ANÁLISIS COMPARATIVO ENTRE EL NESTED PCR Y PCR REAL TIME PARA EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) EN LITOPENAEUS vannamei
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(2) R E P O S IT O R I O. N A C IO N A L. F IC H A T ÍT U L O. DE. E N C IE N C IA. R E G IS T R O. DE. Y. T E C N O L O G ÍA. T E S IS. Y S U B T ÍT U L O : A N Á L IS IS. D E L V IR U S. C O M P A R A T IV O. D E L S ÍN D R O M E. DE. E N TR E. LA. E L N E S TE D -P C R. M ANCHA. B LA N C A. A U TOR :. Y P CR. R E A L T IM E. P A RA. ( W S S V ) E N L IT O P E N A E U S. E L D IA G N Ó S T I C O. V A N N A M E I.. C o m e n t a d o [ A 1 ] : R e v is a r f o r m a to. TU TO R : W a l te r. F a b r iz io. J a v ie r. B r io n e s P a c h e c o. A r c o s A l c ív a r R E V IS O R E S : In g . S i s i a n a. IN S T IT U C I Ó N :. C hávez. C h ic a , M g .. FA C U L T A D :. U N IV E R S I D A D. DE. G U A Y A Q U IL. U n id a d. d e P o s g r a d o , In v e s ti g a c i ó n. N o. D E. P ÁGS :. y D e s a r r o llo. CARRE RA: M a e s tr ía. e n B i o te c n o l o g ía. FE C H A. DE. M o le c u la r. P U B L IC A C I Ó N :. J u lio d e l 2 0 1 6 T ÍT U L O. 80. O B T E N ID O :. M a g i s te r. e n B i o te c n o l o g ía. ÁRE AS. T E M Á T IC A S :. P A LA B R A S. M o le c u la r .. 6 2 A g r i c u l tu r a ,. s i l v i c u l tu r a. y pesca. C LA V E :. N e s te d - P C R ,. R e a l ti m e. E s p e c i fi c i d a d ,. TaqM an. v a lid a c ió n. P C R , S ín d r o m e. d e la M a n c h a. B l a n c a , D i a g n ó s ti c o. M o le c u la r ,. S e n s ib ilid a d ,. d e p r u e b a d i a g n ó s ti c a .. RESU M EN : L a e n f e r m e d a d d e l V ir u s d e la M a n c h a B la n c a e n C a m a r o n e s d e e x p o r t a c ió n s e h a c a r a c t e r iz a d o p o r s e r d e t ip o a g u d a y d e g r a n im p a c t o a la e c o n o m ía d e m u c h o s p a ís e s , p o r m á s d e 1 8 a ñ o s s e h a a p r e n d id o a c o n v iv ir c o n e l p r o b le m a , la s in v e s t ig a c io n e s a n iv e l m u n d ia l s e b a s a r o n p a r a c o n o c e r m á s s o b r e s u p a t o g é n e s is , f a c t o r e s d e r ie s g o , t r a n s m is ió n , e n. la c u a l e l p r o d u c t o r y t é c n ic o s. han. t r a b a ja d o e n. d if e r e n t e s s is t e m a s d e p r o d u c c ió n , t a n t o e n la b o r a t o r io s. c o n ju n t o r e a liz a n d o c a m b io s e n e l m a n e jo e n lo s. p r o d u c t o r d e la s p o s t la r v a s y e n e l c a m p o . A s í t a m b ié n e l. s e g u im ie n t o e p id e m io ló g ic o r e a liz a d o p o r lo s o r g a n is m o s in t e r n a c io n a le s , u n iv e r s id a d e s , c e n t r o s d e in v e s t ig a c io n e s a n iv e l m u n d ia l, r e c o m ie n d a n o t r a s t é c n ic a s a b a s e d e P C R e n t ie m p o r e a l y s u s v a r ia n t e s p a r a r e e m p la z a r la q u e e s t á a p r o b a d a p o r l a O IE N e s t e d -P C R . E s t e t r a b a j o c o m p a r ó l a s e n s i b i l i d a d e n t r e d o s p r u e b a s l a T a q M a n P C R r e a l T i m e y la N e s t e d P C R , s e e v a lu a r o n 5 0 m u e s t r a s d e c a m a r ó n s o m e t id o a c o n g e la c ió n lis t o p a r a s u e x p o r t a c ió n , d e la s 14. fu e ro n. m u e s tra s con. d e te c ta d o s p o s it iv a s. la v a lo r a c ió n. de. c u a le s. p o r T a q M a n P C R r e a l T im e y 1 1 p o r N e s t e d P C R , lo in t e r e s a n t e a m e n c io n a r e s q u e d e la s 2 5. s o lo e n. 8. c o in c id ie r o n e n a m b a s p r u e b a s , s e r e a liz ó lo s c á lc u lo s d e s e n s ib ilid a d y e s p e c if ic id a d. la P r u e b a d e. D i a g n ó s t i c o , e l N e s t e d -P C R r e s u l t ó s e r m á s e s p e c í f i c a q u e s e n s i b l e , t i e n e m a y o r. c a p a c id a d p a r a d e t e r m in a r in d iv id u o s s a n o s q u e e n f e r m o s , y e n c a s o s d e la a p a r ic ió n d e la e n f e r m e d a d o u n b r o t e e n una. p o b la c ió n. con. una. p r e v a le n c ia. m ayor del 20%. e l v a lo r p r e d ic t iv o d e. casos. n e g a t iv o s. es. del 92%. y lo s. casos. p o s it iv o s s e e s t im a r ía c o n u n 5 6 % . E n c a m b io e l R e a l T im e P C R e s m e jo r p a r a d e s c a r t a r la e n f e r m e d a d , c o m p a r a n d o o tro s. e s t u d io s. s e c u e n c ia d e. la s e n s ib ilid a d d e la s p r u e b a s e s a f e c t a d a p o r la c a n t id a d d e A D N v ir a l p r e s e n t e e n la s m u e s t r a s , la lo s. p r im e r s. u t iliz a d a b á s ic a m e n t e. ya que. la v a r ia b ilid a d. g e n é t ic a d e l v ir u s. e s m u y a m p lia , a d e m á s la. e s p e c ie d e c a m a r ó n a f e c t a d a t a m b ié n in f lu y e e n s u d e t e c c ió n . N o. D E. R E G IS T R O. D IR E C C I Ó N ADJUNTO. URL. ( e n b a s e d e d a to s ) :. ( t e s is. N o. D E. P D F:. X. x. C ON TA C T O. CON. C ON TA C T O. E N LA. C L A S IF I C A C I Ó N :. e n la w e b ) :. A U T O R /E S IN S T I T U C I Ó N :. S I. T e l é fo n o :. x x x. NO 24935916. E - m a i l : a r c o s fa b r i z i o 7 6 @ g m a i l .c o m. N o m b re :. U n id a d. d e P o sg ra d o. T e l é fo n o :. 2 3 2 5 5 3 0 -3 8. In v e s ti g a c i ó n. y D e s a r r o llo. E x t. 1 1 4. E - m a il : u p id @ u g . e d u . e c. x * x x x x X x. ii.
(3) iii.
(4) iv.
(5) D E C L A R A C IÓ N. Y o ,. F A B R IZ IO. D ire c c ió n. d e. J A V IE R P o s g ra d o. ARCO S d e. la. J URAD A. A L C IV A R ,. U n iv e rs id a d. DE L. AUTO R. d e c la ro d e. b a jo. j u r a m e n to. G u a y a q u il, q u e. a n te. e l tr a b a j o. la. a q u í. d e s c r i to , a s í c o m o s u s r e s u l ta d o s , c o n c l u s io n e s y r e c o m e n d a c i o n e s p r e s e n ta d o s , so n. d e. m i. a u to r ía. y. e x c lu s iv a. re s p o n s a b ilid a d , q u e. e s. i n é d i to. y. n o. h a. s id o. p r e v i a m e n te p r e s e n ta d o p a r a n i n g ú n g r a d o o c a l i fi c a c i ó n p r o fe s i o n a l .. L a r e p r o d u c c i ó n to ta l o p a r c i a l d e e s ta te s i s e n fo r m a i d é n ti c a o m o d i fi c a d a , n o a u to r i z a d a. p o r. lo s. e d i to r e s. tr a n s g r e d e. lo s. d e re c h o s. d e. a u to r ía .. C u a lq u ie r. u ti l i z a c i ó n d e b e s e r p r e v i a m e n te s o l i c i ta d a a l a U n i v e r s i d a d d e G u a y a q u i l , a tr a v é s d e l a D i r e c c i ó n d e P o s g r a d o o a l a u to r .. F ir m a . - - - - - - - - - - - -- -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -- - -N ° C é d u la 0 9 1 5 3 5 9 8 9 - 7. v.
(6) D e d ic a t o r ia. A m is p a d r e s V íc t o r H u g o y M a r ía E s t h e r p o r la p a cie n cia y s u s p ir o s , A m is h e r m a n o s F r a n k lin y H u g o a m ig o s p a r a t o d a la v id a . A L o r e p o r lo s a ñ o s co m p a rtid o s e n e s ta a v e n tu ra d e la v id a A m i F a b r i p o r ca b a lle ro y v a lie n te . A m i A m e lia , in t e le c t u a l y d e b u e n s e n t id o d e h u m o r . A m i A m a n d a p o r su ca p a cid a d d e a m a r y p e rd o n a r.. vi.
(7) A g r a d e c im ie n t o s. A l e q u i p o d e T r a b a j o d e l In s t i t u t o N a c i o n a l d e P e s c a ( IN P ) . A l D ire cto r B lg o . E d w in M o n ca y o C a ld e re ro . B lg o . N a r cis o P in Q u im is -- D ir e ct o r d e la b o r a t o r io d e B io lo g ía M o le cu la r B lg o . J o rg e E rra e z—. Á re a d e M icro b io lo g ía y P C R. Q f . J o r g e R o y C a s t r o G u e r r e r o – D ia g n ó s t ic o s c o n N E S T E D -P C R M s C . P a u la P in to . D ia g n ó s tico s co n q P C R B lg o . X a v ie r T o a la – Á re a M icro b io lo g ía B lg o R ica rd o P e la e z – C o n tro l d e C a lid a d P ro d u cto s P e s q u e ro s . M s C . L e o n a rd o R o d ríg u e z C o n tro l d e ca lid a d d e M a te ria s P rim a s co n P C R .. In g M a r t h a B u c a r a m. d e J o rg g e y f a m ilia p o r e l a p o y o p a ra s e g u ir e n la d o ce n cia U n iv e rsita ria ,. D r. K le v e r C e v a llo s C e v a llo s — D e ca n o d e la F a cu lta d d e M e d icin a V e te rin a ria y Z o o te cn ia D r . D é d i m e C a m p o s Q u i n t o — D i r e c t o r d e l D e p a r t a m e n t o d e In v e s t i g a c i ó n - U A E . D r. W a lte r B rio n e s P a ch e co - M é d ico V e te rin a rio - P ro f e s o r d e P a to lo g ía A cu íco la U n iv e rsid a d A g ra ria d e l E cu a d o r. v ii.
(8) R E S U M E N. L a. e n fe r m e d a d. e x p o r ta c i ó n. se. h a. d e l. V iru s. c a r a c te r i z a d o. d e. la. M a n ch a. p o r se r d e. ti p o. B la n c a. a g u d a. e n. y d e. C a m a ro n e s. g ra n. i m p a c to. d e a. la. e c o n o m ía d e m u c h o s p a ís e s , p o r m á s d e 1 8 a ñ o s s e h a a p r e n d i d o a c o n v i v i r c o n e l p r o b l e m a , l a s i n v e s ti g a c i o n e s a n i v e l m u n d i a l s e b a s a r o n p a r a s o b re. su. co n o ce r m á s. p a to g é n e s i s , fa c to r e s d e r i e s g o , tr a n s m i s i ó n , e n l a c u a l e l p r o d u c to r y. té c n i c o s. h a n. tr a b a j a d o. d i fe r e n te s s i s te m a s d e. e n. c o n j u n to. re a liz a n d o. p r o d u c c i ó n , ta n to. e n. c a m b io s. e n. e l m a n e jo. l a b o r a to r i o s p r o d u c to r d e. e n. lo s. la s p o s t. l a r v a s y e n e l c a m p o . A s í ta m b i é n e l s e g u im i e n to e p i d e m io l ó g ic o r e a l i z a d o p o r l o s o rg a n is m o s. i n te r n a c i o n a l e s , u n i v e r s i d a d e s , c e n tr o s d e. m u n d ia l,. re c o m ie n d a n. v a r i a n te s. p a ra. o tr a s. té c n i c a s. re e m p la z a r la. q u e. e s tá. a. b a se. d e. a p ro b a d a. i n v e s ti g a c i o n e s a. P CR. e n. p o r la. ti e m p o. O IE. re a l. n iv e l y. su s. N e s te d - P C R . E s te. tr a b a j o c o m p a ró l a s e n s i b i l i d a d e n tr e d o s p r u e b a s l a T a q M a n P C R r e a l T i m e y l a N e s te d P C R , s e e v a l u a ro n 5 0 m u e s tr a s d e c a m a r ó n s o m e ti d o a c o n g e l a c i ó n l i s to p a ra. su. e x p o r ta c i ó n , d e. l a s c u a l e s 1 4 fu e r o n d e te c ta d o s p o r T a q M a n P C R r e a l. T i m e y 1 1 p o r N e s te d P C R , l o i n te r e s a n te a m e n c i o n a r e s q u e d e l a s 2 5 m u e s tr a s p o s i ti v a s. s o lo. e n. 8. c o in c id ie ro n. q u e. v a lo ra c ió n. e n fe r m o s , y. d e. e n. la. P ru e b a. lo s c á lc u lo s d e. r e s u l tó s e r m á s e s p e c ífi c a q u e s e n s i b l e , ti e n e m a y o r c a p a c i d a d p a r a sa n o s. la. re a liz ó. N e s te d - P C R. in d iv id u o s. co n. a m b a s p ru e b a s , s e. y. d e te r m i n a r. e s p e c i fi c i d a d. e n. s e n s ib ilid a d. ca so s. d e. d e. la. D i a g n ó s ti c o , e l. a p a ric ió n. d e. la. e n fe r m e d a d o u n b r o te e n u n a p o b l a c i ó n c o n u n a p r e v a l e n c i a m a y o r d e l 2 0 % e l v a l o r p r e d ic ti v o d e c a s o s n e g a ti v o s e s d e l 9 2 % y l o s c a s o s p o s i ti v o s s e e s ti m a r ía c o n u n 5 6 % e n c a m b io e l R e a l T im e P C R c o m p a ra n d o c a n ti d a d. d e. o tr o s A DN. e s tu d i o s. la. v i r a l p r e s e n te. u ti l i z a d a. b á s i c a m e n te. a d e m á s. la. e s p e c ie. d e. ya. q u e. e s m e j o r p a r a d e s c a r ta r l a e n fe r m e d a d ,. s e n s ib ilid a d. la. c a m a ró n. e n. la s. d e. la s. p ru e b a s. m u e s tr a s , l a. v a ria b ilid a d a fe c ta d a. g e n é ti c a. ta m b i é n. e s. a fe c ta d a. s e c u e n c ia. d e. lo s. p o r la. p rim e rs. d e l v iru s e s m u y a m p lia ,. i n fl u y e. e n. su. d e te c c i ó n. y la. c o i n fe c c i ó n .. v iii.
(9) S U M M A R Y. D i s e a s e o f th e w h i te s p o t v i r u s i n s h r i m p e x p o r t h a s b e e n c h a r a c te r i z e d b y a c u te ty p e a n d o f g r e a t i m p a c t to th e e c o n o m ie s o f m a n y c o u n tr i e s , fo r o v e r 1 8 y e a r s h a s l e a r n e d to l i v e w i th th e p r o b l e m , th e r e s e a r c h e s i n th e w o r d w i l d to th e l e a r n m o r e a b o u t i ts. p a th o g e n e s i s , r i s k. fa c to r s , tr a n s m i s s i o n , i n. w h ic h. th e. p ro d u c e r. a n d. te c h n i c i a n s h a v e w o r k e d to g e th e r m a k i n g c h a n g e s i n m a n a g e m e n t i n th e d i ffe r e n t p r o d u c ti o n s y s te m s b o th i n th e p o s t l a r v a l - p r o d u c i n g l a b o r a to r i e s a n d i n th e fi e l d ; w e l l a s th e e p i d e m i o l o g i c a l fo l l o w - u p c a r r i e d o u t b y i n te r n a ti o n a l o r g a n i z a ti o n s , u n i v e r s i ti e s , c e n tr e s. o f re s e a rc h. a ro u n d. o th e r te c h n i q u e s b a s e d o n r e a l ti m e P C R. th e. w o rld , m a n y. w o rk s re c o m m e n d e d. a n d i ts v a r i a n ts to r e p l a c e th e o n e th a t i s. a p p r o v e d b y th e O IE N e s te d - P C R , th i s w o r k c o m p a re d th e s e n s i ti v i ty b e tw e e n tw o te s ts. th e. Ta q M a n. P CR. re a l T im e. a n d. th e. N e s te d. P CR, a sse sse d. 5 0. re a d y. fo r. e x p o r t s u b j e c t to fr e e z i n g s h r im p s a m p l e s , o f w h i c h 1 4 w e r e d e te c te d b y T a q M a n P C R re a l T im e th e. 2 5. a n d. s a m p le s. s e n s i ti v i ty. a n d. 1 1. b y N e s te d P C R , th e i n te r e s ti n g th i n g to m e n ti o n i s th a t o f. p o s i ti v e. s p e c i fi c i ty. o n ly. in. wa s. p e r fo r m e d , th e. 8. th e y. c o in c id e d. in. b o th. te s ts , c a l c u l a ti o n s. N e s te d - P C R i s m o r e. o f. s p e c i fi c th a n. s e n s i ti v e , i s b e tte r a b l e to d e te r m i n e h e a l th y th a n s i c k i n d i v i d u a l s , a n d i n c a s e s o f o n s e t o f th e d i s e a s e o r a n o u tb r e a k i n a p o p u l a ti o n w i th a h i g h e r p r e v a l e n c e o f 2 0 %. n e g a ti v e p r e d i c ti v e v a l u e i s 9 2 % c a s e s a n d p o s i ti v e c a s e s w o u l d b e e s ti m a te d. a t 5 6 % , w h e r e a s th e R e a l T i m e P C R i s b e tte r to. d i s c a r d th e d i s e a s e , c o m p a r i n g. o th e r s tu d i e s s e n s i ti v i ty te s ts i s a ffe c te d b y th e a m o u n t o f v i r a l D N A p r e s e n t i n th e s a m p l e s , th e. se q u e n ce. o f p rim e rs. u se d. b a s ic a lly. b e ca u se. th e. g e n e ti c. v iru s. v a r i a b i l i ty i s v e r y b r o a d a l s o a ffe c te d s h r i m p s p e c i e s a l s o i n fl u e n c e s i ts d e te c ti o n a n d c o - i n fe c ti o n .. ix.
(10) T A B L A D E C O N T E N ID O. IN T R O D U C C IÓ N ................................................................ ......................................................... 1 1 .2. F O R M U L A C IÓ N D E L P R O B L E M A ................................................................................... 2. 1 .3. J U S T IF IC A C IÓ N D E L T E M A ................................................................ ............................. 3. 1 .4. O B J E T IV O S ................................................................ ...................................................... 4. 1 .4 .1. G e n e r a l .................................................................................................................... 4. 1 .4 .2. E s p e cíf ico s ............................................................................................................... 4. C A P ÍT U L O 2 ................................................................................................................................ 5 2 .0. M A R C O R E F E R E N C IA L ................................................................ ........................................ 5. 2 .1 .- Im p a c t o d e l a s e n f e r m e d a d e s v i r a l e s e n l a p ro d u c c i ó n c a m a r o n e r a . ................................ 5 2 . 2 - D i s t r ib u c i ó n g e o g r á f i c a d e l S í n d r o m e d e l V i r u s d e l a M a n c h a B l a n c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 .3 .- S ig n o s c lín ic o s ........................................................................................................................ 7 2 . 4 . - T r a n s m i s ió n d e l S S W V .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 . 5 . - M o r f o l o g ía y G e n o m a d e l S S W V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 .6 . - I n f e c c i ó n d e l W S S V , m i R N A s y P a t o g é n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 .6 . 1 . - I n f e c c i ó n d e l W S S V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 .6 . 2 . - R e c e p t o r e s v i r a l e s , i n t e r a c c i o n e s y e n t r a d a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 .6 . 3 . - E s c a p e d e l o s E n d o s o m a s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 .6 . 4 . - R e p l i c a c i ó n v i r a l , p r o c e s o m o l e c u l a r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 .6 . 5 . - M a n t e n i é n d o s e e n e l a m b i e n t e c e l u l a r d e l h o s p e d e r o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 .6 .6 . - M e t a b o l i s m o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 .7 .- T r a t a m i e n t o p a ra W S S V . ................................ ..................................................................... 2 5 2 .8 . - V i r u l e n c i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 .9 . - T é c n i c a s p a r a d e t e c t a r W S S V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 .9 .1. T é c n i c a d e R e d u c c i ó n In m u n o m a g n é t i c a D e p e n d i e n t e ( IM R ) . ......................... 2 9. 2 .9 .2. T é c n i ca d e T in ció n N e g a t iv a . ............................................................................... 3 0. 2 .9 .3. T é c n i c a M i c r o s c o p ia In m u n o e l e c t r ó n i c a ( IE M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0. 2 .9 .4. T é c n i c a In m u n n o c i t o q u ím i c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0. 2 .9 .5. M é t o d o b a s a d o e n l a d e t e c c i ó n s e r o ló g i c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0. 2 .9 .6. M é t o d o s b a s a d o s e n so n d a s d e D N A .................................................................. 3 1. 2 .9 .7. R e a c c i ó n e n C a d e n a d e la P o l im e r a s a ( P C R ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2. 2 . 1 0 . - S e n s i b i lid a d d e l a s p r u e b a s d e P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 C A P IT U L O 3 .............................................................................................................................. 3 5 A S P E C T O M E T O D O L Ó G IC O S ................................................................................................... 3 5 3 .0. M A T E R IA L E S Y M É T O D O S . .............................................................................................. 3 5 x.
(11) 3 .1. C o le cció n y S e le c ció n d e M u e s t r a s . ................................................................................ 3 6. 3 . 2 . P r o c e d i m i e n t o p a r a la d e t e c c i ó n d e W S S V N E S T E D - P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 R e a c c i ó n e n c a d e n a d e la p o lim e r a s a ( P C R ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 . 2 .2 P r o t o c o l o d e a m p l i f i c a c i ó n d e l N E S T E D - P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 3 .2 .2 .1 3 . 2 .2 . 2 3 .2 .3. P r im e r a r e a cció n d e P C R r e a ct iv o s e m e z cló : 8 µ L / r e a cció n ............................... 3 8 R e a c c i ó n P C R a n id a d a m e z c l a d e r e a c t i v o s : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 µ L / r e a c c i ó n 3 9. C o n d ició n d e r e a cció n d e l P C R co n v e n cio n a l: ........................................................... 4 0. 3 .2 .3 .1. P e r f i l d e l a p rim e r a r e a c c i ó n d e P C R : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0. 3 . 2 . 3 .2. P e r f il d e R e a c c i ó n d e N e s t e d P C R : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1. 3 . 2 . 4 P ro c e d im i e n t o d e r e a c c i ó n d e l P C R c o n v e n c i o n a l : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 3 .2 .4 .1. C o r rid a d e P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2. 3 .2 .4 .2. P r e p a r a c i ó n d e l a s d i l u c i o n e s p a r a l a s c o r r i d a s d e N e s t e d -P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3. 3 . 2 . 5 E l e c t r o f o r e s i s y B ro m u r o d e E t id io . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 3 .2 .7. D ia g n ó s t ico d e l P C R co n v e n cio n a l. ............................................................................ 4 6. 3 .2 .7 .1. M u e s tra s p o s itiv a s y lo s e s tá n d a re s m o s tra rá n lo s s ig u ie n te s p a tro n e s. s o b r e e l g e l:........................................................................................................................... 4 6 3 . 2 .8 C o n f i r m a c i ó n P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 . 3 .0 P r o c e d i m i e n t o p a r a l a d e t e c c i ó n d e W S S V P C R r e a l t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 3 .3 .1. P r e p a r a c i ó n d e l a s m u e s t r a s y e x t r a c c i ó n p a r a P C R r e a l tim e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7. 3 .3 .2. P r o t o c o l o d e R e a c c i ó n p a r a l a A m p li f i c a c i ó n e n P C R r e a l t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7. 3 .3 .3. C o n f i r m a c i ó n R e a l T i m e -P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7. 3 .4 .. D i s e ñ o E s t a d í s t i c o .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9. 3 .5 .. V a l id a c ió n d e la P r u e b a s D ia g n ó s t i c a s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9. 3 .6 .. V a ri a b l e s ................................................................................................ ........................ 5 2. IV .-R E S U L T A D O S ................................................................ ...................................................... 5 3 V .-D IS C U S IÓ N ................................................................................................ ........................... 6 1 V I.-C O N C L U S IO N E S Y R E C O M E N D A C I O N E S ................................................................ ......... 6 5 V II.-L IS T A D E R E F E R E N C IA S ................................ .................................................................... 6 6 A N E X O S ................................................................................................................................... 7 0. xi.
(12) IN D IC E D E C U A D R O S. C U A D R O 1 .- C á lcu lo s d e r e a ct iv o s p a r a N e s t e d -P C R ......................................................... 4 0 C U A D R O 2 . - P o b la c i ó n a n a l i z a d a e n p o r c e n t a j e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 C U A D R O 3 .-C a so s p o s i ti v o s p o r c a t e g o r í a . ........................................................................ 5 4 C U A D R O 4 .-C a s o s p o s i ti v o s p o r c a t e g o r i a ......................................................................... 5 5 C U A D R O 5 . - D ia g n ó s t i c o p o r c a d a P r u e b a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 C U A D R O 6 . -C o n s i s t e n c i a s d i a g n ó s t i c a s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 C U A D R O 7 . - V a l id a c ió n d e P r u e b a D i a g n ó s t i c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9. IN D IC E D E G R Á F IC O S. G R Á F IC O 1 .- M u e s t r a s d e c a m a ró n A d u l t o y e n l a d e r e c h a P o s t l a r v a s ............................ 3 6 G R Á F IC O 2 . - E x t r a c c i ó n d e á c id o s n u c l e i c o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 G R Á F I C O 3 . - P r e m i x y e n z i m a p o lim e r a s a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 G R Á F IC O 4 T e r m o c i c l a d o r y t u b o s d e r e a c c i ó n . ................................ ................................. 4 1 G R Á F I C O 5 . - P r e p a r a c ió n d e la s o l u c i ó n P r e m i x y e n z i m a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 G R Á F I C O 6 . - r e a c t i v o s p a r a r e a li z a r e l e c t r o f o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 G R Á F IC O 7 . - C o r r id a e l e c t r o f o r é ti c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 G R Á F I C O 8 - L e c t u r a s d e a m p li c o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 G R Á F IC O 9 .- R e a l T i m e P C R , c o n t r o l n e g a t i v o y m u e s t r a n e g a t i v a . ................................ . 4 8 G R Á F IC O 1 0 . - C o n t r o l p o s i t iv o d e l R e a l T i m e P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 G R Á F I C O 1 1 . - D i s t r ib u c i ó n d e la s m u e s t r a s e n p o r c e n t a j e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 G R Á F I C O 1 2 . - P r o p o r c ió n d e lo s c a s o s p o s i t i v o s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 G R Á F IC O 1 3 .- N ú m e r o d e c a s o s p o s i ti v o s p o r c a t e g o r í a ................................................... 5 5 G R Á F IC O 1 4 .- C a s o s p o si t i v o s e n p o r c e n t a j e . ..................................................................... 5 6 G R Á F IC O 1 5 .- C a s o s p o s i ti v o s p o r c a d a p r u e b a e x p r e s a d o s e n p o r c e n t a j e ..................... 5 7 G R Á F IC O 1 6 .- C o n s i s t e n c i a D i a g n ó s t i c a e x p r e s a d a s e n p o r c e n t a j e ................................ .. 5 8 G R Á F IC O 1 7 .- E s p e c i f i c i d a d y S e n s i b i l i d a d … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..6 1. x ii.
(13) IN D IC E D E A N E X O S .. A N E X O 1 . - A m p l i c o n e s d e l N e s t e d -P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 A N E X O 2 - E s t r u c t u r a d e l v i r u s d e la M a n c h a B l a n c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 A N E X O 3 - L e s io n e s e n e l e x o e s q u e le t o d e M a n c h a B la n ca . ............................................. 7 2 A N E X O 4 . - T i n c i o n e s h i s t o p a t o ló g i c a s p a r a e l v i r u s W S S V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 A N E X O 5 .- E s t r a t e g ia v ir a l p a r a in g r e s a r a la cé lu la e in t e r a c cio n e s a m b ie n t a le s ........... 7 4 A N E X O 6 . - D i a g n ó s t i c o p o r In m u n o e l e c t r o n e i n m u n o c i t o q u ím i c a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 A N E X O 7 . - F o t o e l e c t r o m i c r o g r á f i c o p o r m e d io d e l a T i n c i ó n e n N e g a t i v o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 A N E X O 8 .- P ro t e í n a v i r a l e s y d e l h o s p e d e ro ...................................................................... 7 7 A N E X O 9 .- F a ct o r e s d e t r a n s cr ip ció n ................................................................................. 7 8 A N E X O 1 0 . - V a l id a c ió n d ia g n ó s t i c a c o n l a p r u e b a S S P S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 A N E X O 1 1 . - A n á l i s i s e s t a d í s t i c o d e lo s d i a g n ó s t i c o s c o n N e s t e d - P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 A N E X O 1 2 . - A n á l i s i s e s t a d í s t i c o d e lo s d i a g n ó s t i c o s c o n R e a l T im e P C R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1. x iii.
(14) IN T R O D U C C I Ó N. E l S ín d r o m e d e l v i r u s d e l a M a n c h a B l a n c a ( W S S V ) , e s e l p a tó g e n o v i r a l m á s g r a v e e n e l c u l ti v o d e c a m a r ó n , p o r q u e p u e d e p ro p a g a r s e r á p i d a m e n te y c a u s a r l a m u e r te h a s ta e l 7 0 - 1 0 0 % d e l a p o b la c ió n e n 3 a 1 0 d ía s ( B a l a k r is h n a n , 2 0 1 2 ) . L a s e s p e c i e s d e c a m a r ó n d e i m p o r ta n c i a e c o n ó m ic a a fe c ta d a s s o n P e n a e u. m o n o d o n , L i to p e n a e u v a n n a m e i y L . s ty l i r o s tr i ( G L e a l , 2 0 1 4 ) , c a u s a n d o u n g r a n i m p a c to e c o n ó m ic o ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) e n l a A c u a c u l tu r a , y a q u e e s a l ta m e n te v i r u l e n to , y p u e d e c a u s a r u n a i n fe c c i ó n l a te n te y a s i n to m á ti c a ( R o z e n b e r g , 2 0 1 5 ) . P o r s u s e fe c to s a d v e r s o s , l a W S S V. h a s i d o i n c l u i d o e n l a l i s ta. d e e n fe r m e d a d e s d e n o ti fi c a c i ó n o b li g a to r i a d e l a O fi c i n a d e E p i z o o ti a s In te r n a c i o n a l ( O IE ) d e s d e 1 9 9 7 ( M e n d o z a - C a n o , 2 0 1 3 ) , e s te v i r u s h a s i d o d e te c ta d o ta m b i é n e n d e c á p o d o s d e a g u a d u l c e , c a n g r e j o s , l a n g o s ta s y p l a n c to n . ( R o z e n b e r g , 2 0 1 5 ) ( M a l a th i, 2 0 1 2 ). E l W S S V. e s c a u s a d o p o r u n v iru s D N A. d o b l e c a d e n a p e r te n e c ie n te a l. g é n e r o W h i s p o v i r u s d e l a fa m i l i a N i m a v i r i d a e , ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ) ( B a l a k r i s h n a n , 2 0 1 2 ) ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) ( O tta , 2 0 1 4 ) ti e n e fo r m a d e b a c i l o y u n a e n v o l tu r a n o o c lu i d a ( G L e a l , 2 0 1 4 ) , e s tu d i o s c o n m i c r o s c o p io e le c tr ó n ic o h a n m o s tr a d o q u e l a n ú c l e o c a p s i d e d e l v i r u s , ti e n e fo r m a d e v a r i l l a c o n u n a s o m b ra d e r a y a s r o d e a d o d e u n a e n v o l tu r a tr i l a m in a r y , te n i e n d o u n a c o la ú n i c a c o m o a p é n d ic e a l fi n a l, s u g e n o m a e s d e 3 0 0 k b ( M a l a th i, 2 0 1 2 ) a fe c ta a m u c h a s e s p e c i e s d e c a m a r ó n , a c u a l q u ie r e d a d p r o v o c a n d o u n a l a r g a e s c a l a d e m o r ta l i d a d , y e l fo c o d e i n fe c c i ó n , s o n l o s te j i d o s o r i g in a d o s d e l m e s o d e r m o y e c to d e r m o , c o m o l a s b r a n q u i a s , ó r g a n o s l i n fo i d e s y e p i te l i o c u ti c u l a r (B a la k ris h n a n , 2 0 1 2 ).. 1.
(15) P a r a e n te n d e r l a p a to g é n e s is y m o r fo g é n e s is d e l v i r u s s e i d e n ti fi c ó y c a r a c te r i z ó a l g u n a s p r o te ín a s c o n s e c u e n c i a c ió n s h o tg u n y ta g s i s o b á r ic o s p a r a l a c u a n ti fi c a c i ó n r e l a ti v a y a b s o l u ta ( iT R A Q ) d e 1 4 p r o te ín a s , e n tr e e l l a s V P 2 8 y V P 1 9 . ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ). L a tr a n s m i s i ó n d e l W S S V e n e l a m b i e n te n a tu r a l s e d a p r i n c i p a l m e n te a tr a v é s d e l a i n g e s ti ó n , e s d e c i r , p o r l a v ía o r a l a l c o n s u m i r c a m a r o n e s m u e r to s o i n fe c ta d o s. p o r. e l. e n d o c i to s i s , e s p r o te ín a s. v iru s , a. e l q u e. v ira le s. le. n iv e l c e lu la r p e r m i te. V P 2 8. Y. se. a l v iru s V P 1 9. h a. e n c o n tr a d o. in g re s a r a (X ia n - W e i. la. q u e. e l p ro c e s o. c é lu la , a. W a n g ,. tr a v é s d e. 2 0 1 4 ). d e la s. (V o ra w it. A n a n p h o n g m a n e e , 2 0 1 5 ).. V a r i o s m é to d o s s e h a n u ti l i z a d o p a r a e l d ia g n ó s ti c o d e l V i r u s d e l s ín d r o m e d e l a M a n c h a B l a n c a e n e l c a m a r ó n , c o m o h i s to p a to lo g ía , e n s a y o s i n m u n o ló g i c o s , té c n i c a s m o l e c u l a r e s e h i b r i d a c i ó n i n s i tu , l a s p r u e b a s d e P C R o fr e c e n a l to g r a d o d e. s e n s ib ilid a d. re c o m e n d a d o. e n. y. e s p e c i fi c i d a d ,. e l 2 0 0 9. p o r la. O IE. a sí. co m o. e l. p r o to c o l o. d e. N e s te d. P CR. y d e s a r r o l l a d o p o r L o e t a l e n 1 9 9 6 , e s ta. p r u e b a d e m a n d a ti e m p o y a r r o j a fa l s o s p o s i ti v o s , ta m b i é n o tr o s i n v e s ti g a d o re s h a n p ro b a d o. q P C R , S y b r- G re e n , T a q m a n ; p e ro. n o h a n s i d o a p r o b a d o s p o r l a O IE ,. h a n d a d o b u e n o s r e s u lta d o s e n c a s o s c l ín i c o s p e r o h a n p r e s e n ta d o v a r ia b i li d a d e n l a r e p r o d u c ib ili d a d y s e n s i b i lid a d e n l o s r e p o r te s d e l o s ú l ti m o s a ñ o s . ( L e a l , 2 0 1 2 ). 1 .2. F O R M U L A C IÓ N. DE L. P RO BLE M A. L a v a r i e d a d d e m é to d o s q u e h a n s i d o d e s a r r o ll a d o s p a r a d e te c ta r W S S V , h a n s i d o d i v i d i d o s e n d o s g r u p o s , b a s a d o s e n ta r g e ts m o l e c u l a r e s c o m o l a s p r o te ín a s v i r a l e s o e l D N A . E l p r i m e r g r u p o e s b a s a d o e n m é to d o i n m u n o ló g ic o , 2.
(16) p o r l o c u a l e s u n s i s te m a d e d e te c c i ó n r á p id o y d e b a j o c o s to c o n l a d e s v e n ta ja d e b a j a s e n s i b i lid a d y l ím i te e n e l r e n d i m i e n to . E l o tr o g r u p o , e n l a c u a l s e d e te c ta e l DNA. p o r m e d io d e u n a P C R. c o n v e n c i o n a l, e s e l m á s u ti l i z a d o a n i v e l m u n d ia l , y a. q u e e s u n p o d e r o s o m é to d o p a r a d e te c t a r a l g e n o m a d e l p a tó g e n o e n d ife r e n te s ti p o s d e h o s p e d e r o s , c o m o p l a n ta s , a n i m a le s , h u m a n o s ; p e r o r e q u i e r e d e u n te r m o c i c l a d o r , c o n s u m e ti e m p o y d e p e n d e d e l c l á s i c o g e l d e A g a r o s a p a r a r e a li z a r l a e l e c tr o fo r e s is p a r a l a l e c tu r a d e l a a m p l ifi c a c ió n , ta m b i é n s e h a p r o b a d o c o n NE S TE D. P C R , R e a l T im e P C R , L A M P - P C R. q u e e s a tr a c ti v o p o r e l c o r to ti e m p o. d e l p r o c e s o p e r o n o s e p u e d e c u a n ti fi c a r y e l d i s e ñ o d e l o s p r i m e r s s o n c o m p le jo s , m á s p a ra P C R. y p a ra R P A. q u e e s u n a a m p l i fi c a c ió n i s o te r m a l. m o d i fi c a d a e n u n s o l o tu b o , q u e u ti l i z a r e v e r s e tr a n s c r ip ta s a p a r a d e te c ta r D N A RNA. y. e n e s te c a s o p a r a d e te c ta r a l g e n V P 2 8 q u e c o d i fi c a u n a p ro te ín a q u e s e. e x p r e s a e n e l p r o c e s o d e i n fe c c i ó n v i r a l . ( X i a o m in g X i a , 2 0 1 4 ). 1 .3. J U S T IF IC A C I Ó N. DE L. P o r l o s tr a b a j o s r e v i s a d o s s i g u e s i e n d o e l P C R. TE M A. c o n v e n c io n a l, c o m o l a. p r u e b a d e o r o p a r a e l d ia g n ó s ti c o d e l S ín d r o m e d e l V i r u s d e l a M a n c h a B l a n c a , a p e s a r q u e s e h a n v a l i d a d o l a s p r u e b a s v a r i a n te s d e q P C R , c o m o e l d ú p l e x P C R h a m o s tr a d o r o b u s te z , a l ta s e n s i b il id a d e n l a m u e s tr a s c l ín i c a s ( G L e a l , 2 0 1 4 ) , c o m o s o n ta n v a r i a b le s l o s r e s u l ta d o s d e b i d o p r i n c ip a lm e n te. d e DNA. p o r l a c o n c e n tr a c i ó n. e n l a m u e s tr a , to d a s s o n a l ta m e n te s e n s i b l e s e n m u e s tr a s c l ín i c a , p e r o. p a r a m o n i to r e o y s e g u im ie n to , l a P C R. c o n v e n c io n a l N e s te d - P C R. e s la m á s. a d e cua da.. 3.
(17) 1 .4. 1 .4 .1. . O B J E T IV O S. G e n e ra l. C o m p a r a r e l d i a g n ó s ti c o o b te n i d o d e l R e a l T i m e P C R. c o n N e s te d - P C R. p a r a e l S ín d r o m e d e l V i r u s d e l a M a n c h a B l a n c a e n L IT O P E N A E U S va n n am ei. 1 .4 .2. . E s p e c íf ic o s. E s ta b l e c e r l a s e n s i b il id a d , e s p e c ifi c i d a d y v a l o r e s p r e d i c t i v o s d e l. Re a l. T im e P C R . . C o r r e l a c i o n a r l o s r e s u l ta d o s c o n l a e ta p a fi s i o l ó g i c a d e p r o d u c c i ó n .. 4.
(18) C A P ÍT U L O. 2 .0. M ARCO. 2. R E F E R E N C IA L. 2 .1 .- Im p a c t o d e la s e n f e r m e d a d e s v ir a le s e n la p r o d u c c ió n c a m a r o n e r a .. E l c u l ti v o d e c a m a r o n e s o c u p a l a m a y o r p a r te e n l a i n d u s tr i a d e l a A c u a c u l tu ra y e s e l p r i n c i p a l p r o d u c to d e e x p o r ta c i ó n e n m u c h o s p a ís e s , e n l a s d o s ú l ti m a s d é c a d a s e l c u l ti v o d e L i to p e n a e u h a c r e c i d o m u y r á p i d a m e n te e n a c u ífe r o s a l i n o s . L o s. c u l ti v o s d e c a m a r ó n c o n tr i b u y e n c o n e l 4 2 % d e l to ta l d e l a. p r o d u c c i ó n d e e s p e c i e s d e m a r , c o n u n e s ti m a d o d e 6 ,6 7 m i ll o n e s d e to n e l a d a s e n 2 0 0 9 , e n l a d é c a d a d e 1 9 8 5 - 1 9 9 5 l a i n d u s tr ia c a m a r o n e r a s e i n c r e m e n tó a p r o x im a d a m e n te e n u n 4 0 0 % , e s to fu e p o s i b le d e b i d o a l a i n te n s i fi c a c i ó n y e s p e c i a li z a c ió n d e l a s g r a n j a s c a m a r o n e r a s , a p r o x im a d a m e n te e l 7 5 % d e l a p r o d u c c i ó n d e c a m a r ó n e s d o m i n a d o p o r d o s e s p e c i e s , p o r e l c a m a r ó n ti g re n e g r o o b l a c k T i g e r s h r i m p ( P e n a e u s m o n o d o n ) y c a m a r ó n b l a n c o d e l P a c ífi c o o W h i te P a c i fi c s h r i m p ( L i to p e n a e u s v a n n a m e i ) . ( B a l a k r is h n a n , 2 0 1 2 ). L a s i m p o r ta c i o n e s d e p r o d u c to d e m a r a E s ta d o s U n i d o s d u r a n te e l s e m e s tr e d e l 2 0 1 4 fu e ro n d e In d o n e s i a ( + 3 4 % ) , E c u a d o r ( + 1 9 % ) y V i e tn a m ( + 7 7 % ) ta m b i é n to d o ti p o d e c a m a r ó n p e la d o ( + 4 0 % ) , m u y s i m i l a r l a s i m p o r ta c io n e s d e c a m a r ó n p e l a d o ( i n c lu s i v e c o n c o l a , P T O , b u tte r fl y - c u t e tc .) fu e d e l 7 0 % y 3 0 % d e V i e tn a m y E c u a d o r r e s p e c ti v a m e n te . ( F A O , 2 0 1 4 ) .. E l i m p a c to e c o n ó m ic o d e e n fe r m e d a d e s v i r a l e s e n l a p r o d u c c ió n d e c a m a r ó n a n i v e l m u n d ia l h a s i d o u n fa c to r l i m i ta n te p a r a e l d e s a r r o l lo d e l a c a m o r o n ic u l tu r a , d e s d e 1 9 9 1 s e h a r e p o r ta d o g r a n d e s p é r d id a s s o c i a l e s y e c o n ó m i c a s e n tr e 8 a 1 5 b i l l o n e s o u n b i l l ó n p o r a ñ o ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) y o tr o a u to r r e m a r c a l a s p e r d i d a s e n m á s d e U S $ 6 b i l l o n e s a n i v e l m u n d ia l c o m o 5.
(19) r e s u l ta d o d e l a s p a n d e m ia s v i r a l e s , p o r e j e m p lo e n B r a s il , l o s p r o b le m a s r e c i e n te m e n te c a u s a d o p o r l a i n fe c c i ó n d e v i r u s d e l a H y p o d e r m a l y h e m a to p o y é ti c o d e B r a s i l , y e l S ín d r o m e d e l v i r u s d e l a. M y o n e c r o s is ( IM N V ) 2 0 0 6 , y p o r e l n e c r o s is ( IH H N V ). 2 0 0 9 e n e l n o r d e s te. m a n c h a b la n c a ( W S S V ) e n S a n ta C a ta l i n a. 2 0 0 5 a 2 0 1 0 . ( L i s s a n d r a S o u to C a v a l l i , 2 0 1 3 ) .. C o m o r e s e ñ a h is tó r i c a e n 1 9 9 8 e l E c u a d o r fu e e l s e g u n d o p r o d u c to r m u n d ia l d e c a m a r ó n , d e s p u é s d e T a i l a n d ia , s u p r o d u c c i ó n a l c a n z ó 1 5 4 .0 0 0 to n e l a d a m é tr i c a , r e p r e s e n ta b a e l 2 0 ,2 % d e l to ta l m u n d i a l ( C h a v e z l i z a r d o , 2 0 0 0 ) . F u e r e p o r ta d o W S S V. e n e l a ñ o 1 9 9 9 i m p a c ta n d o l a e c o n o m ía d e l p a ís , l o s. p r o d u c to re s a g r u p a d o s e n l a C á m a r a N a c i o n a l d e A c u a c u l tu ra , s e a p o y a ro n e n e l C e n tr o d e S e r v i c i o s A c u a c u l tu ra ( C S A ) y e n e l C e n tr o N a c i o n a l d e A c u i c u l tu r a e In v e s ti g a c io n e s M a r i n a s ( C E N A IM ). p a r a e s tu d i a r l o s e fe c to s y d e te r m in a r. m e c a n is m o s d e c o n tr o l d e l a e n fe r m e d a d . ( N o ta r i a n n i, 2 0 0 6 ) .. 2 .2 - D is t r ib u c ió n g e o g r á f ic a d e l S ín d r o m e. D e s d e q u e s e d e s c u b r ió e l S S W V. d e l V ir u s d e la M a n c h a B la n c a .. e n C h in a e n 1 9 9 2 , e l v iru s s e d is p e rs ó. r á p i d a m e n te a to d a l a s p r i n c i p a le s g r a n j a s a n i v e l m u n d ia l , d e b id o a l s i s te m a i n te n s i v o e i n a d e c u a d a m e d id a s s a n i ta r i a s , d e s d e 1 9 9 6 s e h a d i s tr i b u id o p o r to d a A s i a , In d o n e s i a e In d i a , e n 1 9 9 2 e n J a p ó n fu e d e te c ta d o e n P e n a e u s ja p o n ic u s , e n 1 9 9 5 p o r p r i m e r a v e z d i a g n o s ti c a d o e n U S A. y e n 1 9 9 8 e n C o r e a e In d i a , e n. 1 9 9 9 e n A m é r ic a C e n tr a l y S u r , e n e l 2 0 0 2 e n E u r o p a ,( F r a n c ia ) y e n e l M e d i o O r i e n t e ( I r á n ) , s o l o A u s t r a l i a e s t á l i b r e d e l a e n f e r m e d a d p o r s u e x c e l e n t e y e s t r i c ta m e d i d a d e c u a r e n te n a a p li c a d o p o r l a s a u to r id a d e s . ( B a l a k r is h n a n , 2 0 1 2 ) ( A r u n K . D h a r , 2 0 0 1 ,) ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ). 6.
(20) 2 .3 .- S ig n o s c lín ic o s .. L o s a n i m a l e s a fe c ta d o s p u e d e n p r e s e n ta r l e ta r g ia , r e d u c c ió n e n e l c o n s u m o d e a l i m e n to , p é r d i d a d e l a c u tíc u l a y d e c o l o r a c ió n d e l h e p a to p á n c r e a s. y. d e l d i s c o r o j o h a c i a r o s a d o e n e l c u e r p o , l a s c a r a c te r ís ti c a s d e e s te s ín d r o m e , e s d e b i d o a q u e e l v i r u s i n c l u y e u n a s m a n c h a s b l a n c a s e n e l e x o e s q u e l e to , e s p e c i a lm e n te e n e l c a r a p a c h o y e n e l ú l ti m o s e g m e n to a b d o m i n a l, l a i n fe c c i ó n s e d a e n te j i d o m e s o y e c to d e r m o ( b r a n q u ia s , ó r g a n o s l i n fo id e s , e p i te l io c u ti c u la r y te j i d o c o n e c ti v o s u b c u ti c u la r ) ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) L a e x p a n s i ó n d e l c r o m a tó fo r o s e n l a e p i d e r m i s p r o v o c a n d o u n c a m b i o e n l a c o l o r a c ió n d e tr a s lu c i d o a r o s a d o o c a fé . ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ) E s ta s m a n c h a s s o n d e l r e s u l ta d o d e d e p ó s i to d e c a l c i o q u e p u e d e n m e d ir u n o s p o c o s m i l ím e tr o s h a s ta 1 c m. o m á s.. ( A r u n K . D h a r , 2 0 0 1 ,) ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ) ( A n e x o 3 ). N ú c l e o s i n fe c ta d o s s e h i p e r tr o fi a n c o n m a r g in a li z a c ió n d e c r o m a ti n a , y c o n ti e n e n c u e r p o s d e i n c l u s ió n q u e s e ti ñ e n i n te n s a m e n te e o s i n o fíl i c a e n e s ta d i o s te m p r a n o d e i n fe c c ió n y b a s ó fi l o s i l a i n fe c c i ó n e s tá a v a n z a d a . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ). L a s m u e s tr a s i d ó n e a s a to m a r p a r a e l d i a g n ó s ti c o s o n l o s p l e ó p o d o s , b r a n q u i a s , h e m o li n fa , e s tó m a g o , m ú s c u l o a b d o m in a l. ( Y u n - L o n g T s a i , 2 0 1 4 ). 2 .4 .- T r a n s m is ió n d e l S S W V .. S e h a i d e n ti fi c a d o a l r e d e d o r d e 9 8 e s p e c i e s h o s p e d e r o s , c o m o d e c á p o d o s , n o d e c á p o d o s y c o p é d o c o s , i n d i v id u o s p o r ta d o r e s d e l S S W V. q u e h a b ita n e n e l. m i s m o e s ta n q u e fu n c i o n a n d o c o m o v e c to r , i n d i c a n d o y d e m o s tr á n d o s e q u e n o e s fa ta l p a r a e s ta s e s p e c i e s d e c r u s tá c e o s y e s te d e ta l le e s d e g r a n i n te r é s p a r a c o m p r e n d e r l a r e s i s te n c i a a e n fe r m e d a d e s . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) 7.
(21) E l m o d o d e tr a n s m i s i ó n d e S S W V. e n u n a m b i e n te n a tu r a l e s v e r ti c a l y /u. h o r i z o n ta l , e s ta ú l ti m a p u e d e s e r p o r i n g e s t i ó n d e c a m a r o n e s m u e r to s , c a n i b a lis m o o d e p r e d a c ió n y a tr a v é s d e l a e x p o s i c i ó n a l a g u a q u e c o n ti e n e p r i o n e s ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) l a i n fe c c i ó n ta r d ía p u e d e s e r a tr a v é s d e l a s b r a n q u ia s , p e r o p u e d e o c u r r ir p o r o tr a v ía c o m o l a s u p e r fi c ie d e l c u e r p o , s e h a d e m o s tr a d o q u e l a v ía d i g e s ti v a e s l a v ía d e tr a n s m i s i ó n m á s e fi c i e n te q u e l a c o h a b i ta c i ó n . L a tr a n s m i s i ó n v e r ti c a l o c u r r e d e m a d r e a s u d e s c e n d e n c ia a tr a v é s d e l d e s o v e , n o s e s a b e e l m e c a n is m o p a r a q u e l a s p a r tíc u l a s v i r a l e s l l e g u e n a l o s h u e v o s , e l v i r u s m a ta a n te s q u e m a d u r e n l o s h u e v o s y s e h a p o d i d o d e te c ta r e n e l s i s te m a r e p r o d u c to r ta n to d e l a h e m b ra y d e l m a c h o , p r o te ín a s v i r a l e s , a tr a v é s d e l a h i b r i d a c ió n i n s i tu ( B a l a k r i s h n a n , 2 0 1 2 ) .. L a tr a n s m i s i ó n a tr a v é s d e l c o n ta c to fís i c o c o n u n a n i m a l i n fe c ta d o e s s u fi c i e n te p a r a i n i c ia r y p r o g r e s a r e n e p id e m i a s e n e s ta n q u e s , l a tr a n s m i s i ó n d e l o s r e p r o d u c to r e s a s u s d e s c e n d ie n te s s e h a s u g e r i d o a l d e te c ta r e l W S S V. e n. o o c i s te s , p e r o n o a p a r e c e n n i s e d e s a r r o l la n e n h u e v o s m a d u r o s .. E l W S S V , e s e l p a tó g e n o v i r a l m á s d e v a s ta d o r e n l a i n d u s tr ia c a m a r o n e r a a n i v e l m u n d ia l , ta m b i é n e s c o n o c i d o c o m o H i p o d e r m a l B a c u lo v i r u s , V i r u s N e c r ó ti c o H e m a to p o y é ti c o. ti e n e u n a fo r m a d e e s p i r a l , ta m b i é n s e l o h a d e n o m i n a d o c o m o. V i r e m i a A g u d a e n P e n a e i d o s , b a c u l o v ir u s d e l e c to y m e s o d e r m o , B a c u l o v ir u s m o n o d o n s i n o c l u s ió n , y S ín d r o m e d e l a M a n c h a B l a n c a p o r B a c u lo v i r u s , a s í c o m o ta m b i é n B a c u l o v ir u s c h i n o y e l S ín d r o m e d e l a M a n c h a B l a n c a , p a r a e v i ta r e s ta c o n fu s i ó n s e p r e fi e re u ti l i z a r e l S ín d r o m e d e l V i r u s. d e la M a n c h a B la n c a . (A ru n K .. D h a r , 2 0 0 1 ,). L o s c a m a r o n e s i n fe c ta d o s c o n H i p o d e r m a l y n e c r o s is h e m a to p o y é ti c a ( IH H V N V ). m u e s tr a n u n c r e c i m i e n to l e n to y d e fo r m i d a d e n e l r o s tr u m c o m o. 8.
(22) d i a g n ó s ti c o c l ín ic o , e n l o s c a s o s s u b c l ín i c o s s e h a d e m o s tr a d o c o - i n fe c c i ó n c o n W S S V. p o r P CR. e h i s to p a to l o g ía . ( O tta , 2 0 1 4 ). E l s ín d r o m e d e l a M a n c h a B l a n c a p u e d e e x p a n d i rs e a tr a v é s d e l a g u a y d e l o s ta n q u e s v e c i n o s d e l a s o tr a s g r a n j a s , l a r u ti n a d e r e c a m b io d e a g u a y l i b e r a r e l a g u a u ti l iz a d a d u r a n te u n b r o te d e l a e n fe r m e d a d , e n l a c o s e c h a d e e m e r g e n c ia p u e d e p re s e rv a r e l W S S V. e n l a g r a n ja , s e to m ó P l a n c to n y h e m o li n fa d u r a n te u n. b r o te d e l a e n fe r m e d a d y s e a n a li z ó c o n P C R. y c o n p r u e b a s d e fi l tr a c i ó n s e p u d o. c o m p r o b a r q u e l a s fr a c c i o n e s d e a g u a e n tr e 1 0 0 y 0 .6 5 µ M p u e d e i n d u c i r l a i n fe c c i ó n , d e m o s tr a n d o q u e e l a g u a d e l e s ta n q u e , y l a s p a r tíc u l a s o fr a c c i o n e s d e l W S S V. d i s p e r s o s y s u s p e n d id o s e n e l a g u a p u e d e a d j u n ta r s e a l a s m i c r o a l g a s o. l l e v a d a s p o r e l z o o p l a n c to n . ( H é c to r M . E s p a r z a - L e a l, 2 0 0 9 ). 2 .5 .- M o r f o lo g ía y G e n o m a d e l S S W V. M o r fo l ó g ic a m e n te , e l v i b r i ó n d e W S S V. e s g r a n d e y c o n fo r m a d e v a r i l l a , c o n. d i m e n s i o n e s q u e v a n d e s d e u n r a n g o d e 8 0 – 1 2 0 d e l o n g itu d x 2 5 0 – 3 8 0 n m d e a n c h o , e s tr u c tu r a l m e n te , ti e n e u n n ú c l e o c á p s id e r o d e a d o p o r u n a e n v o ltu r a tr i l a m i n a r c o n u n a c o l a c o m o a p é n d ic e fi n a l , c u y a fu n c i ó n s e d e s c o n o c e . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) ( P o r ta l B i o n i n fo r m a ti c R e s o u r c e , 2 0 1 6 ) ( A n e x o 2 ). E l g e n o m a d e l S S W V. e s tá c o n s ti tu i d o p o r u n D N A. d o b le c a d e n a , c irc u la r,. s ú p e r - e n r o ll a d o , a p r o x im a d a m e n te d e 3 0 0 K i l o b a s e s d e p a r e s ( K b p ) , e l a n á li s is d e e s ta s e c u e n c ia m o s tr ó s e r ú n i c a , n o ti e n e n a d a d e h o m o l o g ía c o n o tr o s v i r u s c o n o c i d o s , p o r l o ta n to , fu e a s i g n a d o a u n a n u e v a fa m i li a N iv a v ir id a e y a l g é n e r o W h is p o v ir u s . V a r i o s a i s l a d o s d e m u c h a s p a r te s g e o g r á fi c a s d e S S W V i d e n ti fi c a d o s , s o n m u y s i m i l a r e s e n e l p e r fi l m o r fo l ó g i c o y p e r fi l p r o te i c o , l o s. 9.
(23) p a tr o n e s d e R F L P. ti e n e n p o c a s d i fe r e n c ia s , e s to s u g i e r e n q u e h a a lc a n z a d o u n a. e s ta b i l id a d g e n ó m i c a e l e v a d a . ( B a l a k r is h n a n , 2 0 1 2 ) ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ) T a i l a n d ia , C h i n a y T a i w á n p u b li c a r o n tr e s g e n o m a s c o n p e q u e ñ a s d i fe r e n c i a s e n e l ta m a ñ o 2 9 2 ,9 6 7 ; 3 0 5 ,1 0 7 ; 3 0 7 ,2 8 7 b p r e s p e c ti v a m e n te c o n u n a i d e n ti d a d d e l 9 9 ,3 2 % . E l g e n o m a c h i n o W S S V - C N 6 8 4 ,5 3 1 y 5 0 7 O R F. ti e n e u n to ta l d e G - C d e 4 1 % , u n to ta l d e. p u ta ti v o s h a n s i d o i d e n ti fi c a d o s e n e l g e n o m a d e T a i l a n d ia. 1 8 4 O R F , e l g e n o m a c h i n o 1 8 1 O R F p a r a c o d i fi c a r p ro te ín a s fu n c i o n a l e s .. P a r a s u g e n o ti p ifi c a c i ó n y p a r a p r o p ó s ito s e p i d e m io l ó g i c o s s e h a n u s a d o tr e s m i c r o s a té lite s O R F 9 4 , O R F 7 5 , O R F. 1 2 5 , l a c a r a c te r i z a c ió n d e l a s r e g i o n e s. v a r i a b l e s d e l g e n o m a d e l W S S V d e d i fe r e n te s p a r te s d e l m u n d o n e c e s ita n s e r te r m i n a d o s p a r a a y u d a r a e l u c i d a r l a e v o l u c ió n g e n é ti c a y c o n o c e r l a s v a r i a c io n e s q u e e s ta to m a l u g a r e n s u g e n o m a d u ra n te e l ti e m p o y s u r e l e v a n c i a e n s u v i r u l e n c ia . ( B a l a k r is h n a n , 2 0 1 2 ) ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ) .. E l g e n o m a c o n ti e n e n u e v e r e g i o n e s h o m o lo g a s ( h r 1 - 9 ) q u e c o n s ta d e a l g u n a s r e p e ti c io n e s d e fr a g m e n to s d e 2 5 0 – 3 0 0 p b q u e c o m p r e n d e r e p e ti c io n e s d i r e c ta s , s e c u e n c ia s i n v e r ti d a s a típ i c a s y s e c u e n c i a s p a l ín d r o m a s i m p e r fe c ta s , s e h a h i p o te ti z a d o q u e j u e g a n u n r o l i m p o r ta n te e n l a r e p l i c a c ió n d e l D N A. co m o e n. l o s B a c u l o v i r u s . A l g u n a s i m p o r ta n te s v a r i a c io n e s g e n é ti c a s s e h a n i d e n ti fi c a d o e n tr e l o s g e n o m a s a i s l a d o s d e T a i l a n d i a ( W S S V - T H ) , T a i w á n ( W S S V - T W ) y C h i n a (W S S V - C N ), e n la m is m a re g ió n g e n ó m ic a , e n e l g e n o m a W S S V - T H s e h a im p lic a d o u n a g ra n d e le c ió n d e 1 3 k b y d e 1 k b e n W S S V - C N ,. p e ro n o a p a re c e. h o m o lo g ía e n l a s s e c u e n c i a s p u b li c a d a s , y o tr a v a r i a c ió n s e h a d e te c ta d o e n e l g e n o m a W S S V - T H u n i n s e r to d e 1 3 3 7 b p q u e m u e s tr a u n 1 0 0 % d e h o m o l o g ía c o n u n e l e m e n to tr a n s p o s a b le c o n o c id o . T a m b i é n s e h a p r e s e n ta d o u n n ú m e r o v a r i a b l e d e r e p e ti c i o n e s e n tá n d e m ( V N T R ) e n tr e l a s r e g i o n e s h r 1 , h r 8 , h r 3 y h r 9 , e s to s o c u r r e n e n l o s M a r c o s A b i e r to s d e L e c tu r a ( O R F ) , y a m e n c i o n a d o s O R F 9 4 ,. 10.
(24) 7 5 y 1 2 5 h a s i d o s u g e r i d o p a r a e l g e n o ti p a je p a r a e l g e n o m a W S S V - T H . ( B a s V e rb ru g g e n , 2 0 1 5 ). R e s p e c to a l p r o te o m a d e l W S S V , e s te ti e n e g e n e s q u e c o d i fi c a n p a r a p r o te ín a s e s tr u c tu r a le s c o m o l a c á p s i d e o e l v i b r i ó n ( V P ) y l o s n o e s tr u c tu r a le s c o d i fi c a n p r o te ín a s y e n z i m a s i n v o l u c r a d a s e n e l m e ta b o l is m o d e n u c l e ó ti d o s y l a r e p l i c a c ió n v i r a l .. L a s p r o te ín a s e s tr u c tu r a le s s o n c r u c i a l e s p a r a l a a d h e s i ó n c e l u la r , p a r a l a tr a n s d u c c ió n d e s e ñ a le s , y e n l a e v a s i ó n r á p id a d e l h o s p e d e r o c u a n d o s o n d e s p l e g a d a s s u s d e fe n s a s a n ti v i r a le s . T a m b i é n s o n l a s p r i m e r a s e n a c tu a r c o n l a s c é lu la s d e l h o s p e d e ro , la s V P s e d e s ig n a n p o r s u m a s a m o le c u la r e n K D a . V P 1 9 , V P 2 8 a s o c i a d a s a l a e n v o l tu r a v i r a l y V P. 1 5 , V P 2 4 y V P 2 6 a s o c ia d a s a la. n u c le o c á p s id e .( A n e x o 8 ). L a s fr a c c i o n e s d e l a e n v o l tu ra v i r a l d e l o s v i b r i o n e s d e W S S V , fu e r o n s e p a r a d o s p o r S D S - P A G E , l a s p r o te ín a s p e r te n e c ie n te s a 3 1 K D a d e n o m in a d a s V P 3 1 , fu e r o n a n a liz a d a s p o r N a n o - E S I M S / M S , i d e n ti fi c a d a s p o r W e s te r n B l o t y p o r TE M. ( m i c r o s c o p ia d e tr a n s m i s i ó n e le c tr ó n ic a ) y p o r G o l d - l a b e l in g , y s e p u d o. d e m o s tr a r e n p r u e b a s d e n e u tr a li z a c ió n s u r o l i m p o r ta n te e n l a i n fe c c i ó n . ( L i L i , 2 0 0 5 ). S e s u g i r i ó u n a c l a s i fi c a c i ó n p ro te i c a e n b a s e a s u fu n c i ó n d e l a s p r o te ín a s q u e c o d i fi c a n , p o r e j e m p lo , l a s p r o te ín a s d e l a te n c i a , s i n te ti z a d a s e n l a s e ta p a s te m p r a n a s d e l a i n fe c c i ó n , o tr o g r u p o s e r i a l a s r e g u la d o r a s te m p o r a l e s , n o r e q u ie r e n p r o te ín a s v i r a l e s y a q u e u ti l i z a n l a m a q u in a r i a m o l e c u la r d e l h o s p e d e r o d u r a n te l a s p r i m e r a s h o r a s d e i n fe c c i ó n . ( M a r ti n I. B u s ti l l o - R u i z , 2 0 0 9 ). 11.
(25) 2 .6 .- In f e c c ió n d e l W S S V , m iR N A s. y P a t o g é n e s is .. S e h a d o c u m e n ta d o q u e p e q u e ñ a s m o l é c u l a s A R N. n o c o d i fi c a n te. c o n o c i d a s c o m o m i R N A s , s o n e x p r e s a d a s a m p li a m e n te e n e s p e c i e s a n i m a le s y p l a n ta s , y ti e n e n u n r o l i m p o r ta n te e n l a r e g u la c i ó n d e u n g r a n n ú m e r o d e v ía s c e l u l a r e s i n c l u y e n d o d e s a r r o l lo te m p r a n o , d i fe r e n c ia c i ó n c e lu l a r y p r o l ife r a c ió n , a p o p to s i s , s e ñ a l d e tr a d u c c i ó n e i n m u n id a d .. E s tá n i n v o l u c r a d o s e n m u c h a s i n te r a c c io n e s e n tr e h o s p e d e r o - p a tó g e n o s , l a fu n c i ó n p r i n c i p a l o típ i c a d e e s to s m i R N A s. e s l a r e g u la c i ó n d e l a e x p r e s ió n d e. g e n e s a tr a v é s d e l a r e p r e s i ó n d e l a tr a d u c c i ó n o d i r i g ie n d o l a d e g r a d a c ió n e s p e c i fi c a d e l a s e c u e n c ia d e l A R N m , ta m b i é n l a e v id e n c ia p u b l ic a d a i n d ic a q u e a c tú a s o b r e g e n e s ta r g e t r e g u la n d o l a e x p r e s i ó n d e g e n e s . E l m i R N A s. c o d i fi c a d o. e n e l g e n o m a d e l v i r u s p o d r ía fu n c io n a r p a r a l a r e g u l a c ió n d e l o s g e n e s ta n to d e l v i r u s c o m o d e l h o s p e d e r o y a s í m a n i p u la r l a r e s p u e s ta i n m u n e c e l u la r e n b e n e fi c io d e l v i r u s , a d i c i o n a lm e n te , l o s v i r u s p o d r ía n r e g u l a r e l m i R N A s. d e l h o s p e d e ro y a s í. p o d e r r e g u la r s u p r o p i a r e p l ic a c i ó n o r e g u l a r e l c i c l o d e v i d a d e l v i r u s , a l te r n a ti v a m e n te , l o s m i R N A s. d e l h o s p e d e r o p o d r ía n l im i ta r l a r e p l i c a c i ó n v i r a l y. o tr o s p r o c e s o s c e l u l a r e s e n d e s v e n ta j a d e l v i r u s . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ). E n c a m a r o n e s ( M . j a p o n ic u s ) e x p u e s to s a W S S V , s e h a i d e n ti fi c a d o 6 3 m iR N A. d e l h o s p e d e ro a tr a v é s d e s u p e q u e ñ a s e c u e n c i a d e R N A , d e l a c u a l 4 8. p u d i e r o n s e r m a p e a d o s e n o tr o s m i R N A d a to s . T r e i n ta u n o d e e s to s m i R N A. d e a r tr ó p o d o s c o n o c id o s e n l a b a s e d e. m o s tr a r o n e x p r e s i ó n d i fe r e n c ia l e n l a. r e s p u e s ta a l a i n fe c c i ó n d e W S S V , u s a n d o a lg o r itm o s p a r a l a p r e d ic c i ó n d e l o s g e n e s ta r g e t, m u c h o s d e e s to s m i R N A. fu e r o n p r e d i c h o s p a r a l o s g e n e s ta r g e ts. i n v o l u c r a d o s e n l a i n m u n i d a d d e l h o s p e d e r o , i n c l u s i v e e n l a s v ía s d e s e ñ a l e s d e tr a d u c c i ó n m e d ia d o s p o r p e q u e ñ a s G T P a s a , a u to fa g ia , fa g o c i to s is , a p o p to s i s , l a s. 12.
(26) v ía s d e s e ñ a l d e l r e c e p to r T o l l , r e s p u e s ta h u m o r a l a n ti m ic r o b i a n a , e n d o c ito s is , R N A i , y r e g u l a c ió n d e l a r e s p u e s ta i n m u n e i n n a ta . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) .. E s to s m i R N A c o n m i c r o a r r e g lo s m iR N A s. fu e r o n p r e d ic h o s p o r a n á l i s is b i o i n fo r m á ti c a s y c o n fi r m a d o s y N o r th e r n b l o t, e s to s e h a o b s e r v a d o e n l a m a y o r ía d e l o s. q u e fu e r o n e x p r e s a d o s e n e s ta d i o s te m p r a n o s y d e l o s g e n e s h o s p e d e ro s. c o m o D r o s h a , D ic e r 1 y A g o 1. s o n n e c e s a r io s p a r a l a b i o g é n e s is e x i to s a d e. m i R N A , i n te r e s a n te m e n te , a l g u n o s m o s tr a r o n e x p r e s i ó n d i fe r e n c ia l e n l o s d i fe r e n te s ti p o s d e te j i d o , i n d i c a n d o e s tr a te g i a s r e g u l a to ri a s v i r a l e s p o d r ía s e r r e g u la d o p a r a a d a p ta r s e a l ti p o d e te j i d o i n fe c ta d o . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ). L o s m iR N A. j u e g a n u n i m p o r ta n te r o l e n l a r e g u la c i ó n d e l s i s te m a i n m u n e. i n n a ta y a d a p ta ti v a e n a n i m a le s , p l a n ta s y p r o to z o o s , i d e n ti fi c á n d o lo s , y e n te n d i e n d o s u r o l e n l a i n te r a c c ió n p a tó g e n o – h o s p e d e r o , e s i m p o r ta n te p a r a e l e s tu d i o d e l s i s te m a i n m u n e d e l h o s p e d e ro , c o n tr o l d e l a e n fe r m e d a d y r e a l i z a r C r u z a m i e n to s p a r a i n c r e m e n ta r l a r e s i s te n c ia a W S S V , c o m o e s c o n o c id o l o s m iR N A. s o n i m p o r ta n te s r e g u la d o r e s d e m u c h o s p r o c e s o s c e l u l a r e s c o m o l a. a p o p to s i s , d i fe r e n c ia c i ó n , m e ta b o li s m o , s e ñ a le s d e tr a d u c c i ó n y r e s p u e s ta s a l e s tr é s . ( D .G . Z e n g X . C ., 2 0 1 5 ) .. O tr o e j e m p lo d e s u e fe c to e n l a r e g u l a c ió n d e g e n e s d e l W S S V - m i R - N 2 4 ti e n e l a c a p a c i d a d d e i n h i b ir l a a p o p to s is a tr a v é s d e l a r e g u l a c ió n d o w n d e l a e x p r e s ió n d e l a C a s p a s a 8 , ta m b i é n p u e d e r e g u la r e l b a l a n c e e n tr e l a p r o m o c ió n d e l a i n fe c c i ó n v i r a l y l a te n c i a . ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ). 13.
(27) 2 .6 .1 .- In f e c c ió n d e l W S S V .. E l c i c l o d e v i d a d e l v i r u s e s b i e n e s tu d ia d o , y p u e d e s e r e n fo r m a g e n e r a l d i v i d i d o e n tr e s fa s e s , p r i m e r a m e n te , la e n t r a d a e n l a c é l u l a d e l h o s p e d e r o q u e p u e d e s e r d i r e c to o a tr a v é s d e l o s m e c a n i s m o s d e l h o s p e d e r o c o m o e n d o c i to s i s , s i n d e s c a p s id a c i ó n d e l g e n o m a p a r a l a s i g u i e n te r e p lic a c ió n , y fi n a l m e n te e l e n s a m b la je d e la p a r t íc u la y s u lib e r a c ió n , d u r a n te to d a e s ta fa s e , h a y u n a m p l i o r a n g o d e i n te r a c c io n e s m o l e c u la r e s q u e o c u r r e n e n tr e e l W S S V. y e l. h o s p e d e ro ( A n e x o 5 ). L a s p r o te ín a s W S S V. i n te r a c tú a n c o n l o s r e c e p to r e s d e l h o s p e d e r o , l a c u a l. e s d i r i g i d a p o r l a i n d u c c ió n d e l m e d i a d o r d e e n d o c ito s is C a tr i n e s . E l v i r u s v i a j a a tr a v é s d e l o s e n d o s o m a s , d u r a n te l a m a d u r a c ió n e l p H d e c r e c e c o m o s e ñ a l d e l a s a l i d a d e l o s v i r u s p o r l o s e n d o s o m a s . E n e s te e s ta d i o e s p r o b a b le q u e i n v o l u c r e l a i n te r a c c i ó n e n tr e V P 2 8 y R a b 7 . D e. c ó m o e l v iru s W S S V. p a s a a tr a v é s d e l a. e n v o l tu r a n u c le a r e s d e s c o n o c i d a . U n a v e z e n e l n ú c l e o , l o s fa c to r e s d e tr a n s c r i p c ió n s e u n e n c o n e l g e n o m a d e l W S S V. y e l i n i c i o d e l a e x p r e s ió n d e. g e n e s v ira le s . (B a s V e rb ru g g e n , 2 0 1 5 ). L a r e p l i c a c ió n d e l D N A. d e l W S S V. r e q u ie r e l a m a q u in a r ia d e l h o s p e d e r o , y. p a r a h a c e r d i s p o n ib le e l W S S V p u e d a d e te n e r e l c i c l o c e l u l a r e n l a fa s e S a tr a v é s d e E 2 F 1 . U n a l to n i v e l d e l a p r o d u c c i ó n d e l a p r o te ín a v i r a l p u e d e d ir ig i r e l E R e s tr é s . L a a c ti v a c i ó n d e l a s p r o te ín a s d e s p le g a d a s r e s p o n s a b le s d e l a s v ía s ( U P R ) . F a c to r e s d e tr a n s c r i p c i ó n d e l o s U P R. p u e d e n a c ti v a r l a e x p r e s i ó n d e l o s. g e n e s v i r a l e s , q u e a s u v e z p u e d e i n h ib i r l a tr a d u c c ió n e l F 2 . L a r e p l i c a c ió n d e l v i r u s r e q u ie r e n u tr i e n te s e s e n c i a le s i n c l u s i v e h i e r r o . P a r a p r e v e n i r q u e e l h o s p e d e r o m a n te n g a h ie r r o , e l W S S V. p u e d e i n h i b ir l a u n i ó n d e h ie r r o a l a fe r r i ti n a .. P u e d e i n fl u e n c i a r l a s e ñ a liz a c ió n d e a p o p to s is y a s e a a tr a v é s d e l a i n h i b ic i ó n d e. 14.
(28) m iR N A. m e d i a d o r d e l a i n i c ia c i ó n d e C a s p a s a o a tr a v é s d e l a s p r o te ín a s v i r a l e s. q u e i n h i b e n l a a c ti v i d a d e fe c to r a d e l a C a s p a s a. .. (B a s V e rb ru g g e n , 2 0 1 5 ). 2 .6 .2 .- R e c e p t o r e s v ir a le s , in t e r a c c io n e s y e n t r a d a .. E l o b s tá c u l o p r i m a r i o p a r a e n tr a r a l a c é l u l a d e l h o s p e d e r o e s l a m e m b r a n a c e l u l a r . L o s v i r u s ti e n e n a lg u n o s m é to d o s p a r a s u p e r a r e s ta b a r r e r a i n c l u s iv e l a fu s i ó n l i p íd i c a y l a p e r fo r a c ió n d e l a m e m b r a n a , p e r o p o r l o g e n e r a l i n g r e s a n p o r e n d o c i to s is . E n e s te c a s o l o s v i r u s s e u n e n a l a s u p e r fi c ie d e l a c é lu l a c o n p r o te ín a s , c a r b o h id r a to s , y l íp i d o s , c o n l a c u a l i n i c i a l a c a s c a d a d e v a r i a s v ía s d e e n d o c i to s is i n c l u y e n d o l a m e d ia d a p o r C a tr ín , C a v e o l a r y l a M a c r o p in o c ito s is . E l W S S V. e n tr a a l a c é l u l a d e l h o s p e d e r o a tr a v é s d e l a c é l u l a a c ti v a n d o l o s p r o c e s o s. d e e n d o c i to s i s c o n l a s p r o te ín a s d e i n te r a c c ió n , e s to s e l e m e n to s c o n o c i d o s q u e i n te r a c tú a n c o n h o s p e d a d o r ( A n e x o 8 ) ( B a s V e r b r u g g e n , 2 0 1 5 ) ( M a r ti n I. B u s ti l l o R u iz , 2 0 0 9 ). L o s r e c e p to r e s d e In te g r i n a e n l a s u p e r fi c ie c e l u la r d e l h o s p e d e r o h a n s i d o d e m o s tr a d o s q u e s o n d e g r a n i m p o r ta n c ia c o m o ta r g e ts p a r a e l W S S V . P r i n c i p a l m e n te i n v o l u c r a l a u n i ó n d e l a s c é l u l a s h a c i a l a m a tr i z e x tr a c e l u l a r, l a s i n te g r in a s s o n r e c e p to r e s h e te r o d í m e r o s d e s u p e r fi c i e q u e r e c o n o c e n l o s m o ti fs A rg -G ly -A s p (R G D ). e n p r o te ín a s ta r g e ts . A l g u n a s p r o te ín a s d e l W S S V. p u e de n. u n i r s e a l a α - o e l β - h o m ó l o g o s d e i n te g r i n a . E x p e r i m e n to s d e i n m u n o p r e c ip ita c ió n h a n m o s tr a d o u n io n e s d e β - in t e g r in a p a r a V P 1 8 7 , u n a p r o te ín a v i r a l q u e c o n ti e n e u n m o ti f R G D . T a m b i é n s e p u d o e n c o n tr a r q u e l a i n fe c c i ó n d e W S S V p o d r ía b l o q u e a r u n a s o l u b l e i n te g r i n a , u n a i n te g r in a e s p e c ífi c a a u n a n ti c u e r p o , u n R G D c o n te n ie n d o u n p é p ti d o , y u n s i l e n c i a d o r d e β - i n te g r i n a , i n d i c a n d o u n i m p o r ta n te r o l p a r a l o s r e c e p to r e s d e i n te g r i n a . L a s p r o te ín a s v i r a l e s V P 2 6 , V P 3 1 , V P 3 7 , V P 9 0 y V P 1 3 6 ta m b i é n i n te r a c tú a n c o n l o s r e c e p to r e s d e l a s i n te g r in a s d e L . v a n n a m e i , p r i n c i p a lm e n te i n te r a c c i o n e s c o n p é p ti d o s m o ti f p r e s e n te s e n l a s. 15.
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