P1. Identificación de material y equipos.

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P1. Identificación de material y equipos.

Objetivo: Situar e identificar los aparatos y el material general y específico del laboratorio de microbiología, asociándolo a su correcto uso.

A) EQUIPOS:

1. Generales:

a) Seguridad:

- Ducha de emergencia y lavaojos.

- Extintores.

- Vitrina extractora.

b) Uso común:

- Mecheros.

- Granatarios.

- Estufa de secado.

- Placas de calefacción y baños.

2. Específicos:

- Autoclaves.

- Estufas de incubación.

- Equipos de filtración con membrana.

- Microscopios.

- Lupa binocular.

- Agitador excéntrico.

- Stomacher.

- Contador de colonias.

B) MATERIAL:

1. General:

- Matraces.

- Probetas.

- Pipetas.

- Pipeteadores y peras de goma.

- Tubos de ensayo.

- Placa de toques.

2. Específico:

- Pinzas.

- Asa de siembra y - Pincho de siembra.

- Asa de Driglaski.

- Frascos de cultivo.

- Tubos de cultivo.

- Placas de Petri.

- Placas de contacto.

- Placas de membrana filtrante.

- Portaobjetos.

- Cubreobjetos.

- Campanas de Durham.

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P2. Uso del microscopio.

Objetivo: Identificar las partes del microscopio óptico y conseguir su correcto uso, mantenimiento y limpieza, mediante la visualización de preparaciones ya hechas.

Material:

- Microscopio óptico.

- Aceite de inmersión.

- Papel de limpieza óptico.

Procedimientos:

• USO DEL MICROSCOPIO.

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Prácticas de Microbiología

Página 4 de 45 Salvador Camacho Garrido

USO DEL MICROSCOPIO:

1. Comprueba que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias.

2. Coloca la preparación sobre la platina sujetándola.

3. Coloca en posición el objetivo de menos aumentos.

4. Baja al mínimo el condensador y abre totalmente el diafragma.

5. Enfoca con el tornillo macrométrico:

- Sin mirar por el ocular y con el tornillo macrométrico, acerca al máximo el objetivo a la preparación sin que exista contacto.

- Con el tornillo macrométrico, suba lentamente el objetivo hasta conseguir un enfoque nítido.

6. Pase al objetivo intermedio y sube el condensador.

7. Enfoca con el tornillo micrométrico. Si no lo consigue, repita los puntos 3 al 5.

8. Gira el revólver a medio camino entre los objetivos intermedio y alto.

9. Coloca una gota mínima de aceite de inmersión en el punto de luz.

10. Gira el revólver, asegurándote que el objetivo de más aumentos, no toca la preparación pero sí la gota.

11. Enfoca muy despacio con el tornillo micrométrico. Si no lo consigue, repita los puntos 3 al 10.

12. Una vez acabada la observación, coloca en posición el objetivo de menos aumentos.

13. Retira la preparación de la platina.

14. Limpia perfectamente el objetivo de inmersión antes de que se seque.

15. Una vez acabadas todas las observaciones, limpia perfectamente todas las partes ópticas y mecánicas del microscopio y lo guardas en el lugar habilitado para ello. Si va a volver a usarlo en la misma sesión de trabajo, basta con enfundarlo.

Nota: Repetir el proceso para cada una de las preparaciones, seleccionando un campo visual para cada preparación, dibujándolo y anotando las observaciones pertinentes para cada uno de los objetivos utilizados.

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P3. Preparación de muestras microscópicas y su observación.

Objetivo: Confeccionar preparaciones microscópicas en fresco y por tinción simple y diferencial, para su posterior observación.

Material:

- Mechero.

- Asa de siembra.

- Pinzas.

- Portaobjetos y cubreobjetos.

- Microscopio óptico y aceite de inmersión.

- Papel de filtro.

Reactivos:

- Azul de metileno al 1 %.

- Safranina al 0,5 %.

- Violeta cristal al 1 %.

- Lugol (disolución diluida de yodo).

- Alcohol-acetona 1:1 (o etanol de 95º).

- Metanol.

Procedimientos:

• OBSERVACIÓN EN FRESCO.

• FIJACIÓN DE BACTERIAS.

• TINCIÓN SIMPLE.

• TINCIÓN DE GRAM.

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OBSERVACIÓN EN FRESCO:

1. Toma una gota (o pequeña porción sólida) de muestra con el asa estéril y deposítala en el portaobjetos.

2. Coloca el cubreobjetos evitando la formación de burbujas.

3. Observa al microscopio sin inmersión, cambiando varias veces de campo.

4. Anota las observaciones de morfología, movimiento, etc., dibujando los diferentes campos observados.

5. Repite el proceso para gota pendiente utilizando un porta excavado.

Nota: La observación se realizará en una muestra de:

- Agua estancada.

- Yogurt.

FIJACIÓN DE BACTERIAS:

1. Coloca una pequeña gota de agua en el porta con el asa de siembra.

2. Transfiere con el asa estéril una pequeña porción sólida. Suspéndela y extiéndela. Si el cultivo es líquido basta con colocar y extender una gota.

3. Evapora el líquido sin calor.

4. Fija las bacterias al porta:

a) Por calor, pasando 3 veces el porta por la llama durante unos segundos y dejando enfriar entre cada pase.

b) Con metanol, añadiendo unas gotas sobre la extensión seca y evaporando al aire.

Nota: Realiza la fijación en 2 muestras de yogurt y 2 muestras de agua, utilizando las dos técnicas de fijación.

TINCIÓN SIMPLE:

1. Cubre el material a colorear con el colorante durante el tiempo necesario.

2. Lava con agua con el porta inclinado sin que el agua incida en el frotis, escurriéndola desde el borde superior.

3. Elimina, golpeando de canto, la máxima cantidad de agua posible del porta, secándolo después por presión (nunca frotando) entre papel de filtro.

4. Observa al microscopio con objetivo de inmersión excepto la tinción de la cebolla.

Selecciona un buen campo, anota morfología, movimientos, etc., y dibújalo.

Nota: Realiza la tinción de:

- Frotis del yogurt con azul de metileno (15 minutos).

- Frotis del agua con safranina (1 minuto).

TINCIÓN DE GRAM:

1. Tiñe el frotis con violeta cristal durante 1 minuto.

2. Lava abundantemente con agua.

3. Cubre con lugol durante 1 minuto.

4. Lava con agua el exceso de lugol.

5. Decolora con alcohol-acetona (o alcohol de 95º) hasta que el líquido de lavado sea incoloro.

6. Lava con agua.

7. Tiñe con safranina durante 1 minuto.

8. Lava con agua.

9. Seca la pareparación.

10. Observa con el microscopio utilizando el objetivo de inmersión. Selecciona un buen campo, anota morfología, movimientos, etc., y dibújalo.

Nota: Realiza la tinción de:

- Frotis del agua.

- Frotis del yogurt.

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P4. Uso del autoclave y otros métodos de esterilización y limpieza.

Objetivo: Preparar las disoluciones desinfectantes a utilizar, así como limpiar y esterilizar el material que con posterioridad se utilizará.

Material:

- Mechero.

- Asa de siembra.

- Pinzas.

- Vasos de precipitados de vidrio.

- Vasos de precipitados de politeno.

- Probetas de politeno.

- Material para limpiar y esterilizar.

Reactivos:

- Etanol o metanol de quemar.

- Isopropanol.

- Fenol.

- Jabón o detergente.

- Solución de hipoclorito comercial (lejía).

Procedimientos:

• PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE INMERSIÓN.

• PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE ASPERSIÓN.

• ESTERILIZACIÓN DE ASAS Y PINCHOS DE SIEMBRA.

• ESTERILIZACIÓN DE PINZAS Y ESCALPELOS.

• LIMPIEZA DEL MATERIAL.

• UTILIZACIÓN DEL AUTOCLAVE.

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PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE INMERSIÓN:

1. En un matraz o vaso de precipitados de 1 L, añade unos 50 mL de lejía comercial y agua hasta completar el litro.

2. Distribuye en probetas de politeno a fin de utilizarlas como cementerios de pipetas.

3. Distribuye en vasos de precipitados de politeno a fin de utilizarlos como cementerios de portaobjetos y cubreobjetos.

PREPARACIÓN DE DISOLUCIÓN DESINFECTANTE DE ASPERSIÓN:

1. Pesa 10 g de fenol.

2. Disuelve en un matraz o vaso de precipitados de 1 L lleno de isopropanol.

3. Distribuye en pulverizadores a fin de utilizarlos para la aspersión de manos, superficies y vertidos ocasionales.

ESTERILIZACIÓN DE ASAS Y PINCHOS DE SIEMBRA:

1. Enciende el mechero y pon llama oxidante.

2. Introduce el asa o pincho de siembra inclinado en la llama y en la zona de fusión o de máxima temperatura.

3. Déjalo que se ponga al rojo en toda su extensión. Enfríalo al lado de la llama.

ESTERILIZACIÓN DE PINZAS Y ESCALPELOS:

1. Sumerge las pinzas o escalpelo en alcohol de quemar.

2. Con las debidas precauciones, enciende el alcohol hasta su agotamiento.

3. Envuélvelas, hasta su utilización, en papel seda (el papel de prensa también es válido y además de barato colaboramos en su reciclado).

LIMPIEZA DEL MATERIAL:

1. Efectúa el tratamiento previo si es necesario (neutralización de vidrios alcalinos nuevos, limpieza con mezcla crómica si existen rastros de tinción, etc.).

2. Lava el material con agua y jabón perfectamente auxiliándote de los escobillones.

3. Enjuaga, al chorro en grifo, con agua abundantemente.

4. Enjuaga, con los frascos lavadores, con agua destilada o desmineralizada.

5. Seca el material en escurridores o en la estufa de secado.

UTILIZACIÓN DEL AUTOCLAVE:

1. Puesta en marcha:

1. Comprueba que los grifos de desagüe y de vapor estén cerrados.

2. Conecta a la red eléctrica. Abre la tapa del autoclave girando el volante de cierre hasta levantarla totalmente, y hecho esto, girar el brazo hacia afuera.

3. Llena el autoclave con agua destilada hasta el nivel de la gradilla inferior.

4. Introducir el material en el interior bien en bolsas directamente o en cestos, procurando que entre el material queden espacios para la circulación del vapor.

5. No taponar los orificios de la parte alta del interior del depósito.

6. Tener la precaución, de que al colocar los tubos en los cestos, no sobresalgan, para que el cesto siguiente quede perfectamente colocada sobre la de abajo.

7. Cerrar la tapa girando el brazo hasta el tope y apretar el volante de cierre hacia abajo, cerrando completamente.

8. Accionar el interruptor.

9. Asegurarse que el terminal posterior de desagüe, por el que saldrán las gotas de agua de condensación del aire, está colocado en la rejilla de salida y ésta no está obstruida.

10. Comprobar que la temperatura y el tiempo están seleccionados.

11. La esterilización empieza y acaba cuando suena un zumbador bitonal.

2. Durante la esterilización:

1. Al accionar el interruptor mirar que se enciende el piloto de red, el de calefacción y el regulador de temperatura real del autoclave.

2. Observar el aumento de la temperatura y la purga automática del aire hasta encenderse, el piloto de purga total.

3. La temperatura aumenta hasta llegar a la seleccionada, generalmente 121 ºC, apagándose entonces el piloto de calefacción

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e iluminándose el piloto del temporizador, hasta acabar el tiempo seleccionado, generalmente, 20 minutos.

4. El temporizador va graduado de 0 a 1, con divisiones decimales. Para pasar a minutos, debemos tener en cuenta, el multiplicar los decimales por 60.

5. El temporizador no inicia la cuenta del mismo hasta no alcanzar la temperatura seleccionada.

3. Parada:

1. Cuando suena el zumbador, cerrar el interruptor. Dejar enfriar el autoclave hasta que la presión sea 0 y la temperatura sea inferior a 100 ºC. NUNCA ABRIR ANTES.

2. Abrir el autoclave.

3. Sacar los cestos y las bolsas con el material.

Comprobar el nivel de agua del interior.

Nota: Siempre que se trabajen con muestras, además de lavarse con agua y jabón, es preceptivo rociar las manos con solución desinfectante, no sacar la bata hasta su lavado y limpiar todas las superficies utilizadas con la misma solución desinfectante.

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P5. Análisis de microorganismos genéricos.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos aerobios mesófilos.

Material:

- Mechero.

- Estufas de cultivo.

- Equipo de filtración con membrana.

- Placas de Petri de 90 mm.

- Placas de cultivo de membranas.

- Tubos de ensayo de 160x16 mm.

- Tubos de ensayo normales.

- Matraces de Erlenmeyer o vasos de precipitados.

- Pipetas de 10 y 1 mL graduadas.

- Pipetas de Pasteur.

- Asa de siembra.

- Asa de Driglaski.

- Pinzas.

- Espátulas o cucharillas.

- Portaobjetos.

- Papel de filtro.

- Parafina.

Reactivos:

- Etanol de 95º.

- Rojo de metilo al 0,2 % (disolución hidroalcohólica).

Medios de cultivo:

- Agua de peptona (o de triptona).

- Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA).

- Caldo nutritivo (o caldo lactosado).

- Agar nutritivo con 1 % de glucosa.

- Agar de cultivo de membranas.

Procedimientos:

• PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES.

• ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN MASA.

• ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN SUPERFICIE.

• ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO LÍQUIDO POR EL MÉTODO N.M.P.

• ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS POR FILTRACIÓN CON MEMBRANA.

• ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS TOTALES POR EL MÉTODO DE EXTENSIÓN.

• AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.

• CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.

• CULTIVO EN ANAEROBIOSIS.

• PRUEBAS BIOQUÍMICAS EN MICROORGANISMOS GENÉRICOS.

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PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES:

PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES

1. Prepara la muestra a investigar.

2. Homogeneiza por agitación.

3. Toma con pipeta 1 mL de la mezcla resultante.

4. Añade a un tubo con 9 mL de agua de triptona (TW), o de agua de peptona (PW) como diluyente, y homogeneiza. Es la suspensión madre que se rotula como tal, o mejor, 1/10 ó 10^-1.

5. Transfiere con una pipeta 1 mL de la suspensión madre a un tubo que contenga 9 mL de diluyente y homogeneiza. Marca la dilución como 1/100 ó 10^-2.

6. Transfiere con una nueva pipeta, 1 mL de la disolución 10^-2 aun tubo con 9 mL de diluyente, homogeneiza y rotula como 1/1000 ó 10^-3.

7. Transfiere con una nueva pipeta, 1 mL de la disolución 10^-3 aun tubo con 9 mL de diluyente, homogeneiza y rotula como 1/10000 ó 10^-4.

8. Repite el proceso hasta conseguir la dilución 1/100000 ó 10^-5.

RECUENTO EN MASA:

1. A partir de la serie de diluciones decimales, y por duplicado, deposita con una pipeta 1 mL de cada dilución, en otras tantas placas de Petri marcadas con la dilución a emplear. Si comenzamos con la más diluida y seguimos de forma ordenada, sólo tendremos necesidad de una pipeta.

2. Añade unos 15 mL de agar nutritivo (PCA), atemperado entre 47-45 ºC en cada placa.

3. Mezcla perfectamente el medio con el inóculo girando en sentido horario y antihorario así como en dos direcciones perpendiculares.

4. Deja solidificar en un plano horizontal.

5. Invierte las placas.

6. Incuba las placas invertidas a 31 ºC durante 72 horas.

7. Cuenta las colonias en la dilución más adecuada (entre 30 y 300 colonias).

8. Calcula el resultado expresado como ufc/mL.

Nota: El tiempo transcurrido desde que se deposita la muestra y se vierte el medio de cultivo no debe sobrepasar los 10 minutos.

Igualmente, desde que se prepara la primera dilución de la serie de diluciones decimales,

hasta que se vierte el agar en la última placa, no superará los 20 minutos.

H2O LC1

FECAL

2mL 18mL

1 mL

TW = Agua de triptona -2 -3 -1

9mL TW (0,1 %)

AGITAR AGITAR

AGITAR

AGITAR AGITAR AGITAR

-4 -5

-1 -2 -3

Agar PCA 1) 1 mL

2) 15 mL de agar atemperado 45-47 ºC 3) agitar 4) solidificar

DILUCIONES DECIMALES

PCA = Agar de recuento en placa

ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN MASA

INVERTIR 31 ºC 72 h.

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RECUENTO EN SUPERFICIE:

1. Prepara las placas de Petri necesarias con 15 mL de agar nutritivo (PCA).

ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN SUPERFICIE

2. Sécalas en posición invertida en estufa a una temperatura inferior a 45 ºC.

3. A partir de la serie de diluciones decimales, y por duplicado, transfiere 0,1 mL de cada dilución a cada placa ya marcada con la dilución empleada.

4. Disemina el inóculo por toda la superficie con un asa de Driglaski o asa de vidrio acodada.

5. Deja las placas en reposo hasta absorción del inóculo.

6. Invierte las placas.

7. Incuba las placas, en posición invertida, a 31 ºC durante 72 horas.

8. Toma las placas de la dilución cuyo número de colonias esté comprendida entre 30-300.

9. Cuenta las colonias que aparezcan perfectamente aisladas.

10. Calcula el resultado, expresado como ufc/mL.

Nota: Debe agitarse cada tubo de dilución perfectamente antes de la toma del inóculo, por rotación entre las palmas de las manos en posición vertical, o mediante el agitador excéntrico.

RECUENTO EN MEDIO LÍQUIDO NMP:

1. Prepara 3 series de 3 tubos con caldo lactosado (BL) y campana de Durham.

2. Rotúlalos en función de las diluciones a utilizar.

3. Toma las diluciones 10^-1, 10^-2 y 10^-3.

4. Siembra con pipeta 1 mL de la dilución 10^-1, en los tres tubos de la primera serie, mezclando perfectamente.

5. Repite el proceso para cada dilución. Si comienzas por la serie más diluida (10^-3), solo tendrás que utilizar una pipeta.

6. Incuba a 31 ºC / 72 horas o a 37 ºC / 48 horas.

7. Lee los tubos positivos (enturbiamiento y/o formación de gas).

8. Aplica las tablas NMP para dar el resultado.

Las tablas NMP, expresan tanto el valor más probable, como los valores con una confianza del 95 %, expresado como u.f.c./

g o mL de la dilución más concentrada utilizada, en nuestro caso 10^-1.

Nota: Si los tres tubos de la dilución más diluida resultan positivos, repite el proceso para 3 nuevas series más diluidas.

PCA = Agar de recuento en placa DILUCIONES DECIMALES

-5 -4

72 h.

31 ºC

-1 -2 -3

Agar PCA placas secas 0,1 mL

INVERTIR

ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS EN MEDIO LÍQUIDO POR EL MÉTODO N.M.P.

BL = Caldo lactosado

DILUCIONES DECIMALES

-4 -5

72 h.

31 ºC

AGITAR

1 mL

-1 -2 -3

10 mL de BL

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RECUENTO POR FILTRACIÓN EN MEMBRANA:

1. Prepara con antelación una muestra de agua contaminando 99 mL de agua de grifo con 1 mL de agua fecal.

2. Prepara el equipo de filtración a vacio.

3. Filtra los 100 mL de la muestra.

4. Con unas pinzas estériles, retira el filtro de membrana del equipo de filtración, y deposítalo sobre la superficie de una placa con agar de cultivo en placa ENDO.

5. Incuba a 37 ºC durante 24-48 horas.

6. Realiza el recuento.

7. Expresa el resultado como ufc/mL.

RECUENTO POR EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO:

1. Prepara la suspensión madre 10^-1.

2. Toma 0,01 mL de suspensión y extiéndelo en 1 cm² del portaobjetos, dejándolo secar al aire.

3. Fija la extensión mediante calor.

4. Tiñe según Gram.

5. Con el objetivo de inmersión de x100 y el ocular de x10 (x1000 en total), examina 10 campos de la muestra elegidos al azar y contando las agrupaciones bacterianas encontradas de gérmenes grampositivos y/o gramnegativos.

6. Calcula el resultado como ufc/g, según las fórmulas siguientes:

• ; donde N es ufc/g y n el

número de agrupaciones bacterianas de un campo (trabaja con la media de los 10 campos observados).

n N =5⋅10⁵ ⋅

• ; donde N es ufc/g y n el número de agrupaciones bacterianas observadas en los 10 campos.

n N =1,5⋅10⁶ ⋅

• n

k N f

+r

⋅

= ⋅ 10⁶

ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS POR FILTRACIÓN CON MEMBRANA

; donde N es ufc/g, f un factor de ponderación en función del tipo de muestra, cuyo valor es 1 si la muestra es seca, 2 si es una muestra con alta actividad de agua y 0,5 si es una muestra no diluida, k el número de agrupaciones contadas en n campos y r el logaritmo decimal de la dilución empleada.

•

Nota: Solo se consideran las agrupaciones bacterianas y no el número de bacterias.

Para contar una única bacteria, debe estar aislada, es decir, que esté separada del resto

por una distancia superior al eje mayor de la bacteria considerada.

H₂O

FECAL

48 h.

37 ºC 99 mL

1mL

ENDO = Agar para filtración con membrana H₂O

MEMB RANA FILTRANTE

AGITAR VACIO

C ERRAR ABRIR

Agar ENDO seca

RECUENTO DE MICROORGANISMOS TOTALES POR EL MÉTODO DE EXTENSIÓN

1 cm² 1mL 9 mL

H₂O

FECAL H2O

0.01 mL

EXTENDER

EVAPORAR AL AIRE

FIJAR

TINCIÓN DE GRAM

MICROSCOPIO

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Nota: por duplicado, para trabajar individualmente cada alumno.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS:

PRUEBA DEL ROJO DE METILO Y FORMACIÓN DE GAS:

1. Prepara 2 placas de Petri con agar PCA.

2. Inocula una de ellas, a partir de una colonia típica de las placas de recuento en superficie, utilizando la técnica de agotamiento en superficie mediante estrías oblicuas.

1. Prepara 2 tubos con caldo lactosado y campana de Durham.

3. Inocula la otra, a partir de un tubo de caldo positivo, de los utilizados en la técnica NMP, utilizando la técnica de agotamiento en superficie mediante estrías perpendiculares.

2. Inocula uno de ellos a partir de una colonia típica superficial y el otro a partir de un tubo de caldo positivo.

3. Incuba a 37 ºC durante 48 horas.

4. Toma con una pipeta de Pasteur de cada tubo 1- 2 mL y deposítalos en un tubo de ensayo normal.

5. Añade 1-2 gotas del reactivo de rojo de metilo.

4. Incuba las placas a 37 ºC durante 48 horas.

6. Visualiza y anota los resultados, incluyendo la formación o no de gas en los tubos.

5. Visualiza y anota los resultados, dibujando las placas.

CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS:

1. Prepara 2 tubos con agar PCA en slant.

2. Inocula uno a partir de la misma colonia típica, de la placa de recuento en superficie, mediante una estría única superficial.

3. Inocula el otro, a partir del mismo tubo de caldo positivo, mediante una estría única superficial.

4. Incuba a 37 ºC durante 48 horas.

5. Visualiza y anota los resultados.

CULTIVO EN ANAEROBIOSIS:

1. Prepara 2 tubos de ensayo con unos 10 mL de agar PCA con un 1 % de glucosa.

2. Funde el medio de cultivo y ponlo en baño María a 100 ºC durante 10 minutos, o mejora aún, manténlos en la estufa de mantenimiento de agares una vez esterilizados.

3. Atempera los tubos a unos 47-45 ºC.

4. Siembra uno, a partir de una colonia típica en superficie, y el otro, a partir de un tubo positivo de caldo. Homogeneiza ambos tubos agitando suavemente mediante giro y sin formar burbujas de aire.

5. Solidifica los medios en baño de agua o al chorro de agua fría rápidamente.

6. Sella los tubos de ensayo con parafina.

7. Incuba a 37 ºC durante 48 horas en las condiciones menos oxigenadas posibles.

8. Visualiza y anota los resultados.

CULTIVO EN ANAEROBIÓSIS, AISLAMIENTO,

CONSERVACIÓN Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE MICROORGANISMOS GENÉRICOS

37 ºC 48 h.

PCA

37 ºC 48 h.

PCA (s)

BL

PCA con glucosa (1%) atemperado 45-47 ºC

PARAFINAR

37 ºC 48 h.

ENFRIAR

1-2 mL 37 ºC

48 h.

Rojo de metilo

Viraje = ácido(+)

PCA = Agar de recuento en placa BL = Caldo lactosado

BL

(16)

(17)

P6. Análisis de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a los análisis de microorganismos indicadores, mediante el análisis de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y E. coli.

Material:

- Mechero.

- Tubos de ensayo normales.

- Pipetas de Pasteur.

- Asa de siembra.

- Asa de Driglaski.

- Papel de filtro.

Reactivos:

- Rojo de metilo al 0,2 % (disolución hidroalcohólica).

- α-naftol al 40 % (etanol absoluto).

- Hidróxido potásico al 40 % (solución acuosa).

- Creatinina (sólida).

- Paradimetilaminobenzaldehído al 5 % (alcohol amílico / HCl c.c. 75:25).

- Clorhidrato de N,N-dimetilparafenildiamina al 1 % (solución acuosa).

- Agua de triptona.

- Caldo lactosado biliado verde brillante.

- Caldo E.C.

- Caldo MR-VP.

- Agar Levine.

- Agar nutritivo (o agar P.C.A.).

- Agar citrato de Simmons.

Procedimientos:

• ANÁLISIS DE COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO N.M.P.

• ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

• DETECCIÓN DE E. COLI.

• ANÁLISIS DE E. COLI EN MEDIO SÓLIDO.

• CONFIRMACIÓN GENERAL DE E. coli.

• CONFIRMACIÓN COMPLEMENTARIA DE E. coli.

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ANÁLISIS DE COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO N.M.P.:

1. Prepara la muestra.

2. Agita la mezcla.

3. Toma 1 ml de la mezcla.

4. Añade 9 mL de agua de peptona (PW) o agua de triptona (TW) como diluyente, y homogeneiza que se rotula como 10^-1. 5. Prepara las diluciones 10^-2 y 10^-3 de la

muestra.

6. Prepara 3 series de 3 tubos con campana de Durham de caldo lactosado biliado verde brillante al 2% (B.G.B.L.).

7. Añade con pipeta de 10 mL, previa agitación de las ciluciones decimales, y comenzando por la más diluida para utilizar una única pipeta, 1 mL de disolución 10^-1 a tres tubos rotulados al efecto, 1 mL de disolución 10^-2 a otros tres tubos y 1 mL de disolución 10^-3 a los otros tres tubos restantes.

8. Incuba a 37 ºC / 24 h.

9. Lee los tubos. Considera positivos aquellos cuya campana de Durham contiene al menos un 10 % de su volumen ocupado por gas.

10. Aplica la tabla de NMP, expresando el resultado como coliformes totales /mL de muestra.

ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.:

1. Con un asa de cultivo, subcultiva todos los tubos positivos para la investigación y recuento en medio líquido de coliformes totales, en 10 mL de B.G.B.L.(o también medio E.C.) con campana de Durham.

2. Incuba 44,5 ºC / 24-48 h en baño de agua, y si no es posible, en incubadora pero separados.

3. Lee los tubos. Considera positivos aquellos cuya campana de Durham contiene al menos un 10 % de su volumen ocupado por gas.

4. Aplica nuevamente la tabla de NMP, expresando el resultado como coliformes fecales /mL de muestra.

Nota: A los coliformes totales se les considera como presuntos E. coli.

H₂O

FECAL

LC1

2mL 18mL

AGITAR AGITAR AGITAR AGITAR

9mL TW (0,1 %) 1 mL

-1 -2 -3

10 mL BGBL (2%) ANÁLISIS DE

COLIFORMES TOTALES POR EL MÉTODO N.M.P.

1 mL ^AGITAR

37 ºC 24 h.

BGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillante TW = Agua de triptona

10 mL BGBL (2%) incubado a 37 ºC / 24 h ANÁLISIS DE COLIFORMES FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

AGITAR

AGITAR 44,5 ºC 24-48 h.

10 mL BGBL (2%)

-1 -2 -3

BGBL = Caldo lactosado bilidado al verde brillante

(19)

DETECCIÓN DE E. COLI:

1. Todos los tubos positivos presuntos E. coli se siembran por agotamiento en estrías sobre placas de Petri con agar Levine (E.M.B.).

10 mL BGBL (2%) incubado a 44,5 ºC / 24-48 h.

AGITAR

-1 -2 -3

2. Incuba las placas a 37 ºC / 24 h.

3. Lee las placas. Las colonias típicas presentan un centro negro-azulado y generalmente, pero no siempre, un brillo metálico verdoso.

Agar EMB secas

INVERTIR 37 ºC 24 h.

DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI

BGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillante EMB = Agar eosina azul de metileno (de Levine)

ANALISIS DE E. COLI EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA SUPERFICIAL:

1. Prepara una serie de diluciones decimales a partir de la muestra de LC1 contaminado.

2. A partir de la serie de diluciones decimales, y por duplicado, siembra 0,1 mL de cada dilución, por extensión superficial con asa de Driglaski, en placas de agar biliado rojo violeta lactosado (V.R.B.L.) perfectamente secas.

3. Incuba con las placas en posición invertida a 44,5 ºC / 24 h.

4. Lee las placas. Las colonias típicas son de color rojo-púrpura rodeadas de una zona violeta.

5. Haz el recuento de las placas (que contengan entre 30-300 colonias).

6. Expresa el resultado como ufc/mL de muestra.

Nota: Alternativa al método del N.M.P.

-2 -3 -1

1 mL

9mL TW (0,1 %)

2mL 18mL

ANÁLISIS DE E. COLI EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA SUPERFICIAL H₂O LC1

FECAL

0,1 mL

Agar VRBL secas

EXTENDER 44,5 ºC

24 h.

INVERTIR

TW = Agua de triptona VRBL = Agar lactosa bilis rojo violeta

(20)

CONFIRMACIÓN GENERAL Y COMPLEMENTARIA DE E. COLI:

1. Toma una colonia típica por placa de Levine y la subcultivas por duplicado en caldo B.G.B.L. con campana de Durham y en T.W (5%).

2. Incuba los tubos en baño de agua o en estufa a 44,5 ºC / 24-48 h.

3. Lee los tubos. Se consideran positivos, aquellos que:

• Presentan gas en el tubo de B.G.B.L. y,

• Al añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs para indol (paradimetilaminobenzaldehido) al tubo de T.W., agitar y transcurrido un minuto, se forma un anillo rojo (no amarillo) en su superficie.

4. Expresa los resultados obtenidos.

5. A partir de colonias típicas de Agar Levine, siembra placas con agar P.C.A. (o agar nutritivo).

6. Incuba a 37 ºC / 18-24 h.

7. Coloca en un cubeta de toques un disco de papel de filtro (preferiblemente Whatman).

8. Añade 3 gotas de solución acuosa al 1 % de α-naftol (dimetilparafenilendiamina), preparada recientemente.

9. Con una pipeta de Pasteur de punta cerrada, o mejor un capilar, toma una pequeña cantidad de una colonia y deposítala formando una línea.

10. Una coloración violeta-negro, se considera positiva, y por tanto no es E. coli.

11. En caso de ser oxidasa negativo siembra con la colonia 2 tubos de medio Clark y Lubs (MR-VP).

12. Incuba a 37 ºC / 4 días.

13. De uno de ellos, toma en un tubo de ensayo 1-2 mL y se añaden 1-2 gotas de rojo de metilo. Una coloración rojo indica positiva la prueba, como debe suceder con E. coli.

14. En el segundo tubo, se realiza la prueba de Voges-Proskauer, añadiendo 0,6 mL de α- naftol (al 40 % en etanol absoluto), 0,2 mL de potasa (al 40 % en agua) y unos cristales de creatinina.

15. Un fuerte color entre los 15 minutos y las 4 horas implica reacción positiva, contrario a E. coli.

16. A partir de una colonia reciente en el agar nutritivo utilizado, siembra un tubo en slant de agar citrato de Simmons, mediante estría única superficial.

17. Incuba a 37 ºC / 24 h.

18. Un crecimiento abundante (generalmente con alcalinización del medio), implica un

resultado positivo de la prueba, lo que no sucede con E. coli.

Nota: A las pruebas del rojo de metilo, Voges- Proskauer, Citrato de Simmons junto con la del indol, se las conoce como pruebas I.M.V.i C.

Agar EMB incubada a 37 ºC / 24 h.

10 BGBL (2%)

10 mL TW (5%)

AGITAR

FORMACIÓN DE GAS

44,5 ºC 24-48 h.

P-DIMETILAMINOBENZLDEHIDO

0,5 mL ^AGITAR anillo rojo

Agar EMB Agar PCA

37 ºC 24 h.

1 m.

3 gotas de α-naftol

color violeta (-)

Rojo metilo color rojo

37 ºC 4 días

Agar citrato de Simmons MR-VP

1) 0,6 mL de α-naftol 2) 0,2 mL de pot asa 3) crist al de creatinina

0,25- 4 h.

color (-) 37 ºC 24 h.

Crecimiento y alcalinización (-)

CONFIRMACIÓN

GENRAL Y COMPLEMENTARIA DE E. COLI

EMB = Agar de Levine

BGBL = Caldo lactosado biliado al verde brillante TW = Agua de triptona

MR-VP = Caldo de rojo de metilo-Voges Proskauer

(21)

P7. Análisis de Enterobacteriaceae totales.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos Enterobacteriaceae totales.

Material:

- Mechero.

- Pipetas de 10 mL graduadas.

- Asa de siembra.

- Pincho de siembra.

- Portaobjetos.

Reactivos:

- Hidróxido potásico al 3 % (solución acuosa).

- Agar nutritivo (o agar de recuento de placas PCA).

- Agar violeta rojo bilis glucosa.

- Agar de Klinger.

Procedimientos:

• ANÁLISIS EN MEDIO SÓLIDO CON SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA.

• CONFIRMACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAE.

(22)

Nota: La lectura sobre agar de Klinger, se verifica mirando el color del fondo (amarillo implica la fermentación de la glucosa y el rojo no), el color de la superficie (amarilla implica la fermentación de la lactosa y roja no), la presencia o ausencia de gas (atrapado en el medio, entre el medio y el tubo, o incluso rotura del agar) y la producción de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento de la interfase que separa el fondo de la pendiente y que incluso a veces se ennegrece toda la parte inferior del tubo).

ANÁLISIS EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA:

1. Prepara la muestra contaminando 18 de yogurt con 2 mL de agua fecal.

2. Pesa 1g de yogur.

3. Prepara una serie de diluciones decimales hasta 10^-3.

4. A partir de las diluciones decimales, y por duplicado, añade 1 mL a placas de Petri.

5. Añade en cada placa 10 mL de agar biliado rojo violeta glucosa (V.R.B.G.), fundido y atemperado a 45-47 ºC.

6. Mezcla cuidadosamente y deja solidificar.

7. Cubre las placas con otros 10 mL del mismo agar y deja solidificar de nuevo.

8. Incuba las placas, en posición invertida, a 37 ºC / 18-24 h.

9. Lee las placas. Las colonias características son de color violeta (fermentación de la glucosa con producción de ácido) con un halo de precipitación alrededor (sales biliares).

10. Expresa el resultado como ufc / g.

Nota: Las colonias típicas deben entenderse como presuntas Enterobacteriaceae.

CONFIRMACIÓN:

1. A partir de 2 colonias típicas, siembra por agotamiento en estrías las dos mitades de una placa bien seca de agar V.R.B.G.

2. Incuba a 37 ºC / 24 h.

3. Selecciona 2 colonias típicas y resiembra en dos mitades de una placa de agar nutritivo o P.C.A.

4. Incuba a 37 ºC / 18-24 h.

5. A partir de las colonias aisladas, siembra 2 tubos en slant de agar Klinger (K.I.A.), sembrando abundantemente en superficie mediante asa, y en el fondo por picadura mediante el pincho.

6. Incuba a 37 1ºC / 24 h.

7. Lee los tubos a las 24 horas siempre.

8. Compara los resultados obtenidos con la tabla de identificación sobra agar Klinger.

9. Como prueba adicional, toma una porción de una colonia y llévala sobre un portaobjetos con una gota de potasa.

10. Mezcla perfectamente con el asa de siembra y observa si al tirar del asa se forman filamentos o no, para comprobar si son Gram positivos o Gram negativos como corresponde a Enterobacteriaceae.

ANÁLISIS DE

ENTEROBACTERIACEAE EN MEDIO SÓLIDO SIEMBRA EN MASA CON DOBLE CAPA

TW = Agua de triptona

VRBG = Agar glucosa bilis rojo violeta PCA = Agar recuento en placa KIA = Agar de Klinger hierro

INVERTIR

24 h.

37 ºC Agar VRBG secas H₂O

FECAL

2mL 18 g

9mL TW (0,1 %) 1 mL

-1 -2 -3

YOGURT

1) 1 mL

2) 10 mL de agar atemperado 3) agitar

4) solidificar 5) 10 mL de agar atemperado 6) solidificar

18-24 h.

37 ºC VRBG

PCA Agar KIA

24 h.

37 ºC KOH

Gramnegativo

TABLA IDENTIFICACIÓN

(23)

P8. Análisis de estreptococos fecales.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos estreptococos fecales.

Material:

- Mechero.

- Pipetas de 10 mL graduadas.

- Asa de siembra.

- Portaobjetos y cubreobjetos.

- Papel de filtro.

Reactivos:

- Etanol de 95º.

- Hidróxido potásico al 3 % (disolución acuosa).

- Peróxido de hidrógeno (10 volúmenes).

- Agar nutritivo (o agar de recuento de placas P.C.A.).

- Caldo azida de Rothe.

- Caldo etil violeta azida o de Litsky.

Procedimientos:

• DETECCIÓN Y RECUENTO DE STREPTOCOCOS DEL GRUPO D DE LANCEFIELD:

• CONFIRMACIÓN DE LOS ESTREPTOCOCOS FECALES:

Nota: actualmente se suelen denominar como enterococos.

(24)

ANÁLISIS PRESUNTIVO DE ESTREPTOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

1. Prepara la muestra.

2. Pesa 1 g o toma 1 mL

3. Prepara la serie de diluciones decimales hasta 10^-3.

4. Prepara, ya rotulados, 3 series de 3 tubos con 10 mL de caldo de cultivo glucosa azida (Rothe).

5. Inocula 1 mL de cada dilución a cada serie.

6. Incuba a 37 ºC / 24-48 h.

7. Lee los tubos. Se consideran positivos si existe enturbiamiento del medio.

8. Expresa el resultado según la tabla de NMP en ufc /g.

ANÁLISIS CONFIRMATIVO DE ESPTREPTOCOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

1. Resiembra con tres asas de cultivo los tubos positivos del caldo presuntivo azida de Rothe, en caldo confirmativo etil violeta azida (E.V.A.) o caldo Litsky.

2. Incuba a 37 ºC / 24-48 h.

3. Lee los tubos. Se consideran positivos los que presentan enturbiamiento y/o sedimento violeta.

4. Resiembra los tubos sospechosos en placa de agar nutritivo o agar P.C.A., previamente sectorizadas.

5. Incuba a 37 ºC / 24-48 h.

6. A partir de una colonia aislada efectúa una tinción de Gram. Deben observarse cadenas de cocos Gram positivos.

7. A partir de una colonia aislada efectúa la prueba de la potasa.

8. Sobre un portaobjetos añade 1 gota de H2O2

de 10 volúmenes sobre la que se emulsiona el cultivo a estudiar. En el caso de desprendimiento de burbujas se considera al microorganismo catalasa positivo. Los estreptococos del grupo D de Lancefield son catalasa negativos.

Nota: Después de suspender, sobre unas gotas de solución acuosa de potasa al 3 % en un porta, con movimientos circulares una porción de colonia, sólo puede considerarse positivo el ensayo, si al tirar del asa se forma un mucus que se adhiere al asa de siembra.

H2O

FECAL

2mL 18 g

9mL TW (0,1 %) 1 mL

-1 -2 -3

10 mL GAB ANÁLISIS PRESUNTIVO DE ESTREPTOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

YOGURT

1 mL ^AGITAR

37 ºC 24-48 h.

GAB = Caldo glucosa azida (Rothe) TW = Agua de triptona

EVA = Caldo azida violeta de etilo (Litsky)

ANÁLISIS CONFIRMATIVO DE ESTREPTOCOCOS FECALES POR EL MÉTODO N.M.P.

AGITAR

37 ºC 24-48 h.

-1 -2 -3

3 AS AS

10 mL Azida de Rothe incubados 37 ºC / 24-48 h.

AGITAR

10 mL caldo EVA

H2O2 KOH

Gram cocos Gram (+)

Gram (+)

Catalasa (-) 37 ºC

24-48 h.

(25)

P9. Análisis de Clostridium sulfito reductores.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la preparación de muestras, preparación de medios de cultivo, siembra, incubación, identificación y recuento, mediante el análisis de microorganismos Clostridium sulfito reductores.

Material:

- Mechero.

- Baño de agua termostatizado.

- Jarra de anaerobiosis (o similar).

- Parafina.

- Agar sulfito-polimixina-sulfadiazina.

Procedimiento:

• PRESENCIA O AUSENCIA DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES.

Nota: Actualmente, se está sustituyendo este parámetro microbiológico por el de Clostridium perfringens.