COMO PLANTEAR UN ESTUDIO POTENCIALMENTE PUBLICABLE EN UNA REVISTA DEL SCI

ELISABET VILA CALSINA, DPTO DE FARMACOLOGIA, FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA, ESPAÑA

COMO PLANTEAR UN ESTUDIO POTENCIALMENTE

PUBLICABLE EN UNA REVISTA DEL SCI

DELIMITAR EL TEMA DE INVESTIGACIÓN

ESTUDIAR Y ENTENDER LAS FASES DEL PROCESO A ESTUDIAR:

BUSCAR BIBLIOGRAFÍA DEL TEMA (P.EJEMPLO:INFLAMACIÓN Y/O

EPILEPSIA)

Buscar bibliografía actual sobre el tema para ver como y qué se

publica

Ver que tipo de experimentos se realizan en plantas medicinales

sobre el tema

Delimitar aquellos experimentos que se puedan realizar con los

medios de los que se dispone.

Buscar la metodología (si no la tenemos a punto) de cada uno de

los puntos que se quieren abordar

FASES INFLAMACIÓN AGUDA

1. Aumento de la permeabilidad vascular

Exudación de fluidos de la sangre

al líquido intersticial

2. Infiltración de leucocitos de la sangre a los tejidos

3. Formación de granuloma y reparación tisular (fase proliferativa)

Edema de oreja y/o Edema plantar

Actividad de la MPO en tejido

DOSIS LETAL MEDIA (DL

₅₀

)

Dosis a la que mueren el 50% de animales.

1.

Grupos de 6 animales:

Administrar por via i.p.

E0. 0 ug/kg ( DMSO?) E1. 50 ug/kg Extracto E2. 100 ug/kg Extracto E3. 200 ug/kg Extracto E4. 300 ug/kg extracto

2. Observar durante 24/48 h y anotar el numero de ratones que mueren

3. Calcular el porcentaje

EDEMA EN OREJA

Vehiculo (Control) Antiinflamatorio patrón (iv/po) Antiinflamatorio problema Croton oil (2.5% ) en acetona (2.5% (v:v) TPA (2.5 ug en 20 ul de acetona/ 5 ul etanol)

Xilene (20 ul) en solición salina

1 h? 30 min?

Frotando en oreja derecha por los 2 lados 4h 1h 4h o 6 h SACRIFICIO , cortar circulos de 6-7 mm de diametro de las orejas, pesar y hacer la relacion entre peso od/oi

[(W_d-W_i) Control] – [(W_d-W_i) trat extracto ] [(W_d-W_i) Control]

X 100 Inh(%)=

EDEMA PLANTAR

EDEMA

Salino (5mg/kg) (ip,/po) CONTROL Antiinflamatorio patrón Antiinflamatorio problema 1 h? Carraginina 0.5 ul al 1% pata derecha (sc) Medir a distintos tiempos (0, 1,2,3,4,5 h) el V desplazamiento de las 2 patas con el pletismómetro

[(Vt-Vc) Control] – [(Vt-Vc) trat extracto ] [(Vt-Vc) Control]

X 100 Inh(%)=

FASES INFLAMACIÓN AGUDA

1. Aumento de la permeabilidad vascular

Exudación de fluidos de la sangre

al líquido intersticial

2. Infiltración de leucocitos de la sangre a los tejidos

3. Formación de granuloma y reparación tisular (fase proliferativa)

Determinacion de mieloperoxidasa (MPO) en las

orejas edematizadas con y sin extracto

1- Homogenizar circulos de 6 mm Φ (45 min, 0ºC) en 0.75 ml PBS (80 mM, pH 5.4) + 0.5% HTBA

2- Decantar el homogenizado en microtubulos + 0.75 ml de PBS 80 mM/HTBA y centrifugar a 11200 rpm (4ºC, 20 min)_A • 30 µl de A • 100 µl de PBS 80 mM pH 5.4 • 85 ul de PBS 220 mN pH 5.4 • 15µl de H₂O₂ 0.017 % • 20µl de TMB 18.4 mM en dimetilformamida

4. Añadir por triplicado en una placa de 96 pocillos

5. INCUBAR a 37ºC, 3 min 6. AÑADIR 30 µl de acetato sódico 1.46 M, pH 3 7. LEER a 630 nM 1.5 ml 3- Coger

FASES INFLAMACIÓN AGUDA

1. Aumento de la permeabilidad vascular

Exudación de fluidos de la sangre

al líquido intersticial

2. Infiltración de leucocitos de la sangre a los tejidos

3. Formación de granuloma y reparación tisular (fase proliferativa)

COTTON PELLET GRANULOMA

1. Anestesiar, afeitar la espalda, limpiar con etanol 2. Hacer una incisión en la parte dorsal, abrir

3. Implantar por via sc el “pellet” de algodón esterilizado 4. Coser o grapar la incisión

DIAS 0 1 2 3 4 5 6 7 Implantación pellet Sacrificio TRATAMIENTO G1 – G3: ≠ concentraciones de extracto G4: Vehículo G5: Antiinflamatorio patrón i) Sacrificar al ratón

ii) Extraer el pellet de algodón

iii) Pesar (peso total, P_i)

iv) Secar (24h, 60ºC o 48 h, 37ºC) v) Pesar (peso seco, P_s)

Inflamación por LPS: Estudios in vivo

LPS (10 o 20 mg/kg), ip) 24h _Anestesiar (PB 70 mg/kg)

Extraer sangre por puncion cardiaca, tratar

adecuadamente, alicuotar, congelar a -80ºC

Determinación de NO (sin Kit), TNF-α, 1 β, 6, IL-10 (ELISA kits)

Extractos

VHC

t?

Sacrificar el animal;

recoger tejidos y congelar con N₂ y guardar a -20ºC

Inflamación por LPS: Estudios in vitro

Cultivo de macrófagos Raw 264,7

Mantenimiento en DMEM suplementado con:

10% FBS

penicilina (100 U/ml)

(o 100 ug/ml algún trabajo)

estreptomicina (100 ug/ml)

en algunos casos dice tb glutamina 2 mM

CULTIVAR a 37º C en CO2 5% en incubador humidificado

Se cambia el medio cada 2 días y se van haciendo pasajes

hasta que las células confluyen

Ensayos de viabilidad celular

MTT: methyl thiazolyl tetrazolium (Sigma) (aunque hay quien utiliza CCK pero menos)

Cultivo en medio celular de una placa de 96 pocillos: densidad (5x104

cel/pocillo o 2x105; _{cel/pocillo; 2x10}6; _cel/pocillo)

• Vehículo (30 min

• Distintas concentraciones de extracto (30 min)

Añadir 100 ul de DMEM con 1mg/ml de MTT/pocillo REVISAR concentración…… 4 h 37ºC 5% CO2

Se aspira el sobrenadante y se añaden150- 200 ul de DMSO /pocillo agitando suavemente unos 10 min a t ambiente; tb 30 min a 37ºC) y se lee a 490 o 550 o 570 nm) generalmente por quintuplicado o

cuadruplicado (100%)

+ LPS 1 ug/ml (18 h/22 h) a 37ºC 5% CO2

Macrofagos estimulados por LPS

Dia 1. Se cultivan los macrófagos en una placa con DMEM con 10% FBS Dia 2. Se cambia el medio por uno con 1 % FBS

Determinacion de Nitritos: Medida de la formación d Oxido nítrico

Dia 3 se aplica el LPS (1 ug/ml) después de la incubación durante 1 h con vehículo o extractos y se incuban durante 24 h

Se recoge el sobrenadante y se congela o se hace directamente 100 ul sobrenadante/pocillo + 100 ul solución de Griess

10 min a t ambiente y se lee a 540 nm

Determinación de citoquinas (IL-6; TNF-α: IL-1 β)

Dia 3 se aplica el LPS (1 ug/ml) después de la incubación durante 1 h con vehículo o extractos y se incuban durante 6 h (REVISAr tiempo)

Se recoge el sobrenadante y se congela a -80ºC hasta el dia del experimento de ELISA.

Determinación de diversas proteinas por Western Blot o por mRNa. De momento aquí no se puede

ESCRITURA DEL TRABAJO: EN INGLES mejor no traducir

1) Analizar todos los resultados y graficarlos

2) Decidir posibles revistas según los resultados obtenidos

3) Buscar y leer varios artículos en nuestro caso de extractos y ver como plantean los trabajos (esto ya se había hecho antes de planificar el estudio). Actualizar al máximo la bibliografía

4) Leer las instrucciones de la revista elegida

5) Escribir los materiales y métodos SIEMPRE CON EL ESTILO DE LA REVISTA 6) Escribir los resultados

7) Escribir la introducción 8) Escribir la discusión 9) Bibliografia

10) Revisar el estilo de la revista

CONSEJOS:

Apuntar un poco alto eligiendo una revista de impacto (siempre siendo realistas) Si nos lo rechazan del todo: NO DESANIMARSE ni ESPERAR (no guardar el tabajo en un cajón)

Leer atentamente los comentarios de los referees y ver si podemos mejorar el artículo con los comentarios para mandarlo según lo que digan a otra revista de menor impacto.

Si no lo rechazan y dan oportunidad de contestar hacerlo y remandarlo asap conteatando uno por uno los puntos de los referees y del revisor.