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Histamine-Release

Componentes de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa

de la emisión de histamina en sangre entera heparinizada. Este

producto puede ser usado solamente en conjunto con

IBL Histamine ELISA (REF RE59221).

RE95000

96

2-8°C

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Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

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1. USO PROPUESTO

Componentes de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de la emisión de histamina en sangre entera heparinizada.

Este producto puede ser usado solamente en conjunto con IBL Histamine ELISA (REF RE59221).

2. IMPLICACIONES CLÍNICAS

En los humanos, la histamina (ß-imidazola etilamina) es el mediador más importante y se encuentra principalmente en la fase inicial de una reacción anafiláctica (alergia de “tipo inmediato”). La histamina se biosintetiza mediante la descarboxilación enzimática de la histidina. En el organismo, la histamina está presente en casi todos los tejidos y se almacena principalmente en los gránulos metacromáticos de los mastocitos y los leucocitos basófilos. Está presente en una forma unida e inactiva, y sólo se libera según sea necesario.

De interés clínico en la determinación de la histamina es la cuantificación de la liberación de histamina de los leucocitos basófilos en alergias de “tipo inmediato”, además de la cantidad de histamina que está presente en distintos líquidos corporales (plasma, orina, sobrenadantes de cultivos celulares), después de la administración de alérgenos. El primer contacto del organismo con un alérgeno no tiene como resultado el comienzo de la liberación de histamina. Primero, se producen anticuerpos IgE específicos que migran a los mastocitos y allí se unen a los receptores. En el segundo contacto con el alérgeno, ya no se necesita una transformación de un linfocito B a un plasmocito. El alérgeno pasa directamente a los anticuerpos IgE ya unidos a los mastocitos y se une a estos anticuerpos. El mastocito responde mediante la secreción de histamina de sus gránulos.

3. PRINCIPIO DEL ENSAYO

Muestras de sangre enteras con heparina, son incubadas con diferentes concentraciones de supuestos alergenos. La liberación de histamina ocurrirá bajo la estimulación de granulacitos basofílicos, dependiendo de su sensibilidad al alergeno. La liberación de histamina en el sobrenadante se determina subsecuentemente usando un inmuno ensayo de plasma específico, el Histamine ELISA (REF RE59221) comprado con combinación con este kit. Este valor de histamina, se encuentra en relación con el control 100% (= Histamina total) y con el valor del blanco (= Liberación espontánea).

La determinación de la liberación in vitro de histamina representa un método sensitivo y específico asi como un procedimiento adicional a aquellos de diagnóstico rutinarios, incluyendo el ensayo convencional de piel y ensayos de radioalergenosorbentes (RAST) para la determinación de anticuerpos específicos IgE en suero de pacientes atópicos.

Adicionalmente, este ensayo detecta la capacidad de liberar histamina de las celulas.

La detección directa de sustancias mediadoras durante una reacción alérgica, no posee solo un interés científico sino un significado práctico en relación a la terápia antagónica específica.

Este ensayo es también apto para el análisis de respuestas patofisiológicas a drogas, químicos y otros compuestos que no han sido evaluados en sus efectos adversos.

4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional.

2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo.

3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.

4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos.

5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.

6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL.

7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad.

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5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8°C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes.

6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Sangre Heparinizada

Veinticuatro horas antes de la extracción de muestras de sangre, el paciente debe evitar tomar cualquier medicamento que le produzca alergia, antihistamínicos, corticoesteroides orales y sustancias que bloqueen los receptores H2.

La liberación de histamina se realiza con sangre heparinizada. Deben observarse las precauciones usuales para las venopunciones. Es importante preservar la integridad química de una muestra de sangre, desde el momento de su extracción hasta su análisis.

Las muestras deben mezclarse con cuidado, inmediatamente después de su obtención.

Cálculo de los volúmenes de las muestras para la determinación de histamina mediante ELISA: 50 µL para contenido total de histamina

200 µL para liberación espontánea 200 µL para control positivo con anti-IgE 200 µL para cada concentración de alérgeno

Ejemplo: Para un análisis con 2 alérgenos y 5 concentraciones cada uno, se necesitarán 2.45 mL de sangre.

Almacenamiento: 18-25°C

Estabilidad: 24 h

Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. No refrigerar. A 2ºC–8ºC, los leucocitos se coagulan.

7. MATERIALES SUMINISTRADOS

Cantidad Símbolo Componente

1 x RELEASEBUF Solución Buffer de Separación liofilizado Ácido piperazinodietanosulfónico en amortiguador con 0.01% de timerosal.

1 x ANTI IGE Anti-IgE liofilizado IgE antihumano. Anticuerpo policlonal de oveja.

1 x 20 mL HYPOMED medio hipotónico Listo para usar. Solución de sal.

8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS

Además de los materiales necesarios para la determinación de histamina mediante ELISA, se necesitan los siguientes materiales:

1. Tubos de ensayo desechables de cristal (12 x 75 mm) 2. Centrífuga; ≥ 700 x g

3. Baño maría, 37°C 4. Baño de hielo

9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO

1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados.

2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25°C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.

3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.

4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo.

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5. Las fuerza centrífuga relativa (g) no es equivalente a las revoluciones por minuto (rpm) sino que tiene que ser calculada teniendo en cuenta el radio del rotor de la centrífuga.

10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO

10.1. Preparación de componentes liofilizados o concentrados

Diluya / disuelva

Componente con Diluyente Notas Almacenamiento Estabilidad

2-8°C 3 d.

RELEASEBUF 20 mL agua bidest. Deje reposar durante 15 min. Mezcle sin formar espuma.

≤ 20°C 1 mes

2-8°C 3 d.

ANTI IGE 2 mL RELEASEBUF (reconstituido) Deje reposar durante 15 min. Mezcle sin formar espuma.

≤ 20°C 1 mes

10.2. Preparación de Alérgenos

Preparar varias diluciones en 10 partes (por ej. de 10-1 a 10-5) usando una solución madre de alérgenos de 1 mg/mL (por ej. solución madre en 0.9% de NaCl o amortiguador PBS).

10-1 = 30 µL Solución stock del alergénico (1 mg/mL) + 270 µL Solución Buffer de Separación 10-2 = 30 µL 10-1 Dilución + 270 µL Solución Buffer de Separación 10-3 = 30 µL 10-2 Dilución + 270 µL Solución Buffer de Separación 10-4 = 30 µL 10-3 Dilución + 270 µL Solución Buffer de Separación 10-5 = 30 µL 10-4 Dilución + 270 µL Solución Buffer de Separación

11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

11.1. Reacción de Sangre con Diluciones de Alérgenos (en tubos de vidrio)

Rotular los tubos de vidrio según el siguiente esquema para cada alérgeno y cada muestra de los pacientes. Colocar con una pipeta anti-IgE, dilución de alérgenos, sangre y amortiguador de liberación, según el esquema, en los tubos respectivos. Revolver con cuidado las muestras de sangre antes de transvasarlas con una pipeta.

Tubo Anti-IgE Dilución de

Alérgenos Sangre Buffer de Solución Separación 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 etc. - - - - - - 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL - - - - - - Liberación Espontánea - - 200 µL 200 µL 1. Control Positivo 200 µL - 200 µL -

2. Mezclar los tubos con cuidado y evitar dejar gotas en la pared del tubo. 3. Incube 60 min a 37 °C en baño maría.

4. Detener la liberación mediante incubación durante 10 minutos en un baño de hielo. 5. Centrifuge 10 min a 700 x g.

6. Extraer 100 µL del sobrenadante transparente para el paso de acilación de la determinación de

Histamina mediante ELISA. Evitar la toma de células del sedimento.

11.2. Histamina Total

Para liberar la histamina total de los leucocitos.

1. Transvasar con una pipeta 50 µL de cada muestra de sangre heparinizada a los tubos de vidrio. 2. Agregar con una pipeta 950 µL de Medio Hipotónico a cada tubo.

3. Incube 60 min a 37°C en baño maría.

4. Mezclar usando un vortex. Extraer 100 µL para el paso de acilación de la determinación de

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11.3. Almacenamiento de las Muestras

Los sobrenadantes de las muestras respectivas pueden almacenarse a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC por un día. Para un almacenamiento durante más tiempo, hasta una semana, congelar a -20ºC. Evitar el descongelamiento y congelamiento reiterados.

11.4. Acilación para el análisis ELISA (en tubos de vidrio)

Usar los estándares de plasma para la sangre completa.

Usar los estándares U/C para los sobrenadantes de cultivos de células sin suero.

Para detectar cualquier influencia de la preparación de alérgenos, debe realizarse una o más de una de las diluciones de alérgenos, a modo de control adicional de alérgenos en el ensayo.

La acilación se realiza de acuerdo con el siguiente esquema. Estándares de Plasma (para sangre completa) Sobrenadante de Liberación e Histamina total Dilución de

Alérgenos Plasma de Control 1+2 (del kit ELISA)

Estándares 50 µL - - - Sobrenadante de

Liberación e

Histamina total - 100 µL - - Dilución de Alérgenos - - 50 µL -

Controles del Kit - - - 50 µL Solución Buffer de

Separación 50 µL - 50 µL 50 µL Solución Buffer

Indicadora 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL Mezclar usando un vortex.

Reactivo de Acilación 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL Mezclar usando un vortex.

Incube 30 min a TA (18-25°C).

Buffer de Ensayo 0.75 mL 0.75 mL 0.75 mL 0.75 mL Mezclar usando un vortex.

11.5. Histamine ELISA

Realice la determinación de Histamina mediante ELISA de acuerdo con lo indicado en el capítulo PROCEDIMIENTO DE ENSAYO de las instrucciones de determinación de Histamine ELISA (REF RE59221).

12. CONTROL DE CALIDAD

Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados.

En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado.

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13. CÁLCULO DE RESULTADOS

Debido al factor de dilución 1:2 para los estándares, la concentración de histamina de las muestras desconocidas (liberación espontánea, control positivo, liberación del sobrenadante, control de alergeno) puede ser leida directamente de la curva de estándares.

El valor total de histamina debe ser corregido multiplicando por 10 (debida a la dilución por 20 durante la liberación de histamina).

El resultado de la liberación espontánea debe ser substraido de las muestras desconocidas y de la histamina total. Calcule el porcentaje para cada muestra, considerando el contenido total como 100%. Dibuje la curva del porcentaje de histamina liberada versus la concentración del alergeno, en un papel semi logaritmico.

El grado de sensibilización celular (HR50) está definido como la concentración de alergeno que induce a una liberación del histamina del 50% de la histamina total. Si la liberación es menor al 50%, se puede usar el HR30 (concentración de alergeno que induce una liberación del 30%).

Un ejemplo típico de liberación de histamina se da a continuación.

Resultados Típicos de un Experimento de Liberación de Histamina.

Conversión:

Histamina (ng/mL) x 8.997 = nmol/L

14. VALORES ESPERADOS

Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico.

Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: Histamina total en sangre

entera <59 ng/mL (en sangre total con EDTA después de la lisis con media hipotónica al hora de medir la histamina total solamente, pero no la Emisión por inducción Alérgica)

Emisión Espontánea Este valor deber ser menor al 5% del contenido total de histamina. Valores más elevados indican ruptura de células. Personas que no presentan alergias tiene una emisión espontánea de 1-2 ng/ml.

Control Positivo Este valor debe ser mayor al 5% del contenido total de histamina. Emisión por inducción

Alérgica Cualquier emisión mayor al 5% (después de la substracción del valor correspondiente a la emisión espontánea) debe ser considerado como una reacción alérgica positiva.

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15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La toma de la muestra tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles.

16. PRUEBAS FUNCIONALES

Vea las instrucciones de uso del ensayo Histamine ELISA (REF RE59221).

17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO

1. Carlos D. Infection and Immunity (2009) Histamine plays an essential regulatory role in lung inflammation and protective immunity in the acute phase of Mycobacterium tuberculosis infection

2. Patou J. J Allergy Clin Immunol (2007) Staphylococcus aureus enterotoxin B, protein A, and lipoteichoic acid stimulations in nasal polyps.

3. Clejan, S., J. Cell. Mol. Med. (2002) Blood histamine is associated with coronary artery disease, cardiac events and severity of inflammation and atherosclerosis.

4. Crockard, AD., Clinical and Experimental Allergy (2001) Basophile histamine release tests in the diagnosis of allergy and asthma.

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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.

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Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

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