Universidad de Costa Rica
Escuela de Biología
Andrés Gatica Arias, M.Sc.
andres.gatica@ucr.ac.cr
2511-8656
Contenidos
•
Introducción al curso
•
Cultivo de tejidos y sus aplicaciones
•
Historia del cultivo de tejidos
•
Laboratorio de cultivo de tejidos
•
Medios de cultivo
Lab
oratorio
de Cultiv
o de
Tej
ido
s
Tomado de Roca W.M., Mroginski L.A. (ed). 1993. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. CIAT
Cámara de flujo laminar
Control de la contaminación
microbiana
Control de la contaminación
microbiana
Fuentes de la contaminación
microbiana
Fuentes de la contaminación
microbiana
Fuentes de la contaminación
microbiana
Fuentes de la contaminación
microbiana
T omado de A gu il ar F . 2000.Esterilización
• Proceso por el cual cualquier material
vegetal, superficie o sitio se libera de
cualquier microorganismo vivo o espora.
• Asepsia.
• Cultivo axénico: cultivo que se encuentra
libre de virus, hongos y bacterias.
Preparación del explante
• Tratamiento de la planta donadora. • Desinfección superficial del explante. • Desinfectantes: – Etanol al 70 % v/v – Hipoclorito de sodio – Hipoclorito de calcio – Cloruro de mercurio • Antibióticos y fungicidas.
Chawla H.S. 2003. Plant Biotechnology: A practical approach.
Jiménez et al. 2006. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 86: 389–395
• Llama directa del mechero • Calor seco
– Estufa a 160-180 ºC por 2-3 horas. – Instrumentos y cristalería.
• Calor húmedo
– 15 min a 100 ºC.
– No destruye las esporas.
• Vapor bajo presión (autoclave)
– 15 lb por 20 min a 121 ºC.
– Tamaño y cantidad del recipiente, volumen del medio.
– Cambio de pH y degradación de compuestos.
• Filtración
– Filtros milipore (0.22 um) estériles.
– Líquidos sensibles al calor (termolábiles).
• Radiaciones ultravioleta
• 200-300 nm.
• Provocan la ruptura del ADN causando mutaciones.
• Control de microorganismos del 50 al 90 %.
• Superficies, agua y aire.
• Queman la piel (CUIDADO).
Control microbiológico
químico
Recomendaciones
• Limpiar la cámara de flujo laminar con alcohol de 70%.
• Desinfectar la parte externa de los recipientes y cualquier material que ingrese a la cámara.
• Desinfectar las manos y antebrazos con con alcohol de 70%.
• Flamear instrumentos metálicos con alcohol de 95%. • Trabajar en la parte interna de la cámara de flujo
laminar.
Componentes del medio de
cultivo
• Nitrógeno
– Sales de nitrato (25-40mM) o amonio (2-20 mM).
– Parte de los aa, proteínas y ácidos nucleicos. • Potasio (2-26 mM)
– Sales de nitrato (25-40mM) o cloruro. – Regulación osmótica en la célula.
Componentes del medio de
cultivo
• Calcio (1-3 mM)
– Componente de la pared y membrana celular, balance catión- anión.
• Fósforo (1-3 mM)
– Forma parte de las moléculas de ADN, ARN y ATP.
Componentes del medio de
cultivo
• Magnesio (1-3 mM)
– Componente de enzimas, fotosíntesis,
participa en la síntesis de ATP.
• Azufre (1-3 mM)
– Forma parte de aa, proteínas y enzimas.
– Sulfolípidos y polisacáridos.
Componentes del medio de
cultivo
• Boro
– En la síntesis y estabilidad de la pared y mebrana celular.
• Cloro
– Osmoregulación. – Fotosíntesis II.
Componentes del medio de
cultivo
• Cobre
– Participa en la fotosíntesis.
– Forma parte de complejos enzimáticos. • Cobalto
Componentes del medio de
cultivo
• Manganeso
– Participa en la Reacción de Hill en la fotosíntesis II.
– Forma parte de las metaloproteínas. • Molibdeno
– Cofactor en muchas enzimas.
Componentes del medio de
cultivo
• Zinc
– Participa en la síntesis de proteínas. – Forma parte de muchas enzimas. • Hierro
– Se adiciona como un quelato (EDTA) de tal manera que esta disponible a pH 8.0.
– Formación de proteínas: heme proteínas y proteínas azufre/hierro.
Fuentes de carbono
Citocininas
Naturales
Sintéticas
Citocininas
Fenilureas
Auxinas
Agentes gelificantes
• Agar (derivado de un alga): 6-10 gl-1.
• Alginato, Gelrite (requiere Ca y Mg), Phytagel. • Absorben y retienen agua y nutrientes.
