matthaei and Nirenberg, 1961];

[Leder and Nirenberg, 1964].

Es de esta manera, por transcripción inicial a ARN mensajero y luego lectura de este último por los ribosomas para el ensamblado correcto de las prote´ınas, que el ADN ejerce su función central de instructor para la s´ıntesis precisa de las prote´ınas, secuencia informática que se conoce bajo el nombre de dogma central de la biolog´ıa molecular.

2.2. Metodolog´ıas de secuenciaci´ on de los ´ acidos nucleicos

Una vez que se hab´ıa manifestado el papel central del ADN como codificador de la secuencia de las prote´ınas, surgió de manera lógica el interés en desarrollar métodos para la secuenciación del ADN. Se vislumbraba incluso la posibilidad de que, si estos métodos resultaran ser lo suficientemente rápidos, eficaces y confiables, podr´ıan llegar a fungir como la metodolog´ıa primaria para la determinación de la secuencia de las prote´ınas, aunque a primera vista parecer´ıa que este abordamiento ser´ıa ineficaz, ya que se requiere de la identificación de un triplete de bases nucleot´ıdicas para especificar un aminoácido.

As´ı, se requiere determinar la secuencia de un tramo de 300 bases para deducir, mediante el código genético, la secuencia del hectopéptido correspondiente. No obstante, hoy en d´ıa la gran mayor´ıa de las secuencias proteicas se obtienen de esta manera, lo que confirma

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la rapidez y eficacia de los m´etodos modernos de secuenciaci´on automatizada del ADN.

2.2.1. Comienzos de la secuenciaci´on de los ´acidos nucleicos

Los primeros abordamientos para la obtención de información sobre las secuencias nucleot´ıdicas presentes dentro de los ácidos nucleicos no contemplaban aún la determi- nación de secuencias locales concretas, en el sentido de lo que hoy en d´ıa entendemos por secuenciación. Más bien apuntaban a cuantificar en amplio la representación de ciertas secuencias sumamente cortas a través de todo el ADN, y a comparar la frecuencia en que se daban estas secuencias con la representación que se esperar´ıa si estas secuencias se dieran estrictamente sobre la base de su probabilidad aleatoria, en función del porcentaje en que cada una de las bases participaba en el ADN. Una contribución interesante en este campo fue la de [Burton and Petersen, 1960], que investigaron la representación de todas las secuencias homopirim´ıdicas del ADN de timo de bovino. Para este fin, trataron al ADN en solución acuosa de ácido fórmico/difenilamina, degradando todas las posiciones púricas (es decir, posiciones A y G), obteniendo de esta manera tramos cortos homopirim´ıdicos, con funcionalidades de fosfomonoéster en ambas terminales (por ejemplo:

d-pTpCpCpTp). Tras desfosforilación enzimática de las terminales (formando fragmentos del tipo d-TpCpCpT) resolvieron el conjunto de fragmentos mediante una cromatograf´ıa bidimensional en papel, con lo que obtuvieron, para oligonucleótidos cortos, una resolu- ción no sólo por longitud de los oligómeros, sino también por su composición e incluso lograron, para los dinucleótidos, la separación de isómeros secuenciales (d-CpT vs.

d-TpC). Mientras que algunas de las secuencias homopirim´ıdicas (T, TTTT, CT, CCC) se ve´ıan representadas aproximadamente en las cantidades esperadas, otras estaban claramente subrepresentadas (TT, TTT, C, CC, TC, con 65 %, 76 %, 71 %, 79 % y 66 % del valor esperado, respectivamente). Estas desviaciones tan significativas, con secuencias de ensayo tan cortas y en una muestra tan amplia como la provee un ADN de mam´ıfero, evidenciaban de una manera sorprendente cu´an alejada est´a la secuencia del ADN de ser aleatoria.

Un análisis más general, para la determinación de la frecuencia de todas las 16 secuencias dinucleot´ıdicas posibles en un genoma escrito con cuatro elementos (A, C, G y T) fue desarrollado por el grupo de Arthur Kornberg en los 1960s. El método es conocido como análisis del vecino inmediato(en inglés: nearest-neighbor analysis) y se lleva a cabo de la siguiente manera [Josse et al., 1961]. El ADN de interés es aleatoriamente copiado en todas sus secuencias posibles en una incubación in vitro con ADN polimerasa I de E. coli, en presencia de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), en cuatro incubaciones en paralelo, donde cada una de estas incubaciones tiene uno de los cuatro nucleósidos trifosfato radiomarcados con³²P en su grupo α-fosfato. De ah´ı se obtienen cuatro copias del ADN de interés, una donde del lado 5’

de cada posición A tenemos un ³²P , otro donde las marcas de ³²P se encuentran in- mediatamente del lado 5’ de cada posición C, etc. Si estos materiales radiomarcados son completamente degradados a las unidades mononucleot´ıdicas constituyentes por métodos enzimáticos que producen mononucleósidos 5’-monofosfato, se obtienen como los únicos

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productos radioactivos en el primer caso [³²P ]5’-dAMP, en el segundo caso [³²P ]5’-dCMP, etc., lo que es el resultado lógico y trivial. En cambio, si la degradación de estos ADNs radiomarcados se efectúa de manera que se obtengan mononucleósidos 3’-monofosfato (con desoxirribonucleasa de Micrococcus luteus, y luego tratamiento con fosfodiesterasa de bazo bovino), los grupos fosfato radiomarcados introducidos en la s´ıntesis enzimática acaban en los diferentes nucleósidos 3’-monofosfato de acuerdo a cuál de las cuatro bases alternativas se encontraba como vecino inmediato del lado 5’ del nucleótido originalmente 5’-radiomarcado. De ah´ı que, del material enzimaticamente sintetizado en presencia de [³²P ]5’-dATP, se obtienen, mediante este tipo de análisis, las frecuencias en que se dan las secuencias dinucleot´ıdicas ApA, CpA, GpA y TpA. El análisis análogo del material sintetizado en presencia de [³²P ]5’-dCTP, arroja como resultado las frecuencias de repre- sentación de las secuencias dinucleot´ıdicas ApC, CpC, GpC y TpC, y as´ı con las demás muestras de ADN radiomarcado.

La aplicación de este análisis a una variedad de ADNs de animales y plantas mostró que, por lo general, las secuencias dinucleot´ıdicas GpC y ApT estaban representadas aproximadamente con las frecuencias que se calculan estad´ısticamente del contenido global de cada una de estas bases dentro del ADN bajo consideración, mientras que las secuencias ApG y TpA estaban subrepresentadas [Trautner et al., 1962]. Para los genomas bacterianos investigados, se observó subrepresentación de la secuencia TpA y sobrerepresentación de GpC, mientras que CpG y ApT aparec´ıan aproximadamente con las frecuencias estimadas sobre la base estad´ıstica.

El primer ácido nucleico con función biológica a ser secuenciado enteramente fue el ARN de transferencia para alanina, de levadura, un polirribonucleótido de una longitud de 77 unidades nucleot´ıdicas [Holley et al., 1964]. Este logro le valió a Robert Holley el premio Nobel en 1968. El trabajo se basó en un abordamiento complejo, que se describe de la siguiente manera.

El 77-mero, purificado por distribución en contracorriente [Apgar et al., 1962], fue sometido a una digestión completa con ribonucleasa A, enzima aislada de páncreas bovino, que corta la cadena del polirribonucleótido del lado 3’ de todas las bases C o U, pro- duciéndose as´ı un total de 19 productos mononucleot´ıdicos u oligonucleot´ıdicos definidos (algunos de ellos repetidos), con longitudes de entre una y ocho unidades nucleot´ıdicas.

En paralelo, el 77-mero fue también sometido a digestión completa por la ribonucleasa T1 de Aspergillus oryzae, enzima que corta la cadena polirribonucleot´ıdica del lado 3’ de todas las bases G o I, creándose as´ı otro conjunto de fragmentos definidos (un total de 17), algunos de ellos repetidos, con longitudes de entre una y ocho unidades nucleot´ıdicas.

Las secuencias nucleot´ıdicas de todos los oligómeros formados de esta manera se pudieron determinar mediante digestiones parciales con fosfodiesterasa de veneno de serpiente y posterior identificación, mediante hidrólisis alcalina de los nuevos términos 3’ develados [Holley et al., 1964].

La secuencia total del 77-mero fue ensamblada a partir de estas secuencias parciales mediante el traslape de las secuencias derivadas de los dos conjuntos de fragmentos, adem´as de utilizarse en este ensamblado tambi´en fragmentos de mayor longitud,

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obtenidos por digestiones parciales del 77-mero con ribonucleasa T1 a temperatura de 0°C.

M´etodos similares fueron utilizados por el grupo de Sanger en Cambridge [Brownlee and Sanger, 1967]; [Brownlee et al., 1968] para determinar la secuencia completa de un polirribonucle´otido de mayor tama˜no: el ARN ribosomal 5S de Escherichia coli, con una longitud de 120 bases.

Aún mayor fue la longitud de la secuencia de ARN publicada por el grupo de Sol Spiegelman en 1973 [Mills et al., 1973]. Se trataba de una versión abreviada del ARN del fago Q_β, con una longitud total de 218 nucleótidos. Q_β es un bacteriófago de doble hebra de ARN que invade a la bacteria E. coli, donde expresa una replicasa que es fundamental para su replicación. Esta replicasa es una ARN polimerasa dependiente de ARN, que puede copiar la hebra (+) del ARN de Q_β, formando la hebra (-), como también puede sintetizar la hebra (-) usando la hebra (+) como molde, en ambos casos arrancando de posiciones definidas, sin intervención de un cebador. Esto permite sintetizar in vitro cualquiera de las dos hebras, en versión radioactivamente marcada, elemento que el grupo de Spiegelman utilizó con ventaja en sus trabajos.

La digestión de estas hebras con ribonucleasa T1 o alternativamente con ribonucleasa A produjo un catálogo de oligonucleótidos cuya secuencia fue determinada en cada caso por degradación con fosfodiesterasa de veneno de v´ıbora o con fosfodiesterasa de bazo de bovino, as´ı como por análisis de vecino inmediato. Las secuencias parciales fueron ali- neadas a través de traslapes de secuencias locales derivadas de las dos digestiones endonucleol´ıticas alternativas, as´ı como por traslapes entre las secuencias parciales derivadas de la hebra (+) y la hebra (-), basado en el hecho de que estas dos hebras son complemen- tarias. Otro elemento central en el ordenamiento de los fragmentos endonucleol´ıticos a lo largo de las hebras totales fue el análisis del conjunto anidado de fragmentos que se obtiene interrumpiendo la s´ıntesis in vitro del ARN a diferentes tiempos, determinando cuál es la longitud m´ınima de la cadena de ARN en proceso de s´ıntesis para que ya contenga la secuencia oligonucleot´ıdica bajo consideración.

Los primeros intentos para determinar secuencias de ADN fueron modestos y dif´ıciles, ante todo debido a que hab´ıa pocos casos de ADN natural con terminaciones bien definidas. Esto a diferencia de la situación con ARN, donde el mundo biológico prove´ıa varios ejemplos de polinucleótidos de tamaño pequeño y exactamente definido (como los ARNs de transferencia o los ARNs 5S antes mencionados). Una situación favorable en el ambiente del ADN que se utilizó en fechas tempranas fue el hecho de que la forma lineal del ADN de doble hebra del bacteriófago λ tiene por naturaleza términos exac- tamente definidos, con estructura local de cabos cohesivos, circunstancia aprovechada por [Wu and Kaiser, 1968] para elucidar en esa región una secuencia decanucleot´ıdica de CCCCCGCGCG mediante estudios de incorporación enzimática de diferentes deso- xirribósidos trifosfato radiomarcados, en un estudio complicado que en algunos aspectos prefiguraba los desarrollos posteriores del grupo de Sanger.

Otro estudio fue desarrollado por [Kelly and Smith, 1970], quienes determinaron la secuencia de reconocimiento para una de las primeras enzimas de restricci´on a ser ais-

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ladas, la enzima HincII, producida por el microorganismo Haemophilus influenzae. Par- tiendo de una muestra de ADN del fago T7 completamente digerida con la enzima HincII, marcaron con radioisótopo las terminales 5’, y sometieron el material a digestiones totales o parciales con fosfodiesterasa de veneno de serpiente. El análisis de los mononu- cleótidos, dinucleótidos y trinucleótidos radiomarcados que resultaron de este proceso permitió identificar la secuencia de reconocimiento de la enzima HincII como 5’-GTPy↓

PuAC-3’, donde Py representa pirimidina (C o T), Pu representa purina (A o G), y la flecha indica el sitio exacto del corte (de la doble hebra) que realiza esta enzima.

Estas metodolog´ıas iniciales dieron resultados que se recibieron con mucho interés, por ser las primeras secuencias nucleot´ıdicas que se determinaron. Sin embargo, estaba claro que estos abordamientos eran demasiados complejos y laboriosos para ser utilizados en la determinación rutinaria de secuencias. Fue sólo en la década de los 1970s que se produjo un rápido avance de las metodolog´ıas para la secuenciación del ADN, debido a dos desarrollos importantes. El primero fue el descubrimiento por Werner Arber [Linn and Arber, 1968], [Arber and Linn, 1969] de las enzimas de restricción, nucleasas que cortan ambas hebras del ADN con precisión en posiciones definidas por una secuencia nucleot´ıdica local rigurosamente acatada, lo que permite cortar el ADN de interés en segmentos cortos y manejables, que tienen terminales exactamente definidas, trabajo por el cual Arber, junto con Daniel Nathans y Hamilton Smith, recibió el premio Nobel de Fisiolog´ıa en 1978. El segundo fue el desarrollo de metodolog´ıas para la s´ıntesis automatizada de oligodesoxirribonucleótidos de secuencia definida, por los grupos de Robert Letsinger [Letsinger and Mahadevan, 1965];[Letsinger and Ogilvie, 1969];

[Pless and Letsinger, 1975]; [Letsinger et al., 1975];[Letsinger and Lunsford, 1976] y Caruthers [Beaucage and Caruthers, 1981];[Matteucci and Caruthers, 1981], lo que per- mitió el desarrollo de metodolog´ıas de secuenciación basadas en la extensión enzimática a partir de un cebador en una posición exactamente definida sobre la hebra de ADN a secuenciar, para crear un conjunto anidado de productos de elongación que conten´ıa la información sobre la secuencia nucleot´ıdica de la hebra molde.

2.2.2. M´etodo de la mancha itinerante

El primero de los nuevos m´etodos que surgieron en esa ´epoca lleva el nombre de

técnica de la mancha itinerante(en inglés: wandering-spot technique). A diferen- cia de los abordamientos anteriores de Holley y de Brownlee y Sanger, en los cuales la determinación y posterior ensamblado de las secuencias locales representaban un re- to al ingenio y a la creatividad del investigador, el método de la mancha itinerante permite una determinación sistemática, en un solo proceso lineal, de la secuencia de bases dentro del polinucleótido, acotada sólo por los l´ımites de resolución del sistema electroforético-cromatográfico en que se basa. Por un tiempo, el método de la mancha itinerante pareció muy prometedor para la determinación rutinaria de la secuencia de polidesoxirribonucleótidos, pero luego fue rápidamente rebasado por los nuevos abordamientos introducidos en la segunda mitad de los 1970s, a saber la secuenciación por el método de terminadores de Sanger y el método de cercenamiento qu´ımico de Maxam y

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Figura 2.1: Secuenciaci´on con la t´ecnica de la mancha itinerante.

El oligonucle´otido secuenciado es d-(p*AGTCCATCACTTAA). De [Tu and Wu, 1980].

Gilbert.

Latécnica de la mancha itinerantese basa en un sistema eficaz de resolución en dos dimensiones, aplicable a oligonucleótidos, publicado por [Sanger et al., 1965]. La reseña de [Tu and Wu, 1980] resume el método. En breve, el oligonucleótido a secuenciar es enzimaticamente marcado en su terminal 5’ con un ³²P -fosfato, y luego tratado con la exonucleasa de Crotalus adamanteus, enzima que act´ua sobre el oligonucleótido recortan- do unidades nucleot´ıdicas secuencialmente a partir de la terminal 3’, de manera distribu- tiva, para as´ı producir un conjunto anidado de fragmentos, todos con la misma terminal 5’ radiomarcada. La resolución de esta mezcla en dos dimensiones, con electroforesis en acetato de celulosa a pH 3.5 como primera dimensión, seguido en la segunda dimensión de homocromatograf´ıa (usando como eluente una mezcla aleatoria de oligonucleótidos sin marca isotópica) en placas de capa fina de DEAE-celulosa, produce un patrón bidimensional de radioactividad donde cada mancha representa un miembro del conjunto anidado de fragmentos.

La relación direccional entre manchas sucesivas es indicativa de la unidad nucleot´ıdica por la que difieren; esto se debe a que, a pH 3.5, las diferentes bases del ADN se distinguen en su grado de protonación, debido a sus diferentes valores de pKa: a este pH, los grupos citosina llevan una carga eléctrica positiva casi entera, grupos adenina están protonizados a medias, grupos guanina llevan en promedio una carga positiva de aproximadamente 0.2, y grupos timina no llevan carga eléctrica. Estas diferencias en el estado de carga de las bases lógicamente afectan la movilidad electroforética de los fragmentos en la primera

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dimensión de la resolución, a pH 3.5, lo que se refleja en diferencias en la dirección de los vectores que relacionan manchas sucesivas en el conjunto anidado visible en el autorradiograma bidimensional; la dirección de estos vectores revela la identidad de la base de diferencia en cada caso, lo que permite deducir la secuencia del oligonucleótido inicial. La Figura 2.1, adaptada de la reseña de [Tu and Wu, 1980], muestra un ejemplo de secuenciación por la técnica de la mancha itinerante, para un oligodesoxirribonucleótido corto de secuencia *pAGTCCATCACTTAA.

La limitante principal de este método fue la decreciente resolución de los fragmentos en la segunda dimensión, que se presentaba para longitudes mayores a aproximadamente 20 bases. Los nuevos métodos de secuenciación que surgieron posteriormente permitieron secuenciar de manera consecutiva tramos de centenares de bases; esto se deb´ıa, entre otros elementos, al uso de un medio de resolución claramente superior: electroforesis en geles de poliacrilamida de alta calidad, que permit´ıa de una manera robusta la resolución de polinucleótidos muy largos, difiriendo en longitud por una sola unidad nucleot´ıdica.

2.2.3. M´etodo del m´as y del menos

El primero de estos métodos, denominado elmétodo del más y del menos(en inglés:

plus-minus method), fue publicado por el grupo de Sanger en 1975 [Sanger and Coulson, 1975] y prefiguraba en muchos aspectos el posterior método am- pliamente exitoso de secuenciación por terminadores, propuesto por el mismo grupo de investigadores dos años después. El método del más y del menos aprovecha dos propiedades fundamentales manifestadas por la gran mayor´ıa de las ADN polimerasas dependientes del ADN: 1) el alto grado de fidelidad en la replicación de la hebra molde, que causa un paro practicamente absoluto en el avance de la polimerasa si no se dispone del deso- xinucleósido trifosfato especificado por la base instructora ubicada en la hebra molde, y 2) la actividad 3’-5’ exonucleol´ıtica de las polimerasas, que causa una excisión inmediata de una unidad nucleot´ıdica que acaba de ser malincorporada (la tal denominada activi- dad de revisión, en inglés editing activity o proofreading activity, responsable de la baja frecuencia de las mutaciones introducidas por malapareamiento durante el proceso de replicación del ADN), pero que también, en ausencia de los nucleósidos trifosfato que son los sustratos monoméricos del proceso de replicación, causa una lenta digestión sucesiva en la dirección 3’ a 5’, incluso en tramos con apareamiento correcto. El procedimiento fundamental para este método se presenta de manera esquemática en la Figura 2.2.

Al ADN a ser secuenciado, que está presente en forma de hebra sencilla, se le agrega in vitro un oligodesoxirribonucleótido espec´ıficamente dise˜nado para que se asiente sobre la hebra a secuenciar en una ubicación espec´ıfica, creándose de esa forma una estructura molde-cebador idónea para ser extendida por una ADN polimerasa. A esta solución se le a˜nade la enzima (polimerasa I de E. coli, fragmento de Klenow, en el caso de la publicación de [Sanger and Coulson, 1975]), as´ı como los cuatro desoxinucleósido 5’- trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), con uno de éstos marcado con³²P en su grupo α-fosfato, de manera que el ADN que ahora comienza a sintetizarse in vitro resulta radiomarcado. Las condiciones de esta extensión inicial son tales que la extensión del

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Figura 2.2: Principio del m´etodo del m´as y del menos. De [Sanger and Coulson, 1975].

cebador inicial sea lo más as´ıncrona y aleatoria posible, lo que se logra mediante una muy baja temperatura de operación (0°C) y colección de parte de la mezcla tras diferentes tiempos de incubación. De esta manera, en esta etapa del experimento se obtiene una distribución amplia de fragmentos extendidos a diferentes longitudes. Estos fragmentos radiomarcados constituyen un conjunto anidado, donde todos los miembros tienen la misma terminal 5’, que es idéntica con la terminal 5’ del cebador inicial.

La mezcla obtenida de esta manera es resuelta mediante una cromatograf´ıa en gel de agarosa, para obtener, libre de nucleósidos trifosfato y de polimerasa, el conjunto de hebras nuevas radiomarcadas, de diferentes extensiones, asentadas sobre la secuencia complementaria en las hebras molde. A este material se le somete ahora a dos tipos alternativos de análisis. En el primero, denominadosistema menos, el conjunto de cadenas preextendidas es tratado in vitro con polimerasa y sólo tres nucleósidos trifosfato (por

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ejemplo: dCTP, dGTP y dTTP, en el caso del análisis menos A), lo que causa una reextensión local de cada una de las cadenas preformadas, hasta alcanzar una posición que requiere la incorporación de la base faltante (para nuestro ejemplo, la base adenina), lo que arresta la extensión en esa posición. El análisis de la mezcla resultante de este proceso, por electroforesis de alta resolución en un gel desnaturalizante de policrilamida, en dirección vertical descendente, con posterior visualización de las bandas radioactivas por autorradiograf´ıa, produce un patrón de bandas cuyas distancias de migración elec- troforética reflejan las posiciones de la base faltante (A en nuestro caso) que causaron la delimitación de estos fragmentos. Cabe recalcar que en este análisis por el sistema menos, los fragmentos que señalan las posiciones de la base de interés no terminan en ese nucleótido, sino que su posición 3´ terminal es el nucleótido justamente anterior a la posición de esa base.

De manera análoga, el análisis en paralelo para otras bases delimitantes (análisis menos C, menos G y menos T, con incubaciones conteniendo dATP/dGTP/dTTP, dATP/dCTP/dTTP o dATP/dCTP/dGTP, respectivamente) brinda información acerca de las otras bases. La resolución electroforética en paralelo de estas cuatro mezclas de incubación produce un patrón en cuatro carriles que ya permite, en gran medida, deducir la secuencia de bases dentro de la secuencia investigada, determinando simplemente en cuál carril aparecen las bandas electroforéticas que representan fragmentos sucesivamente más largos. La sucesión de bandas desde la parte inferior del gel hacia arriba corresponde a la dirección 5’ a 3’ en la hebra sintetizada in vitro. Por supuesto que la secuencia de esta hebra implica, por los principios de complementaridad de bases y de antiparalelidad, inequ´ıvocamente la secuencia del tramo de ADN de interés, que sirvió como molde.

Este análisis por el sistema menosse complementa con el análisis por el sistema más, donde el conjunto de fragmentos preextendidos es incubado con polimerasa y sólo uno de los nucleósidos trifosfato canónicos (por ejemplo: dATP en el caso de análisis

más A). En este tipo de incubación, la polimerasa recorta, en la dirección 3’ a 5’, las terminales 3’ preexistentes, hasta llegar a una posición 3’ terminal de la base especi- ficada en la modalidad más A(adenina en nuestro ejemplo), donde, en caso de que la polimerasa recortar´ıa esta base, la repondr´ıa de inmediato. De ah´ı que se forma un conjunto anidado de fragmentos de longitudes definidas, cuyos tamaños revelan las posiciones de la base de interés. El análisis electroforético en paralelo de las incubaciones

más A, más C, más Gy más T produce un patrón en cuatro carriles de bandas radioactivas, que nuevamente se pueden leer de manera sucesiva. Cabe observar que en el sistema del más, los fragmentos indicativos para las diferentes bases s´ı contienen la base de interés como unidad nucleot´ıdica 3´ terminal del fragmento. Los resultados del sistema del mássirven para confirmar y complementar los resultados que arroja el

sistema menos. Un ejemplo real de datos de un an´alisis del m´as y del menos se presenta en la Figura 2.3.

El método del más y menos representó un avance fundamental sobre los abor- damientos anteriores para la secuenciación del ADN. Permitió secuenciar de manera sistemática y rutinaria a través de decenas de bases. Para dar ejemplos, este método

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Figura 2.3: Ejemplo de una secuenciación por el método del más y del menos. De [Fedoroff and Brown, 1978].

fue utilizado para secuenciar un tramo de 110 bases dentro del ADN del bacteriófago ϕX174 [Brown and Smith, 1977], y luego se publicó el genoma de este bacteriófago, de 5386 bases, en su casi totalidad [Sanger et al., 1977]. El ADN del bacteriófago G4 tam- bién fue secuenciado en parte por elmétodo del más y del menos[Godson et al., 1978].

Sin embargo, este abordamiento aún adolec´ıa de serias desventajas. Una estribaba en que el método involucraba dos etapas sucesivas, primero la preextensión, para asegurar una amplia cobertura de secuencia, y luego la segunda etapa, donde se llevaban a cabo extensiones y recortes que produc´ıan los conjuntos de fragmentos indicativos de la secuencia inicial. Otra desventaja era que la segunda etapa requer´ıa de ocho incubaciones en paralelo (cuatro del tipo másy cuatro del tipo menos) lo que también implicaba el requerimiento de ocho carriles electroforéticos. Finalmente, y de mayor importancia, se presentaba la desventaja de que en los casos donde la secuencia local consist´ıa de una misma base en serie, sólo la primera (en el sistema menos) y la última posición (en elsistema más) de esta seguidilla quedaban representadas en los patrones autorradio- gráficos, lo que requer´ıa de una estimación de la longitud de este tramo homonucleot´ıdico, dif´ıcil en el caso de seguidillas extensas.

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Figura 2.4: Principio del m´etodo de secuenciaci´on con terminadores didesoxi. De [Sanger et al., 1977].

2.2.4. Secuenciaci´on con terminadores

Estas dificultades fueron sobrellevadas por el método de terminadores propuesto por el grupo de Sanger en 1977, nuevamente basado en una replicación enzimática in vitro del ADN de interés [Sanger et al., 1977]. Este método conjuntaba en una misma etapa los procesos de extensión enzimática amplia a partir de un cebador definido y de terminación de esta extensión en una manera definida que fuera informativa en cuanto a la secuencia nucleot´ıdica. El principio de este método se resume, de manera esquematizada, en la Figura 2.4.

En este abordamiento, el cebador debidamente escogido es extendido sobre el ADN de interés, que obra como molde, en una incubación enzimática (con la ADN polimerasa I de E. coli, fragmento de Klenow, en el caso de [Sanger et al., 1977]) que contiene el complemento completo de nucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), además de un análogo del tipo 2’,3’-didesoxirribonucleósido 5’-trifosfato de una de estas bases, que funge como elemento terminador espec´ıfico para esa base. Debido a la disponi- bilidad de los cuatro precursores monoméricos canónicos se logra una extensión en- zimática significativa a partir de la posición del cebador, y por ende una buena cobertura de secuencia en un mismo experimento. Simultaneamente, para una de las cuatro bases se da, por la presencia del análogo terminador (por ejemplo: 2’,3’-didesoxiadenosina 5’-trifosfato, ddATP), en cada posición de esta base una competencia entre la posible incorporación de la unidad nucleot´ıdica normal (en nuestro ejemplo: incorporación de una unidad de dAMP, con introducción de una nueva terminal 3’-hidrox´ılica extensible por la polimerasa) y la posible incorporación de la unidad nucleot´ıdica análoga (incor-

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poración de una unidad de ddAMP, carente de funcionalidad 3’-hidrox´ılica y por ende incapaz de ser extendida por la polimerasa). As´ı, en cada posición de la base de interés (en nuestro ejemplo: adenina), una cierta proporción de las cadenas crecientes se verán truncadas, acumulándose fragmentos cuya longitud servirá para señalar esa posición de la base de interés, mientras que la mayor´ıa de las cadenas incorporarán la unidad nucleot´ıdica normal, por lo que serán enzimáticamente extendidas, con lo que se harán accesibles, r´ıo abajo, otras posiciones de la base de interés, donde nuevamente una frac- ción de las cadenas serán truncadas por incorporación del terminador tipo didesoxi. De esta manera, la resolución de la mezcla de incubación por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida producirá una escalera de bandas interpretable en términos de las posiciones de la base de interés. El análisis paralelo, con cuatro incubaciones (con los terminadores ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP, respectivamente) seguido de resolución electroforética en cuatro carriles (rotulados A, C, G y T, respectivamente) produce un patrón de bandas radioactivas que se puede interpretar directamente en términos de secuencia nucleot´ıdica. La marca radioisotópica requerida se puede introducir ya sea como

32P en el fosfato 5’ terminal del oligonucleótido cebador, o a través de la marcación con

32P del grupo α-fosfato de uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, con in- corporación de la marca isotópica a las cadenas en crecimiento. A diferencia del método del más y del menos, el análisis de secuencia con terminadores didesoxi da una banda isotópica para cada una de las posiciones, incluso en seguidillas de una misma base.

Entre los primeros logros del método de terminadores fue la conclusión de la secuen- cia del fago ϕX174, de 5386 bases [Sanger et al., 1978], y la conclusión de la secuencia total del bacteriófago G4, de 5577 bases [Godson et al., 1978]. Un ejemplo de datos de secuenciación por terminadores didesoxi se muestra en la Figura 2.5.

Numerosas han sido las adecuaciones y mejoras que se han propuesto e implementado al método de secuenciación por terminadores propuesto por el grupo de Sanger, lo que no es de sorprender dado que se trata de un abordamiento muy exitoso para una aplicación de importancia central, que incluso en nuestros d´ıas sigue siendo el fundamento de las metodolog´ıas empleadas en los proyectos de secuenciación de genomas. Un avance importante fue el desarrollo de protocolos que permitieran presentar al ADN a secuenciar en forma de hebra sencilla. Esto se debe a que, durante las incubaciones de extensión, el avance de la polimerasa a lo largo del ADN molde debiera de estar libre de impedimen- tos. Por esta consideración, las primeras secuenciaciones extensivas se dirigieron a ADNs que se presentaban naturalmente en forma de hebra sencilla, como lo es el ADN del fago ϕX174. Sin embargo, la gran mayor´ıa de los ADNs de interés ocurren en forma de doble hebra. Para superar esta dificultad, el grupo de Joachim Messing desarrolló un protocolo en el cual el fragmento de ADN a secuenciar, en forma de doble hebra, se insertaba al virus M13, en la forma de doble hebra del virus. Tras esta clonación, el virus pasaba a su estad´ıo de hebra sencilla, en la cual presentaba, como injerto, el fragmento de ADN de interés, en forma de hebra sencilla y, por ende, fácilmente secuenciable [Messing, 1983].

Posteriormente, se introdujo la termosecuenciaci´on [Murray, 1989], donde el ADN de doble hebra es t´ermicamente desnaturalizado antes de que comiencen las reacciones de

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Figura 2.5: Ejemplo de una secuenciaci´on por el m´etodo de terminadores didesoxi. De [Sanger et al., 1977]

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extensión, e incluso es térmicamente desnaturalizado repetidas veces en estas incubaciones, lo que permite reutilizar el mismo ADN varias veces, obteniéndose una señal más fuerte aún cuando se esté partiendo de cantidades limitantes de ADN muestra.

Como otro rubro de mejora, se introdujeron diferentes nucleótidos análogos para reducir la propensión de los fragmentos producto a formación de horquillas, que se pueden dar incluso en las condiciones altamente desnaturalizantes de la resolución electroforética, ya que la formación de tales horquillas redunda en una irregularidad de la presentación de las bandas (la tal llamada compresión de bandas), que dificulta o imposibilita la lectura correcta del autorradiograma. Análogos de este tipo son la 7-desaza-2’-desoxiguanosina 5’-trifosfato (c⁷dGTP) [Mizusawa et al., 1986] y la N⁴-metil-2’-desoxicitidina 5’-trifosfato (N⁴medCTP) [Li et al., 1993].

En el rubro de enzimas, el fragmento de Klenow utilizado por [Sanger et al., 1977]

fue sustituido por una ADN polimerasa extra´ıda del bacteriófago T7, qu´ımicamente modificada, que ten´ıa las siguientes propiedades benéficas en una polimerasa de secuen- ciación: alta procesividad, alta tasa de s´ıntesis, baja tasa de exonucleólisis 3’-5’ y baja discriminación contra diferentes tipos de análogos, como son la 7-desaza-dGTP y la dITP, el [³⁵S]tiodATP y los análogos terminadores ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP [Tabor and Richardson, 1987]. Esta polimerasa fue comercializada por United States Bio- chemicals bajo el nombre de Secuenasa (en inglés: Sequenase).