Pruebas confirmatorias del virus WSSV

Para corroborar que la alta mortalidad presentada en los acuarios infectados corresponde a la infección por el virus WSSV, se realizaron tres tipos de análisis que ratificaron la presencia del mismo y su efecto sobre los tejidos del camarón. Para los tres casos se obtuvieron los resultados esperados, cada una de estas técnicas mostró como positiva la presencia del virus.

6.3.1 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)

De forma inmediata, al momento de la recolección de muestras para la confirmación de la presencia del virus en los camarones moribundos que presentaron uno o más signos de esta enfermedad, se les realizó una prueba de inmunocromatografía en la

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sala de bioensayos. Esta técnica logró corroborar en primera instancia el diagnóstico presuntivo de la enfermedad causada por el virus WSSV. Luego de procesadas las 20 muestras estas arrojaron como resultado positivo a WSSV en todos los casos sometidos a confirmación. (ANEXO 11)

Figura 39: (A) Fotografía que indica resultados positivos para el virus WSSV mediante la Prueba de Shrimple®_{. (B) Zona C y Zona T con bandas color rosa. La muestra corresponde a un camarón}

recolectado de un acuario sometido al tratamiento de la dieta BASE más infección con el virus WSSV (Acu. 16 - CONTINF).

Para las 20 muestras analizadas mediante inmunocromatografía, todos los resultados arrojados fueron positivos. Como la toma de muestras se realizó dentro de las 36 h y las 62 h post-infección, esto favoreció la eficacia del kit (Shrimple®) en cuanto a la detección del virus. Para la interpretación de los resultados se tuvo en cuenta lo descrito por Powel James (2006) y el manual para el uso del kit comercial (EnBioTec Laboratories Co., Ltd.) donde se debe considerar positivo para el virus WSSV cuando

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la prueba da lugar a dos bandas de color rosa en la zona T y C, como se observa en la Figura 39.

En la investigación realizada por Powel, J. (2006), donde se infectaron camarones con el virus WSSV, se determinó el rango de sensibilidad en la que el kit de diagnóstico es capaz de detectar el virus y el rendimiento del mismo en comparación con las técnicas de PCR convencional y Real Time – PCR. Dentro de los resultados se obtuvo que los resultados del test de Shrimple® se correlacionan con los arrojados por PCR convencional, en cuanto a los obtenidos por Real Time- PCR está técnica posee una mayor especificidad y sensibilidad en comparación con las otras dos. Aunque mucho menos sensible que la Real Time -PCR, los kits de la prueba de Shrimple® proporcionan una herramienta útil para la detección de la infección causada por el virus WSSV antes el desarrollo de signos graves de la enfermedad aguda (12 horas post – infección) (Powel, J. 2006)

6.3.2 Nested – PCR (Reacción en cadena de la polimerasa anidada)

La Figura 40 revela los resultados obtenidos, luego de procesar las 20 muestras tomadas al momento del registro de mortalidad. Como se observa en la fotografía del gel de agarosa, todas las muestras son positivas, es decir, que el ADN del virus WSSV fue amplificado satisfactoriamente, obteniendo así la debida confirmación. Para la interpretación de los resultados se debe tener en cuenta que todas las muestras que se encuentran en los carriles del 1 al 20 son consideradas como positivas ya que presentan una banda al mismo nivel de la banda observada para el control positivo (C +). En cuanto al control negativo (C-), no se observa ninguna banda lo que indica que no hubo contaminación cruzada entre las muestras y tampoco hubo contaminación de ADN en ninguno de los reactivos utilizados para la PCR. (Morales, M. 2009)

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Figura40: Electroforesis en gel de agarosa que permite la observación de los resultados de la amplificación del ADN viral mediante nested-PCR para cada una de las muestras procesadas. Los controles están definidos de la siguiente forma: CP, control sin DNA (control negativo de PCR); CE, control sin DNA (control negativo de extracción); Carriles del 1 al 20 son los productos de PCR. C (-), control negativo y C (+) control positivo.

Estudios realizados por Hossain (2001) y Esparza–Leal (2009) demuestran que para el análisis experimental de la inefectividad del virus sobre el camarón L. vannamei y otras especies de crustáceos, se obtuvieron resultados de mayor sensibilidad utilizando nested–PCR que PCR convencional.

A pesar de que está técnica tiene un alto grado de sensibilidad, existen inconvenientes dentro de los cuales puede estar un elevado costo, requiere de personal y equipos altamente especializados y, en ocasiones pueden existir inhibiciones y contaminaciones que pueden dar resultados falsos positivos. Por lo anterior, se debe tener conocimiento de la existencia de otras pruebas que nos permitan detectar la presencia del virus.

6.3.3 Histopatología

Está técnica a parte de que nos confirmó la presencia del virus en las 20 muestras analizadas, también nos permitió observar el daño que genera la infección del

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patógeno viral sobre los tejidos del camarón. Las láminas con los cortes histológicos fueron observadas y analizadas bajo en microscopio (400X y 600X) por el director de la Tesis, Dr. Jorge Cuéllar–Anjel, Patólogo Veterinario especialista en organismos acuáticos. Para esta prueba todos los resultados fueron positivos, donde se encontraron hallazgos relacionados con el virus WSSV, clasificados dependiendo el grado de severidad 0 – 4, siendo el 4 el más severo. (ANEXO 13)

Tabla 12: Hallazgos relacionados con la infección del virus WSSV en láminas histológicas

No. muestra No. Acu Tratamiento VAC WSSV

1 5 ERGINF 1 4 2 2 ERGINF 1 3 3 14 CONTINF 2 3 4 9 ERGINF 3 4 5 7 ERGINF 3 4 6 11 CONTINF 3 3 7 1 ERGINF 4 4 8 8 ERGINF 1 4 9 18 CONTINF 3 4 10 12 CONTINF 1 4 11 13 CONTINF 3 4 12 10 ERGINF 0 4 13 15 CONTINF 2 4 14 20 CONTINF 3 4 15 4 ERGINF 2 3 16 6 ERGINF 3 4 17 3 ERGINF 1 4 18 17 CONTINF 2 4 19 16 CONTINF 2 3 20 19 CONTINF 2 1

VAC= nivel de vacuolas lipidícas en HP WSSV= Lesiones causadas por el virus WSSV HP= hepatopáncreas

0 - 4 = clasificación de grados de severidad siendo el 4 lo más severo

Como se observa en la Tabla 12 no hubo diferencias relevantes en la prevalencia de hallazgos causados por el virus WSSV sobre los tejidos de camarones pertenecientes tanto al tratamiento de la dieta con ERGOSAN® como la dieta BASE (control). En general, los organismos infectados por WSSV presentaron cuerpos de inclusión bastante prominentes, de tinción principalmente basofílica, los cuales son

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aproximadamente 2-3 veces más grandes que el tamaño normal del núcleo (forma variable de circular a irregular) y muy numerosos. (Morales V., y Cuellar–

Anjel J., 2008)

Figura 41: Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección del virus WSSV en una de las muestras analizadas, donde se observa los núcleos hipertrofiados y con cuerpos de inclusión basofílicos(600X). Foto cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel.

En todas las muestras analizadas se evidenció lo publicado por la OIE (2000), donde los principales tejidos afectados son de origen ectodermal y mesodermal, en particular el epitelio cuticular y tejidos subcuticulares del estómago, del cefalotórax y de las branquias. Como se mencionó con anterioridad, estos presentan células con núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas centrales rodeadas de cromatina.

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Figura 42: Microfotografía de láminas histológicas observadas bajo el microscopio (600X). A. Epitelio cuticular que presenta células con núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas. B. Epitelio subcuticular de las branquias, donde se observan los cuerpos de inclusión característicos para la enfermedad por WSSV. Fotos cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel.

Estudios realizados por Yoganandhan (2003) donde se evaluó detección temprana en tejidos afectados por WSSV en camarones L. linicus mediante los métodos de diagnóstico histopatología y PCR, permitieron determinar su sensibilidad para la detección temprana de este virus y al igual que el bioensayo del que es objeto el presente trabajo, las observaciones histopatológicas revelaron la presencia de cuerpos de inclusión intracelulares en branquias, tejido blando, apéndice y tejido conectivo después de 36 horas post – infección. El análisis mediante PCR en dicho estudio reveló que el virus pudo ser detectado a las 6 horas post – infección en muestras de hemolinfa y a las 12 horas post- infección en el resto de los órganos analizados. Lo anterior, indica que la técnica molecular es de mayor sensibilidad pero cabe resaltar que las dos técnicas utilizadas permiten la detección temprana del virus, sirviendo como herramienta útil antes de que se alcancen mortalidades significativas en los estanques de cultivo.

La ventaja de la histopatología es que nos permite observar detalladamente los cambios a nivel celular que puede producir la infección del virus WSSV, es decir, que esta técnica puede ser de tipo cualitativa.

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