AREA DE PRODUCCION AGRICOLA
Proyecto núm. SC94-071
ETIOLOGIA, EPIDEMIOLOGIA Y CONTROL DE VIROSIS EN CUCURBITACEAS
Equipo Investigador Aragón
Marisol-Paz Luis Arteaga (Dra. I.A.);
José María Alvarez Alvarez (Dr. I.A.).
Cataluña
M.ª Asunción Battle Durany (Dra. C.B.);
Amparo Laviña Gomila (I.T.A.);
Enrique Moriones Alonso (Dr. I.A.).
Universidad Politécnica de Madrid
Fernando García-Arenal Rodríguez (Dr. I.A.);
Juan José Bernal Muñoz (Dr. C.B.).
Equivalente de jornada completa: 2,60
Centro de Investigación
Servicio de Investigación Agroalimentaria. (SIA). Aragón.
Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentaries. (IRTA). Cataluña.
Universidad Politécnica de Madrid
Duración: Enero, 1994 - Diciembre, 1996.
Coste: Miles de pesetas: 21.191 Financiación INIA: 100%
P LANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
Las cucurbitáceas se ven afectadas con fre- cuencia por enfermedades virales que, normal- mente, inducen síntomas en hojas y frutos y cau- san pérdidas de producción. Se conocen más de 50 virus que infectan a especies de cucurbitáceas en todo el mundo. Diez de estos virus se han des- crito como enfermedades graves y causa de pérdi- das económicas importantes en diferentes paises, entre ellos los de la cuenca Mediterránea. La infor- mación disponible hasta el momento en España indica que, en condiciones naturales, las cucurbitá- ceas pueden presentar infecciones por los siguien- tes virus: mosaico del pepino (CMV), mosaico de la sandía (WMV-2), mosaico amarillo del calabacín (ZYMV), manchas anulares de la papaya-cepa sandía (PRSV-w), mosaico de la calabaza (SqMV), manchas necróticas del melón (MNSV), y ciertos amarilleos transmitidos por mosca blanca causa- dos por diferentes closterovirus. Los datos disponi- bles son limitados y corresponden a estudios loca- les, dificilmente generalizables a las principales zonas de cultivo.
Entre las cucurbitáceas, el melón es uno de los cultivos hortícolas más importantes tanto a nivel mundial como nacional. Los datos del Ministerio de Agricultura del año 1993 indican que, tras el tomate, es el cultivo hortícola que ocupa una mayor superficie (50.514 ha), siendo el tercero en cuanto a producción (852.826 t) y a ingresos origi- nados (30.607.000 pta). El melón es, por tanto, un cultivo clave en la agricultura española. En muchas de las zonas de producción se desconoce la situación de las enfermedades producidas por virus en este cultivo.
Cualquier programa de control de las enferme- dades virales del melón debe basarse en un cono- cimiento de su etiología en las diferentes zonas, así como de la frecuencia de todos y cada uno de los virus implicados y su epidemiología.. Además
es necesario conocer la estructura poblacional de los virus implicados en las epidemias, con el fin de buscar estrategias de control basadas en la incor- poración de resistencias en los cultivares comer- ciales.
Dada la importancia del cultivo del melón en España, dado que las enfermedades de etiología viral representan un problema para dicho cultivo y dada la inexistencia de información respecto a zonas donde dicho cultivo es importante, se planteó este proyecto con el fin de adquirir un conocimiento global y actualizado de la situación de las virosis en melón cultivado al aire libre. Por otro lado, era nece- sario continuar los trabajos iniciados en el Servicio de Investigación Agraria de Zaragoza referentes a búsqueda de resistencias a virus en material autóc- tono español, y a introducción de las resistencias conocidas a CMV (en PI 161375, Freeman’s
‘cucumber’, ‘Mitangcheng’ y ‘Shirourinigo’) y a ZYMV (en PI 414723) en material autóctono.
El problema se ha abordado con la participación de tres equipos de investigación (Cataluña, Madrid y Zaragoza) y con los siguientes objetivos:
A. Estudio de la distribución en España de las principales virosis del melón cultivado al aire libre.
B. Estudio de la epidemiología de las virosis en melón .
C. Obtención de una colección de aislados de los diferentes virus y caracterización biológi- ca de los mismos.
D. Estudio de la variabilidad genética de los principales virus encontrados.
E. Búsqueda de resistencia a enfermedades producidas por virus en una colección de material autóctono de melón.
F. Inicio de la introducción de resistencia a los virus CMV, ZYMV y MNSV en cultivares autóctonos.
R ESULTADOS
A) ESTUDIO DE LA DISTRIBUCION EN ESPAÑA DE LAS PRINCIPALES VIROSIS QUE AFECTAN AL CULTIVO DEL MELÓN
Se realizaron muestreos en las provincias de Barcelona, Valencia, Murcia, Zaragoza,
Navarra, La Rioja, Madrid, Ciudad Real, Bada- joz y Sevilla durante los años 1995 y 1996.
Estas provincias incluyen las de mayor superfi- cie de cultivo de melón al aire libre, y represen- tan condiciones climáticas y de cultivo distintas.
Para poder comparar los datos se muestreó siempre en estado de primer fruto cuajado.
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Los virus con mayor incidencia en todas las zonas fueron CMV y WMV-2. ZYMV aparece sobre todo en la costa mediterrá- nea y PRSV-W en el centro y el oeste. La incidencia de virosis en este estado del cul- tivo es mayor en la costa mediterránea que en el interior. A pesar de diferencias de inci- dencia de cada virus para cada año, se observan tendencias que relacionan su incidencia con características climatológi- cas (suavidad del invierno) y con prácticas de cultivo (uso o no de túneles de semifor- zado).
En la Tabla 1 se resumen los resultados obtenidos de incidencia de los virus CMV, WMV-2, ZYMV y PRSV-W en cultivos de melón de diez zonas españolas.
B) ESTUDIO DE LA EPIDEMIOLOGIA DE LAS VIROSIS DEL MELON
Se ha estudiado la evolución temporal, espacial y espacio-temporal de las epide- mias causadas por CMV, WMV-2, ZYMV y PRSV-W en parcelas de las provincias de Madrid, Zaragoza y Barcelona. En todos los casos se siguió un diseño experimen- tal similar. En una zona elegida al azar en una parcela comercial (Barcelona y Madrid) o experimental (Zaragoza) se demarcó una subparcela de 500 plantas.
En esta se mapeó la posición de cada planta y se observó la aparición de sínto- mas virales a intervalos de 8-10 dias durante el desarrollo del cultivo. La natu- raleza del agente inductor de los sínto- mas observados se analizó inmunologica- mente usando antisueros comerciales.
Los datos obtenidos se utilizaron para realizar los siguientes análisis epidemio- lógicos :
a) Análisis temporal
Los datos se ajustaron a los modelos de evolución temporal denominados monomo- lecular, logístico, de Gompertz y de Wei- bull. La mayor parte de las epidemias ana- lizadas se ajustaba bien a este último modelo, que se eligió para la comparación de las curvas de progreso de la enferme- dad.
Esta comparación se realizó por un análi- sis de componentes principales, que tras la reducción de variables redundantes o corre- laccionadas quedó reducido a tres ejes de un peso similar que representan un factor de gravedad (que indica la incidencia a que se llega), un factor de posición (que indica como de temprana es la epidemia respecto al ciclo del cultivo) y un factor de forma (que indica como de rápido se alcanzan inciden- cias altas).
Las epidemias no se agrupan según el virus en cuestión y sólo parcialmente según la localidad o el año, lo que sugiere un papel importante en el desarrollo de la epidemia de factores ambientales.
Un análisis de regresión lineal múltiple indica, en efecto, que la incidencia máxi- ma de las epidemias de CMV está positi- vamente correlacionada con las tempera- turas del periodo invernal. Por el contrario, la incidencia de WMV-2 depende de las temperaturas y lluvias de primavera. Las correlaciones no son suficientemente bue- nas como para establecer un modelo pre- dictivo con valor aplicado. Sin embargo estos datos son de interés pues indican que distintas especies de vectores con distinta ecología son los responsables de las epidemias inducidas por estos dos virus.
b) Análisis espacial y espacio temporal Se han utilizado los métodos denomina- dos análisis de las clases de dos dimensio- nes (2DCLASS) y análisis de focos, y el aná- lisis espacio-temporal derivado del primer método.
Los resultados obtenidos indican que la mayoría de las epidemias analizadas (12 de 18) se explican por un solo aporte inicial de inóculo externo, y dispersión secundaria a partir de los focos iniciales, lo cual es de rele- vancia para el establecimiento de estrategias de control.
Además, el análisis espacial y espacio temporal indica modelos de distribución dis- tintos para las epidemias debidas a CMV y WMV-2, lo que apoya los resultados del aná- lisis temporal que señalaban distintos vecto- res para estos dos virus.
Tabla 1 Incidencia de CMV, WMV-2, PRSV y ZYMV en distintas zonas de cultivo de melón ND: No determminado. Incidencia viral: Valor medio de la incidencia de las parcelas prospectadas, estimada mediante la relación entre el número de plantas sintomáticas encontradas y el total observado.
AñoRegiónProvinciaN.°deN.°plantasN.°muestrasN.°de muestras positivas paraIncidencia parcelasobservadassintomáticasCNVWMV-2PRSV-WZYMVviral 19951Barcelona31.5008585 (100%)0006% 2Valencia41.00010629 (27%)59 (56%)2 (2%)5 (5%)11% 3Murcia71.1006517 (26%)28 (43%)5 (8%)8 (12%)<1% 4Zaragoza15908989 (100%)00015% 5NavarraNDND9292 (100%)4 (4%)00ND 6La RiojaNDND6027 (45%)53 (45%)00ND 7Madrid15003632 (89%)24 (67%)13 (37%)07% 8Ciudad Real32.7001310 (76%)3 (23%)3 (23%)0<1% 9Sevilla42.00092 (22%)000<1% 10Badajoz32.0009682 (85%)62 (65%)70 (73%)13 (14%)5% 19961Barcelona21.0009430 (32%)52 (55%)07 (7%)10% 2Valencia31.00010376 (74%)16 (15%)0010% 3Murcia81.0009014 (16%)25 (28%)040 (44%)9% 4Zaragoza21.0505251 (98%)1 (2%)005% 5Navarra34453030 (100%)0007% 6La Rioja6660435 (12%)38 (92,7%)006,5% 7Madrid150076 (86%)1 (14%)001,50% 8Ciudad Real51.80080000<1% 9Sevilla42.700130000<1% 10Badajoz42.6001412 (86%)000<1%
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C. OBTENCION DE UNA COLECCION DE AISLADOS DE LOS DIFERENTES VIRUS Y CARACTERIZACION
BIOLOGICA DE LOS MISMOS
Se han obtenido aproximadamente diez aislados de cada uno de los virus encontra- dos en las zonas de muestreos (Barcelona, Valencia, Murcia, Badajoz, Madrid, La Rioja, Navarra y Zaragoza) en los dos años en que se llevaron a cabo prospecciones.
Se ha iniciado la caracterización biológi- ca de los mismos, llevándose a cabo en la Estación Experimental de La Mayora (CSIC-Málaga) para los virus WMV-2, PRSV y ZYMV y en el SIA (Zaragoza) para el CMV. La caracterización se realiza sobre una gama de especies indicadoras específica para cada virus. Los resultados parciales obtenidos hasta ahora, que han de ser continuados en futuros proyectos, indican que existe variabilidad biológica en los aislados de CMV y que todos los carac- terizados pertenecen al Subgrupo I. En los aislados de WMV-2 no se ha encontrado hasta el momento variabilidad biológica, mientras que los aislados del ZYMV pue- den encuadrarse en los tres patotipos des- critos, 0, 1 y 2.
Además, se participó en una reunión inter- nacional (Zucchini Ring-Test) sobre virus de cucurbitáceas organizada como una Acción COST de la Unión Europea y celebrada en el Laboratorio de Virología Aplicada del CNR, Turín (Italia), en Octubre de 1996, con el fin de caracterizar y comparar aislados virales de diferentes orígenes geográficos, biológi- camente sobre especies indicadoras y sero- lógicamente con anticuerpos monoclonales y policlonales, homólogos y heterólogos, y por PCR con iniciadores de CMV, Potyvirus y ZYMV. A ella se aportaron algunos aislados de CMV, ZYMV y WMV-2 obtenidos en dife- rentes zonas por los equipos participantes durante la realización del presente proyecto.
D) ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENETICA DE LOS PRINCIPALES VIRUS ENCONTRADOS
Este apartado ha sido abordado por el equipo de la E.T.S.I. Agrónomos de Madrid, centrándose en CMV.
El análisis de una colección de más de 150 aislados se ha realizado por análisis de protección frente a Rnasa A de sondas que representan 800-1000 nucleótidos de los cuatro marcos de lectura abierta del genoma de estos virus. Todos los aislados analiza- dos pertenecen al Subgrupo I, y dentro de éste se distinguen, para las cuatro sondas utilizadas, dos tipos genéticos claramente definidos.
El análisis muestra que hay recombina- ción y reordenamiento de segmentos genó- micos (pseudorecombinación), lo que pue- de ser de importancia al generar estos mecanismos la aparición de nuevos tipos biológicos. Sin embargo tanto los recombi- nantes como los pseudorrecombinantes parecen tener desventaja biológica respec- to a los tipos originales: su frecuencia en las poblaciones analizadas es baja, y cada nuevo tipo sólo se encuentra en una única población.
E) BUSQUEDA DE FUENTES DE RESISTENCIA EN MATERIAL AUTOCTONO ESPAÑOL
MNSV y ZYMV son virus presentes, sobre melón, en algunas zonas de España, cau- sando el primero importántes pérdidas eco- nómicas en los cultivos protegidos del Sur y Sudeste. MNSV, transmitido por el hongo del suelo Olpidium bornovanus (=Olpidium radi- cale), induce manchas necróticas en las hojas y tallos de melón, y manchas y motea- do interno en frutos. ZYMV, transmitido por áfidos de forma no persistente, provoca mosaico, amarilleo y deformaciones en hojas y agrietado en frutos de melón.
Se ensayaron 36 y 23 cultivares autócto- nos de melón para resistencia a MNSV y ZYMV respectivamente. Se usaron dos ais- lados de ZYMV, M-30-38 perteneciente a patotipo 0 y colectado en Zaragoza, y M-7-85 que pertenece al patotipo 1 y cuyo origen es Almería, y un aislado de MNSV (M-8-85) también procedente de Almería. Cada uno de los aislados virales se inoculó mecáni- camente sobre 10-15 plantas de cada varie- dad, en el estado de dos cotiledones. Se hicieron observaciones de síntomas, locales y sistémicos, cada dos días, durante un mes desde la inoculación.
INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO.
POSIBLES APLICACIONES
El proyecto ha dado lugar a:
— La primera evaluación sistemática y compa- rable de la incidencia de distintas virosis en el cultivo del melón al aire libre en distintas regiones españolas.
— El primer análisis epidemiológico detallado de las epidemias causadas por estos virus en melón. Hay que señalar que análisis de ese grado de detalle se han realizado con muy pocas enfermedades virales en el mundo.
— El análisis epidemiológico realizado nos sitúa cerca de describir un modelo predictivo, lo que unido a que la mayoría de las epidemias se deben a un único aporte inicial de inóculo posibilitaría el planteamiento de estrategias
eficaces de control basadas en el control de los pulgones vectores para evitar el aporte inicial de inóculo.
— El análisis de la variabilidad genética de los virus que infectan un cultivo, y la estima de la posibilidad de implantación de nuevos genotipos, es clave para plantear estrate- gias de control basadas en la resistencia genética.
FORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de José Luis Alonso Prados, titulada “Epidemiolo- gía de las virosis que afectan al cultivo del melón al aire libre en España”, en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universi- dad Politécnica de Madrid. Marzo, 1997. Apto
“cum laude”.
Todos los cultivares inoculados con MNSV aparecieron como susceptibles. La mayoría de los cultivares inoculados con el patotipo 0 de ZYMV resultaron ser susceptibles, pero en dos de ellos, ‘Invierno’ y ‘Común’, sola- mente unas pocas de las plantas inoculadas (20%) mostraron síntomas de virus, y ‘De la Marina’ no mostró ninguna planta con sínto- mas tras la inoculación. Todos los cultivares inoculados con ZYMV patotipo 1 aparecieron como susceptibles, pero es interesante hacer notar que alrededor del 50% de las plantas inoculadas de ‘ANC-13’ no mostra- ron síntomas de virus.
F) INTRODUCCION DE RESISTENCIA EN CULTIVARES AUTOCTONOS Se han obtenido las generaciones F1y F2 del cruzamiento entre la línea ‘Pi 414.723’, resistente a ZYMV, y los cultivares autócto- nos ‘Piel de Sapo’ y ‘Amarillo’, éste descrito como resistente a oidio.
Dado que la resistencia a ZYMV viene conferida por un solo alelo dominante Zym, la F1era toda resistente, y en la generación
F2 se obtuvieron plantas resistentes y sensi- bles en la proporción 3:1. Nos interesaban únicamente aquellas plantas resistentes en la F2homocigóticas para el alelo Zym. Para detectrlas se autofecundaron las plantas de la F2, estudiándose la resistencia a ZYMV de la descendencia de cada planta. Aquellas plantas, pertenecientes a una generación de autofecundación uniforme para resistencia, se pasaron a invernadero y allí fueron retro- cruzadas con ‘Amarillo’ o con ‘Piel de Sapo’.
Este ciclo habrá de repetirse 3 ó 4 veces para obtener una línea comercial con resis- tencia a ZYMV.
También se han obtenido las genera- ciones F1 y F2 de los cruzamientos entre la línea ‘PI 161.375’ que ha sido descrita como resistente a CMV y a MNSV y los cultivares autóctonos ‘Piel de Sapo’ y ‘Amarillo’. La resistencia a CMV en ‘PI 161.375’ ha sido descrita como oligocénica recesiva (se habla de tres genes), y la resistencia a MNSV está controlada por un único gen recesivo (nsv).
Las generaciones F1eran sensibles tanto a CMV como a MNSV. En la generación F2habrá que identificar las plantas resistentes a ambos virus con las que se repetirá el proceso.
PUBLICACIONES
Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios
Batlle A., Laviña A., Moriones E. Epidemiología de virosis en cultivos de melón del Baix Llobregat.
VII Congreso de la Sociedad Española de Fitopa- tología. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
Alonso J.L., Bernal J.J., Fraile A., García-Are- nal F. Epidemiología de las virosis de cultivos de cucurbitáceas en la Comunidad de Madrid. VIII Congreso de la Sociedad Española de Fitopato- logía. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
Alonso J.L., Bernal J.J., Fraile A., García-Arenal F. Epidemiología de las virosis de cultivos de cucurbitáceas en la Comunidad de Madrid. IV Con- greso Nacional de Virología, Madrid (España).
Septiembre 1995.
Moriones E., Batlle A., Luis M., Álvarez J.M., Bernal J.J., Alonso J.L. Studies on the epidemics of
aphid-transmitted viruses infecting melon in Spain for virus control. Xth Int. Congress of Virology.
Jerusalem (Israel). Agosto, 1996.
Moriones E., Luis M., Álvarez J.M., Batlle A., Laviña A., García-Arenal F., Alonso J.L., Bernal J.J., Fraile A. Occurrence and distribution of viru- ses infecting field-grown melon in Spain. VI Eucar- pia Meeting on Cucurbit Genetics and Breeding.
Málaga (España). Mayo, 1996. Ed.: Gómez-Guilla- món: M.L., Soria C., Cuartero J., Torés J.A., Fer- nández-Muñoz R.
Moriones E., Luis M., Álvarez J.M., Batlle A., Laviña A., García-Arenal F., Alonso J.L., Bernal J.J., Fraile A. Distribución, importancia relativa y caracterización de las virosis que afectan a los cul- tivos de melón realizados al aire libre. Resúmenes VIII Congreso Nacional Soc. Esp. Fitopatología.
Córdoba (España). Septiembre, 1996.
Alonso-Prados J.L., Bernal J.J., Luis Arteaga M., Moriones E., Fraile A., García-Arenal F. Epidemio- logía de las virosis que afectan al cultivo de melón en España. Resúmenes VIII Congreso Nacional Soc. Esp. Fitopatología. Córdoba (España). Sep- tiembre, 1996.
