ADITIVO DE LEVADURAS DE MANZANA PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL

ADITIVO DE LEVADURAS DE MANZANA PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL

Por:

D. Ph. Daniel Díaz Plascencia.

D. Ph. Carlos Rodríguez Muela.

D. Ph. Pablo Fidel mancillas Flores.

Facultad de Zootecnia y Ecología

Universidad Autonoma de Chihuahua, México.

[email protected] www.lebas.com.mx

Noviembre de 2013

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RESUMEN GENERAL

Esta investigación consta de seis experimentos, cuyo objetivo fue la evaluación y desarrollo de diferentes sustratos, y cepas de levaduras autóctonas obtenidas de la fermentación de subproductos de manzana, para elaborar un aditivo de levaduras vivas y activas para ser usado de manera segura en la alimentación animal. El primer trabajo consistió en el desarrollo de un aditivo de levaduras, empleando oxigenadores en medios líquidos para evaluar ocho tratamientos, utilizando diferentes niveles de manzana molida y melaza de caña como sustratos, y dos cepas de levaduras obtenidas de la fruta de la manzana. El segundo trabajo consistió en evaluar el comportamiento fermentativo in vitro de ocho cepas de levaduras aisladas de subproductos de manzana, tomando como base los resultados del primer estudio. Dichas levaduras fueron identificadas a través de la amplificación del ADNr 18S mediante la reacción en cadena a la polimerasa (PCR), para luego ser multiplicadas a escala mediante la fermentación sólida sumergida (FSS). El tercer trabajo consistió en determinar el nivel óptimo a utilizar del aditivo en dietas para vacas lecheras. En el cuarto trabajo se evaluó el efecto del aditivo de levaduras y bagazo de manzana (BMZN) en la dieta de becerros Angus en crecimiento sobre el comportamiento productivo y sistema inmune. El quinto trabajo consistió en evaluar el efecto en la fermentación in vitro de dietas con la adición del aditivo y BMZN. El sexto trabajo consistió en evaluar el efecto en la fermentación in vitro de dietas para becerros en crecimiento adicionadas con cuatro cepas de levadura. Cabe destacar que en la actualidad no hay un aditivo líquido de levaduras en México para ser usado en la ganadería, por lo que nos consideramos pioneros en esta area. La importancia de los cultivos vivos de levaduras es por que producen enzimas, vitaminas del complejo B, minerales y diversos tipos de aminoácidos y como consecuencia, estimulan la absorción de nutrientes creando un ambiente intestinal saludable y mejorando el sistema inmune. Por otra parte, los minerales traza tales como el Zinc, Cobre y Manganeso son elementos que juegan un papel importante en varias funciones

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corporales, necesarias para mantener una salud óptima y por lo tanto son nutrientes esenciales para todos los animales, ejercen su efecto sobre un correcto crecimiento, reproducción, rutas de secreción hormonal y respuesta inmune. Del mismo modo, los antioxidantes pueden formar parte de enzimas que directa o indirectamente protegen a las células contra los efectos adversos de numerosas drogas y sustancias carcinogénicas. La adición de antioxidantes en la dieta de animales domésticos mejora la respuesta inmune y disminuye el estrés oxidativo, generando una mayor resistencia a enfermedades infecciosas y degenerativas. Este aditivo levaduras está enfocado principalmente en la reducción del uso indiscriminado de antibióticos en la producción animal, formando parte de los probióticos, prebióticos y simbióticos que se perfilan como las opciones más destacadas respecto de la utilización de antibióticos en animales y como una solución promotora de la calidad y de la seguridad alimentaria, actuando de manera directa en el sistema inmunológico del animal que lo consume, reduciendo de esta manera la frecuencia del uso de antibióticos a largo plazo.

4 CONTENIDO

Página

RESUMEN GENERAL……….. 2

LISTA DE CUADROS………... 10

LISTA DE GRÁFICAS……….. 12

LISTA DE FIGURAS………. 13

LISTA DE ABREVIACIONES……….. 14

INTRODUCCIÓN GENERAL………... 15

REVISIÓN DE LITERATURA……….. 17

Producción de manzarina………. 17

Fermentación de Manzana………... 17

La Manzarina en la Alimentación Animal………... 18

Fermentación Sólida……….. 19

Fermentación Semi-Sólida……… 21

Fermentación Líquida……… 22

Principales Características de las Levaduras……… 23

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae……….. 23

Fermentación en Estado Sólido Comparada con la Fermentación Sólida Sumergida…….. 23

Optimización de Medios de Cultivo………. 24

La Manzarina en la Alimentación Animal……….. 25

Uso de Levaduras en la Nutrición Animal……….. 25

Cultivos de Levadura en la Fermentación Ruminal……….. 27

5

Página

Temperatura Ambiental Sobre el Comportamiento Productivo……….. 28

Alimento Funcional………. 29

Producto Nutracéutico………... 29

Probióticos en la Alimentación Animal……… 30

Mecanismos de Acción de las Levaduras en el Rumen……….. 31

Función de la Pared Celular de Levaduras en el Sistema Inmune……… 31

Función de los Microminerales en el Sistema Inmune……… 32

Zinc……… 33

Manganeso……….. 34

Cobre……… 34

Actividad Antioxidante………... 36

Biometría Hemática en Rumiantes……….. 37

Digestibilidad y Fermentación de los Alimentos en el Rumen……… 38

Producción de Gas y Perfiles de AGV en el Rumen……… 39

ESTUDIO I. DESARROLLO DE UN INOCULANTE A PARTIR DE DOS SUSTRATOS MEDIANTE FERMENTACIÓN SÓLIDA SUMERGIDA………. 40

RESUMEN……….. 41

MATERIALES Y MÉTODOS……… 43

Localización del Área de Trabajo……… 43

Material y Equipo Experimental………... 43

Tratamientos………... 43

Variables Medidas……….. 46

6

Página

Análisis Estadístico……… 50

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 52

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 58

ESTUDIO II. COMPORTAMIENTO FERMENTATIVO DE OCHO CEPAS DE LEVADURAS AISLADAS DE SUBPRODUCTOS DE MANZANA……… 59

RESUMEN……….. 60

MATERIALES Y MÉTODOS……… 61

Localización del Área de Trabajo……… 61

Material y Equipo Experimental………... 61

Material Biológico y Medios de Cultivo………... 61

Preparación de Inóculos……… 62

Tratamientos………... 62

Variables Medidas……….. 63

Análisis Estadístico……… 66

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 67

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 73

ESTUDIO III. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN IN VITRO DE RACIONES PARA VACAS HOLSTEIN ALTAS PRODUCTORAS……… 74

RESUMEN……….. 75

MATERIALES Y MÉTODOS……… 77

Localización del Área de Trabajo……… 77

Material y Equipo Experimental………... 77

7

Página

Preparación del Aditivo………. 77

Tratamientos………... 78

Variables Medidas……….. 81

Análisis Estadístico……… 83

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 84

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 94

ESTUDIO IV. INÓCULO DE LEVADURAS Y BAGAZO DE MANZANA FERMENTADO EN LA DIETA DE BECERROS ANGUS EN CRECIMIENTO SOBRE EL COMPORTAMIENTO PRODUCTIVO Y SISTEMA INMUNE……….. 95 RESUMEN……….. 96

MATERIALES Y MÉTODOS……… 97

Localización del Área de Estudio……… 97

Descripción de los Animales y Tratamientos………. 97

Material Biológico………... 99

Manejo de los Animales……… 100

Toma de Muestras………. 101

Análisis Estadístico……… 105

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 106

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 125

ESTUDIO V. FERMENTACIÓN IN VITRO DE DIETAS CON UN INÓCULO DE LEVADURAS Y DE BAGAZO DE MANZANA FERMENTADO PARA BECERROS EN CRECIMIENTO……….. 126

RESUMEN……….. 127

MATERIALES Y MÉTODOS………... 129

8

Página

Localización del Área de Estudio……… 129

Descripción de los Tratamientos………. 129

Análisis Químico de las Dietas………. 129

Digestibilidad in vitro de la MS, FDN, FDA y el Contenido de LDA de la Dieta………... 130

Obtención del Líquido Ruminal……… 131

Producción de Gas in vitro……… 131

Producción y Perfiles de AGV……….. 133

Nitrógeno Amoniacal (N-NH3)……….. 133

Ácido Láctico………... 134

Análisis Estadístico……… 135

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 137

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 151

ESTUDIO VI. FERMENTACIÓN IN VITRO DE DIETAS PARA BECERROS EN CRECIMIENTO ADICIONADAS CON CUATRO CEPAS DE LEVADURAS………. 152

RESUMEN……….. 153

MATERIALES Y MÉTODOS……… 155

Localización del Área de Estudio……… 155

Descripción de los Tratamientos………. 155

Análisis Químico de las Dietas………. 157

Digestibilidad in vitro de la MS, FDN, FDA y el Contenido de LDA de la Dieta………... 157

Obtención del Líquido Ruminal……… 158

Producción de Gas in vitro……… 158

9

Página

Producción y Perfiles de AGV……….. 158

Nitrógeno Amoniacal (N-NH3)……….. 159

Ácido Láctico………... 159

Análisis Estadístico……… 159

RESULTADOS Y DISCUSIÓN……… 161

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……… 175

FOTOGRAFÍAS………. 176

LITERATURA CITADA………. 189

10

LISTA DE CUADROS

Cuadro Página

1 Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la

Levadura A………. 44

2 Diseño de tratamientos con dos sustratos y diferentes combinaciones con la

Levadura D………. 45

3 Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura A….. 56 4 Medias (± EE) en la comparación de los diferentes sustratos con la levadura D….. 57 5 Medias (± EE) del comportamiento fermentativo in vitro entre tratamientos de

ocho cepas de levaduras………. 70

6 Medias (± EE) de producción de gas entre cepas de levaduras durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS)………. 72 7 Contenido y análisis calculado de la dieta para vacas Holstein altas productoras

con producción esperada de 35 L de leche vaca/d utilizada en el experimento…… 79 8 Diseño de tratamientos con diferentes niveles de inóculo………. 80 9 Medias (± EE) del comportamiento fermentativo entre tratamientos (t) durante la

fermentación in vitro………. 88

10 Medias (± EE) del comportamiento en la producción de gas entre tratamientos (t) durante la fermentación ruminal in vitro (PG en mL/0.2g MS)……….. 90 11 Medias (± EE) del comportamiento en la producción de AGV´s entre tratamientos

(t) durante la fermentación in vitro……… 93 12 Composición del alimento concentrado por tratamiento………. 98 13 Temperatura ambiental promedio registrada durante el experimento…………. 107 14 Medias (± EE) del comportamiento productivo de becerros alimentados con tres

dietas diferentes………

108

15 Medias (± EE) de la concentración de zinc (μmol/L) en suero sanguíneo de

becerros alimentados con tres dietas diferentes………. 111

11

Cuadro Página

16 Medias (± EE) de la concentración de manganeso (μmol/L) en suero

sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes……… 113 17 Medias (± EE) de la concentración de cobre (μmol/L) en suero sanguíneo de

becerros alimentados con tres dietas diferentes……….. 115 18 Medias (± EE) de la actividad antioxidante (μmol/L FeSO4)² en plasma

sanguíneo de becerros alimentados con tres dietas diferentes………

118

19 Medias (± EE)² de células blancas de biometría hemática de becerros

alimentados con tres dietas diferentes……….. 120 20 Medias (± EE)² de células rojas de biometría hemática de becerros

alimentados con tres dietas diferentes……….. 121 21 Medias (± EE) de la digestibilidad in vitro de las fracciones de la fibra de dietas

conteniendo bagazo de manzana fermentado y un inóculo de levaduras………….. 138 22 Parámetros de la degradabilidad ruminal de MS de tres dietas diferentes…………. 143 23 Comportamiento en la producción y perfiles de AGV entre tratamientos durante la

fermentación in vitro………. 146

24 Medias (± EE) del comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y

pH de tratamientos durante la fermentación in vitro……… 149 25 Diseño de tratamientos para la preparación de los inóculos con las cuatro cepas

de levaduras……….. 156

26 Digestibilidad in vitro de las fracciones de las fibras entre tratamientos……….. 162 27 Parámetros de la digestibilidad ruminal de MS entre tratamientos……….. 168 28 Comportamiento en la producción y perfil de AGV entre tratamientos durante la

fermentación in vitro………. 170

29 Comportamiento en la concentración de N-NH3, ácido láctico y pH entre

tratamientos durante la fermentación in vitro……… 172

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LISTA DE GRÁFICAS

Gráfica Página

1 Medias (± EE) de la producción de gas del T1 (heno de avena, ensilaje de maíz y concentrado), T2 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado y bagazo de manzana fermentado) y T3 (heno de avena, ensilaje de maíz, concentrado e

inóculo de levaduras) durante la fermentación ruminal in vitro……….. 142 2 Medias (± EE) de la producción de gas durante la fermentación ruminal in vitro

del T1, T2, T3 y T4 conteniendo todos los tratamientos heno de avena, ensilaje

de maíz, concentrado y su respectiva cepa de levadura………. 166

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LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Cuadrícula de un hematocímetro (cámara de Neubauer)……… 49

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LISTA DE ABREVIACIONES

Abreviación Significado

AGV´s Ácidos grasos volátiles

AcL Ácido láctico

AS Azucares solubles

BM Bagazo de manzana

C Cenizas

cel Células

CL Conteo de levaduras

CP Conteo de protozoos

cm centímetros

d Día

EE Extracto etéreo

FC Fibra cruda

FEL Fermentación en estado líquido

FES Fermentación en estado sólido

FL Fermentación liquida

FS Fermentación solida

FSS Fermentación solida sumergida

gbrix Grados brix

h Hora

Lev Levadura

mL Mililitro

mM Milimolar

MS Materia seca

min minutos

NH3 Amoniaco

nm nanómetros

N-NH3 Nitrógeno amoniacal

NNP Nitrógeno no proteico

PC Proteína cruda

PG Producción de gas

pH Potencial hidrogeno

PV Proteína verdadera

rpm Revoluciones por minuto

S Sustratos

t Tratamiento

T Temperatura

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INTRODUCCIÓN GENERAL

El uso indiscriminado de promotores de crecimiento en la producción animal y la creciente demanda por satisfacer las necesidades de alimentos, en una sociedad cada vez más exigente, nace la necesidad de plantear nuevas alternativas para reducir el uso de antibióticos usados hoy en día en la ganadería que ponen en riesgo la salud humana y animal.

Algunos microorganismos benéficos, conocidos como 'probióticos', así como ciertas biomoléculas y compuestos derivados, se suministran directamente a los animales para mejorar su metabolismo, salud y producción (Glade y Biesik, 1986; Wiedmeier et al., 1987; Cole et al., 1992). Los probióticos estimulan la digestión y ayudan a mantener el equilibrio microbial en el intestino de los animales, acciones que contrarrestan el estrés derivado de los cambios en las dietas, las condiciones detrimentales de manejo, y el ataque de patógenos (Kornegay et al., 1995; Anderson et al., 1999). Las enzimas, vitaminas y otros nutrientes o factores de crecimiento producidos por estos microorganismos originan respuestas de producción benéficas en los animales que los consumen (Kornegay et al., 1995;

Castro y Rodríguez, 2005).

El desarrollo de productos mediante la fermentación solida sumergida (FSS) ha mantenido un interés creciente en los últimos años. Esto se debe entre otros factores, al aumento en los costos de los ingredientes convencionales como esquilmos agrícolas y subproductos agroindustriales utilizados en la alimentación del ganado. Un ejemplo lo representan los cultivos de levaduras, los cuales se han empleado en una forma dinámica en las últimas décadas buscando mejorar la respuesta productiva de los animales a menor costo. Está documentado y estudiado que los aditivos alimenticios de levaduras, compuestos fundamentalmente por Saccharomyces cerevisiae han permitido mejorar la salud y la productividad de los animales que las consumen (Miller et al., 2002; Lila et al., 2004).

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La búsqueda de alternativas de alimentos económicamente viables para los animales que mejoren su productividad y que no compitan con la alimentación humana y que además constituyan fuentes naturales y seguras para la salud humana y la de los propios animales son algunas de las primicias para los nutriólogos (Calsamiglia et al., 2005). Es importante mencionar que el enriquecimiento nutritivo de subproductos agroindustriales a través de procesos de fermentación, también se ha probado en otro tipo de sustratos (Reid, 1985; Peñaloza et al., 1985). Diversos estudios se han enfocado a evaluar el proceso de fermentación en la búsqueda de su optimización (Becerra et al., 2008; Díaz- Plascencia et al., 2010a; Rodríguez et al., 2010). Estos autores describieron la existencia de una variabilidad en la concentración y calidad nutritiva del producto, dependiendo en su mayor parte, por los niveles de concentración de carbohidratos estructurales del sustrato utilizado.

El uso de un inóculo de levaduras Kluyveromyces lactis obtenido a partir del bagazo de manzana, por medio de la técnica fermentación sólida sumergida (FSS) contribuirá en un futuro no muy lejano en el desarrollo de levaduras de gran utilidad en la nutrición y alimentación animal, al aportar de una manera eficiente levaduras benéficas activas (LEBAS), siendo una vía biotecnológica adecuada para el aprovechamiento de desechos agroindustriales ricos en carbohidratos (Díaz-Plascencia et al., 2010a).

Por lo anteriormente escrito el objetivo del presente estudio fue la evaluación de diferentes sustratos y cepas de levaduras autóctonas obtenidas de la fermentación de subproductos de manzana para la elaboración de un aditivo líquido para ser usado en la alimentación animal bajo condiciones aeróbicas.

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REVISION DE LITERATURA Producción de Manzana

A nivel mundial se producen aproximadamente 60 millones de toneladas de manzana al año en una superficie de 5.6 millones de hectáreas, siendo China el principal productor con más de 20 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos de Norte América con 5.0 millones. Estos países aportan el 45% de la producción mundial, mientras que México aporta 0.46 millones de toneladas al año; de este total en la región Noroeste del Estado de Chihuahua, México; se produjeron alrededor de 409,778 toneladas de manzana (SAGARPA, 2007) de este total, cerca de 145,000 toneladas se comercializaron como manzana de desecho (UNIFRUT, 2007). Este desecho, no apto para consumo humano, es utilizado en su mayoría en la industria de la extracción para la elaboración de jugo; proceso del cual se obtiene un residuo o subproducto conocido como bagazo de manzana o pomasa. Gran parte de este bagazo es utilizado inadecuadamente en la alimentación animal y el resto, junto con buena parte de manzana de desecho que se queda en la huerta sin utilización alguna, dan origen a un problema de contaminación del medio ambiente por su alta velocidad de putrefacción, con la consecuente pérdida de nutrientes y dinero para el productor. Se estima una producción de pomasa de aproximadamente 32,000 toneladas (UNIFRUT, 2007) la cual no es aprovechada, o en algunos casos, se sub utiliza en la alimentación animal.

Fermentación de Manzana

Becerra (2006) y Díaz (2006) desarrollaron un proceso biotecnológico del cual obtuvieron un producto al que llamaron “manzarina” el cual usan en la alimentación animal, que se obtiene de la fermentación en estado sólido de la manzana. En este proceso la energía de los carbohidratos disponibles y la urea como fuente de nitrógeno son utilizadas para el crecimiento de la microbiota epifita de la manzana. El desarrollo biotecnológico de la manzarina como alimento alternativo para consumo

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animal, está llamada a constituir un elemento importante en el desarrollo de la producción animal en el Estado de Chihuahua, demostrando la factibilidad de aprovechar los recursos alimenticios de bajo valor nutritivo, como son los subproductos de manzana a través de la fermentación en estado sólido (Díaz, 2006). El uso de la fermentación en estado sólido de subproductos de manzana constituye una alternativa para el aprovechamiento de estos, evitando la contaminación ambiental provocada por la rápida descomposición de los mismos (Díaz-Plascencia et al., 2010b).

La Manzarina en la Alimentación Animal

La manzarina ha sido utilizada como ingrediente en la elaboración de bloques multinutricionales los cuales fueron evaluados en la alimentación de becerros en crecimiento (Rodríguez et al., 2006a). La manzarina es un suplemento proteico que se ha obtenido a mediana escala en condiciones rusticas para utilizarla y evaluarla como ingrediente en dietas para rumiantes. Se encontró que puede sustituir parte de los ingredientes en dietas de vacas lecheras, con incrementós en la producción láctea (Gutiérrez, 2007) y beneficios en la salud del animal (Gallegos, 2007). Han sido evaluadas como ingrediente en la dieta para la alimentación de borregos en engorda (Hernández, 2008) y como parte del suplemento en alimentación de bovinos de carne (Rodríguez et al., 2006b).

Rodríguez et al., (2006b) reportaron que becerros en engorda, alimentados con bloques multinutricionales, elaborados con un 14.6% de manzarina como ingrediente puede tener ganancias diarias de peso de 0.570 kg d^-1; la dieta se baso en el uso de forraje verde picado, ensilaje y rastrojo de maíz y como concentrado proteico, mineral y energético, se utilizaron los bloques multinutricionales. El consumo de bloque fue de 1.52 Kg a^-1 d^-1, el costo de la materia prima para la elaboración de los bloques fue menor al utilizar la manzarina comparado con el costo de la materia prima que se requiere para elaborar bloques multinutricionales con harinolina como principal fuente de proteína.

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Cave mencionar y destacar que toda esta información presentada ha servido como plataforma para plantear el desarrollo de un aditivo liquido de levaduras vivas, ayudando de una manera significativa en la reducción de la mano de obra que se requiere para desarrollarlo y llevarlo a cabo.

Fermentación Sólida

La fermentación sólida (FS) puede ser definida como un cultivo de microorganismos adheridos a un soporte sólido poroso y humedecido en el cual el medio líquido está extendido en una capa muy fina en contacto con una interface aérea. Las bacterias, levaduras y hongos son los microorganismos que pueden crecer en la fermentación sólida, pero la mayoría de las investigaciones se llevan a cabo con hongos filamentosos. El crecimiento en forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua y condiciones de alta osmolaridad hacen que los hongos sean la microflora natural más adecuada para la fermentación sólida (Hesseltine, 1972).

Pandey et al., (2001) define como fermentación en estado sólido al crecimiento de microorganismos en un material sólido y húmedo, siendo el material sólido la fuente energética, el sustrato también puede estar formado por un material sólido e inerte y húmedo, al cual se le adiciona una fuente energética.

En la fermentación en estado sólido, generalmente no se requiere agregar agua si el sustrato tiene un contenido alto de humedad (70 a 80%) (Pandey et al., 2001) y no necesariamente se tiene que inocular con alguna especie de microorganismo, si existe la posibilidad de potencializar el crecimiento de algunas de las especies microbianas de las que se encuentran de manera natural en los sustratos;

algunos de estos tienen una amplia diversidad de microorganismos, en este caso se tiene un sistema heterogéneo. El modelo de crecimiento miceliar da una ventaja adicional a los hongos filamentosos sobre los microorganismos unicelulares en la colonización de la matriz sólida y en la utilización de los nutrientes del medio de cultivo. El modelo básico de crecimiento de los hongos es una combinación del

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crecimiento apical con la generación de nuevas hifas por ramificación. Mientras que el crecimiento apical se lleva a cabo de manera lineal, la ramificación se lleva a cabo de manera exponencial y como resultado se logra una alta velocidad de crecimiento y una gran capacidad de cubrir eficientemente la superficie de cultivo (Valiño et al., 2002).

La estructura de la pared celular unida al crecimiento por las puntas y la ramificación da a los hongos una estructura sólida y firme que les permite penetrar en el interior de la matriz sólida. Las enzimas hidrolíticas son excretadas por las puntas de las hifas sin que se diluyan como en el caso de la fermentación líquida lo que hace la acción de las enzimas hidrolíticas sea eficiente y les permite penetrar en la mayoría de los substratos sólidos, lo que aumenta la disponibilidad de los nutrientes del interior de los substratos (Raimbault, 1998).

Existe un gran interés en la utilización de S. cerevisiae para transformar desechos agroindustriales en productos bioquímicos de valor comercial, por medio de la fermentación sólida (FS), porque se ha encontrado que durante la FS se manifiestan características fisiológicas diferentes en los microorganismos en comparación con la Fermentación liquida (FL). Entre los productos comerciales más importantes, se encuentran algunas enzimas que son excretadas al medio y cuya producción por FL se presenta en forma muy disminuida debido a los fenómenos de represión catabólica (Ramesh y Lonsane, 1991; Solís-Pereira et al., 1993). A veces, las enzimas producidas por FS tienen características modificadas, como un aumento en su termo resistencia, menores tiempos de producción y mayor actividad (Grajek y Gervais, 1987; Pandey et al., 1992; Acuña-Argüelles et al., 1995).

Los efectos que se derivan de la utilización de FS sobre los microorganismos son múltiples como modificaciones en el transporte de azúcares, la composición de la pared, la membrana celular y en la actividad enzimática (Grajek y Gervais, 1987; Pandey et al., 1992). Mientras que las bacterias y las levaduras requieren de alta actividad de agua (A, > 0.98), los hongos filamentosos pueden crecer

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con valores de Aw tan bajos como 0.85, y por esta razón, son microorganismos muy bien adaptados para la fermentación sólida sugiere incluso que un bajo nivel de Aw favorece la germinación y el crecimiento miceliar de los hongos (Raimbault, 1998). De acuerdo con Raimbault, (1998) el soporte de la fermentación sólida debe cumplir con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa que puede ser biodegradable o inerte, y requiere presentar una gran superficie de área por volumen dentro del rango de 103 o 106 cm²/cm³ que permita el crecimiento microbiano en la interface sólido-líquido.

Debe absorber agua en una o varias veces su propio peso con una actividad de agua relativamente grande en la interface sólido-líquido para poder permitir una alta velocidad de los procesos bioquímicos.

Fermentación Semi-Sólida

Este tipo de fermentación, utilizada básicamente para hongos, el microorganismo se desarrolla en la superficie húmeda de un material sólido, el cual generalmente es algún grano de cereal procesado, aunque se han realizado intentos para utilizar materiales de desecho. Esto permite al hongo crecer en condiciones similares a las encontradas en la naturaleza; las esporas, los propágulos infectivos mediante los cuales el hongo sobrevive e infecta insectos, son producidas en el aire. Aunque las fermentaciones semi sólidas son relativamente fáciles de desarrollar en pequeña escala, el escalado de las mismas a las proporciones necesarias para productos comerciales es bastante difícil (Taborsky, 1992).

En el caso de los hongos entomopatógenos, los países en vías de desarrollo han aplicado métodos de fermentación en sustrato sólido, pero estos presentan muchas restricciones para la producción a nivel comercial. Por un lado, el escalado se dificulta por problemas asociados con la esterilización del sustrato, intercambio gaseoso, control de la temperatura, mantenimiento de cultivos puros y recuperación del producto a partir del sustrato (Jackson, 1997).

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Por otra parte, el tiempo de fermentación necesario para la esporulación en sustratos sólidos generalmente requiere semanas, la cantidad de personal y la infraestructura grandes espacios físicos, son factores que aumentan los costos de gran manera en este tipo de metodologías (Deshpande, 1999;

Jackson et al., 2004).

Fermentación Líquida

Se puede definir a la fermentación líquida (FL) o sumergida como un cultivo de células microbianas dispersas en forma homogénea en un recipiente agitado que puede no ser aireado por medios mecánicos. La forma de fermentación liquida más utilizada en los laboratorios de investigación es el matraz agitado. El desarrollo de esta técnica ha sido importante porque ha permitido el cultivo de organismos aeróbicos en condiciones homogéneas con una densidad moderada de la biomasa y ha simplificado el estudio de la fisiología de los organismos. A su vez, el cultivo de suspensiones de células en fermentadores agitados ha evolucionado a gran escala, pues no es raro ver fermentadores con volúmenes superiores a 10 mil litros, en los cuales se producen todo tipo de compuestos derivados del metabolismo microbiano (Jackson, 1997).

En estos sistemas, la agitación mecánica permite aumentar la transferencia del gas a la biomasa de tres formas básicas: 1) Dispersa el gas en burbujas más pequeñas incrementando el área de interface gas-líquido. 2) Incrementa el tiempo de contacto de líquido con las burbujas de gas. 3) Disminuye el grueso de la capa estacionaria del líquido al aumentar la turbulencia del cultivo. Además, la agitación mezcla el cultivo manteniéndolo homogéneo. Esto es particularmente importante para la dispersión de la biomasa y la transferencia de calor (Henzler y Schedel, 1991).

Gran parte del gasto energético que debe realizarse en la FL está relacionado con la necesidad de satisfacer la demanda de oxígeno en el crecimiento de los microorganismos, esto es muy claro en el caso de Aspergillus niger, que es un organismo aeróbico estricto y necesita una alta tasa de

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transferencia de oxígeno para mantener su crecimiento (Righelato, 1975; Solomon, 1975; Raimbault, 1998).

Principales Características de las Levaduras

Hubert (1987), Jones y Thomas (1987) mencionan que los cultivos de levaduras Saccharomyces cerevisiae presentan varias características importantes: 1) No son patógenos, ni tóxicos. 2) No se absorben en el tracto digestivo. 3) No dejan residuos en los tejidos animales. 4) Se utilizan en pequeñas cantidades. 5) Proliferan in vivo e in vitro. 6) Promueven el crecimiento de bacterias celulolíticas. 7) Son estables a temperaturas elevadas y 8) no causan mutación.

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras requieren para su óptimo crecimiento un ambiente acuoso, pH con rango de 3.5 a 5.0, posiblemente debido a que la actividad de las proteínas plasmáticas de las levaduras en los límites de su membrana se da en estos valores de pH (Rose, 1987a); en estas condiciones de pH requerido para el crecimiento de la levadura, la actividad bacteriana a nivel ruminal tendría consecuencias detrimentales para los microorganismos y para los rumiantes; aunque las levaduras mantienen su actividad metabólica y resisten el estrés físico asociado con el secado, calentamiento y exposición al pH ácido en condiciones anaeróbicas (Dawson, 1993).

El rango de temperatura óptima para el crecimiento de las levaduras es de 28 a 30 ºC, con sobrevivencia a 37 ºC por medio de la formación de ascosporas (Dengis et al., 1995), aunque a 39 ºC que es la temperatura del ambiente ruminal, se ve afectado su crecimiento y disminución de la viabilidad de la levadura a 48 h de incubación (Mendoza y Ricalde-Velasco, 1993).

Fermentación en Estado Sólido Comparada con la Fermentación Sólida Sumergida

Doelle et al., (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos: Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes

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necesarios. La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras. La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo. Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las manipulaciones en la preparación del inóculo. Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol. El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente, como alimento animal ó productos para el control biológico. Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias.

Entre las principales desventajas se encuentran: Aplicación limitada para microorganismos que crecen en contenidos bajos de humedad. La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso. La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y productos. Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión. Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están muy poco caracterizados. El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento (Gervais y Bazelin, 1986).

Optimización de Medios de Cultivo

Los medios de cultivo con fines industriales, en la mayoría de los casos han sido diseñados mediante procedimientos empíricos de ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo, sino también en las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los componentes del mismo y las materias

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primas utilizadas, siendo factible en muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere del uso de varios métodos de optimización (Maddox y Richert, 1977).

Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés industrial no es sólo el logro de una formulación racional del mismo, sino también la posible inclusión de materias primas de bajo costo que hagan rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo valor comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno (Dreyer et al., 2000).

La Manzarina en la Alimentación Animal

Becerra et al., (2008); Villagrán et al., (2009); Díaz-Plascencia et al., (2010b), coinciden en que durante la FES del BM, el producto obtenido se ve enriquecido nutricionalmente y esto es resultado del incrementó de la cantidad de levaduras con que se inoculó o de la potencialización del desarrollo poblacional de aquellas que se encuentran presentes de manera natural en el BM; esto genera que en el caso de la manzarina, se pueda asumir que además de ser un alimento rico en PV, sea un alimento con un aporte importante de levaduras, debido a la alta cantidad de levaduras que contiene, ya sea obtenida del bagazo de manzana o de manzana de desecho.

Una célula de levadura puede llegar a pesar 7.922x10^-11g (Haddad y Lindegren, 1953), tomando esto en cuenta, las levaduras pueden representar una fracción importante de la MS de la manzarina, considerando que se han obtenido conteos de hasta 4.5x10⁸ cel/mL (Rodríguez et al., 2006b), en base seca esa cantidad puede ser hasta 10 veces mayor.

Uso de Levaduras en la Nutrición Animal

En la alimentación de rumiantes, las levaduras agregadas en la dieta influencian el metabolismo microbiano ruminal (Miller-Webster et al., 2002); se ha reportado que al agregar cultivos de levaduras

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en dietas con una alta proporción de concentrado, se puede reducir la producción de lactato e incrementar un poco el pH en el rumen (Moya et al., 2008); incluso la adición de cultivos de levaduras en la dieta de vaquillas lecheras puede incrementar la cantidad total de bacterias viables en el rumen (Lazcano y Heinrichs, 2008).

Sin embargo, aún y cuando algunas levaduras son anaerobias facultativas, debido a su hábitat natural aerobio (requieren oxígeno para el desarrollo normal de sus poblaciones), 24 h después de suspender su suplementación en la dieta, la cantidad de levaduras viables en condiciones rumínales puede ser indetectable (Kung et al., 1997). Cuando se incluyen en dietas para ganado lechero, las vacas alimentadas muestran tendencias a tener menor concentración de ácidos grasos no esterificados en la circulación sanguínea periférica, después del parto (AlIbrahim et al., 2008); tienden a incrementar el porcentaje de grasa en la producción de leche (Putnam et al., 1997; Wang et al., 2001), tienden a incrementar la producción de leche (Putnam et al.,, 1997; Wohlt et al., 1998; Wang et al., 2001;

Bitencourt et al., 2008), pueden incrementar el consumo de materia seca (Wohlt et al., 1998; Dann et al., 2000) e incluso pueden disminuir la pérdida de condición corporal antes del parto (Robinson, 1997).

En no rumiantes, productos obtenidos de las levaduras, tienen un efecto benéfico en la ecología microbiana del conducto gastrointestinal; disminuyen la población de clostridium perfringens (Hernot et al., 2008), pueden capturar bacterias patógenas en el conducto gastrointestinal, esto debido a que esas bacterias se unen a las paredes celulares de levaduras (Ganner et al., 2008), permitiendo tener un efecto de modulación en la concentración microbiana en el intestino de cerdos destetados (Weedman et al., 2008). Los cultivos vivos de levaduras permiten la estabilización de la micro flora normal del ciego cuando se ofrecen en la dieta a cerdas gestantes y lactantes (Walker et al., 2008), existiendo la posibilidad de incrementar su productividad, debido a incrementós en la ganancia de peso de las camadas y reducción del número de días del destete al empadre exitoso (Kim et al., 2008).

27 Cultivos de Levadura en la Fermentación Ruminal

La inclusión de Sc en el alimento resulta en un aumento en el número total de bacterias celulolíticas (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus), tanto in vitro como in vivo (Lila et al., 2004). En otro estudio, Chaucheyras et al., (1995) observaron la estimulación del crecimiento del hongo Neocallimastix frontalis. Los mismos autores reportaron que Sc parece estimular la utilización de lactato por Megasfaera elsdenii y Staphylococcus ruminantium propiciando un aumento en la síntesis de propionato (Lila et al., 2004). Estos últimos autores reportaron que la disminución del nivel de ácido láctico resulta en un incremento del pH ruminal favoreciendo el crecimiento de las bacterias celulolíticas, provocando un incremento en la digestión de la fibra y en la producción de ácidos grasos volátiles (AGV). Por otra parte, el efecto de Sc sobre la concentración de nitrógeno amoniacal (N-NH3) es muy variable, y se ha observado tanto una reducción como un incremento (Chaucheyras-Durand y Fonty, 2001).

Calsamiglia et al., (2005) han reportado evidencia del efecto de las levaduras sobre la fermentación ruminal, mencionando que las levaduras y sus medios de cultivos pueden contener nutrientes (ácidos orgánicos, vitaminas del grupo B, enzimas, aminoácidos, etc.) que estimulan el crecimiento de las bacterias que digieren la celulosa y utilizan el ácido láctico. Estos mismos autores reportaron que las levaduras vivas mediante su acción de respiración, consumen el oxígeno residual disponible en el medio ruminal, protegiendo a las bacterias anaeróbicas estrictas. Newbold et al., (1996) compararon varias cepas de Sc y observaron una fuerte correlación entre la capacidad de las levaduras de consumir oxígeno y el crecimiento bacteriano, lo que les permitió concluir que el efecto de estimulación de Sc sobre las bacterias ruminales podría atribuirse, al menos parcialmente, a su actividad respiratoria.

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En otro estudio, Yoon y Stern (1996) reportaron un mecanismo de acción para levaduras y hongos mediante el cual el aumento del pH ruminal y la reducción de la disponibilidad de oxígeno estimulan el incremento del crecimiento de las bacterias celulolíticas y por ende, se mejora la degradabilidad de la fibra, disminuye el llenado ruminal, aumenta la ingestión de materia seca e incrementa la producción, sin que mejore necesariamente la eficacia de utilización de nutrientes. Chung et al., (2011) publicaron que la levadura también tiene un potencial de incrementar el proceso de fermentación en el rumen de manera que disminuya la formación de gas metano (CH4). En otro estudio propusieron que a través de una selección de cepas, puede ser posible desarrollar un producto de levadura comercial que disminuya la producción de CH4 mientras minimiza la acidosis ruminal y promueva la digestión de la fibra y fermentación ruminal (Newbold y Rode, 2006).

Temperatura Ambiental Sobre el Comportamiento Productivo

La temperatura ambiental es una de las variables más investigada y al mismo tiempo la más utilizada como indicador de estrés. Mujibi et al., (2010) mencionaron que los efectos de la temperatura ambiente sobre el rendimiento de los animales han sido estudiados ampliamente en el ganado bovino, ya que los rumiantes dentro de su capacidad genética y fisiológica se ajustan continuamente para enfrentar los cambios ambientales (Young et al., 1989).

Arias et al., (2008) indicaron que animales adaptados al medioambiente en el que viven, experimentan estrés debido a las oscilaciones en las temperaturas o por una combinación de factores negativos a los que se someten durante un corto período de tiempo, enfrentándolo a través de modificaciones fisiológicas y de comportamiento. Por ende, en la mayoría de los casos la respuesta revela cambios en los requerimientos de nutrientes, siendo las necesidades de agua y la energía los más afectados cuando el ganado se encuentra fuera de la zona termo-neutral (Conrad, 1985). Arias et al., (2008) demostraron que los cambios en los requerimientos, así como las estrategias adoptadas por

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los animales para enfrentar el periodo de estrés, resultan en una disminución en su desempeño productivo. Como parte del comportamiento de aclimatación del animal, el consumo de materia seca (CMS) y el consumo diario de agua son directamente afectados, ya que ambos se relacionan con el balance térmico e impactan la regulación de la temperatura corporal (Finch, 1986). Collin et al., (2001) encontraron que en los animales dentro de su zona de termoneutralidad, la energía de la dieta es utilizada para mantenimiento, crecimiento, producción, reproducción y actividad física; mientras que abajo o arriba de esta zona la energía es reorientada a funciones para mantener la condición homeotérmica y en algunos casos puede existir un aumento en la demanda de energía para estos procesos.

Alimento Funcional

Se refiere a cualquier alimento en forma natural o procesada, que además de sus componentes nutritivos contiene componentes adicionales que favorecen a la salud, la capacidad física y el estado mental de una persona. El calificativo de funcional se relaciona con el concepto bromatológico de

"propiedad funcional", la característica de un alimento, en virtud de sus componentes químicos y de los sistemas fisicoquímicos de su entorno, sin referencia a su valor nutritivo. En Europa se define alimento funcional a "aquel que satisfactoriamente ha demostrado afectar benéficamente una o más funciones específicas en el cuerpo, más allá de los efectos nutricionales adecuados en una forma que resulta relevante para el estado de bienestar y salud o la reducción de riesgo de una enfermedad" (Roberfroid, 2000).

Producto Nutracéutico

Cualquier producto que pueda tener la consideración de alimento, parte de un alimento, capaz de proporcionar beneficios saludables, incluidos la prevención y el tratamiento de enfermedades. El concepto de alimento nutracéutico ha sido recientemente reconocido como "aquel suplemento dietético

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que proporciona una forma concentrada de un agente presumiblemente bioactivo de un alimento, presentado en una matriz no alimenticia y utilizado para incrementar la salud en dosis que exceden aquellas que pudieran ser obtenidas del alimento normal" (Zeisel, 1999).

Probióticos en la Alimentación Animal

La dieta juega un rol importante en la salud animal y humana. En años recientes, se ha dedicado especial atención a la producción de alimentos funcionales, teniendo como objetivo adicionar microorganismos o compuestos benéficos dentro del organismo a través del consumo diario de la dieta (Di Criscio et al., 2010).

Los probióticos han mostrado resultados prometedores en varias áreas de producción animal.

Un probiótico se define como un cultivo o cultivo mixto de microorganismos vivos que benefician al hombre o animales mejorando las propiedades de la microflora autóctona del intestino (Champagne et al., 2005). En otro estudio, se mencionó que los probióticos son microorganismos viables y benéficos para el huésped cuando son consumidos en cantidades apropiadas, lo que se traduce en una mejor producción y salud (Rook y Burnet, 2005). Los beneficios incluyen la inhibición de bacterias patógenas, reducción de niveles de colesterol en suero, diarrea y cáncer intestinal; mejoran la tolerancia a la lactosa, absorción de calcio, síntesis de vitaminas y estimulan el sistema inmune (Sánchez et al., 2009).

Bontempo et al., (2006) sugirieron posibles mecanismos que exhiben el papel benéfico en el animal, indicando la colonización y adhesión en la mucosa intestinal (competencia por receptores), competencia por nutrientes, producción de sustancias antimicrobiales y la estimulación de la mucosa y sistema inmune.

Las levaduras como probióticos están ganando popularidad en los sistemas de engorda, ya que son resistentes y con una alta viabilidad en condiciones ambientales adversas. Comitini et al., (2005) reportaron que las levaduras ejercen actividad inhibitoria sobre diferentes cepas de bacterias

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patógenas, desarrollando una actividad bactericida o bacteriostática debido a ciertos compuestos metabólicos producidos por las mismas. Stephens et al., (2007) mencionaron que corderos alimentados con probióticos disminuyeron la excreción de Escherichia coli O157:H7, los mismos autores publicaron que la suplementación microbial directa en el alimento también redujo la cantidad de Salmonella ssp. en bovinos productores de carne. La utilización de varias especies de probióticos favorecen el incrementado de la ganancia diaria de peso (GDP) y eficiencia alimenticia de corderos y bovinos en engorda durante el periodo inicial de la alimentación (Lema et al., 2001).

Mecanismos de Acción de las Levaduras en el Rumen

Aunque se han propuesto muchos mecanismos de acción que regulan la respuesta en los rumiantes al incluir levaduras (Rose, 1987b; Martin y Nisbet, 1992; Wallace y Newbold, 1992; Dawson, 1993; Newbold et al., 1996), estos aún no quedan debidamente esclarecidos (Marrero, 2005). Uno de los mecanismos propuesto es que las levaduras vivas a través de su respiración aerobia permiten eliminar el pequeño porcentaje de oxigeno (1%) que entra al rumen cuando el animal ingiere los alimentos, facilitando así el crecimiento de los microorganismos anaerobios más estrictos como bacterias Celulolíticas y hongos (Rose, 1987a; Newbold et al., 1996). Otro mecanismo de acción propuesta es que los cultivos de levaduras proveen vitaminas (específicamente tiamina), glucanos, mananoproteínas y ácidos orgánicos que estimulan el crecimiento de microorganismos que digieren la fibra y utilizan el ácido láctico (Nisbet y Martin, 1991; Chaucheyras et al., 1995; Oeztuerk et al., 2005).

Función de la Pared Celular de Levaduras en el Sistema Inmune

La pared celular de las levaduras contiene mananooligosacáridos (MOS) que pueden actuar como receptores de alta afinidad compitiendo con los sitios de unión con las bacterias gram negativas, las cuales poseen fimbrias específicas de manosa tipo 1 (Ofek et al., 1977), eliminando patógenos del sistema digestivo y evitando la colonización y fijación del patógeno a la mucosa (Nocek et al., 2011).

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Ferket, (2003) mencionó que este beneficio puede provocar una respuesta antigénica importante, mejorando así la inmunidad humoral contra patógenos específicos a través de la presencia de antígenos a las células inmune atenuada, además, este proceso puede suprimir la respuesta inmune proinflamatoria, la cual es perjudicial para el comportamiento productivo. Otro componente predominante de la pared celular de levaduras, es el β-1,3/1,6-glucano (β-glucano), el cual a mostrado tener efecto inmunomodulatorio cuando las levaduras se usaron como suplementos en dietas para aves (Chae et al., 2006), cerdos (Li et al., 2006) y animales acuáticos (Dalmo y Bogwald, 2008).

Pocos estudios han investigado el uso de los componentes de la pared celular de levaduras sobre la función inmune en ganado lechero (Nocek et al., 2011). Sin embargo, Franklin et al., (2005) observaron que la suplementación de vacas secas con MOS mejoró la respuesta inmune humoral contra rotavirus e incrementaron la transferencia de anticuerpos para sus crías. Reed y Nagodawithana, (1991) publicaron que los oligosacáridos presentes en la pared celular de Sc tales como glucanos y mananos mejoran el sistema inmune e influyen en la interacción patógeno-huésped en el tracto digestivo de animales y humanos. Animales de laboratorio, que consumieron glucanos de avena mejoraron la función de neutrófilos incrementando la defensa contra patógenos (Murphy et al., 2007).

Esto puede ser particularmente importante en becerros jóvenes, que son comúnmente afectados por protozoarios, virus y bacterias que causan enfermedades del tracto digestivo y algunos otros que pueden dar lugar a infecciones sistémicas (Magalhâes et al., 2008). Así mismo, productos solubles de cultivos de levaduras inhiben la actividad y crecimiento microbiano y modulan el sistema inmune (Jensen et al., 2008).

Función de los Microminerales en el Sistema Inmune

Los minerales traza (MT) tales como el cobre (Cu), zinc (Zn), manganeso (Mn) y cobalto (Co) son importantes para el correcto crecimiento, reproducción y respuesta inmune (Dorton et al., 2007), y

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en muchos procesos fisiológicos de los animales (Spolders, 2007). Sin embargo, el impacto de la suplementación de MT sobre la inmunidad en rumiantes ha sido variable (Spears, 2000). Este mismo autor mencionó que la suplementación de oligoelementos se centró en un principio en prevenir signos clínicos de deficiencia y la disminución de la producción, pero el rol de estos elementos en la inmunidad ha sido enfatizado en estudios más recientes. La concentración de Zn y Cu en suero están influenciados por muchos factores, tales como el tiempo de muestreo y el animal (Spolders et al., 2010).

Por otro lado, en los componentes de la sangre pueden influir muchos factores externos (clima, estación del año y hora del día) y factores internos tales como la raza, edad y etapa de lactación (McDowell, 2003).

Las deficiencias de MT resultan en un daño en la tasa de crecimiento (Blackmon et al., 1967), dificultades al parto (James et al., 1987), y disminución en la producción de células T, células B, neutrófilos y macrófagos, propiciando un incremento en la susceptibilidad a infecciones (Chandra, 1999).

Zinc. Es un microelemento esencial para el buen funcionamiento de las células, también ha sido identificado como un componente estructural, catalítico o regulador de más de 200 enzimas involucradas en el metabolismo de proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos (Vallee y Auld, 1990), siendo esencial para la integridad del sistema inmune (Hambridge et al., 1986), aunque su rol específico sobre la respuesta inmune no está muy claro. Así mismo, Murray et al., (2000) mencionaron que es un componente estructural de la enzima superóxido dismutasa (SOD), que ayuda a eliminar radicales libres producto de varios procesos en el cuerpo. Por otro lado, la función protectora de Zn contra la formación de radicales libres y estrés oxidativo, ha dado lugar a estudios sobre el efecto antioxidante de Zn y su participación en el sistema de defensa antioxidante (De Oliveira et al., 2009). Al considerar la gran variedad de enzimas que contienen Zn (lactato dehidrogenasa, fosfatasa alcalina, alcohol

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dehidrogenasa, anhidrasa carbónica, superóxido dismutasa, carboxipeptidasas, málico dehidrogenasa, etc.) resulta fácil suponer las graves consecuencias que ocasiona una deficiencia celular de Zn (Kirchgessner et al., 1993).

Hambridge et al., (1986) publicaron que una deficiencia de Zn, daña la función inmune a través de una reducción en la función de células T así como una disminución en la función de muchos componentes claves del sistema inmune (timo y neutrófilos). Cymbaluk et al., (1986) mencionaron que altas concentraciones de Zn obstaculizan la utilización de Cu y van acompañados de cojeras, anomalías óseas y puede producir anemia (De Auer y Seawright, 1988).

Manganeso. Es otro antagonista potencial del Cu, por lo tanto, ingredientes con alto contenido de Mn en la dieta pueden tener impacto negativo en la absorción de Cu (Hansen et al., 2009). Grace (1994) publicó que la concentración de Mn de algunos forrajes puede contener más de 100 mg/kg de MS, mientras que el contenido de Cu es típicamente bajo. El papel antagónico del Mn sobre el Cu es limitado, sin embargo, estudios con ratas han mostrado una interacción complicada entre el efecto de Mn en la dieta (10 a 50 mg/kg de MS) y Cu (<1 a 6 mg/kg de MS) sobre índices de niveles de fierro (Fe) en suero sanguíneo (Reeves et al., 2004). Hidiroglow (1979) menciono que el Mn se absorbe pobremente (1 % o menos) en dietas de rumiantes. En otro estudio, mencionaron que los factores dietéticos que pueden influir en la biodisponibilidad de Mn han recibido poca atención, probablemente porque la deficiencia no es considerada como problema principal en rumiantes (Van Bruwaene et al., 1984). Por otro lado, la limitada evidencia sugiere que dietas altas en calcio y fosforo puede reducir la biodisponibilidad de Mn (Hidiroglow, 1979).

Cobre. Es un elemento esencial en la nutrición animal, y participa en muchos procesos biológicos del organismo, la mayoría relacionados con actividades enzimáticas (Grace, 1994). Así mismo, Swenson y Reece (1993) publicaron que forma parte integral del sistema citocromo, de enzimas

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Cu-superóxido dismutasa (CuSOD), CuZn-superóxido dismutasa (CuZnSOD), ceruloplasmina (Cp), citocromo oxidasa, tirosinasa (polifelin oxidasa), ácido ascórbico oxidasa, monoamina oxidasa plasmática. Spears (2000) mencionó que en bovinos y otras especies se ha documentado que el Cu ejerce efecto sobre el sistema inmune. En otro estudio, se encontró que la habilidad fagocitica de neutrófilos se incrementó al doble cuando administraron Cu a terneros con deficiencia (Jones y Suttle, 1981). Prohaska y Failla (1993) reportaron que la inmunidad humoral y células mediadoras fueron dramáticamente disminuidas en ratas y ratones con deficiencia de Cu. Así también, la respuesta inmune humoral de novillos en crecimiento fue mejorada cuando fueron inyectados con 90 mg de Cu antes del destete y alimentados con 7.5 mg Cu/kg de MS durante la fase de crecimiento (Ward y Spears, 1999).

La deficiencia de Cu en bovinos es un desorden bastante común en todo el mundo y sus dietas son regularmente altas en la concentración de Cu (arriba de 35 mg/kg de MS), el máximo nivel de suplementación de Cu para ganado lo estableció la Unión Europea (Council Regulation (EC) No.

1334/2003/EC), muy por encima de los requerimientos fisiológicos generales (10 mg/kg MS; NRC, 1996). Kendall et al., (2001) comentaron que el margen relativamente amplio en la suplementación de Cu es porque en bovinos, y en rumiantes en general, los requerimientos nutricionales no dependen exclusivamente de la concentración de Cu en la dieta, si no que estriban altamente de la suplementación y disponibilidad del Cu, lo cual justifica la interferencia con antagonistas, principalmente molibdeno (Mo), azufre (S), fierro (Fe) y Zn. Hansen et al., (2009) publicaron que la deficiencia de Cu en ganado productor de carne, puede presentarse en forma de una disminución de crecimiento, despigmentación del pelo y anemia. Estos signos puede ser explicados por la reducida actividad de cuproenzimas tales como citocromo c oxidasa, tirosinasa y ceruloplasmina, que son importantes en la producción de energía, melanina y metabolismo de Fe, respectivamente (NRC, 1996).

36 Actividad Antioxidante

La nutrición tiene un gran efecto sobre la salud y la inmunidad en los animales, las deficiencias nutricionales perjudican la respuesta inmune y por lo tanto, incrementan la morbilidad y mortalidad (Chew, 1995). Este mismo autor mencionó que los antioxidantes sirven para estabilizar los radicales libres altamente reactivos, por lo que mantienen la integridad funcional y estructural de las células. Los antioxidantes han sido agrupados en enzimáticos y no enzimáticos, y son las sustancias capaces de controlar en el organismo la producción de radicales libres (RL) que se generan como consecuencia del metabolismo aerobio, ya sea secuestrando RL o estabilizándolos (Halliwell y Whiteman, 2004).

Tremellen (2008) mencionó que para contrarrestar los RL existe en primera instancia el sistema antioxidante enzimático, que incluye la seleno-enzima glutatión peroxidasa (GPx) que actúa fundamentalmente reduciendo el peróxido de hidrogeno (H2O2), y la SOD que actúa sobre el anión superóxido (O2-) transformándolo en un radical secundario (H2O2) para una posterior acción de la GPx.

La mayoría de las moléculas presentes en el organismo son químicamente estables, es decir, tienen un número par de electrones en su orbital externo, pero existen otras cuyo número de electrones es impar, estas sustancias químicas altamente inestables y reactivas se conocen como radicales libres (Barquinero, 1992). Halliwell (1992) reportó que cuando un radical interactúa con una sustancia estable, toma de ella un electrón cargando positivamente la molécula; así el compuesto estable se convierte en un radical libre altamente agresivo, pudiendo generar más radicales, dando lugar a una reacción en cadena. Por otra parte, el oxígeno aun siendo esencial para la vida, también es tóxico por ser una sustancia oxidante ya que puede aceptar electrones desestabilizando a la molécula que lo pierde, por tanto en el metabolismo aerobio se producen oxidantes denominados metabolitos oxigenados reactivos, entre los que se encuentra el O2-, hidróxido (OH) y H2O2 (Ceballos et al., 1998).

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El confinamiento y el estrés calórico pueden contribuir a incrementar los requerimientos de antioxidante en los animales. Por lo que se ha motivado en realizar estudios en los que se ofrecen suplementos antioxidantes a los animales, en la dieta o en forma parenteral, observándose que la suplementación mejora la respuesta inmune y disminuye el estrés oxidativo, provocando una mayor resistencia a enfermedades infecciosas y degenerativas (Chew, 1995). Así mismo, González-San José et al., (2001) publicaron que a medida que un individuo envejece dicho balance está a favor de los oxidantes, lo que hace de interés la necesidad de ingerir alimentos con antioxidantes para disminuirlos.

En otro estudio, mencionaron que la vitamina E es un antioxidante fenólico lípido soluble; por lo que su actividad antioxidante se basa en la habilidad de donar un átomo de hidrógeno a radicales libres (Yurttas et al., 2000).

Biometría Hemática en Rumiantes

En la práctica clínica de la Medicina Veterinaria los parámetros de los valores de biometría hemática (BH) son una ayuda diagnóstica fundamental en el análisis y orientación del estado clínico de un animal y en el seguimiento de un determinado hato; esta información es útil en los casos de control, valoración de procesos de estabilidad enzoótica y el estado nutricional de los animales. Así mismo, la BH es un examen de ayuda diagnóstica que en la evaluación clínica permite tomar decisiones profilácticas y curativas. Barrio et al., (2003) mencionaron que la BH es la evaluación numérica y descriptiva de los elementos celulares de la sangre (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas);

constituyendo una de las pruebas más solicitadas en el laboratorio clínico, ya que acompaña casi todos los protocolos de diagnóstico con precisión, exactitud y rapidez.

Los componentes celulares sanguíneos, transportan oxígeno (glóbulos rojos o eritrocitos), protegen de organismos extraños y antígenos (glóbulos blancos o leucocitos), fagocitando, capturando o destruyéndolos, e inician la coagulación (Aiello y Mays, 2000). Estos mismos autores, mencionaron

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que las células sanguíneas se dividen en leucocitos (fagocitos y linfocitos); los fagocitos se subdividen en monocitos (mononucleares) y granulocitos (polimorfonucleares), así mismo, estos últimos se subdividen en neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Por otro lado, los linfocitos son glóbulos blancos responsables de la inmunidad humoral y celular, su producción se origina en la medula ósea. En otro estudio, Aiello y Mays (2000) reportaron que los análisis hematológicos muestran las cantidades de los elementos celulares; su evaluación permite determinar problemas de salud, inflamación de tejidos o funciones proliferativas de la medula ósea.

Digestibilidad y Fermentación de los Alimentos en el Rumen

Por algunos años, los microbiólogos y nutriólogos de rumiantes se han interesado en la manipulación del ecosistema microbial del rumen para mejorar la eficiencia en producción (Callaway y Martin, 1997). La adición de extractos de Aspegillus oryzae y cultivos de Sc en la dieta de rumiantes mejoran la digestibilidad de MS, proteína cruda (PC) y hemicelulosa; aumentando el número de bacterias en el rumen, disminuyendo la concentración de lactato e incrementado la producción de leche en vacas frescas (Gomez-Alarcon et al., 1990). Sin embargo, la respuesta a la suplementación con cultivos de levaduras u hongos han sido variables (Martin y Nisbet, 1992). Estudios previos (Newbold et al., 1996) han mostrado que el cultivo de levadura incrementa el número de bacterias celulolíticas en el rumen, y en algunos casos incrementan la degradación de celulosa. Por otra parte, los microorganismos que se adhieren a la digesta, representan más del 75 % de la microflora total del rumen, y Sc estimula el crecimiento principalmente de F. succinogenes, R. albus y R. flavefaciens siendo las más activas en la degradación de la fibra (Chaucheyras-Duran y Fonty, 2001). Así también, otros autores han utilizado la levadura Sc como aditivo en dietas fibrosas para rumiantes produciendo mejoras en la eficiencia de utilización y disponibilidad de los nutrientes (Newbold et al., 1998) e incrementos en la digestión ruminal

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de la MS, materia orgánica y FDN, tanto in vivo como in vitro, así también, en la degradabilidad de FDA y nitrógeno (Biricik y Turkman, 2001).

Producción de Gas y Perfiles de AGV en el Rumen

Se conoce que la cuantificación de la producción de gas en fermentaciones in vitro se utiliza para determinar la digestibilidad y la cinética de la fermentación ruminal de los alimentos (Theodorou et al., 1994), lo que unido a las ecuaciones de regresión múltiple y los componentes nutricionales del sustrato (Noguera et al., 2004) propician con bastante precisión la estimación de la degradabilidad in vivo y la digestibilidad aparente de la MS de forrajes (Blümmel et al., 1997); ajustando los perfiles acumulados de gas a una ecuación apropiada que permita resumir la información cinética (Groot et al., 1996). Por otro lado, la energía para el crecimiento microbiano se deriva de la fermentación de los carbohidratos, principalmente almidón y celulosa, cuya digestión anaerobia produce AGV, succinato, lactato, etanol, dióxido de carbono (CO2), CH4 y trazas de hidrógeno (H2); sin embargo, estos también aportan esqueletos de carbono esenciales para la síntesis de biomasa microbiana (Opatpatanakit et al., 1994). En otro estudio (Getachew et al., 1998) reportaron que la producción de gas es generada principalmente cuando el sustrato es fermentado hasta acetato y butirato, produciéndose propionato únicamente desde la neutralización del ácido y por consiguiente, es de menor cantidad. Por otra parte, los microorganismos ruminales son muy sensibles a cambios en el pH y la mayoría prefieren un rango entre 6.5 a 6.8. Grant y Mertens (1992) comentaron que las bacterias celulolíticas, en particular, son más sensibles a bajos pH que las amilolíticas. Así mismo, Hoover et al., (1984) demostraron que un pH alto (7.5) o bajo (5.5) compromete severamente la digestión de la fibra.

Noguera et al., (2004) reportaron que la técnica de producción de gas permite detectar diferencias entre sustratos generados por su madurez, condiciones de crecimiento, especie o cultivo y métodos de preservación.

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