EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C.
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE
LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME
DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
para optar por el título de
MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C.
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
APROBADO
______________________________ ___________________________ Jorge Cuéllar-Anjel, D.V.M., M.Sc. Janeth del Carmen Arias, M.Sc. Director Jurado
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
APROBADO
______________________________ ___________________________ Ingrid Schuler, Ph.D. Janeth del Carmen Arias, M.Sc.
A Dios, por guiarme y llenarme de infinitas bendiciones. A mis padres, Orlando Suárez y Elina Gómez, por su amor incondicional, su esfuerzo y perseverancia para formarme como persona y profesional integral. A mi hermosa hermana, Carmen Suárez, por brindarme todo su cariño y valiosos
consejos en momentos difíciles. A mi cuñado, Eduardo Jaimes, por su gran ayuda y colaboración. A mi sobrinita Isabella, quien con su simpatía y ternura alegró mis días.
vi
AGRADECIMIENTOS
Especialmente al Dr. Jorge Cuéllar-Anjel, por su meritorio compromiso como Director de Tesis, por su valioso aporte de conocimientos, por su inmensa colaboración, paciencia y perseverancia en situaciones de dificultad. Por todo el apoyo brindado con el cual hizo posible la conclusión satisfactoria de ésta investigación. Además, mis más sinceros agradecimientos por todos los consejos ofrecidos que ayudaron favorablemente en mi crecimiento como profesional integral.
A CAMACO (Camaronera de Coclé S.A), por financiar y permitir el desarrollo de este trabajo. A su gerente el Ing. Roberto Chamorro, por su aprobación y su apoyo.
A Mario Aguirre de la empresa Schering Plough – Salud Animal, por ratificar mi colaboración en la investigación y por su contribución a nuevos avances en Acuicultura.
A mi compañero y amigo el Ing. Agrónomo Giancarlo Cerrud, por su calidad humana representada en su enorme ayuda y cooperación, además agradezco el aporte de ideas y conocimiento que hicieron posible a cabalidad el alcance de los objetivos propuestos. Al personal de la Sala de Bioensayos de CAMACO S.A., Luis Alfredo Quezada y Cristian Saenz quienes cooperaron arduamente en las actividades y trabajo técnico.
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A mis nuevos amigos Yuliana Christopher, Thelma Quintero, Edward Villanero quienes con su afecto se convirtieron en la mejor compañía. Agradezco de corazón a
“Vilo” Ábrego por brindarme su cariño y enseñanzas que hicieron de mi estadía en Aguadulce, Panamá una valiosa experiencia de vida.
A Janeth Arias, Bacterióloga M.Sc., Directora de las carreras de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana, por su respaldo a lo largo de mi carrera lo cual contribuyó significativamente en mi formación profesional.
viii
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción………... 19
2. Marco Teórico……… 21
2.1 Generalidades de los camarones……… 21
2.1.1 Taxonomía………. 21
2.1.2 Anatomía general………. 21
2.1.3 Ciclo de vida de los camarones……… 24
2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones………. 27
2.2.1 Inmunidad celular……… 27
2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón……… 27
2.2.1.2 Funciones de los hemocitos………... 30
2.2.1.3 Fagocitosis……….. 31
2.2.1.4 Formación de nódulos………... 32
2.2.1.5 Encapsulación……… 32
2.2.1.6 Coagulación……… 32
2.2.1.7 Melanización……….. 33
2.2.2 Inmunidad humoral………. 33
2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento……… 34
2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO)……… 34
2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO………. 35
2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones………... 36
2.4 Bioensayos……… 37
2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos………... 37
2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos………. 38
2.5.1 Virus……….. 38
ix
2.5.3 Hongos………... 40
2.5.4 Protozoarios……….. 40
2.5.5 Toxinas……….. 41
2.5.6 Factores Fisicoquímicos………... 41
2.5.7 Etiología idiopática………... 41
2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)……….. 41
2.7 Inmunoestimulantes……… 45
2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan®)……….. 47
2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)……… 48
3. Formulación del problema y Justificación………. 50
3.1 Formulación del problema………. 50
3.2 Justificación………. 50
4. Objetivos………. 53
4.1 General………. 53
4.2 Específicos……… 53
5. Materiales y Métodos……… 55
5.1 Descripción del área de trabajo ……… 55
5.2 Población analizada……… 55
5.3 Fases experimentales………... 56
5.3.1 Preparación del Material de la Sala de Bioensayos (Fase 1)………… 57
5.3.1.1 Acuarios……….. 57
5.3.1.2 Desinfección de acuarios y tuberías de la Sala……… 58
5.3.1.3 Tratamiento del agua……… 58
5.3.1.4 Pruebas microbiológicas del agua……… 59
5.3.2 Transferencia y Siembra de Animales en los Acuarios (Fase 2)…….. 62
5.3.2.1 Control de peso de los camarones……… 63
5.3.2.2 Unidades experimentales……….. 63
5.3.2.3 Mantenimiento de acuarios………. 65
x
5.3.3 Dieta experimental (Fase 3)………. 66
5.3.3.1 Tratamientos experimentales (Diseño de la Investigación)………... 68
5.3.3.2 Alimentación experimental de los camarones………. 69
5.3.4 Infección experimental (Fase 4)……….. 71
5.3.4.1 Amplificación de cepas virales purificadas………. 71
5.3.4.2 Preparación de la Papilla infectante……… 72
5.3.4.3 Verificación de Papilla mediante nested – PCR………. 73
5.3.4.4 Prueba de Virulencia de la Papilla……….. 75
5.3.4.5 Suministro de Papilla infectante……….. 76
5.3.5 Registro de Mortalidad (Fase 5)………. 77
5.3.5.1 Toma de muestras para pruebas confirmatorias de laboratorio……….. 77
5.4 Técnicas confirmatorias de la infección por el virus WSSV…………... 80
5.4.1 Prueba molecular………. 80
5.4.1.1 Extracción de ADN……….. 80
5.4.1.2 Nested – PCR……… 82
5.4.1.3 Observación e interpretación de resultados (nested-PCR)………. 84
5.4.2 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)………. 86
5.4.3 Histopatología………... 88
5.5 Extracción de Hemolinfa (prueba complementaria)……… 90
5.5.1 Conteo de Hemocitos (Hemograma)………... 92
5.6 Análisis de la información……….. 94
6. Resultados y Discusión………. 95
6.1 Pruebas previas al experimento………. 95
6.2 Manifestaciones clínicas de la enfermedad en camarones Infectados……… 96
6.3 Pruebas confirmatorias del virus WSSV………... 98
xi
6.3.2 Nested – PCR………. 100
6.3.3 Histopatología………... 101
6.4 Prueba de desafío mediante infección per os con el virus WSSV……….. 105
6.4.1 Relación de supervivencia entre los tratamientos infectados con los no infectados………... 107
6.4.2 Relación de supervivencia entre el tratamiento con la dieta ERGOSAN® infectado y el Control infectado……… 109
6.5 Efecto del Inmunomodulador comercial (ERGOSAN®) sobre el recuento de hemocitos………. 113
6.5.1 Recuento luego de diez días de suministro de dieta ERGOSAN®……….. 113
6.5.2 Recuento 20 días después de terminado el suministro de dieta ERGOSAN®……… 114
6.5.3 Recuento 30 días después del terminado el suministro de dieta ERGOSAN®……… 116
7. Conclusiones………... 120
8. Recomendaciones……….. 122
9. Referencias bibliográficas………. 123
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de camarones penaeidos……… 21
Tabla 2. Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los camarones penaeidos………. 23
Tabla 3. Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos……… 24
Tabla 4. Funciones de los distintos tipos de células presentes en la hemolinfa de camarón………. 30
Tabla 5. Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular………... 31
Tabla 6. Características alimento CAMPENT – TOP……… 67
Tabla 7. Diseño experimental………. 68
Tabla 8. Diseño experimental – Hemograma………. 69
Tabla 9. Diseño del suministro de papilla infectante………. 76
Tabla 10. Volúmenes necesarios para preparar Mix 1………... 82
Tabla 11. Programación del termociclador – WSSV………. 83
Tabla 12. Hallazgos histopatológicos………. 102
Tabla 13. Porcentaje de Mortalidad……… 105
Tabla 14. Media de Supervivencia………. 108
Tabla 15. Porcentaje de supervivencia por día………... 109
Tabla 16. Porcentaje de supervivencia de cada acuario infectado………. 111
Tabla 17. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 10 días de tratamiento con ERGOSAN®……… 113
Tabla 18. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 20 días sin ERGOSAN®……….. 114
Tabla 19. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 30 días sin ERGOSAN®………. 116
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfología externa de camarones penaeidos………... 22
Figura 2. Ciclo de vida más típico de Penaeidae tropical o subtropical………. 26
Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados……… 28
Figura 4. Tipo de hemocitos………. 30
Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos………. 35
Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV……… 39
Figura 7. Infección por bacterias en camarón peneido - manchas negras en la cutícula………. 39
Figura 8. Lesiones melanizadas causadas por Fusarium solani en camarón Penaeus sp…………. 40
Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad de la mancha blanca (WSSV)……….. 43
Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de infección por Virus de la Mancha Blanca (WSSV)………... 44
Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. – ERGOSAN®………. 47
Figura 12.Vista frontal de la “Casa de Don Popo” – Sala de Bioensayos………. 55
Figura 13. Disposición de acuarios en Sala de Infección……… 57
Figura 14. Recepción de agua marina……….. 59
Figura 15. Microbiología de aguas……….. 60
Figura 16. Esquema descriptivo del proceso de dilución y siembra de muestras de agua marina……….. 61
Figura 17. Proceso de transferencia de camarones a los acuarios………….. 62
Figura 18. Unidades experimentales……… 64
xiv
y conteo de hemocitos………...
Figura 20. Mantenimiento de acuarios………. 65
Figura 21. pHmetro y medición de pH en el agua de los acuarios…………... 66
Figura 22. Dietas experimentales………. 67
Figura 23. Alimentación de los camarones en cada uno de los acuarios……. 70
Figura 24. Inoculación del virus WSSV en camarones sanos……….. 71
Figura 25. Preparación de papilla infectante……… 73
Figura 26. Esquema descriptivo para evaluación semicuantitativa
de la papilla infectante……….. 74
Figura 27. Suministro de papilla infectante a acuarios……… 76
Figura 28. Recolección y registro de animales moribundos……… 77
Figura 29. Proceso de toma de muestras de camarones moribundos………... 79
Figura 30. Extracción de ADN viral……… 81
Figura 31. Técnica de Nested – PCR……….. 84
Figura 32. Observación e interpretación de resultados de la nested –
PCR……….. 85
Figura 33. Shrimple® diagnostic test kit procedure diagram and
potencial test results………. 86
Figura 34. Procesamiento de muestras para técnica de histopatología……… 88
Figura 35. Observación de resultados de prueba Histopatologíca…………... 90
Figura 36. Proceso realizado para la extracción de hemolinfa
en camarones………. 91
Figura 37. Comparación entre los signos clínicos presentados por
un camarón infectado a diferencia de un camarón sano………. 97
Figura 38. Manchas blancas en cutícula de camarón L. vannamei………….. 98
Figura 39. Resultados positivos para el virus WSSV mediante la
Prueba de Shrimple®………. 99
Figura 40. Electroforesis en gel de agarosa con resultados positivos
xv
Figura 41. Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección
del virus WSSV………. 103
Figura 42. Microfotografía de láminas histológicas observadas
bajo el microscopio (600X)………... 104
Figura 43. Gráfico – Curva de mortalidad………... 106
Figura 44. Gráfico - diferencia entre el porcentaje de supervivencia
de los tratamientos infectados con los no infectados………. 108
Figura 45. Gráfico – Curva de supervivencia………... 110
Figura 46. Gráfico - Tendencia de las poblaciones sobrevivientes
por cada uno de los acuarios……….. 112
Figura 47. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de diez días de suministro de la
dieta a base de ERGOSAN®………. 114
Figura 48. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 20 días de haber culminado el suministro de la dieta a base de
ERGOSAN®……… 115
Figura 49. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 30 días de haber culminado el
suministro de la dieta a base de ERGOSAN®………. 117
Figura 50. Gráfico – Consolidado de hemogramas ERGOSAN® vs.
xvi
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. PCR –WSSV, IHHNV, NHP………. 131
Anexo 2.Medios de cultivo……… 131
Anexo 3.Etiqueta alimento “CAMPENT-TOP”……… 134
Anexo 4. Etiqueta producto comercial ERGOSAN®………. 135
Anexo 5. PCR –Papilla infectante………. 136
Anexo 6. Resultados para prueba de virulencia de la papilla infectante……… 137
Anexo 7.Registro de mortalidad……… 138
Anexo 8.Registro de toma de muestras……….. 144
Anexo 9. Shrimple® - Manual Kit EnBioTec………. 145
Anexo 10. Recuento microbiológico del agua de las unidades experimentales……… 151
Anexo 11. Registro de resultados para Pruebas de Shrimple®……… 152
Anexo 12. Registro de resultados para técnica Nested – PCR……… 153
Anexo 13.Registro lectura de láminas histopatológicas………. 154
Anexo 14.ANOVA y Duncan entre los cuatro tratamientos……….. 155
Anexo 15.ANOVA y Duncan para tratamientos infectados……….. 156
Anexo 16. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos luego de 10 días con ERGOSAN®………. 157
Anexo 17. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 20 días después de haber suspendido ERGOSAN®……… 160
Resumen
Este estudio se llevo a cabo en la Sala de infecciones experimentales de la Camaronera de Coclé S.A. ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito de Natá, Provincia de Coclé, República de Panamá. Uno de los mayores problemas a los que se enfrenta la industria camaronera es a la creciente presencia de enfermedades infecciosas causadas principalmente por virus, generando altas tasas de mortalidad y graves pérdidas en el sector. Por lo antes postulado, el objeto de este experimento fue evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN® en el fortalecimiento de sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV). La fase experimental se desarrolló en 40 acuarios y el suministro de las dietas (dieta ERGOSAN® y dieta BASE – Control) se hizo dos veces diarias durante diez días continuos. El día 11 se llevo a cabo la infección vía oral con el virus WSSV, continuando del día 2 en adelante con la dieta control (sin ERGOSAN®) en todos los tratamientos. Posterior a la infección se realizó un registro
Abstract
This study was carried out in the experimental infections room of the Shrimp Factory
Coclé Inc., located in the estate “La Estrella”, Natá District, Province of Coclé, in the Republic of Panama. One of the major problems facing for the shrimp industry is the growing presence of infectious diseases mainly caused by viruses, generating high mortality rates and huge losses in the sector. By the above, the object of this experiment was to assess the ability of the commercial product called ERGOSAN® in
the strengthening of natural defense system and also in the reduction of the mortality rate of white shrimp (L. vatmamei) compared to per os infection of the White Spot Syndrome Virus (WSSV). The pilot phase was developed in 40 aquariums and the supply of the diets (ERGOSAN® diet and BASIC diet - Control) was twice daily for 10 days consecutives. The 11th day was carried out the infection orally with the WSSV virus, continuing from the day 2 at forward with the control diet (without ERGOSAN®) in all treatments. After the infection it was carried out a record of mortality and samples were taken to the confirmation of the virus by immunochromatography, Nested - PCR and histopathology. The group with ERGOSAN®displayed a survival from 11 percent while the Control obtained a 6 percent, without significant differences were presented between the treatments (P < 0.05). The hemogram presented significant differences (P < 0.06) after 10 days with ERGOSAN®, with regard to both the semigranulated and total cells in favour of the
19
1. INTRODUCCIÓN
La Acuicultura en los últimos años ha tenido grandes avances y se ha convertido en una de las más importantes áreas comerciales. La contribución de la acuicultura al suministro mundial, con base en datos arrojados por la F.A.O, en los tres últimos decenios, la acuicultura ha crecido con rapidez a nivel global. En la década de 1970, suponía alrededor del 6 % del pescado disponible para el consumo humano; en 2006, esta cifra era del 47 %. En América Latina, la producción estimada en millones de toneladas fue de 0,07 en 1985, luego aumento a 0,41 en 1995 y en el 2005 alcanzó un total de 1,37. En cuanto a la camaronicultura, se estima que la producción mundial del camarón fue de 4,00 millones de toneladas en el año 2005. Donde la variación anual fue de un 13, 8 % entre los años 1995 al 2005. (F.A.O. – Estado Mundial de la Pesca y la Acuicultura, 2008)
En la República de Panamá se cultivan especialmente dos especies de camarón Litopenaeus vannamei y L. strylirostris. La principal provincia de Panamá dedicada al cultivo de camarón es Coclé, seguida por Herrera, Panamá, Veraguas y Los Santos (Dirección de estadística y Censo de la Contraloría General de la República de Panamá, 2007)
A partir de los esfuerzos que se han hecho en los últimos años, se ha logrado incrementar la producción en Panamá. Sin embargo, su desarrollo ha presentado una serie de problemas relacionados con el crecimiento y la supervivencia en condiciones de cultivo, generados a partir de la presencia de microorganismos patógenos para la especie, como virus, bacterias, Protozoos y Hongos. En la actualidad la principal amenaza para el desarrollo de la industria camaronera son las enfermedades infecciosas especialmente las causadas por virus.
20
mundial. Durante los 90´s emergió una de las mayores panzootias en camarones, causada por el virus de síndrome de la mancha blanca (White Spot Syndrome Virus –
WSSV) en áreas costeras del Sudeste y Norte de Asia, Centro y Sur América. El virus se ha vuelto endémico en América Central y del Sur, principalmente en Ecuador, Panamá, Colombia y Perú. En la actualidad impacta severamente la producción y ha contribuido a la disminución, en corto tiempo, de la producción de camarón en estos países.
El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) posee una presencia permanente en el medio ambiente de las zonas afectadas. Esto indica que la aparición o no de la enfermedad puede estar relacionada con el estado inmunitario de los camarones, la resistencia genética, las condiciones generales del medio ambiente y manejo que se le da al cultivo. Por tal razón, la mejor manera de prevenir brotes de la enfermedad es mantener el cultivo en condiciones ambientales estables, exponiéndolos al menor grado de estrés.
Se ha descubierto que durante los brotes de mancha blanca, se da un descenso dramático en las defensas de los camarones y a la disminución en el conteo de hemocitos circulantes totales. Se estima que en el camarón las reacciones de resistencia a patógenos están basadas en el número de hemocitos circulantes en la hemolinfa. Por tal razón, en la actualidad la inmunoestimulación es una alternativa efectiva para manipular la respuesta inmune del camarón antes de que estos se enfrenten a desafíos de patógenos en el cultivo.
21
2. MARCO TEÓRICO 2.1 Generalidades de los camarones
2.1.1 Taxonomía
[image:22.612.187.456.206.550.2]La ubicación taxonómica de los camarones penaeidos es la siguiente:
Tabla 1: Taxonomía de camarones penaeidos
Phylum: Arthropoda
Clase: Crustacea
Subclase: Malacostraca
Serie: Eumalacostraca
Superorden: Eucarida
Orden: Decápoda
Suborden: Natantia
Sección: Penaeidae
Familia: Penaeidae
Subfamilia: Penaeinae
Género: Penaeus (Litopenaeus)
Especie: vannamei
Adaptado de Rodríguez, 1993. En: Gómez, D. y Fajardo, D. 2003
2.1.2 Anatomía general
22
El cuerpo de los camarones presenta un abdomen y cefalotórax definido. El cefalotórax posee un rostro aserrado. Tienen un exoesqueleto conformado por quitina que suele ser delgado y flexible. Presenta una boca en posición ventral. (Figura 1) El aparato digestivo se ensancha a lo largo del dorso, para formar el hepatopáncreas o glándula digestiva que es un órgano vital involucrado en la digestión del alimento, absorción y almacenamiento de nutrientes. El cordón nervioso se extiende a lo largo del vientre. Sus órganos excretores son las glándulas antenales o verdes que lanzan al medio sustancias de desecho. El sistema circulatorio es abierto y compuesto por vasos sanguíneos que transportan la hemolinfa la cual posee cobre y acarrea el oxígeno, por lo que desarrolla un color azuloso. El oxígeno y el dióxido de carbono son transportados desde y hasta las branquias, que es donde se realiza el intercambio gaseoso (Ruppert, E. E. y Barnes, R. D. 1996)
Figura 1: Morfología externa de camarones penaeidos. (En: Suárez, C. 2008)
23
Tabla 2: Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los camarones penaeidos
Órgano/Estructura Función principal Músculo estriado abdominal (cola
o abdomen del camarón)
Movimientos rápidos de huida hacia atrás contra predadores
Antenas Sensores táctiles (detección de
predadores)
Complejo glándula antenal Excreción y balance osmótico
Anténulas Quimiorrecepción
Ciegos anterior y posterior Desconocida
Exoesqueleto Soporte externo, barrera de defensa.
Intestino anterior (boca, esófago, estómago)
Captación, masticación y almacenamiento temporal de alimento
Branquias Respiración, excreción,
osmorregulación y fagocitosis.
Hepatopáncreas Digestión del alimento, absorción posterior de nutrientes y
almacenamiento de energía
24
Mandíbulas, palpos mandibulares y paquetes branquiales
Sensores táctiles, captura de
partículas de alimento y movimiento de agua hacia las branquias
Intestino medio Absorción y excreción
Pereiópodos y pleópodos Locomoción y quimiorrecepción
Adaptado de Brock y Main, 1994. En: Cuéllar-Anjel, J. et al. 1998
2.1.3 Ciclo de vida de los camarones
Los camarones penaeidos desovan en mar abierto. Las larvas a medida que avanzan en su desarrollo se acercan a la costa, donde alcanzan la forma de postlarva. Éstas generalmente penetran en aguas estuarinas, donde continúan su desarrollo rápidamente a juveniles hasta llegar a veces al estado de subadulto y, finalmente, cuando son camarones adultos, (Figura 2) regresan al mar abierto a desovar (Mendoza, F. E. 2007).
Tabla 3: Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos
Huevo El desove de la hembra ocurre
generalmente durante la noche y cada hembra produce
aproximadamente 150.000 huevos cada 15 días, los cuales deben mantenerse en aireación constante y temperatura entre 26 y 28°C. La eclosión de los
25
Larva Este estadio se divide en tres
subestadios: nauplio (cuerpo piriforme con sólo tres pares de apéndices natatorios, se alimenta de reservas vitelinas propias), protozoea o zoea (se alimenta de algas y microencapsulados, tiene el cuerpo dividido en cefalotórax y abdomen) y mysis (comienza a ser carnívora, consume nauplios de artemia, desarrolla
pereiópodos para su desplazamiento).
Postlarva En este estadio el animal presenta hábitos nadadores y tendencia bentónica. A partir de postlarva 10, empieza a ser comercializada.
26
Adulto Se da cuando el camarón logra un
peso de 20 gramos alcanzando su madures sexual cuando tiene un peso promedio de 25 a 30 gramos. El apareamiento se da en aguas profundas, en esta misma zona la hembra desova durante la noche.
Adaptado de Carvajal, A. M. 1999.
El camarón blanco presenta los siguientes estadios en su ciclo de vida:
27
2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones
El mecanismo innato de defensa de los artrópodos está basado en la inmunidad humoral y celular (Muñoz, M. et al., 2000); éstos, juegan un papel importante en la detección y eliminación de microorganismos y parásitos potencialmente dañinos. Se puede dividir la respuesta inmune de los artrópodos en diferentes fases:
- Reconocimiento de factores ajenos e inicio de actividad inmunológica - Actividad celular y síntesis de efectores inmunitarios
- Actividad humoral del sistema inmune
La capacidad que tienen los camarones para reconocer y destruir invasores, está basada en los componentes de la inmunidad celular y humoral del sistema circulatorio y son expresados en varias respuestas inmunes (Vergara, F. 1999).
2.2.1 Inmunidad celular
Consiste en la activación de una gran cantidad de hemocitos, que tienen la capacidad especial de fijarse al agente extraño y destruirlo.
2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón
28
Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados. C: corazón; HP: hepatopáncreas; OHA: órgano hematopoyético antenal; OHD: órgano hematopoyético dorsal; OHV: órgano hematopoyético ventral; VD: vaso dorsal (Adaptado de Bachere et al., 2004; En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008)
En la hemolinfa son transportados continuamente nutrientes, excretas, oxígeno, hormonas y otras moléculas importantes para los diferentes órganos de esos animales. Debido a su fluidez y por la capacidad de llegar directamente a todos los tejidos de los crustáceos, la hemolinfa contiene además todos los componentes del sistema inmunológico.
La hemolinfa está compuesta por una fracción celular, representada por las células circulantes o hemocitos y por una fracción líquida constituida por el plasma que contiene diferentes factores humorales. Las respuestas inmunocelulares e inmunohumorales actúan de forma integrada en los crustáceos, protegiéndolos contra la invasión de microorganismos y parásitos, garantizando así su integridad corporal y homeostática (Barraco, M. y Perazzolo L. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008)
29
a) Células hialinas (HC): 80% de la hemolinfa. Son pequeñas con un núcleo grande y muy poco citoplasma.
b) Células semigranulares (SGC): 10-13% de la hemolinfa. Más grandes que las hialinas, con presencia de algunos gránulos, sus núcleos son proporcionalmente más pequeños.
c) Células granulares (LGC): 4-10% de la hemolinfa. Son más grandes que las semigranulares y por su gran contenido de gránulos, son más refringentes bajo el microscopio (Le Moullac, G. et al. 1997). (Figura 4)
Las células hialinas y las semigranulares son capaces de fagocitar sustancias extrañas, pero difieren por la presencia del sistema profenoloxidasa (proPO). Los hemocitos semigranulares y granulares son poseedores del sistema proPO, también pueden ser citotóxicos y causar lisis en células eucariotas, similar a la acción de las “natural killer” en mamíferos.
Las células hialinas se mantienen listas para atacar y desplegarse extensamente para fagocitar. Las células semigranulares son inestables, están encargadas de reconocer y responder ante células invasoras para luego atacar desplegándose en la superficie del invasor. Se ha observado que estas células son las únicas que reaccionan ante los
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Figura 4. Tipos de hemocitos (A – F) y reacciones celulares de defensa en curstaceos (G – J). A, D: hemocitos hialinos (HHs) de camarones observado al microscopio de contraste de fase y electrónico de transición, respectivamente; B, E: hemocitos con granulos pequeños (HGPs); C, F: hemocitos con granulos grandes (HGGs). G: fagocitosis de un levadura por un hemocito de L. vannamei; H: encapsulamiento in vitro de nematodo Panagrellus redivirus por hemocitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamiento in vitro de hifas del hongo Ganoderma sp. por hemocitos de
Farfantepenaeus pulensis, con fuerte reacción de melanización; J: nódulo hemocítico en el hepatopáncreas de L. vannamei con agregados bacterianos en el centro. (Reproducido de Covarrubias, 2004; En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J. 2008)
2.2.1.2 Funciones de los hemocitos
Tabla 4: Funciones de los distintos tipos de células presentes en la hemolinfa de camarón
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Células
semigranulares
Encapsulación
Fagocitosis (limitada)
Almacenamiento y liberación del sistema proPO
Citotoxicidad
Células granulares
Almacenamiento y liberación del sistema proPO
Citotoxicidad
Adaptado de Johansson, M. et al. 2000.
2.2.1.3 Fagocitosis
Una vez que el parásito ha superado la barrera fisicoquímica de la cutícula, la fagocitosis constituye, junto con los componentes humorales, la primera línea de defensa, siendo la más común de las reacciones de defensa celular (Carvajal, A. M. 1999; Vergara, F. 1999)
La quimiotaxis se considera comúnmente como el primero, entre varios eventos, que dirigen una partícula extraña a la fagocitosis. En los artrópodos, las células de la hemolinfa viajan por todo el cuerpo, proporcionando una amplia oportunidad para encontrarse con los invasores y contrarrestar eventos infecciosos (Carvajal, A. M. 1999)
El proceso de la fagocitosis está dividido en las siguientes etapas:
Tabla 5: Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular
Opsonización Aumento de la capacidad de
expresión de partículas foráneas.
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2.2.1.4 Formación de nódulos
Cuando la cavidad corporal es invadida por un número de microorganismos que no pueden ser fagocitados, se presenta un agrupamiento de hemocitos que los envuelve inmovilizándolos e impidiendo su diseminación. Se cree que los túbulos del hepatopáncreas y las branquias son los lugares de alojamiento de los agentes extraños eliminados (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992)
2.2.1.5 Encapsulación
Tiene el mismo principio que la formación de nódulos. La diferencia se encuentra en que este proceso ocurre como respuesta a parásitos más grandes (Vergara, F. 1999).
2.2.1.6 Coagulación
Debido a que los artrópodos poseen un sistema circulatorio abierto, las heridas deben ser cerradas rápidamente para prevenir la salida de grandes cantidades de hemolinfa y la entrada de agentes patógenos (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). Al entrar una
Fagocitosis Ingestión de la partícula.
Formación de fagosomas El fagosoma es una vacuola y está compuesto por la partícula extraña rodeada de una envoltura, la cual es parte de la membrana celular del fagocito.
Destrucción y digestión La partícula extraña es destruida por las enzimas del fagolisosoma y/o por un mecanismo bioquímico conocido como choque
respiratorio.
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bacteria a la cavidad corporal, induce la liberación exocitotóxica de la cascada de la coagulación dentro del plasma. Los LPS inducen, a la vez, la activación de la cascada de la coagulación, que comprende la cascada de serino proteasas y la proteína coagulable o cuagulógeno (Vergara, F. 1999).
2.2.1.7 Melanización
Es iniciada por la lisis de los hemocitos cerca de la superficie del parásito, seguido por una deposición de sustancias melanoides en el área que sufrió la lisis y en la membrana del parásito. La melanina y la esclerotina son consideradas materiales de melanización en la respuesta inmune del camarón (Vergara, F. 1999).
Durante la formación de la melanina, se liberan metabolitos tóxicos con actividad fungicida. La melanina y sus compuestos son altamente reactivos y están involucrados en la prevención del crecimiento de microorganismos, inhibiendo las proteasas y las quinasas extracelulares (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992).
2.2.2 Inmunidad humoral
Es realizada por moléculas efectoras y no por células hemolinfáticas. Resulta de procesos generales, más que de procesos dirigidos contra organismos patógenos específicos. Este evento incluye:
a) Resistencia de la cutícula a la invasión por parte de microorganismos.
b) Presencia de moléculas efectoras en la hemolinfa que se unen a los microorganismos, como las proteínas de reconocimiento de microorganismos patógenos (BG-BP y LPS-BP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
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Cuando partículas extrañas penetran la cutícula del camarón hasta llegar a la cavidad corporal, se activa un eficiente y rápido proceso de defensa en el animal: El sistema de activación de la profenoloxidasa (sistema proPO). Lo que se puede observar durante este proceso, es la formación de melanina, un pigmento oscuro que se acumula alrededor de las heridas, o encapsulando e invadiendo los microorganismos para evitar su diseminación a otros tejidos del cuerpo (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento
Los artrópodos no poseen una respuesta inmune adaptativa con inmunoglobulinas. Este mecanismo de defensa es iniciado por el reconocimiento de factores que son liberados o están presentes en la superficie de los microorganismos o parásitos. Las proteínas que reconocen estos factores son denominadas proteínas patrón de reconocimiento (PRP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
Las PRP son macromoléculas utilizadas para el reconocimiento de los determinantes microbianos que son liberados por el patógeno, o que se encuentran sobre su superficie para iniciar ciertas respuestas inmunes. Estas macromoléculas son de gran importancia para iniciar una respuesta en contra de la infección; pueden iniciar la actividad del sistema proPO que es el principal sistema de defensa en los artrópodos, o también pueden actuar directamente como opsoninas o aglutininas (Vergara, F. 1999).
2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO)
A través de heridas o alimentos contaminados, pueden ingresar microbios y parásitos al sistema del artrópodo y algunos hongos pueden penetrar la cutícula (quitina y Calcio) por medio del uso de quitinasas u otros mecanismos. La respuesta se puede observar como manchas oscuras en la cutícula de los animales afectados.
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2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO
El sistema proPO puede activarse por acción de polisacáridos microbiales; las proteínas recubren en primer lugar los carbohidratos y luego inician la activación del sistema, pero los detalles bioquímicos de este proceso son poco conocidos (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992).
Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos, después del reconocimiento del patógeno, vía PRPs plasmática o celulares y subsecuente activación (1) degranulación, con liberación de diferentes inmunoefectores e inmoreguladores; (2) inducción y/o represión de genes inmunológicos; (3) activación de respuestas celulares como fagocitosis y formación de nódulos y cápsulas. (Imagen tomada a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008)
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Los mecanismos encargados de activar el sistema proPO son aquellos que estimulan las diferentes reacciones de defensa celular: a) fagocitosis, b) formación de nódulos, c) encapsulación y d) quimiotaxis de los hemocitos.
2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones
La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo de animales o de una población en un sistema comercial de cultivo. Estos parámetros están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir son: hemograma, concentración de proteínas plasmáticas, capacidad de hemoaglutinación, actividad de la fenoloxidasa, capacidad antibacteriana del plasma, entre otros. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El hemograma consiste en realizar un conteo total o diferencial de los hemocitos de la hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). (Morales V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
En investigaciones realizadas se han tenido conteos totales de hemocitos que van desde 21.000/mm3 (con citómetro de flujo) a 23.300 (con hematocitómetro) en camarones sanos (Owens, L. y O’Neill, A. 1997).
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2.4 Bioensayos
Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones de
una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos y susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos”
(SPF por sus siglas en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende reproducir. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El objeto de los bioensayos es determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.) tóxico (toxinas químicas o biológicas), o descartando lo anterior, de origen ambiental o por manejo. También se utilizan los bioensayos para evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos. (Morales, V y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos
El control de la calidad del agua (parámetros físico - químicos y nutrientes) del estanque y el conocimiento de los límites de tolerancia de las especies son requerimientos indispensables en todo el sistema de cultivo, e influyen decisivamente en el éxito o fracaso de ésta actividad productiva (Spotte, S. 1970; Kinne, O. 1976).
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Estudios previos realizados en el análisis de los parámetros que influyen en la infección del WSSV indican que la temperatura del agua (32 – 33°C) reduce la mortalidad de los camarones infectados por el virus. (Rahman, M. M. y Escobedo –
Bonilla, C. M. 2006). En este contexto, la temperatura del agua está considerada como uno de los factores ambientales más importantes en el desarrollo de los camarones, ya que influye en el metabolismo, el consumo de oxigeno, tipo de alimentación, crecimiento, muda, la supervivencia y la tolerancia a los metabolitos tóxicos. (Rahman, M. M. y Escobedo – Bonilla, C. M. 2006)
Además, en otras publicaciones se ha reportado la influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad. Camarones infectados con WSSV pueden permanecer asintomáticos a temperaturas arriba de 27ºC, pero la enfermedad se hace evidente si la temperatura del agua disminuye (Vidal, O.M. et al., 2001; Granja, C.B. et al., 2003 En: Morales, V. y Cuellar-Anjel, J. 2008).
2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos
Las enfermedades se consideran como una de las principales causas de pérdidas de poblaciones de camarones de cultivo y por ende económicas, debido a mortalidades masivas de curso agudo o crónico producidas por agentes bióticos o abióticos (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Los camarones de cultivo con frecuencia se ven afectados por enfermedades que varían en cuanto a severidad, patogénesis, agente etiológico y manejo/tratamiento de la afección. Las principales causas de estas enfermedades son virus, microorganismos intracelulares, bacterias, hongos, protozoarios internos y externos, organismos epicomensales, toxinas, factores fisicoquímicos y causas de etiología idiopática (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.5.1 Virus
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síndrome de Taura, BP Baculovirus penaei,HPV parvovirus hepatopancreatico y YHV virus de la cabeza amarilla. (Lightner, D.V. 1999; Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV (Pantoja y Lightner. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008)
2.5.2 Bacterias
Son causadas principalmente por especies de los géneros Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Plesiomonas y Serratia. Así como estas bacterias extracelulares causan enfermedad en camarones, también existen microorganismos intracelulares como rickettsias y una alfa Proteobacteria, esta ultima causante de la hepatopancreatitis necrosante (NHP) (Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008)
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2.5.3 Hongos
Son de poca importancia en camarones de cultivo, debido a que no son muy frecuentes y además son poco severas. Los principales géneros de hongos patógenos
se presentan en larvas y postlarvas produciendo la “micosis larval” y son especies de
Lagebidium spp. y Sicolpidium spp. En reproductores se presenta la fusariosis que es causada por el género Fusarium, principalmente F. solani (Lightner, D. V. 1996; Cuéllar-Anjel, J. 1998; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Figura 8. Lesiones melanizadas (negras) dentro de la cámara branquial de un camarón Penaeus sp. causadas por infestación con Fusarium solani (Pantoja, C. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008)
2.5.4 Protozoarios
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2.5.5 Toxinas
Son poco frecuentes. En algunos casos estas se asocian con pesticidas o substancias químicas. Existen toxicosis causadas por algas verde-azules y afectan principalmente la pared del intestino medio de los camarones, produciéndose enteritis hemocítica en los animales (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
2.5.6 Factores Fisicoquímicos
Cambios súbitos o condiciones extremas de los factores físicos (oxigeno disuelto, temperatura, turbidez) y químicos (salinidad, amonio, nitritos, sulfuros) en un estanque de producción, alteran la calidad del agua y pueden ser causas de estrés, el cual dispara enfermedades que se encuentran latentes en los camarones. Adicionalmente, niveles bajos de oxigeno disuelto crean una condición de hipoxia critica para los camarones. (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Le Moullac, G. 2000; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.5.7 Etiología idiopática
Existen pocas condiciones que afectan la salud de los camarones que sean desconocidas. La más frecuente, aun sin ser muy común en la naturaleza, es la necrosis muscular idiopática (NMI), que consiste en el deterioro de una zona de músculo abdominal, con inflamación e infiltración hemocítica abundante. (Cuéllar-Anjel, J. 1998; Cuéllar-(Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-(Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV – por sus siglas en inglés)
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camarón de cultivo por valor de 100 millones de dólares (Cuéllar-Anjel, J. 2000; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El agente causante de la enfermedad de la mancha blanca, es un virus DNA de doble cadena, que es considerado potencialmente letal para todas las especies cultivadas de camarones penaeidos. Los viriones son circulares a elípticos con una envoltura trilaminar y son grandes (80-129 x 250-380 nm), también poseen un apéndice único en forma de cola (Itami, T. 1998a; O.I.E. 2000).
El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) es un patógeno que causó y causa devastaciones en la industria de la cría de camarones en varios países (Lightner et al., 1998; Jiang et al., 2006; En: Esparza – Leal, H. M. 2009), actualmente es uno de los más graves patógenos virales en el mundo (Soto y Lotz, 2001; Flegel, 2006; Sánchez
– Martínez .et al. 2007. En: Esparza – Leal, H. M. 2009). En México, el WSSV apareció por primera vez en 1999 y pronto causo graves pérdidas, en primer lugar afectó el cultivo de Penaeus (también llamado Litopenaeus) stilyrostris y más tarde a la especie de P. vannamei (Galaviz-Silva et al., 2004; Peinado-Guevara y López-Meyer, 2006. En: Esparza – Leal, A .M. 2009).
El virus tiene un período de incubación de 3 a 7 días dentro del organismo del camarón. La transmisión ocurre a través de diversos vectores que incluyen: materia fecal o tejidos en descomposición, canibalismo y fluidos de hembras afectadas (Maldonado, M. y Rodríguez, J. 2004). Se puede dar una transmisión indirecta a través de agua contaminada, comida contaminada, entre otros (Johnson, S. K. 1996). Éste se encuentra presente en el medio ambiente y es portado por los camarones en baja intensidad. Puede no desarrollarse la enfermedad por mucho tiempo en condiciones libres de estrés (Meng – Feng, T. 1999).
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de de estanques o aguas vertidas en el medio adyacente (lagunas costeras o estuarios) donde habitan otras especies de crustáceos que pueden servir como huésped del virus. Muchos crustáceos son potencialmente susceptibles a la infección por WSSV (Escobedo-Bonilla et al., 2008. En: Esparza – Leal, H. M. 2009).
[image:44.612.234.404.392.542.2]La enfermedad de la mancha blanca en los camarones penaeidos está caracterizada por una mortalidad rápida y alta, acompañada por la aparición de manchas blancas, inicialmente circulares en la cutícula, que vistas al microscopio tienen un centro oscuro (Itami, T. 1998). Algunas veces estas manchas se encuentran acompañadas de una coloración roja en toda la superficie del cuerpo. Los puntos blancos, son depósitos de calcio que también pueden ser provocados por causas ambientales relacionadas con la concentración de Ca++ y el pH del estanque. Para verlos más fácilmente, se arranca la cutícula de la cabeza y con la uña del pulgar se rasca hasta retirar la epidermis.(Alday, V. 1999)
Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Las manchas blancas son depósitos calcáreos localizados en la porción interna del exoesqueleto. Fotografía cortesía de P. Saibaba (S.K.B.R College, Amalapuram, India). En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J. 2008).
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En la fase aguda, sufren un episodio de letargia caracterizado por pocos movimientos corporales y aislamiento, cambian su color a rojizo-café oscuro, pierden del reflejo de huida, suspenden el consumo de alimento. Además efectúan una evacuación total del tracto intestinal y mueren a las pocas horas, sin haber consumido significativamente sus reservas del hepatopáncreas. Las inclusiones cuticulares van desde pequeños puntos hasta manchas de varios milímetros de diámetro, que pueden llegar a unirse entre ellas y formar zonas blanquecinas de gran tamaño. Éstas son más fáciles de observar separando la cutícula de la región del cefalotórax del camarón, removiendo los tejidos que puedan estar adheridos a ella y luego colocándolas a contraluz (O.I.E. 2000).
Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de infección por Virus de la Mancha Blanca (WSSV). El camarón de la parte superior y el de la derecha casi no muestran manchas blancas, pero se puede distinguir una coloración rosada a café – rojiza causada por la expansión de los cromatóforos subcuticulares. Es posible que esta coloración sea más aparente durante la etapa aguda de la enfermedad. El camarón de la izquierda y de la parte inferior muestran las manchas blancas que característicamente aparecen en esta especie al pasar la etapa aguda de la infección. (Fotografía tomada a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008)
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2.7 Inmunoestimulantes
La llegada al continente americano del virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV- por sus siglas en ingles) ha creado la necesidad de explorar todas las vías posibles para su control. En este sentido, la inmunomodulación del camarón se presenta como una alternativa. Un aspecto fundamental de la inmunomodulación concierne a la inmunoestimulación, entendiéndose como tal, a la excitación del sistema inmune en animales sin carencias nutricionales (Rodríguez, J. y Le Moullac, G. 2000).
Sustancias inmunoestimulantes están siendo obtenidas a partir de varias fuentes naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de diferentes bacterias, hongos, microalgas y macroalgas. Los principales principios activos de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son: fragmentos de peptidoglucanos (PGs), lipopolisácaridos (LPS), lipopéptidos, polisácaridos sulfatados, β – glucanos, acil – oligopéptidos y péptidos bacterianos específicos (revisión de Song y Huang, 2000, En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
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Además de la publicación mencionada anteriormente Cheng – Fang, C. (1999) realizó un ensayo donde se hizo una infección con WSSV en camarones que fueron
inmunoestimulados con β-1,3-glucano por 20 días y obtuvieron supervivencias del 20% y 12% en juveniles y postlarvas respectivamente, al sexto día de infección a diferencia del control que llegó con supervivencia de 0% al cuarto día de infección.
Los peptidoglucanos derivados de Bifidobacterium thermophilum, también mejoran la actividad fagocítica de los hemocitos granulosos en animales desafiados experimentalmente con WSSV, incrementando la resistencia y supervivencia de los animales al virus. (Itami, T, 1998a). En camarones desafiados con el Vibrio penaeicida, que es un patógeno altamente virulento en los camarones. La tasa de supervivencia fue significativamente mayor que los animales dispuestos para control. Confirmando el refuerzo sobre el mecanismo de defensa a través de la administración de peptidoglicanos, aumentando la actividad fagocítica de los granulocitos y aumenta la resistencia a las enfermedades. (Itami, T. 1998b)
Una forma de evaluar la eficacia de inmunoestimulantes y otras moléculas inmunomoduladoras, además de la supervivencia, sería mediante la cuantificación de parámetros inmunitarios. Estudios sobre parámetros celulares y humorales, tales como generación de radicales de oxígeno, actividad fenoloxidasa, hemoaglutinación, etc. se están realizando como indicadores de salud. (Rodríguez, J. y Le Moullac, G. 2000).
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2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan®)
Aqua Vac. Ergosan® es un inmunomodulador basado en alginatos extraídos de algas marinas. Los ingredientes, incluidos los alginatos y polisacáridos, fortalecen el sistema natural de defensa en camarones. Es un producto completamente natural y como tal es un ingrediente aceptado en los alimentos. Los inmunomoduladores o inmunoestimulantes pueden jugar un papel importante en la acuicultura, su uso incluye la mejora de la respuesta inmune ante un amplio rango de agentes patógenos y al mismo tiempo el fortalecimiento en animales con un sistema débil o en desarrollo (ejemplo: larvas de camarón).
Los ingredientes activos del ERGOSAN® son los alginatos – polisacáridos derivados
de macroalgas y microalgas Laminaria digitata (99%) y Ascofillum nodosum (1%). (Schering – Plough Animal Health, Aquaculture)
Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. - ERGOSAN®. (Schering – Plough Animal
Health, Aquaculture)
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proteger contra el desarrollo de enfermedades. Existen investigaciones en la actualidad que tienen como objeto evaluar el uso potencial de alginatos, como un suplemento dietético para estabilizar la salud normal del animal, o el alivio de ciertas enfermedades. (Brownlee, I. A. 2005).
Se ha demostrado que estos polisacáridos mejoran la transferencia de oxígeno a través de la membrana celular y aumenta la actividad metabólica de las mismas, lo que influye sobre la resistencia a la infección por patógenos y a una mejor reparación de tejidos dañados a causa de estas enfermedades. (Nüssler y Thompson, 1992). En el caso de los crustáceos en el estudio realizado por Cheng W. (2005) se evaluó el recuento de hemocitos, la actividad fagocítica, entre otros parámetros inmunitarios en camarón blanco Litopenaeus vannamei alimentados con una dieta a base de alginatos por cinco meses y su reacción frente a la infección con Vibrio alginolyticus. En esta investigación se obtuvo que la supervivencia de los camarones alimentados con la dieta que contenía alginatos aumentó significativamente, en comparación con la de camarones alimentados con la dieta control. Se concluyó que la administración de alginato de sodio en la dieta puede mejorar la capacidad inmune de L. vannamei y aumentar su resistencia a la infección por V. alginolyticus.
2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés – polymerase chain reaction)
Esta reacción es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN, que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza para la detección genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN y ARN) y bacterias, en muestras de camarones o de organismos relacionados. El principio de la PCR consiste en determinar la secuencia de interés y seleccionar
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las cadenas que flaquean a dicha secuencia, a partir de los cuales se inicia la elongación.
En esta técnica se consideran importantes los siguientes parámetros: un suministro abundante de iniciadores y de deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs); una fuente renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los ciclos periódicos de cambios de temperatura.
La reacción tiene lugar en tres fases:
1) Desnaturalización: el fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90 a 95°C durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas.
2) Anillaje: la temperatura de la mezcla se baja hasta 55°C durante 20 segundos para que los cebadores se enlacen con el ADN escindido.
3) Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. (Morales V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008)
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3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema
La Industria del cultivo de camarón en el mundo y en América Latina ha surgido como una de las fuentes de mayor generación de divisas, con lo que en el transcurso de los años ha generado altos niveles de producción y grandes ganancias. Sin embargo, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta esta industria es a la presencia de enfermedades infecciosas. En la década de los 90’, hubo una reducción
dramática en la producción del camarón de cultivo debido principalmente a enfermedades de origen viral, causando altas tasas de mortalidad (hasta del 100%). El Síndrome de la Mancha Blanca provocado por el WSSV (White Spot Syndrome Virus, por sus siglas en inglés), luego de su aparición en los años 98 y 99, se ha convertido en una de las enfermedades virales más devastadoras para el camarón de cultivo, afectando la producción y dando como resultado el cierre de empresas y la pérdida de muchos empleos.
Durante los brotes de la enfermedad se producen altos episodios de estrés en el camarón debilitando su mecanismo de defensa. Parte esencial de la inmunidad es el estado de alerta por el cual un organismo puede detectar moléculas extrañas; un buen sistema de reconocimiento es lo ideal para expulsión adecuada del virus. Cuando existen fallas en dichas funciones se afectan las actividades de diferenciación y eliminación de patógenos en el animal; comprometiéndose así su salud y estabilidad generando mortalidades en los camarones infectados y por ende grandes pérdidas a nivel económico.
3.2 Justificación
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estrategias para el control de la enfermedad han sido directamente enfocadas en la mejora de la salud animal con el fin de prevenir infecciones por el virus.
Es importante resaltar que al momento de enfrentarnos con problemas virales hay escases en cuanto a la aplicación de tratamientos, como lo son los antibióticos cuando la infección es bacteriana, por tal razón en estos casos el interés está encaminado hacia una prevención antes de que se presenten brotes de la enfermedad. Una nueva alternativa para ello es la inmunoestimulación. En años recientes, los inmunoestimulantes han sido usados para aumentar la resistencia de camarones contra infecciones virales. Las sustancias inmunoestimulantes tienen la cualidad de alertar el sistema inmune no especifico, desarrollando así una mejor respuesta ante posibles microorganismos patógenos.
52
La sostenibilidad de la producción del camarón radica en un buen control y manejo de las enfermedades que se presentan en los cultivos. Dentro de la búsqueda de programas de prevención y estrategias innovadoras, se han intensificado investigaciones en distintas ramas del conocimiento científico, la aplicación de conocimientos fundamentales en inmunología de crustáceos ha permitido elaborar medidas profilácticas inmunomodulatorias, (Rodríguez J. y Cedeño R., 2000) obteniendo resultados favorables que han ayudado a atenuar las consecuencias causadas por la infección del virus WSSV en camarones.
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4. OBJETIVOS 4.1 General
Evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN® en el fortalecimiento de sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV).
4.2 Específicos
1. Determinar la tasa promedio de supervivencia en los camarones del tratamiento con Ergosan® y del Control luego de ser infectados con el virus WSSV y buscar diferencias significativas en estos resultados mediante las pruebas de ANOVA y Duncan.
2. Establecer a partir de un conteo diferencial de hemocitos, si existe un aumento en la proliferación de los mismos, en camarones alimentados con la dieta Ergosan® respecto a la dieta Control.
3. Identificar mediante un examen clínico los camarones infectados y moribundos por acuario (con el virus WSSV), seleccionados por presentar manifestaciones propias de la enfermedad.
4. Determinar el efecto citopático causado por el virus WSSV en las células blanco de camarones infectados y moribundos, a partir de cortes histológicos procesados mediante inclusión en parafina y teñidos con Hematoxilina y Eosina
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6. Valorar de forma semicuantitativa la presencia del virus (WSSV) por inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) en muestras de camarones (L. vannamei) muertos luego de la infección.
7. Cumplir los postulados de Koch a partir del aislamiento e identificación molecular del virus WSSV en camarones sanos, infectados artificialmente con este virus y en los cuales se logre reproducir la enfermedad con todos sus signos clínicos característicos, aislando de nuevo en éstos al agente etiológico (WSSV).
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5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Descripción del área de trabajo
El proyecto se llevó a cabo en la sala de Infección Experimental de la empresa Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO), ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito de Natá, Provincia de Coclé, República de Panamá. La sala está distribuida en dos áreas: una Sala de No – infección y una Sala de infección. El montaje del experimento se distribuyó dependiendo del tipo de actividad realizada.
Figura 12:Vista frontal de la “Casa de Don Popo” donde se encuentra la Sala de Bioensayos.
5.2 Población analizada
Los animales utilizados en el experimento eran procedentes del Centro de Producción
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De manera complementaria, se dispuso una población de camarones para la realización de hemogramas, con el objeto de determinar el posible efecto del producto comercial ERGOSAN® sobre el conteo total y diferencial de los hemocitos y su eventual relación con la supervivencia de los camarones luego de la infección con el virus WSSV.
Se tomó una muestra al azar de los camarones que se utilizaron para el ensayo, esto con el fin de detectar WSSV, virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética (IHHNV) y la bacteria intracelular causante de la hepatopancreatitis necrotizante (NHP), todas mediante la prueba de nested-PCR. (ANEXO 1) Con lo anterior, se buscó descartar la presencia de estos patógenos y que en un futuro pudieran interferir en los resultados de la investigación. Los análisis moleculares se realizaron en UNICAM. Ninguno de los tres patógenos fue detectado en ninguna de las muestras examinadas para este estudio.
5.3 Fases experimentales
Las actividades de este ensayo se realizaron básicamente en cinco fases. La primera estuvo determinada por la preparación de los distintos materiales y las pruebas de laboratorio previas al experimento. La segunda fase consistió en la transferencia y siembra de los camarones en los acuarios. Luego de ello se suministró por diez días una dieta experimental a base del producto (ERGOSAN®), correspondiente a la fase tres. En la fase cuatro se realizó la preparación de la papilla infectiva y posteriormente la infección per os de los camarones con el virus WSSV. Por último en la fase cinco se llevaron a cabo, el registro de las mortalidades en cada uno de los acuarios y las pruebas de laboratorio confirmatorias posteriores a la infección experimental.
