DETERMINACIÓN DE RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA FRENTE A LAS LACTONAS MACROCÍCLICAS POR PARTE DE NEMÁTODOS GASTROINTESTINALES DEL EQUINO MEDIANTE EL TEST DE REDUCCIÓN DE LA OVIPOSICIÓN (FECRT) EN LOS MUNICIPIOS
DE AGUAZUL, EL YOPAL, MANÍ Y PAZ DE ARIPORO DEPARTAMENTO DEL CASANARE
ERIK CHAPARRO SALAMANCA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
DETERMINACIÓN DE RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA FRENTE A LAS LACTONAS MACROCÍCLICAS POR PARTE DE NEMÁTODOS GASTROINTESTINALES DEL EQUINO MEDIANTE EL TEST DE REDUCCIÓN DE LA OVIPOSICIÓN (FECRT) EN LOS MUNICIPIOS
DE AGUAZUL, EL YOPAL, MANÍ Y PAZ DE ARIPORO DEPARTAMENTO DEL CASANARE
ERIK CHAPARRO SALAMANCA 14012027
Trabajo de grado presentado como parte de los requisitos para optar por el título de Médico Veterinario
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTA D.C.
DIRECTIVOS
RECTOR Hno. Carlos Gabriel Gómez Restrepo.
VICERRECTOR ACADÉMICO Hno. Fabio Coronado Padilla.
VICERRECTOR DE PROMOCIÓN Hno. Carlos Pabón Meneses. Y DESARROLLO HUMANO
VICERRECTOR ADMINISTRATIVO Dr. Mauricio Fernández Fernández.
DECANO DE LA FACULTAD Dr. Pedro Pablo Martínez Méndez.
SECRETARIA ACADÉMICA Dra. María Teresa Uribe Mallarino.
COMPROMISO
El presente trabajo de investigación no contiene ideas que de una u otra forma sean contrarias a la Iglesia Católica en cuanto a su doctrina, dogma y moral.
DEDICATORIA
Primero a Dios por haberme permitido nacer y mas en la familia que tengo, a la gran devoción de la Virgen de la medalla Milagrosa por permitirme cumplir el sueño de ser Medico Veterinario.
A mis padres, Pedro León Chaparro R. y Camelia Salamanca E. por su gran ejemplo, dedicación, consejos y regaños para que lograra cumplir mis objetivos, por que no solo han sido mis padres si no mis amigos.
A mi abuelo, Pedro León Chaparro, que con sus historias y sus vivencias mantuvieron firmes mis deseos de crecer y algún día ser un llanero como el.
AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Germán Prada, mi inmensa gratitud por el apoyo y dirección de este trabajo, y por la gran enseñanza que me brindo durante la carrera, siendo un ejemplo a seguir como medico Veterinario.
Al Doctor José Alejandro Espinosa, también una gratitud muy grande por su apoyo, amistad y enseñanza.
A Leydy Rodríguez por su apoyo y amistad incondicional.
Al Club Equino Lasallista, donde tuve la oportunidad de conocer a mis mejores amigos Pedro Rojas, Juan Manuel Montenegro y José Luís Rivera que trabajando en tantas ferias hicimos una historia.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE 1
1.1 PEQUEÑOS STRONGYLUS 1 1.2 GRANDES STRONGYLUS. 3 1.3 PARASCARIS EQUORUM 6 1.4 ANTIPARASITARIOS 8 1.4.1 Lactonas Macrocíclicas. 8 1.4.1.1 Ivermectina. 9 1.4.1.1.1 Mecanismo de Acción. 9 1.4.1.1.1 Espectro. 10 1.4.1.1.2 Farmacocinética. 10 1.5 RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA 11
1.5.1 Factores que favorecen el desarrollo de resistencia antihelmíntica.
12
1.5.2 Estrategias para limitar el desarrollo de resistencia antihelmíntica.
13
1.5.3 Resistencia a la Ivermectina. 15
1.5.4 Técnicas para determinar resistencia antihelmíntica. 16
1.5.4.1.2 Test de reducción de la oviposición 17
1.5.4.2 Métodos in vitro 20
1.5.2.2.5 Análisis del desarrollo de larvas (LDA). 20
2 MARCO DE REFERENCIA 21
2.1 MARCO DEMOGRÁFICO 21
2.2 MARCO GEOGRÁFICO 22
2.2.1 Ubicación Y Localización Geográfica 23
2.2.2 Municipios de investigación 23
2.2.2.1 Municipio de Aguazul. 23
2.2.2.1.1 Finca la Esperanza. 24
2.2.2.2 Municipio de El Yopal. 24
2.2.2.2.1 Finca Santa Lucía 24
2.2.2.3. Municipio de Maní 25
2.2.2.3.1 Finca Titiriji. 25
2.2.2.4. Municipio de Paz de Ariporo 26
2.2.2.4.1 Finca La Defensa. 26
2.3 CONDICIONES CLIMÁTICAS DURANTE EL MUESTREO 26
2.3.1 Temperaturas máximas, media y mínima. 26
2.3.2 Precipitación. 27
3. METODOLOGIA 28
3.1.1. Descripción De Las Técnicas 29
3.1.1.1 Técnica De MacMaster 29
3.1.1.1.1 Identificación y diferenciación de huevos eliminados en la materia fecal
30
3.1.1.1.2 Coprocultivo 31
3.1.1.1.2.1 Identificación y diferenciación del Larvas L3 por coprocultivo.
33
3.1.1.1.3 Test de reducción de la oviposición 35
3.1.2 Materiales de las técnicas desarrolladas. 36
4. ANÁLISIS DE DATOS 37
5. RESULTADOS 38
5.1 TÉCNICA DE MACMASTER PRE TRATAMIENTO CON IVERMECTINA
38
5.1.1 Municipio de Aguazul. 38
5.1.2 Municipio de El Yopal. 39
5.1.3 Municipio de Maní. 40
5.1.4 Municipio de Paz de Ariporo 41
5.1.5 Resultados generales técnica de MacMaster para los 4 predios.
42
5.1.6.1 Comparación de los 4 predios de eliminación de hpg de materia fecal.
5.2 COPROCULTIVOS PRE TRATAMIENTO CON IVERMECTINA. 44
5.2.1 Municipio de Aguazul 44
5.2.2 Municipio de El Yopal 45
5.2.3 Municipio de Maní. 46
5.2.4 Municipio de Paz de Ariporo 47
5.2.5 Resultados generales técnica de Coprocultivo para los 4 predios.
48
5.3 TEST DE REDUCCIÓN DE LA OVIPOSICIÓN (FECRT) 49
5.3.1 Municipio de Aguazul. 49
5.3.2 Municipio de El Yopal 49
5.3.3 Municipio de Maní. 50
5.3.4 Municipio de Paz de Ariporo 50
5.4 COPROCULTIVO POST TRATAMIENTO CON IVERMECTINA 51
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 51
5.5.1 Resultados técnica de MacMaster Pre tratamiento con Ivermectina.
51
5.5.1.1 Prueba de Shapiro & Wilk para normalidad de los errores 52 5.5.1.2 Prueba de Levene para homogeneidad de varianzas. 52
5.5.1.3 Análisis De Varianza De Una Vía 52
5.5.1.4 Comparación no Planeada – Tukey. 53
5.5.2.1 Comparación no Planeada – Tukey. 54 5.5.3 Comparación Test De Reducción De La Oviposición
(FECRT) Y Análisis Del Desarrollo De Larvas (LDA).
55
5.5.3.1 Prueba de Shapiro & Wilk para normalidad de los errores. 55 5.5.3.2 Prueba de Levene para homogeneidad de varianzas. 55
5.5.3.2 Análisis de varianza 56
6. DISCUSIÓN 57
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 63
8. BIBLIOGRAFÍA 65
TABLA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Ciclo biológico de Pequeños strongylus 3
Figura 2. Ciclo biológico de los Grandes strongylus 5
Figura 3. Ciclo de vida de Parascaris equorum 7
Figura 4. Ubicación geográfica Departamento del Casanare. 22
Figura 5. Municipios de estudio. 23
Figura 6. Finca La Esperanza municipio de Aguazul. 24 Figura 7. Finca Santa Lucía municipio de El Yopal. 25
Figura 8. Finca Titiriji municipio de Maní. 25
Figura 9. Finca La Defensa Municipio de Paz de Ariporo. 26 Figura 10. Mapas de precipitación en milímetros del departamento del
Casanare
27
TABLA DE TABLAS
Pág. Tabla 1. Pruebas para la detección de resistencia antihelmíntica. 17 Tabla 2. Indicadores del Porcentaje de reducción de la oviposición. 19 Tabla 3. Temperatura máxima, media y mínima de los municipios de
estudio.
27
Tabla 4. Identificación y diferenciación de huevos eliminados en la materia fecal de los equinos
30
Tabla 5. Características de larvas L3 de Strongylidos del equino. 33 Tabla 6. Interpretación del porcentaje de reducción de la
oviposición.
35
Tabla 7. Resultados de la técnica de MacMaster municipio de Aguazul.
38
Tabla 8. Resultados técnica de MacMaster municipio de El Yopal. 39 Tabla 9. Resultados técnica de MacMaster municipio de Maní. 40 Tabla 10. Resultados técnica de MacMaster municipio de Paz de
Ariporo.
41
Tabla 11. Resultados identificación de larvas L3 municipio de Aguazul.
44
Tabla 12. Resultados identificación de larvas L3 municipio de El Yopal.
Tabla 13. Resultados identificación de larvas L3 municipio de Maní. 46 Tabla 14. Resultados identificación de larvas L3 municipio de Paz de
Ariporo.
47
Tabla 15. Resultados del test de reducción de la oviposición municipio de Aguazul.
49
Tabla 16 Resultado del test de reducción de la oviposición municipio de El Yopal.
49
Tabla 17. Resultado del test de reducción de la oviposición Municipio de Maní.
50
Tabla 18. Resultado del test de reducción de la oviposición municipio de Paz de Ariporo.
50
Tabla 19. Resultados coprocultivo 14 días post tratamiento con Ivermectina.
51
Tabla 20. Anova resultados técnica de MacMaster pre tratamiento con Ivermectina.
52
Tabla 21. Comparación de medias de eliminación de hpg de materia fecal.
53
Tabla 22. Resultados test de reducción de la oviposición. 54 Tabla 23. Resultados mortalidad de Larvas L3 para FERCT y LDA por
municipio.
55
TABLA DE GRÁFICAS
Pág.
TABLA DE ANEXOS
Pág.
ANEXOS 72
Anexo 1. Estadística 72
DETERMINACIÓN DE RESISTENCIA ANTIHELMÍNTICA FRENTE A LAS LACTONAS MACROCÍCLICAS POR PARTE DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES DEL EQUINO MEDIANTE EL TEST DE REDUCCIÓN DE LA OVIPOSICIÓN (FECRT) EN LOS MUNICIPIOS
DE AGUAZUL, EL YOPAL, MANÍ Y PAZ DE ARIPORO DEPARTAMENTO DEL CASANARE
RESUMEN
La presente investigación se llevó a cabo en los municipios de Aguazul, El Yopal, Maní y Paz de Ariporo, departamento del Casanare; el objetivo principal fue determinar los grados de resistencia o susceptibilidad antihelmíntica de parásitos gastrointestinales del equino, frente a las lactonas Macrocíclicas (Ivermectina) para lo cual se muestrearon 40 equinos (10 equinos por municipio), criollos dedicados a la reproducción en estado silvestre. A todos los animales se les tomó una muestra de materia fecal el día cero (antes del tratamiento con Ivermectina) y el día 14 (post tratamiento con Ivermectina) (Ivermectina comercial no genérico), estas muestras se procesaron mediante las técnicas de MacMaster y Coprocultivo, estableciendo un recuento de huevos por gramo de materia fecal (hpg) para cada municipio pre y post tratamiento. Se realizaron coprocultivos pretratamiento determinando que el 98.15% del total de larvas L3 correspondían a Pequeños strongylus. Con los conteos de hpg pre y post tratamiento con Ivermectina, se realizó el Test de Reducción de la oviposición (FECRT), estableciendo que las poblaciones de Pequeños strongylus son altamente susceptibles a la acción de las Lactonas Macrocíclicas (Ivermectina), resultados que se confirmaron mediante coprocultivo post tratamiento, donde no se encontraron larvas L3 en ninguno de los predios en estudio. Los resultados del FECRT se compararon con los resultados del Análisis del Desarrollo de Larvas (LDA) realizado simultáneamente a los mismos equinos obteniendo con las dos pruebas la ausencia de resistencia antihelmíntica.
ABSTRACT
DETECTION OF ANTIHELMINTIC RESISTANCE AGAINST MACROCYCLIC LACTONES IN EQUINE NEMATODE OF BY THE FAECAL EGG COUNT REDUCTION TEST (FECRT)
IN HORSES OF AGUAZUL, EL YOPAL, MANI AND PAZ DE ARIPORO DEPARMENT OF CASANARE.
This investigation was development in Aguazul, El Yopal, Mani and Paz de Ariporo, Deparment of Casanare. The principal objective was to determine the antihelmintic resistance grades or susceptibility, of gastrointestinal parasites in the equines, against macrocyclic lactones (Ivermectin). To zero day (pretreatment with Ivermectin) and fourteen day (postreatment with Ivermectin) fecal samples were collected per rectum to 40 wild horses (10 horses by town) (used Ivermectin containg no generic product); the fecal samples were analyzed by MacMaster and Coprocultive techniques were identifying the fecal egg count for each town pre and post treatment. The 98.15% of nematodes found by coprocultive technique were Small strongyles. With the fecal egg count pre and post treatment with Ivermectin was calculated for each horse the percentage of reduction in fecal egg count determining that Small strongyles were very likely to the Ivermectin. These results were confirmed by coprocultive post treatment were not found L3 larvae in any farm. The Feecal egg count reduction test (FECRT) results were compared with Larval Develoment Assay (LDA) results getting by two test there isn´t antihelmintic resistance in Small strongyles in the four towns located in Casanare.
INTRODUCCÓN
La relación biológica negativa por la cual el hospedador utiliza los nutrientes del hospedero para su conveniencia sin aportarle beneficio aparente, se conoce como parasitismo, esta relación hospedero-parásito puede mantenerse en equilibrio siempre que el daño que genere en el hospedador sea leve y no ponga en peligro la vida del animal (Sievers y Valenzuela, 1998; Prada, 2002).
Cuando existe algún fenómeno que desequilibre esta relación, como por ejemplo, un ambiente con alta cantidad de parásitos, variaciones ambientales, situaciones de estrés tales como parto, cambio de ambiente, fuerte entrenamiento, alta carga de trabajo, mala nutrición, etc, se inclina la balanza en favor del parásito generando daños al hospedero y ocasionando las llamadas parasitosis, sin olvidar que el parásito depende metabólica y evolutivamente del hospedador (Cordero del Campillo y Rojo, 1999; Solis, 2004).
Actualmente los endoparásitos que revisten mayor importancia clínica para la especie equina son los Pequeños strongylus, debido a su creciente prevalencia, efectos patógenos y a la sospecha de estar desarrollando resistencia al grupo de antiparasitarios más comúnmente utilizados en los equinos como las Lactonas Macrocíclicas que se hace necesario implementar técnicas con las cuales se detecte dicho fenómeno, ya sea a través de pruebas realizadas en campo o con pruebas desarrolladas a nivel de laboratorio (Paulrut y col., 1997).
antiparasitarios en equinos (Coles y col., 1992) dentro de las técnicas in vivo, el Test de Reducción de la oviposición (FECRT) es el método más usado, constituyéndose una prueba fácil de implementar en poblaciones equinas con o sin tratamientos antihelmínticos rutinarios (Craven y col., 1999).
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer los grados de susceptibilidad o resistencia antihelmíntica de parásitos gastrointestinales del equino en cuatro municipios del departamento del Casanare frente a las Lactonas Macrocíclicas (Ivermectina) mediante el Test de Reducción de la oviposición (FECRT).
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Identificar y clasificar los género de parásitos gastrointestinales de los equinos de los municipios de Aguazul, El Yopal, Maní y Paz de Ariporo, Casanare, durante la época de invierno.
• Determinar el porcentaje de presentación de nemátodos gastrointestinales presentes en estos cuatro municipios.
• Analizar las poblaciones de parásitos gastrointestinales encontradas, mediante el Test de reducción de la oviposición (FECRT), con el fin de determinar la presencia o no de resistencia antihelmíntica frente a las Lactonas Macrocíclicas (Ivermectina).
• Comparar los resultados de la prueba in vivo Test de Reducción de la
oviposición (FECRT), con los resultados de la técnica in vitro Análisis del desarrollo de larvas (LDA), ambas pruebas se realizan simultáneamente (Pero
1. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE
Los equinos pueden ser atacados por una gran variedad de parásitos gastrointestinales Lichtenfels, (1975), Jub y col. (1985), Lombardero (1990), Colahan y col. (1998), Sievers y Valenzuela (1998), y Prada (2002), Romero (2007) y factores como el encierro, hacinamiento, manipulación de la alimentación, desparasitaciones, trabajo entre otras, pueden llevar al desequilibrio de la relación hospedero-patógeno y causar alteraciones tales como disminución del rendimiento, pérdida de peso, falla multiorgánica e incluso la muerte.
En la actualidad los nemátodos gastrointestinales que revisten mayor importancia clínica para los equinos son, los Pequeños strongylus y en contadas ocasiones los
Grandes strongylus, así como el Parascaris equorum en potros.
1.1 PEQUEÑOS STRONGYLUS.
Son parásitos del ciego y colon ventral de los équidos, considerados actualmente como los endoparásitos más comunes y de mayor patogenicidad en esta especie debido a la drástica reducción causada desde 1980 por los antihelmínticos modernos sobre los Grandes stróngylos (Herd, 1990; Lyons, 1999; Kaplan, 2002). Más del 80% de los huevos eliminados en la materia fecal corresponden a este tipo de parásitos (Prada, 2002; Romero; 2007).
Se encuentran agrupados en 13 géneros, siendo los más importantes
Cylicostephanus, Cylicocyclus y Cyathostomum y se han identificado más de 51
especies (Corwin y Nahm, 1997; Lichtenfels y col., 1997; Lichtenfels y col., 1998; Lichtenfels y col., 2001; Vitaliy y col., 2001).
Su distribución es mundial y su prevalecía es alta con reportes de hasta del 100% (Klei y Chapman, 1999; Chapman y col., 1999). Su ciclo biológico es directo Figura 1., las larvas L3 una vez son ingeridas, llegan al intestino delgado donde pierden su cutícula de protección, penetran la submucosa del colón formando nódulos de tamaño variable, donde mudan a L4 (Klei y French, 1998; Monahan, 2002), cuando la cantidad de Pequeños strongylus es alta se presenta destrucción de la mucosa trayendo como consecuencia el paso de sustancias toxicas desde el intestino grueso hacia el torrente sanguíneo, la L4 sale del nódulo de la submucosa y en la luz intestinal muda a L5 y finalmente a parásito adulto.
Los Pequeños strongylus, son capaces de realizar hipobiosis (Cordero del Campillo y Rojo., 1999), la que consiste en la disminución del metabolismo casi a cero y el enquistamiento de las larvas L3 en la mucosa intestinal, al parecer para garantizar la presencia de la población parasitaria cuando las cantidades de parásitos adultos libres en el intestino disminuyen, cuando las salidas de las larvas hipobióticas son masivas se puede presentar el cuadro clínico conocido como Ciatostomosis larval que cursa con diarreas, emaciación, hipoalbuminemia y colitis granulomatosa (Prada, 2002), cobra vital importancia en países con estaciones, durante los meses de invierno o en lugares donde los cambios climáticos son marcados. (Lyons y col., 1999; Monahan, 2002).
Figura 1. Ciclo biológico de Pequeños strongylus. Modificado de Merial, 2006 y Cordero del Campillo y Rojo, 1999. ID: intestino delgado.
1.2 GRANDES STRONGYLUS.
Las especies de Grandes strongylus que afectan a los equinos son S. vulgaris, S.
edentatus y S. equinus, de los tres el más frecuente y patógeno es el S. Vulgaris.
En general estos parásitos dentro de su ciclo biológico Figura 2., realizan importantes migraciones, en cuanto al S. Vulgaris, luego de ser ingerida la L3 y de perder su cutícula en el intestino delgado, penetra la mucosa y submucosa tanto del
intestino delgado como del grueso donde muda a L4 hacía el 7 día post infección (pi), las larvas que han penetrado la luz de las arteriolas de la submucosa ascienden por ellas en dirección contraria a la corriente sanguínea para llegar a las arterias cecal y cólica el día 14 pi, y al tronco de las mesentéricas anteriores y arteria aorta hacia el día 21 pi, donde mudan a L5, en este lugar generalmente causan aneurismas de tipo verminoso, finalmente la L5 penetra la luz arterial y llega hasta el intestino, donde atraviesa la mucosa del colón mayor mudando a parásito adulto (Jonhstone, 1998).
La L5 puede también producir lesiones tales como, trombos, émbolos, infartos intestinales, cólicos e incluso la muerte (Jub y col., 1985; Lombardero, 1990; Colahan y col., 1998). En cuanto a las lesiones producidas por los parásitos adultos, estas corresponden a hemorragias y ulceraciones a nivel del colon mayor y ciego (Prada y Romero, 2007).
Figura 2. Ciclo biológico de los Grandes strongylus. Modificado de Campillo y Rojo., 1999
El diagnóstico tanto para Pequeños como para Grandes strongylus, se realiza mediante las técnicas coprológicas de MacMaster o de sedimentación–flotación, sin
embargo para diagnosticarlos con seguridad es necesario realizar cultivos y diferenciación de larvas (Bürger y Stoye, 1968; Corwin y Nahm, 1997, Prada y Romero, 2007).
Para el tratamiento de las parasitosis causadas por Grandes y Pequeños
strongylus, actualmente se utilizan Lactonas Macrocíclicas, en especial Ivermectina.
(Lyons y col., 1999; Sangster, 1999; Prada, 2004).
1.3 PARASCARIS EQUORUM
Es de importancia en animales jóvenes, entre 3 a 9 meses de edad (Soulsby, 1987). La principal fuente de infección es la contaminación a partir de los pastos. Después de los 6 meses de edad se desarrolla una inmunidad importante, cuando se trata de infecciones graves, pueden causar obstrucción del conducto biliar e intestino, enteritis severas, diarrea de olor fétido y color pálido, cólico, ocasionalmente perforación intestinal y muerte (Prada, 2002).
El ciclo de vida es directo Figura 3., realiza una migración hepatopulmonar-traqueal migrando finalmente al intestino delgado, luego de transcurridas 48 horas las larvas se ubican en el hígado, para posteriormente llegar a los pulmones entre los 7 - 14 días post infección, donde mudan a L3 y L4 y como L4 atraviesan la pared de los alvéolos pulmonares y bronquíolos, ascienden a través del árbol bronquial, donde son expectoradas y luego de pasar por la traquea llegan a orofaringe donde son deglutidas alojándose en intestino delgado.
Esta fase migratoria dura hasta 4 semanas y las larvas, tras una nueva muda, se convierten en L5 inmaduro, comenzando después un periodo de crecimiento relativamente rápido que puede durar 10 semanas, completando su desarrollo, haciéndose fértiles. (Cordero del Campillo y Rojo, 1999).
El diagnóstico se basa en la identificación de los huevos en las heces mediante las técnicas de MacMaster y sedimentación-flotación.
Como tratamiento se utilizan la Piperazina (88 mg/Kg VO) o Tiabendazol (100 mg/Kg VO) los cuales son efectivos para las formas adultas del parásito. Cambendazol (20 mg/Kg), Febantel (6 mg/Kg), Fenbendazol (7.5 mg/Kg), Mebendazol (10 mg/Kg), Pamoato de Pirantel (19 mg/Kg) e Ivermectina (0.2 mg/Kg) vía oral siendo efectivas contra las formas adultas y estadios larvarios del parásito (Prada, 2004).
Figura 3. Ciclo de vida de Parascaris equorum, Cordero del Campillo y Rojo, 1999.
Otros especies de parásitos menos importantes clínicamente, pero que pueden llegar a causar en un momento dado problemas a la integridad de los equinos corresponden a: Strongyloides westeri, Oxyuris equi, Habronema muscae, H., majus (H.
microstoma) y Draschia megastoma (H. megastoma), Trichostrongylus axei, Dyctiocaulus arnfieldi. Anoplocephala Perfoliata, Anoplocephala magna y Paranoplocephala mamillana.K La mayoría de estas especies no causan un problema
de salud tan serio debido a su baja incidencia de infección (MacAllister y Freeman, 2007).
1.4 ANTIPARASITARIOS.
La herramienta más utilizada para el control de nemátodos gastrointestinales es el tratamiento antihelmíntico (Torres y col., 2003). En la actualidad los medicamentos antihelmínticos se clasifican en 7 grupos que corresponden a: Piperazinas, Organofosforados, Tetrahydropyrimidinas, Imidazothiazoles, Bencimidazoles, Pro-bencimidazoles y Lactonas macrocíclicas (Hardman y Limbird, 2001; Sumano y Ocampo, 2006), la forma como actúan no se conoce en detalle, pero su mecanismo de acción podría explicarse con la interferencia en el metabolismo generador de energía por lo que el parásito muere por hambre o bien por bloqueo en la transmisión neuromuscular causando la parálisis del parásito (Ralston, 2000; Prada, 2002).
1.4.1 Lactonas Macrocíclicas.
Son moléculas obtenidas de la fermentación del Streptomyces sp. Se les llama macrocíclicas por su estructura química (un azúcar y una aglicona) que permite relacionarlas con los macrólidos, obtenidos también del Streptomyces sp.
Este grupo se divide a su vez en dos familias, de acuerdo a su origen en, Avermectinas y Milbemicinas, las primeras son extraídas del Streptomyces avermitilis (Nicholas, 1999; Prada, 2003) y las segundas del Streptomyces hygroscopicus (Sumano y Ocampo, 2006).
Las Avermectinas pueden ser de origen natural, donde se incluyen la Ivermectina y la Abamectina o biosintéticas, tales como la Doramectina, Epironomectina y Selamectina mientras que las Milbemicinas agrupan a la Milbemicina y a la Moxidectina (Sumano y Ocampo, 2006).
1.4.1.1 Ivermectina.
La ivermectina es una Lactona Macrocíclica perteneciente como ya se mencionó al grupo de las Avermectinas, aparece en la década de 1980, siendo efectiva frente a un gran numero de parásitos tanto internos como externos, permitiendo además varias formas de administración (Antonelli, 2004).
1.4.1.1.1 Mecanismo de Acción.
La entrada del fármaco al parásito puede ser por vía oral o transcuticular, una vez dentro del nemátodo, ejercen su acción al unirse a los canales de Cl-, ligados al receptor de glutamato (GluCl), estos canales iónicos están compuestos por tres subunidades (α, β, δ), la Ivermectina, presenta gran afinidad por la subunidad α.
Los receptores para la Ivermectina se encuentran localizados en mayor proporción en las neuronas, células musculares y en el útero de los invertebrados. Cuando la ivermectina se une selectivamente e irreversiblemente a estos receptores se produce un aumento representativo en la permeabilidad al Cl-, lo que genera la hiperpolarización de la membrana celular. (Martin y Robertson, 2000).
A concentraciones bajas, potencializa el efecto del glutamato y a concentraciones elevadas produce por sí misma la apertura del canal, causando una hiperpolarización y un aumento irreversible en la conducción de entrada al Cl-. Como consecuencia del proceso se genera una parálisis flácida que origina pérdida de la motilidad y termina provocando la muerte del parásito, cuando es utilizada a concentraciones mucho menores tienen la capacidad de inhibir el bombeo faríngeo en determinados parásitos, alterando la ingestión del alimento (Antonelli, 2004)
1.4.1.1.1 Espectro.
En general los parásitos afectados son nemátodos y artrópodos, careciendo de actividad frente a céstodos, trematodos y protozoos (Sumano y Ocampo, 2006), debido a la falta de receptores GluCl. Se conocen especies y estadios del ciclo de los parásitos que son menos sensibles al tratamiento o cuya localización dificulta el acceso de la Ivermectina, lo que se conoce como especies y estadios limitantes a la dosis, Entre ellos se pueden destacar los géneros Cooperia y Nematodirus en rumiantes, Trichuris en suidos y los Cyasthostoma en equinos como menos sensible y las fases hipobióticas de los géneros Ostertagia y Haemonchus, larvas de
Cyathostomas y las fases adultas de Trichuris y Onchocerca, como fases resistentes,
dentro del ciclo vital del parásito (Antonelli, 2004).
1.4.1.1.2 Farmacocinética.
Se caracterizan por presentar una amplia distribución y una larga persistencia en el organismo. La absorción depende en gran medida de la vía de administración, de la formulación farmacéutica y de la especie, por ejemplo en bovinos la vía oral no se recomienda debido a que presenta escasa absorción, en equinos la vía intramuscular, no es utilizada dada la reacción local que presenta, cuya inflamación y localización de la lesión impediría la dinámica de la absorción. Debido a que son compuestos muy
liposolubles su distribución es buena presentando un elevado porcentaje de unión a proteínas plasmáticas, concentrándose principalmente en grasa e hígado.
El metabolismo se realiza en hígado, siendo eliminados los metabolitos principalmente por materia fecal, orina y leche (Antonelli, 2004).
1.5 RESISTENCIA ANTIHELMÍTICA
El desarrollo de resistencia a los antihelmínticos por parte los nemátodos que parasitan a los herbívoros domésticos se está incrementando rápidamente, los primeros antecedentes, así como la mayor magnitud del problema, corresponden a los pequeños rumiantes en los cuales se ha informado sobre parásitos gastrointestinales resistentes principalmente a Levamisoles, Benzimidazoles y Lactonas Macrocíclicas (Eddi y col., 1996; Romero y col., 1998). En los bovinos se ha reportado resistencia particularmente a las Lactonas Macrocíclicas y a los Benzimidazoles (Anziani y col., 2004; Anziani y Fiel, 2004). En los equinos el estudio de resistencia antihelmíntica ha llevado a reportarla frente a la Fenotiazina, Bencimidazoles, Pirantel y en la actualidad a las lactonas Macrocíclicas (Prada, 2002).
Se entiende por resistencia antihelmíntica la capacidad heredable de los parásitos de sobrevivir a tratamientos con antihelmínticos que a dosis terapéuticas normalmente causan la inhibición del crecimiento o muerte del mismo (Prichard, 1994). En forma general, la presentación del fenómeno de resistencia comienza cuando solo una pequeña parte de la población parasitaria posee tolerancia genética al tratamiento, ante reiteradas desparasitaciones con un mismo principio activo, la población susceptible muere y sobreviven de esta forma los individuos resistentes que luego de los sucesivos tratamientos, aumentan en número y transmiten esta capacidad de generación en generación (Cristel y Suárez, 2006).
La resistencia puede ser intrínseca (natural) o adquirida (parásitos inicialmente susceptibles que dejan de serlo), las modificaciones genéticas por las que puede ocurrir resistencia adquirida pueden ser:
• Mutación, donde es alterado el ADN en producción o función del componente celular que permite que el fármaco actúe, evitando que éste produzca su acción farmacológica.
• Amplificación génica, la que ocurre por un aumento en la síntesis de sustancias que intervienen con la acción del fármaco convirtiendo a la célula en resistente a concentraciones que normalmente son efectivas.
• Tolerancia génica, donde una célula susceptible incorpora información de resistencia de otra impidiendo que el fármaco cumpla su función.
Si la resistencia ocurre para uno o más antihelmínticos con mecanismos de acción similares o diferentes se presentan tres tipos de resistencia: cruzada, cuando un parásito es resistente a fármacos con mecanismos de acción diferentes, paralela cuando el parásito es resistente a otro compuesto con mecanismo de acción similar o
múltiple, cuando la resistencia ocurre para más de un grupo de antiparasitarios
(Hubert y Kerboeuf, 1992; Márquez, 2003).
1.5.1. Factores que favorecen el desarrollo de resistencia antihelmíntica.
Si bien se citan una serie de factores que inducen la aparición de resistencia antihelmíntica, sin lugar a dudas los principales se centran en la alta frecuencia de desparasitaciones, el uso indiscriminado de antiparasitarios y la falta de rotación de principios activos (Llorens y col., 2004).
En general estos factores se han clasificado como intrínsecos y extrínsecos u operativos, los primeros hacen referencia a características del parásito tales como genética, ecología, comportamiento y fisiología; los segundos se relacionan con
factores controlados por el hombre como, la elección del antihelmíntico, dosis, vías de administración, tiempo y frecuencia de aplicación (Smith y col., 1999).
Uno de los principales factores involucrados con el desarrollo de resistencia antihelmíntica es la población en refugio, término que se refiere a los individuos de una población parasitaria (parásitos de la pradera) que no fue expuesta a un tratamiento en particular, evitando así la selección por resistencia; cuando la población en refugio es baja, el uso de antihelmínticos puede llevar a una rápida selección de resistencia, por el contrario la selección de resistencia es menor cuando la población en refugio es grande debido a que los parásitos susceptibles producirán un mayor efecto de dilución (Coles, 2005),
Las dosificaciones frecuentes son particularmente riesgosas cuando el intervalo entre dosificaciones es cercano al período prepatente, teniendo en cuenta además el período de persistencia de los principios activos, en donde los antihelmínticos de mayor persistencia seleccionarán más sostenidamente que los menos persistentes (Sangster, 1999).
El uso intensivo de un mismo principio activo, es también importante, ya que seleccionará a aquellos especimenes que son genéticamente resistentes, los cuales transmitirán esta característica a su descendencia. Posteriores tratamientos continuarán seleccionando progresivamente e incrementando el nivel de resistencia, en este momento los antiparasitarios serán marcadamente ineficaces en la disminución de la carga parasitaria.
1.5.2 Estrategias para limitar el desarrollo de resistencia antihelmíntica.
En la actualidad cualquier programa de control que pretenda ser efectivo debe incorporar la utilización de antihelmínticos, pero el uso de éstos debe basarse en el
conocimiento epidemiológico y las diferentes alternativas de pastoreo en relación con el riesgo parasitario.
El reto es como frenar el desarrollo de la resistencia. La clave posiblemente está en la necesidad de conservar el estado de susceptibilidad antihelmíntica en los predios, para lo que será necesario que los productores admitan cierta disminución en la producción ocasionada por parásitos gastrointestinales, en áreas de este objetivo (Márquez, 2007)
Por lo menos cinco medidas han sido recomendadas para demorar el desarrollo de resistencia (Antonelli, 2004):
1. Disminución de la frecuencia de aplicaciones antihelmínticas. 2. Utilización de antihelmínticos de espectro reducido.
3. Ajustar las dosis correctamente, evitando subdosificaciones y previniendo el escape de nemátodos sobrevivientes.
4. Rotación de grupos químicos.
5. Utilizar medidas integrales de control que no se basen exclusivamente en la aplicación de antihelmínticos.
Igualmente se puede citar una larga lista de alternativas que apunten a disminuir el número de desparasitaciones, basadas en alternativas de manejo del pastoreo tales como, descanso de pasturas (Barger, 1999), pastoreo alterno, pastoreo rotativo (Castells y col., 2001), silvopastoreo (Thomas y Kevan, 1993) entre otros, y el conocimiento de la epidemiología parasitaria.
Es claro que si se establece un programa de control integrado a través de la combinación de tratamientos antihelmínticos y pasturas con bajos niveles de infectividad (verdeos, rastrojos, praderas nuevas y/o controladas, etc.) sin dudas se
disminuiría la frecuencia de desparasitaciones y con ello el riesgo de resistencia antihelmíntica.
1.5.3 Resistencia a la Ivermectina.
La resistencia hacia la Ivermectina es relativamente baja y se reporta que es más frecuente que la desarrollen los parásitos de ovinos y caprinos (Echeverria y col., 1992; Paiva y col., 2001; Sumano y Ocampo, 2006), en equinos la resistencia solo se ha demostrado, para el grupo de Pequeños strongylus (Pérez y Col., 2001; Ralston, 2000; Lichtenfels y Col, 2001; Vitaliy y Col, 2001; Prada 2002).
Esta resistencia ha sido explicada por dos rutas principales, la primera corresponde a una explicación desde su mecanismo de acción, en cuanto a modificaciones de los receptores GluCl (mutación), que impedirían que el fármaco alcance las concentraciones efectivas (Geary y col., 1999), lo que podría estar asociado a alteraciones propias de las subunidades del receptor GluCl y/o a la expresión aumentada de una glicoproteína (glicoproteína P), la que se cree impide alcanzar las concentraciones activas de la molécula antiparasitaria en el receptor GluCl α del parásito resistente (Geary y col, 1999).
La segunda ha sido relacionada con una disminución en la permeabilidad de la cutícula de los nemátodos por mutación de los genes Dfy responsables de la captación del fármaco y cuya modificación genética haría a los parásitos menos permeables a la Ivermectina, con lo cual no podría alcanzar el receptor y ejercer su mecanismo de acción (Dent y col, 2000).
Finalmente, estudios in vivo han demostrado que la resistencia a las Lactonas Macrocíclicas, se debe a una reducción en la sensibilidad de sus efectos sobre el desarrollo y motilidad larvaria, lo cual implica una disminución en la inhibición de la actividad de la bomba faríngea y de la musculatura somática.
La resistencia antihelmíntica es un fenómeno actual que involucra la selección de nemátodos resistentes por factores propios de los antihelmínticos, los parásitos, los hospedadores y del medio ambiente donde se desarrolla el fenómeno (President, 1985), por lo que al utilizar un antiparasitario es necesario evaluar dosis, ruta de administración, frecuencia de tratamiento y mecanismo de acción (Prada, 2002).
1.5.4 Técnicas para determinar resistencia antihelmíntica.
Se han desarrollado diversas técnicas para la determinación de resistencia antihelmíntica, sin embargo, cualquiera que sea el método utilizado, la correcta anamnesis es imprescindible, la información sobre el propósito del animal, tipo de alimentación, plan sanitario, manejo de potreros, historial de desparasitaciones, frecuencia, principios activos y dosis utilizadas en cada vermifugación, son importantes en el momento en que se quiera establecer la posibilidad de este fenómeno, no obstante aunque la resistencia se pueda sospechar en base a los resultados arrojados por los datos epidemiológicos y clínicos, es necesario la implementación de pruebas de laboratorio que confirmen o descarten la presencia del proceso.
La asociación mundial para el avance de la parasitología veterinaria (WAAVP) ha estandarizado las pruebas para parásitos nemátodos (Coles y col., 1992), Tabla 1. Éstas, son pruebas biológicas, bioquímicas, in vivo e in vitro que detectan los grados
de susceptibilidad o resistencia antihelmíntica de un respectivo antiparasitario (Pook y col., 2002; Taylor y col., 2002; Coles y col., 2006).
Tabla 1. Pruebas para la detección de resistencia antihelmíntica.
IN VIVO - IN VITRO NOMBRE ESPECTRO TIPO DE PRUEBA
In vivo Prueba de eficacia controlada Todos los antihelmínticos
Biológica Test de reducción de la
oviposición Todos los antihelmínticos
In vitro
Eclosión de Huevos Benzimidazol Parálisis de Huevos Levamisol
Morantel Parálisis larval Levamisol Inhibición de la ingestión
larvaria Ivermectina Benzimidazol Análisis del desarrollo de larvas Benzimidazol
Levamisol Ivermectina
Fijación a la Tubulina Benzimidazol Bioquímica
Pruebas PCR Benzimidazol Pruebas de
biología molecular
Modificado de: Prada, 2002 y Márquez, 2003.
1.5.4.1 Métodos in vivo
1.5.4.1.1 Test de reducción de la oviposición (Faecal Egg Count Reduction - FERCT).
Es el método de detección de resistencia más simple, puede ser utilizado en rumiantes, equinos y porcinos, con todo tipo de antihelmínticos y con todas las especies de nemátodos cuyos huevos sean eliminados con la materia fecal y puedan ser cuantificados.
Para esta prueba se recomienda la utilización de animales jóvenes, menores de un año de edad, dado que la respuesta inmune del huésped puede disminuir o anular la oviposición en gran parte de los géneros parasitarios luego del año de edad con un adecuado nivel nutricional (Fiel y col., 1998).
Diferentes métodos para calcular el porcentaje de reducción de huevos en las heces se han desarrollado, una de las recomendaciones de la WAAVP es utilizar un grupo testigo que se mantiene sin tratar para conocer los posibles cambios en la eliminación de huevos durante el periodo de estudio (Coles y col., 1992; Coles y col., 2006), metodología que ha sido estandarizada para ovinos y caprinos pero no en equinos (Kaplan, 2002).
Otra opción consiste en utilizar como grupo testigo a los mismos animales antes del tratamiento, en este caso puede estimarse el porcentaje de reducción individual ya que cada animal es su propio control (Álvarez y col., 2002; Sievers y Alocilla, 2007).
La técnica se basa en la valoración de la eficacia de un antihelmíntico comparando el recuento de huevos fecales de un grupo de animales antes y 10-15 días después del tratamiento.
La forma recomendada para calcular la reducción de los conteos de huevos es:
Donde es la media aritmética del grupo control o media aritmética de hpg pretratamiento y es la media aritmética de los animales tratados o media aritmética de hpg postratamiento (Young y col., 1999).
Algunos autores, (President, 1985), indican que los resultados de este test son sólo una estimación de la eficacia antihelmíntica debido a que la postura de huevos no siempre guarda una estrecha correlación con la carga parasitaria y sólo mide el efecto sobre hembras maduras.
Sin embargo para esta prueba se asume que una reducción de la oviposición ≥ al 95% indican que la población de parásitos es susceptible, con una reducción de la oviposición entre el 80% - 94%, se considera que la población es moderadamente resistente, mientras que reducciones menores o iguales al 79% indican que la población es altamente resistente, tabla 2. (Coles y col., 1992; Probst, 1999; Sangster, 1999; Prada, 2002).
Tabla 2. Indicadores del Porcentaje de reducción de la oviposición. % reducción de la oviposición Indicador
≥ al 95% Población susceptible
80% - 94% Población moderadamente resistente ≤ 79% Población altamente resistente
Cabe resaltar que a pesar de tener limitaciones como sensibilidad baja y requerir un mínimo de 10 días para obtener los resultados, su utilización conjunta con un coprocultivo pre y post tratamiento permite valorar la resistencia adecuadamente (Jackson y Coop, 2000; Álvarez y col., 2002).
1.5.4.2 Métodos in vitro.
1.5.4.2.1 Análisis del desarrollo de larvas (LDA).
Se han publicado diferentes descripciones sobre el LDA para la detección de resistencia antihelmíntica en nemátodos gastrointestinales. Mientras que las diferencias entre las metodologías se deben al tipo de medio de cultivo empleado, la base de la técnica es la misma en todos los casos; los huevos se incuban hasta L3 y luego se someten a distintas diluciones de antihelmíntico (Álvarez y col, 2002; Prada, 2002).
Es una prueba que se emplea para detectar resistencia frente a miembros de las tres familias de antihelmínticos de amplio espectro. Como ocurre con la eclosión de huevos, en esta prueba también se han observado variaciones en la DE50 en función
del momento de la infección, alcanzándose el valor más alto para la DE50 entre el día
50-60 post-infección.
Respecto a la eclosión de huevos, tiene la ventaja de que no son necesarios huevos recién recuperados de las heces para realizar la prueba. Además no es tan subjetiva como la prueba de motilidad larvaria, cuando se realiza la lectura de la muestra. Se considera una buena técnica para emplear en los estudios de resistencia antihelmíntica y para complementar a otras pruebas in vitro e in vivo con las que muestra una buena correlación (Varady y Corba, 1999).
2. MARCO DE REFERENCIA
Equinos dedicados a la reproducción en estado silvestre de los municipios de Aguazul, El Yopal, Maní y Paz de Ariporo departamento del Casanare fueron el objeto de estudio, el presente trabajo de investigación se orientó con el fin de otorgar información sobre las poblaciones de endoparásitos presentes en esta región, así como la determinación de resistencia antihelmíntica frente a la Ivermectina por parte de larvas L3 de nemátodos gastrointestinales de éstos equinos mediante la prueba in
vivo Test de reducción de la oviposición (FECRT).
2.1 MARCO DEMOGRÁFICO
Se muestreó un predio por cada uno de los municipios en estudio (Aguazul, El Yopal, Maní y Paz de Ariporo), se analizaron un total de 80 muestras de materia fecal equina, recolectadas directamente del recto, que se distribuyeron de la siguiente manera:
• 40 muestras de materia fecal recolectadas en Mayo de 2008 (día cero), de equinos de los predios en estudio antes de administrar vía oral la dosis correspondiente del antihelmíntico (Ivermectina no genérica), a las cuales se les realizó la técnica coprológica de MacMaster para determinar la presencia y el número de huevos por gramo de materia fecal (hpg) y la técnica de Coprocultivo para determinar las poblaciones de parásitos gastrointestinales.
• 40 muestras recolectadas 14 días post tratamiento con Ivermectina, a las que igualmente se les realizó la técnica de MacMaster para determinar el porcentaje de reducción de la oviposición y la técnica de Coprocultivo para corroborar la presencia o ausencia de larvas L3 luego del tratamiento con el antihelmíntico.
2.2 MARCO GEOGRÁFICO
Generalidades. El Departamento del Casanare se encuentra dentro de la región
oriental de la Orinoquía “llanos orientales colombianos”. Posee una extensión territorial de 44.640 Km2 donde más del 60% de su territorio es plano; altura promedio es de 220 metros sobre el nivel del mar (msnm), la temperatura promedio en las sabanas es de 30ºC, las lluvias ocurren durante los meses de Abril a Octubre, la red hidrográfica del Departamento está constituida principalmente por los ríos Casanare, Ariporo, Upía, Cusiana, Cravo Sur y Pauto. El Departamento limita por el sur con el Departamento del Meta, al oriente con el Departamento del Vichada, al Occidente con el Departamento de Boyacá y al norte con el Departamento de Arauca (Figura 4) (www.casanare.gov.co/esp/casanare_hoy/cas_historia.htm, 2008).
Figura 4. Ubicación geográfica Departamento del Casanare.
www.casanare.gov
2.2.1 Ubicación Y Localización Geográfica
El Departamento del Casanare se encuentra localizado entre los 04º 17´25” y 06º 50´22” de latitud norte y 73º 04´33” de longitud oeste.
2.2.2 Municipios De Investigación
Los municipios en estudio como ya se ha mencionado fueron: Aguazul, El Yopal, Maní y Paz de Ariporo (Figura 5).
Figura 5. Municipios de estudio.
www.casanare.gov
2.2.2.1 Municipio de Aguazul.
El municipio de aguazul, se encuentra ubicado geográficamente a 5º 10`latitud norte y a 72º 33` longitud oeste, a 290 msnm; tienen una extensión de 1.330 km2 y una temperatura promedio de 27ºC, su clima es predominantemente cálido (www.aguazul.gov.co).
2.2.2.1.1 Finca la Esperanza.
Se encuentra ubicada al oriente del municipio de Aguazul, a 30 minutos del casco urbano (Figura 6).
Figura 6. Finca La Esperanza municipio de Aguazul.
(Chaparro, 2008)
2.2.2.2 Municipio de El Yopal.
El Yopal, es la capital del Departamento del Casanare, se encuentra a 350 msnm, tiene una extensión de 2.771 km2, su temperatura promedio es de 29ºC, su clima es húmedo y dista de la ciudad de Bogotá a 350 Km.
2.2.2.2.1 Finca Santa Lucía
Se encuentra ubicada a 20 minutos de la ciudad de El Yopal, vía Matapantano y a 30 minutos a caballo se ubica el potrero donde se encontraban los equinos a la fecha de los muestreos (Figura 7).
Figura 7. Finca Santa Lucía municipio de El Yopal.
(Chaparro, 2008)
2.2.2.3 Municipio de Maní
Se encuentra a 55 km del municipio de Aguazul y a 80 Km del municipio de El Yopal, se encuentra a 200 msnm, tiene una extensión de 3.860 km2, una temperatura promedio de 30ºC, con un clima que oscila entre cálido y húmedo (www.casanare.gov.co).
2.2.2.3.1 Finca Titiriji.
Se encuentra ubicada hacia el occidente del municipio de Maní, a 30 minutos del casco urbano (Figura 8).
Figura 8. Finca Titiriji municipio de Maní.
(Chaparro, 2008)
2.2.2.4 Municipio de Paz de Ariporo
Con aproximadamente 13.800 Km2, es el municipio del departamento del Casanare con más extensión territorial, se encuentra a 150 km de la capital del Departamento y a 460 km2 de la ciudad de Bogotá, está localizado a 275 msnm, tiene una temperatura promedio de 34ºC y la mayor parte del año el clima es húmedo, siendo los meses más secos Enero y Febrero, donde las temperaturas pueden llegar a superar los 36ºC (www.casanare.gov.co)
2.2.2.4.1 Finca La Defensa.
Se encuentra ubicada al oriente del municipio a aproximadamente 2 horas del centro urbano.
Figura 9. Finca La Defensa Municipio de Paz de Ariporo
(Chaparro, 2008)
2.3 CONDICIONES CLIMÁTICAS DURANTE EL MUESTREO 2.3.1 Temperaturas máxima, media y mínima.
Tabla 3. Temperatura máxima, media y mínima de los municipios de estudio. (Aeropuerto Internacional el Alcaraván de El Yopal; Chaparro, 2008.) Día Municipio Tº Máxima Tº Media Tº Mínima
19/05/08 Aguazul 32 26.9 24 20/05/08 El Yopal 31 25.35 31 21/05/08 Maní 34 27 23 22/05/08 Paz de Ariporo 30 24 20 2/06/08 Aguazul 32 26 25 3/06/08 El Yopal 31 25.13 23 4/06/08 Maní 33 26.3 24 5/06/08 Paz de Ariporo 30 25 22 2.3.2 Precipitación.
Figura 10. Mapas de precipitación en milímetros del departamento del Casanare durante el muestreo. www.ideam.com /2008.
3. METODOLOGÍA
3.1 MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS.
Se recolectó una muestra de materia fecal de aproximadamente 200 gramos, con una manga de palpación humedecida con agua directamente del recto de los equinos de los cuatro municipios en estudio (10 por municipio), posterior a la obtención de la muestra, ésta fue identificada con el nombre del municipio al que corresponde y el número o nombre del equino del cual se obtuvo, la muestra se refrigeró en una nevera de icopor con hielo a una temperatura inferior a 10°C, lo cual evitó la eclosión de los huevos de los parásitos antes de que las muestras fueran procesadas, luego de su recolección se analizaron mediante las técnicas coprológicas de MacMaster y coprocultivo para obtener el número de huevos por gramo de materia fecal y los géneros de parásitos gastrointestinales presentes en los animales.
Una vez recolectada la muestra de materia fecal se procedió a administrar vía oral 200 mcg/kg de un producto comercial a base de Ivermectina (no genérico) a cada uno de los equinos (40 equinos en total, 10 por municipio) y 14 días post administración del antihelmíntico, se recolectó nuevamente una muestra de materia fecal directamente del recto de los animales tratados, igualmente fue identificada y refrigerada y se les realizó la técnica de MacMaster obteniendo el número de huevos por gramo de materia fecal post tratamiento y con ello el porcentaje de reducción de la oviposición, además de corroborar los resultados con la Técnica de Coprocultivo para identificar o no la presencia de larvas L3. (Los animales tratados fueron muestreados para determinar poblaciones parasitarias en 3 ocasiones, 2 en invierno y 1 en verano dentro de la investigación “Determinación de poblaciones de endoparásitos en equinos de las sabanas de Bogota y Casanare, así como los grados de resistencia antihelmíntica frente a las lactonas Macrocíclicas, mediante el Test de reducción de la
oviposición y Análisis del desarrollo de larvas” siendo los muestreos de invierno los de este trabajo de investigación)
Cada muestra recolectada fue dividida de la siguiente manera: • 3 gramos para la técnica de MacMaster.
• 100 – 150 gramos para la técnica de coprocultivo.
Este procedimiento se realizó de la misma forma, el día cero y el día 14 post tratamiento antihelmíntico con Ivermectina.
3.1.1 Descripción De Las Técnicas
3.1.1.1 Técnica De MacMaster Modificada Por Schmidt (1971)
• Se vierte en un frasco plástico una solución saturada de cloruro de sodio (360 gr. / litro de agua) hasta la marca que indica 42 ml (envase plástico con capacidad para 50 ml).
• Luego se agrega materia fecal hasta alcanzar una marca que indica 45 ml, lo que quiere decir que aproximadamente se colocaron 3 g de materia fecal en el envase.
• La muestra de materia fecal debe deshacerse con un baja lenguas.
• Se tapa el frasco y se agita suavemente para asegurar una suspensión homogénea.
• Se destapa el frasco y con un gotero se toma una muestra de la parte media del frasco, luego se procede a llenar las dos secciones de la Cámara de MacMaster. Debe evitarse el ingreso de burbujas de aire, ya que desplazan los huevos de nemátodos y puede causar recuentos erróneos.
• Se deja la cámara en reposo 2 minutos. Se realiza el recuento de huevos en ambas secciones (cuadriculas o ventrículos), con los aumentos 4X, 5X o 10X.
• El número de huevos encontrados se multiplica por 13 para obtener el número de huevos por gramo de materia fecal (hpg) (Romero, 2007).
3.1.1.1.1 Identificación y diferenciación de huevos eliminados en la materia fecal (Técnica de MacMaster).
Para la clasificación de huevos y larvas de parásitos gastrointestinales del equino, se utilizo como referencia a Monteiro (2005), y Bûrger y Stoye (1968), técnicas descritas en las tablas 4 y 5 y figura 11.
Tabla 4. Identificación y diferenciación de huevos eliminados en la materia fecal de los equinos. Monteiro, 2005.
Tipo de Huevo Descripción y Características morfológicas Figura
Strongylido
spp. Agrupan a los huevos de pequeños y grandes strongylus, puesto que son indistinguibles entre si. Huevos de tamaño medio de 100-110 micras de largo por 40-50 micras de diámetro.
Forma alargada.
Posee dos paredes aplanadas. Superficie lisa.
Contiene mórula con un pequeño número de blastómeros.
Strongyloide
spp. Huevos de tamaño pequeño de 40-50 micras de largo por 30-40 micras de diámetro. Ovoide.
Paredes simétricas. Polos largos.
Pared fina y superficie lisa. Contiene una pequeña larva.
Parascaris spp. Los huevos son irregularmente esféricos, midiendo 90-100 џm de diámetro. En su interior contienen al ser puestos una simple célula encerrada en tres cubiertas: una delgada membrana vitelina interior, una gruesa cubierta media, formada por laminillas proteicas y una tercera capa externa, salpicada de diminutos hoyuelos y protuberancias.
Triodonthoforus spp.
Huevos de tamaño grande: 130-140 micras de largo por 55-65 micras de diámetro.
Ovoide. Paredes lisas.
Contiene mórula con blastómeros grandes y muy juntos.
Habronema
spp. Huevos de tamaño pequeño de 40-55 micras de diámetro por 8-16 micras de largo. Cilíndrico o baciliforme, fuertemente comprimido.
Paredes laterales en forma de barril. Contiene una larva en su interior.
Oxyuris spp. Huevos de tamaño medio de 80-95 micras de largo por 40-45 micras de diámetro.
Levemente asimétrico.
Una de sus paredes es ligeramente aplanada.
Siempre contiene un estadio de mórula tardía o larva L1.
Anoplocephala spp.
Huevos de tamaño medio de 50-80 micras de largo por 8-16 micras de diámetro.
Esféricos en la mayoría de los preparados. Ligeramente aplanados en varios de sus lados. Superficie lisa.
Contienen un embrión cercado por un aparato quitinoso piriforme que le da apariencia de pera.
3.1.1.1.2 Coprocultivo (Roberts y Sullivan, 1950).
• En un vaso desechable se colocan de 100 a 150 gr. de materia fecal en porciones pequeñas con el fin de garantizar la aireación apropiada de la muestra. Los vasos se llenan hasta ¾ partes.
• Los vasos se tapan con hojas de papel y se sujetan con bandas elásticas, una vez el vaso es tapado se hacen múltiples perforaciones (preferiblemente con una aguja calibre 18) a la hoja que lo cubre, para que la muestra reciba aire y se evite la deposición de huevos de insectos sobre ella, lo que podría interferir con el desarrollo de las larvas de los nemátodos.
• Las muestras se almacenan en el laboratorio en repisas protegidas de la luz solar. Diariamente cada muestra debe ser agitada suavemente para mejorar la aireación y mantener una humedad uniforme.
• Luego de 15 – 21 días de cultivo se procede a extraer las larvas L3, mediante la técnica de migración activa o técnica de Baermann-Wetzel descrita en Rommel y col (2000). Donde se envuelve aproximadamente 15gr de materia fecal en una porción de gasa, la cual se coloca en un colador que se suspende del borde de un embudo lleno de agua el cual se encuentra empatado con una manguera de goma que en su parte inferior sujeta a un tubo de ensayo sin anticoagulante. Después de 24 horas se recoge el líquido que contiene las larvas en el tubo de ensayo.
• Posterior a la extracción del líquido que contiene las larvas con un gotero se extrae una gota del sedimento (agitando previamente la muestra para homogenizar su contenido) que se coloca sobre una lámina portaobjetos para proceder a realizar la observación en un microscopio a 4X, 5X, 10X y 40X.
33 3.1.1.1.2.1 Identificación y diferenciación del Larvas L3 por coprocultivo.
Tabla 5. Características de larvas L3 de Strongylidos del equino.
Género y/o
especie Forma y Tamaño de la larva Esófago intestinales Células posterior Extremo de la larva Forma de la cola Tamaño de la cola Relación Cuerpo: cola. Strongylus
edentatus Bastante delgada; (800µ) de longitud Bastante largo y filarigorme
18-20, poco
nítidas Adelgaza de apoco Forma de hilo Mediana-larga 2:1
Strongylus equinus Muy delgada; (1000µ) de longitud Largo y filariforme 16-18 Adelgaza muy lento Forma de hilo Corta 2.8:1 Strongylus
vulgaris Grueso y grande; (1000µ) de longitud Corto y filarigorme 28-32, muy nítidas, con granulaciones Adelgaza muy lento Forma de hilo Corta 2.5:1 Pequeños
estróngilos Gruesas y chicas (850µ) de longitud Largo y filariforme 8-12, nítidas Adelgaza muy rápido
Forma
de hilo Muy larga 1.5:1
Trichostrongylus spp. Delgada y chica (700µ) de longitud Corto y filarigorme 16 Corto y redondo Strongyloides
westeri Muy delgada y chica (600µ) de longitud
Muy largo 1/3 de la larva
Poco claras Corto y redondo
Figura 11. Forma y Tamaño larvas L3 del equino.
Bûrger y Stoye, 1968.
3.1.1.1.3 Test de reducción de la oviposición (Young y col., 1999).
Con los resultados obtenidos con la técnica de MacMaster del número de hpg de materia fecal de los días 0 (pretratamiento) y 14 (post- tratamiento), se realizó el Test de reducción de la oviposición, que como ya se mencionó dentro de la revisión de literatura, consiste en el cálculo de la presencia de cepas de parásitos resistentes mediante la prueba de reducción de la oviposición, la cual compara los recuentos de huevos antes y después del tratamiento de los animales en este caso con Ivermectina, determinando el porcentaje de reducción de la oviposición por la fórmula:
(Young y col., 1999).
= Media aritmética de hpg pretratamiento. = Media aritmética de hpg postratamiento.
Para el presente trabajo de investigación se tuvo en cuenta los siguientes porcentajes para determinar la presencia o no de poblaciones resistentes a la Ivermectina Tabla 6:
Tabla 6. Interpretación del porcentaje de reducción de la oviposición. % de reducción en la oviposición. Interpretación.
≥ al 95% Parásitos susceptibles
80% - 94% Parásitos moderadamente resistentes ≤ 79% Parásitos altamente resistentes.
3.1.2 Materiales de las técnicas desarrolladas.
Técnica Materiales
MacMaster (Romero, 2007)
Cámaras de MacMaster de 4 retículos. Frascos de 50 ml. Baja lenguas. Goteros. Microscopio. Coprocultivo (Roberts y Sulivan, 1950) Vasos desechables.
Resma de papel tamaño carta. Bandas de caucho.
Laminas porta objetos. Laminas cubre objetos. Embudos.
Coladores. Gasa.
Manguera de goma. Pinzas.
Tubos de ensayo tapa roja. Microscopio.
Test de reducción de la oviposición (FERCT)
(Young y col., 1999).
Mangas de palpación
Ivermectina oral (no genérica)
Resultados hpg de materia fecal pre tratamiento (Técnica de MacMaster). Resultados hpg de materia fecal 14 días post tratamiento (Técnica de MacMaster).
4. ANÁLISIS DE DATOS.
Para determinar las poblaciones de parásitos se realizó un análisis mediante estadística descriptiva a través del programa computacional Statistix.
Antes de realizar el análisis de los datos obtenidos, se comprobaron los supuestos de normalidad de los errores y homogeneidad de varianzas del error experimental mediante las pruebas de Shapiro & Wilk (P > 0.05) y Levene (P > 0.05) respectivamente, puesto que son premisas que se deben cumplir antes de realizar cualquier procedimiento estadístico.
Se realizaron Análisis de Varianza de una vía para establecer las diferencias estadísticas del promedio de eliminación de hpg entre los 4 predios en estudio con un nivel de significacia del 0.05 y posteriormente la prueba de Tukey para determinar qué municipios se comportaron estadísticamente diferentes en la eliminación de hpg de materia fecal, de igual forma se procedió para determinar las diferencias estadísticas entre el Test de reducción de la oviposición y para la comparación de resultados entre las técnicas Test de reducción de la oviposición y Análisis del desarrollo larval técnica realizada simultáneamente a los mismos equinos, dentro del proyecto de investigación “Determinación de poblaciones de endoparásitos en equinos de las sabanas de Bogota y Casanare, así como los grados de resistencia antihelmíntica frente a las lactonas Macrocíclicas, mediante el Test de reducción de la oviposición y Análisis del desarrollo de larvas”, los procedimientos antes descritos se realizaron en el programa Statistical Analysis System (SAS) versión 9.1.
5. RESULTADOS
5.1 TÉCNICA DE MACMASTER PRETRATAMIENTO CON IVERMECTINA.
Nota: La letra X señala los tipos de huevos observados.
5.1.1 Municipio de Aguazul.
Tabla 7. Resultados de la técnica de MacMaster municipio de Aguazul.
MUESTRA Hpg Strongylidos
spp. Strongyloides spp. Triodonthoforus spp. Habronema spp. Anoplocephala spp. Oxyuris spp. Parascaris spp.
A1 230 X X A2 581 X X A3 351 X A4 176 X A5 135 X A6 418 X X A7 27 X A8 189 X A9 108 X A10 122 X X TOTAL 2336 Promedio de hpg 234
Los equinos de la finca La Esperanza del municipio de Aguzul, resultaron positivos a huevos de tipo Strongylido spp y Triodonthoforus spp. El recuento total de huevos por gramo de materia fecal (hpg) en la finca fue de 2.336 con un promedio de 234 hpg.
5.1.2 Municipio de El Yopal.
Tabla 8. Resultados técnica de MacMaster municipio de El Yopal.
MUESTRA hpg Strongylidos
spp. Strongyloides spp. Triodonthoforus spp. Habronema spp. Anoplocephala spp. Oxyuris spp. Parascaris spp.
Y1 918 X X Y2 770 X X Y3 1256 X X X Y4 338 X X Y5 1134 X X Y6 284 X Y7 999 X X Y8 351 X X Y9 365 X X Y10 918 X X TOTAL 7331 Promedio de hpg 734
Las muestras de materia fecal analizadas de la finca Santa Lucía del municipio de El Yopal, resultaron positivas a huevos de tipo Strongylido spp, Triodonthoforus spp y Anoplocephala spp. El total de hpg de materia fecal fue de 7.331 y el promedio de la finca estuvo en 734 hpg.
5.1.3 Municipio de Maní.
Tabla 9. Resultados técnica de MacMaster municipio de Maní.
MUESTRA hpg Strongylidos
spp. Strongyloides spp. Triodonthoforus spp. Habronema spp. Anoplocephala spp. Oxyuris spp. Parascaris spp.
M1 54 X M2 135 X X M3 108 X M4 68 X X M5 68 X M6 95 X M7 162 X X M8 108 X M9 122 X M10 176 X X TOTAL 1094 Promedio de hpg 110
Los equinos de la finca Titiriji del municipio de Maní, fueron positivos a huevos de tipo Strongylido spp y Triodonthoforus spp. El número total de hpg de materia fecal fue de 1.094 y el promedio de eliminación de hpg estuvo en 110 hpg.
5.1.4 Municipio de Paz de Ariporo
Tabla 10. Resultados técnica de MacMaster municipio de Paz de Ariporo.
MUESTRA hpg Strongylidos
spp. Strongyloides spp. Triodonthoforus spp. Habronema spp. Anoplocephala spp. Oxyuris spp. Parascaris spp.
P1 675 X X P2 986 X X P3 959 X X P4 2673 X X X P5 3847 X X X P6 446 X X P7 702 X X P8 1526 X X P9 189 X P10 702 X X X TOTAL 12704 Promedio de hpg 1271
Las muestras de la finca La Defensa del municipio de Paz de Ariporo, resultaron positivas a huevos de tipo Strongylido spp, Triodonthoforus spp y Habronema spp. El número total de hpg de materia fecal fue de 12.704 con un promedio de eliminación de hpg de 1.271.
5.1.5 Resultados generales técnica de MacMaster para los 4 predios.
El número total de hpg en los predios de los 4 municipios fue de 23.465; las muestras analizadas resultaron positivas a huevos de tipo Strongylido spp,
Triodonthoforus spp, Habronema spp y Anoplocephala spp.
El tipo de huevo que se presentó con mayor frecuencia fue el de Strongylido
spp, observado en el 100% de las muestras (40 muestras) y en orden descendente, Triodonthoforus spp. el cual se observó en el 42.5% de las muestras (17 muestras) y
en los 4 predios; Habronema spp presente en el 7.5% de las muestras (3 muestras) procedentes del municipio de Paz de Ariporo y por último Anoplocephala spp. con un porcentaje de observación del 2.5% (1 muestra) presente en el municipio de El Yopal Grafica 1.
El municipio con el mayor promedio de eliminación de hpg de materia fecal fue Paz de Ariporo con 1.271, seguido por los municipio de El Yopal con 734 hpg , Aguazul con 234 hpg y Manί con 110 hpg Gráfica 2.
5.1.6.1 Comparación de los 4 predios de eliminación de hpg de materia fecal.
Se realizó la prueba de Tukey con un nivel de significacia del 0.05 (Martínez y Martínez, 1997), con el fin obtener las diferencias entre los municipios de estudio (Anexo 1), obteniendo:
• Los municipios Aguazul y Maní, tienen un promedio de eliminación de hpg estadísticamente similar.
• Los municipios de Paz de Ariporo y El Yopal se comportan de forma similar en cuanto a la eliminación de hpg de materia fecal.
5.2 COPROCULTIVOS PRETRATAMIENTO CON IVERMECTINA.
• Siglas para la identificación de larvas.
PS: Pequeños strongylus SEQ: Strongylus equinus. SW: Strongiloides westeri. SV: Strongylus vulgaris. SED: Strongylus edentatus. TA: Trichostrongylus axei.
5.2.1 Municipio de Aguazul.
Tabla 11. Resultados identificación de larvas L3 municipio de Aguazul. ID
MUESTRA PS SW SED SEQ SV TA
A1 94 2 1 3 A2 95 5 A3 93 2 2 3 A4 98 2 A5 100 A6 99 1 A7 98 2 A8 95 2 3 A9 98 1 1 A10 96 1 1 2
El 96.6% del total de larvas L3 corresponden a Pequeños strongylus presentes en todas las muestras, el 2.2% a larvas L3 de Strongylus vulgaris observadas en 9 muestras, el 0.8% a larvas L3 Strongylus edentatus en 5 muestras y el 0.2% a larvas L3 de Strongylus equinus observadas en 3 de las 10 muestras Grafica 3.
