Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del
paciente intoxicado.
Dra. Ana María López Parra
Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Esquema
• Introducción.
• Muestras.
• Envasado, conservación y almacenamiento.
• Análisis químico-toxicológico.
• Métodos de extracción.
• Detección e identificación del tóxico:
técnicas espectrofotométricas técnicas cromatográficas
técnicas inmunoquímicas
Introducci
Introducci ó ó n n
La investigación toxicológica es el conjunto de procesos
analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación.
Muestras Muestras
• Contenido gástrico
• Sangre
• Orina
• Pelo
• Saliva
• Meconio
Muestras Muestras
Contenido gástrico
-Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales.
-En el caso de los lavados estomacales, primer lavado.
-Un volumen de aproximadamente 20 ml.
-Puede ser necesario procedimientos de
homogenización, filtración y/o centrifugación.
-No representa grado de intoxicación.
Muestras Muestras
Sangre
-Es una de las muestras más útiles para la identificación y especialmente para el análisis cuantitativo.
-La sangre total y el plasma son las muestras más representativas.
-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como anticoagulante.
-Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro sódico como conservante. Y la extracción deberá
efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.
Muestras Muestras
Orina
-Ensayos preliminares en el screening de tóxicos.
-Para drogas de abuso.
-La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre.
-Se debe de tomar antes del tratamiento.
-Como mínimo 50 ml.
Muestras Muestras
Pelo
-Tóxicos minerales
-Detección de drogas de abuso.
-Refleja el estado promedio de los elementos
minerales del organismo durante su crecimiento.
Muestras Muestras
Saliva.
-Correlación de los análisis
séricos con drogas de abuso y psicofármacos.
Meconio.
-Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y
células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal.
-Identificación de drogas durante la gestación.
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Muestras Muestras
Hígado
-Niveles de tóxicos superiores a los de la sangre.
-Especialmente útil cuando no se puede disponer de sangre.
-Evitar contaminación por bilis.
-Evitar añadir conservantes.
Envasado y conservaci
Envasado y conservaci ó ó n n
• Tapones PTFE
(polytetrafluoroethylene)
• Conservantes:
– Azida sódica (0,1%, p/v) – Fluoruro sódico (1%, p/v)
• Anticoagulante:
- Heparina - EDTA
- Oxalato potásico (0,5%, p/v).
Almacenamiento Almacenamiento
Factores que intervienen:
Temperatura
Descomposición biológica
Luz
Hidrólisis
Oxidación
An An á á lisis lisis
qu qu í í mico mico - - toxicol toxicol ó ó gico gico
• 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra.
• 2. Detección e identificación del tóxico.
• 3. Cuantificación.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n n
Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en:
– Tóxicos volátiles – Tóxicos gaseosos
– Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles – Tóxicos inorgánicos o minerales
Finalidad:
Aislamiento y purificación del tóxico
Concentración del tóxico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva íntegra
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos vol xicos vol á á tiles tiles
• Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico,
alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos vol xicos vol á á tiles tiles
Las técnicas son:
-Destilación simple.
-Destilación fraccionada.
-Destilación directa al vacío.
-Destilación por arrastre en corriente de vapor.
-Microdifusión.
-Técnica de “espacio de cabeza” ("head space" ).
Destilaci
Destilaci ó ó n simple n simple
Muestra problema
Tóxico volátil extraído
Destilaci
Destilaci ó ó n fraccionada n fraccionada
Separación según puntos de ebullición
Microdifusi
Microdifusi ó ó n n
Análisis Muestra Agente liberador
Compartimento interior
Tiempo de difusión Acetaldehído 3 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3 horas Acetona 3 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3 horas Monóxido de
carbono
1 ml de sangre 1 ml de SO4H2 al 10%
2 ml de cloruro de paladio
1 hora Cianuro 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas Etanol 0,8 ml de sangre
4 ml de tejido
1 ml de CO3K2 al 10%
2 ml de dicromato potásico
3 horas
Formaldehído 3 ml de sangre 5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3 horas Hidrocarburos
halogenados
1-4 ml de sangre 1-4 ml de tejido
- 1 ml de tolueno 3 horas
Isopropanol 2 ml de sangre 5 ml de tejido
1 ml de CO3K2 3,3 ml de SO4H2
al 10%
3 horas Metanol 2 ml de sangre
5 ml de tejido
1 ml de CO3K2 3,3 ml de
SO3HNa 0,15M
3 horas Fenoles 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas Sulfuro 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de SO4H2 al 10%
3,3 ml de NaOH 0,1N
3 horas
Camara de
Conway
T T é é cnica de espacio de cabeza cnica de espacio de cabeza
1. La muestra se deposita en un vial cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire.
2. Se calienta a 60ºC durante 30 min.
3. Se extrae con una jeringa para gases una muestra de la parte
superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos gaseosos xicos gaseosos
• Se denominan tóxicos gaseosos a todas
aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:
CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos gaseosos xicos gaseosos
• Las técnicas son:
-La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión.
-Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles.
-Cromatografía de gases
Cromatografía de gases (GC)
Técnica de separación.
Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento.
T T é é cnicas cnicas cromatogr cromatogr á á ficas ficas
Volatilización
Cromatograf
Cromatograf í í a de gases a de gases
*Line Base *Altura del Pico
*Pico Cromatográfico *Anchura del Pico
*Base del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura
*Área del Pico
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• Técnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.) .
• Posibilidad de derivación (obtener un
compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente
universal.
Cromatograf
Cromatograf í í a de gases a de gases
M M é é todos de todos de microextracci microextracci ó ó n n en fase s
en fase s ó ó lida lida
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos org xicos org á á nicos fijos nicos fijos
Sustancias orgánicas y no volátiles.
Se incluyen:
*Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de síntesis (medicamentos).
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos org xicos org á á nicos fijos nicos fijos
Las técnicas son:
-Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto.
- Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico, cloroformo y diclorometano. Puede ser:
*Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias como la orina
*Previa purificación de la muestra (eliminación de proteínas).
Fraccionamiento del extracto antes de su análisis:
Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es necesario un fraccionamiento del extracto.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos org xicos org á á nicos fijos nicos fijos
Clasificación de tóxicos orgánicos en:
1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por
ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido.
2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.)
3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos org xicos org á á nicos fijos nicos fijos
Las técnicas son:
-Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo
negativo y el resto al polo positivo.
-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con
solventes apropiados.
Extracción en fase sólida
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de
t t ó ó xicos org xicos org á á nicos fijos nicos fijos
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de n de t t ó ó xicos minerales o xicos minerales o
inorg
inorg á á nicos nicos
Estos tóxicos se encuentran en el organismo
firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia
orgánica para poder realizar su análisis.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de t n de t ó ó xicos xicos minerales o inorg
minerales o inorg á á nicos nicos
1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico.
a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc.
b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación).
c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos.
Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada.
M M é é todos de extracci todos de extracci ó ó n de t n de t ó ó xicos xicos minerales o inorg
minerales o inorg á á nicos nicos
Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como:
*Diálisis.
*Ultrafiltración.
*Electrodiálisis.
*Desproteinización.
2. Marcha posterior de extracción
Detecci
Detecci ó ó n e identificaci n e identificaci ó ó n n del t
del t ó ó xico xico
Dos etapas:
1. Rastreo o detección rápida:
-Técnicas de inmunoensayo -Cromatografía en capa fina 2. Técnicas de confirmación:
-Técnicas espectrofotométricas.
-Técnicas cromatográficas.
T T é é cnicas cnicas inmunoensayo inmunoensayo
Fundamento:
Reacciones antígeno-anticuerpo.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos.
Tóxico libre
TTóóxico marcadoxico marcado
+ AC Tóxico libre-AC
TTóóxico marcadoxico marcado
T T é é cnicas cnicas inmunoensayo inmunoensayo
1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo.
2. Enzimoinmunoensayo: enzima.
-ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas -EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo.
4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas.
T T é é cnicas cnicas inmunoensayo inmunoensayo
•Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de concentración).
•Técnicas rápidas, y sensibles.
•Posibilidad de reacciones cruzadas.
T T é é cnicas cnicas cromatogr cromatogr á á ficas ficas
Cromatografía en capa fina (CCF)
Fase movil Fase estacionaria Aplicaciones Cloroformo/acetona
80:20
Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm
Todos los tipos Isopropanol/cloroformo Silica gel G activada a 120ºC/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Barbitúricos Cloroformo/acetona
90:10
Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30-45 min
Anticonvulsionantes Sedantes no
babitúricos
Detecci
Detecci ó ó n e identificaci n e identificaci ó ó n n del t
del t ó ó xico xico
2. Técnicas de confirmación:
-Técnicas espectrofotométricas.
-Técnicas cromatográficas.
T T é é cnicas cnicas espectrofotom espectrofotom é é tricas tricas
Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda
utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones
electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)
Aplicaciones Técnicas
Compuestos Análisis
Espectrofotometría UV visible Orgánicos Cuali/cuantitativo
Espectrofluorimetría Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofotometría infrarroja Orgánicos Cualitativo
Espectrofotometría de absorción atómica Metales Cuali/cuantitativo Espectrometría de masas Orgánicos Cualitativo
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de absorci a de absorci ó ó n n at at ó ó mica (EAA) mica (EAA)
E*
E
Luz
incidente
Fluorescencia emitida
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de a de absorci
absorci ó ó n at n at ó ó mica mica Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de a de absorci
absorci ó ó n at n at ó ó mica mica
Sistema detector Lámpara de
cátodo hueco Sistema atomizador
Sistema monocromador
Sistema detector
La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo
absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• En la interpretación de resultados considerar:
contaminación en la toma y mantenimiento de las muestras, etc.
• Personal especializado.
• Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su sensibilidad permite identificar y cuantificar metales en niveles de traza.
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de absorci a de absorci ó ó n n
at at ó ó mica mica
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de a de emsi emsi ó ó n n at at ó ó mica (EEA) mica (EEA)
E*
E
Luz emitida
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a a de masas (EM)
de masas (EM)
Técnica cualitativa y cuantitativa.
Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.
Volatilización Ionización
2.Aceleración iones
3. Separación
4. Detección
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de masas a de masas
Técnica cualitativa y cuantitativa.
Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular.
Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• Acoplamiento a GC (o HPLC): método más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos.
• ICP-MASAS
Espectrofotometr
Espectrofotometr í í a de masas a de masas
ICP ICP - - Masas Masas
ICP: Plasma de
acoplamiento inducido
T T é é cnicas cnicas cromatogr cromatogr á á ficas ficas
Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases
T T é é cnicas cnicas cromatogr cromatogr á á ficas ficas
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Ventajas e inconvenientes
• Costoso.
• Personal especializado.
• No destruye la muestra, lo que permite la detección por distintos sistemas en serie.
• Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades.
• Mayor precisión que GC. En general se aplica a
compuestos de alto peso molecular y polar mientras que GLC se aplica a gases permanentes y sustancias
volátiles.
• Mejor resolución y menor tiempo de análisis.
