Análisis Metabolómico

5.3.1. Análisis de Compuestos Volátiles por GC-MS

Los compuestos volátiles se determinaron utilizando un cromatógrafo de gases (GC) 7890B acoplado a un detector de espectrometría de masas exactas híbrido con cuadropolo tiempo de vuelo (QTOF-MS) de la serie 7200, de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA). Para esto, se colocaron 10 mL de muestra y 3 g de NaCl en un vial de vidrio ámbar de 20 mL, la cual fue estabilizada a 40°C por 5 min antes de realizar la microextracción en fase sólida del espacio de cabeza de la muestra (HS-SPME, por sus siglas en inglés) con la fibra 50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex de Supelco. Previo a la extracción, la fibra fue acondicionada por 30 min a 240°C. La extracción de compuestos se realizó a 40°C por 30 min aplicando una agitación intermitente a 250 rpm. La fibra fue desorbida por 10 min en el puerto de inyección a una temperatura de 250°C, aplicando una dilución 1:20 (Hjelmeland et al., 2013).

La separación de compuestos se realizó con la columna DB-WAX (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm), el horno se mantuvo a 45°C por 2 min, después se aumentó la temperatura, a una velocidad de 3°C/min, hasta 250°C, la cual se mantuvo por 34 min (Agilent J&W GC Column Selection Guide, 2011). Se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1.29 mL/min, flujo establecido al realizar el RTL (Retention Time Locking, Tiempo de retención fijado) con el estándar 2-Undecanona (Sigma, Aldrich). La temperatura de la línea de transferencia del detector fue de 250°C, la temperatura de la fuente de ionización de impacto electrónico fue de 230°C y su energía de 70 eV. Las muestras fueron analizadas en modo centroide donde la medición se realizó desde 40 m/z hasta 300 m/z adquiridas a 5.8 scans/seg. El método fue validado con los estándares de α-Pineno, Limoneno, γ-Cimeno y 2-Undecanona (tabla 3, Anexo 1).

35 5.3.2. Análisis de Compuestos No Volátiles por LC-MS

Para la determinación de compuestos no-volátiles, se centrifugó 1.5 mL de muestra a 4°C por 5 minutos a 10,000 rpm. Después, se colocó 0.5 mL del sobrenadante en viales de vidrio ámbar con capacidad de 2 mL y se añadió ácido micofenólico deuterado como estándar interno para obtener una concentración final de 25 μg/mL. Se inyectó 4μL de muestra y se analizó en un UHPLC Infinity II 1290 acoplado a un detector QTOF-MS 6530 con fuente de ionización JetStream Electrospray Ionization (ESI), ambos de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA). Se utilizó una columna Kinetex C18 (50 mm x 2.10 mm x 2.6 μm) como fase estacionaria, la cual se mantuvo a 20°C. Las fases móviles fueron 0.1% de ácido fórmico acuoso (A) y 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo (B), utilizando un flujo de 0.4 mL/min. Se utilizó el gradiente lineal establecido por Arbulu y colaboradores (2015) a partir del 2% de B a los 0 min hasta el 40% de B a los 30 min y 100% de B a los 40 min, para regresar a la concentración inicial del 2% de B a los 41 min y reequilibrar la columna por 5 min, para obtener un tiempo total de corrida de 46 min.

La ionización de los compuestos se realizó en modo negativo con las siguientes condiciones en la fuente de ionización: la presión del gas nebulizador fue de 40 psi, la temperatura del gas de secado fue de 300°C con un flujo de 8 L/min, la temperatura del gas envolvente fue de 350 °C y un flujo de 10 L/min. Los iones fueron introducidos al detector por el capilar a un voltaje de 3500 V, el voltaje del fragmentor fue de 150 V y del skimmer fue de 65 V. La adquisición de los datos fue a 2.02 espectros/s en modo centroide en un rango de masa de 50-1700 m/z. Se determinaron límites de detección (LDD) y límites de cuantificación (LDC) para 4 compuestos volátiles y 14 compuestos no-volátiles (tabla 3) para control interno de los métodos (ver Anexo 1).

36 Tabla 3. Determinación de LDD y LDC el análisis de compuestos volátiles y no-volátiles por GC-QTOF/MS y LC-QTOF/MS, respectivamente.

Compuesto

TR¹ (%CV) LDD² LDC³ %CV

Volátiles^ᶲ

α-Pineno 7.113 min

(0.04%) 7.4251 ng/L 24.7503 ng/L 10.30%

Limoneno 13.218 min

(0.03%) 5.7862 ng/L 19.2873 ng/L 8.20%

γ-Cimeno 16.020 min

(0.04%) 4.7591 ng/L 15.8635 ng/L 6.60%

2-Undecanona 29.501 min

(0.01%) 20.2964 ng/L 67.6548 ng/L 15.00%

No-volátiles^†

Ácido gálico 1.271 min

(0.82%) 0.2162 μg/mL 0.7207 μg/mL 4.30%

Ácido protocatéico

2.284 min

(0.81%) 0.2706 μg/mL 0.9020 μg/mL 5.30%

(-)-Esculina 4.211 min

(0.63%) 0.3147 μg/mL 1.0489 μg/mL 6.60%

Ácido cafeico 5.537 min

(0.68%) 0.1276 μg/mL 0.4252 μg/mL 2.60%

Epicatequina 7.286 min

(0.53%) 0.0779 μg/mL 0.2597 μg/mL 1.60%

Ácido p-

cumárico 7.727 min

(0.55%) 0.0957 μg/mL 0.3192 μg/mL 2.00%

Ácido ferúlico 8.976 min

(0.43%) 0.0718 μg/mL 0.2393 μg/mL 1.50%

Ácido

sinapínico 9.579 min

(0.34%) 0.0787 μg/mL 0.2622 μg/mL 1.70%

Naringina 12.768 min

(0.20%) 0.0926 μg/mL 0.3087 μg/mL 1.90%

Mircetina 13.714 min

(0.38%) 0.0660 μg/mL 0.2199 μg/mL 2.70%

Ácido

transcinámico

14.043 min

(0.25%) 0.0531 μg/mL 0.1770 μg/mL 1.10%

Quercetina 16.901 min

(0.29%) 0.0539 μg/mL 0.1798 μg/mL 2.20%

Apigenina 19.715 min

(0.19%) 0.0744 μg/mL 0.2481 μg/mL 3.00%

Isorhamnetina 20.355 min

(0.21%) 0.0360 μg/mL 0.1199 μg/mL 1.50%

1Tiempo de retención

2Límite de detección, ³Límite de cuantificación (n=8)

ᶲn=8 para cálculo de TR, ^†n=36 para cálculo de TR

37 5.3.3. Minería de Datos

Los cromatogramas obtenidos por ambas cromatografías fueron analizados en la paquetería bioinformática de MassHunter para realizar la minería de datos. El análisis inicial de los cromatogramas obtenidos por GC-QTOF/MS se realizó en el programa Qualitative Navigator B.08.00, mientras que el de los cromatogramas obtenidos por LC- QTOF/MS se hizo en el programa Qualitative Analysis B.07.00. Lo anterior para conocer los valores de la señal ruido y la ventana del tiempo de retención de los picos cromatográficos, los cuales son necesarios para realizar la minería de datos por la herramienta de deconvolución recursiva de características de bajo peso molecular (MFE) en el programa Profinder B.08.00. Con esta herramienta, se realizó la alineación de las características volátiles y no volátiles en una ventana de 0.20 min y que cumplieran con una puntuación ≥ 70% de los parámetros de extracción. Además, la extracción de iones se realizó en una ventana de similaridad de 2 mDa + 5.6 ppm (ver Anexo 2). Estos resultados se exportaron en formato para el intercambio de compuestos (.CEF, Compound Exchange Format) para poder ser importados al programa Mass Profiler Professional B.14.9.1 donde se realizó el análisis estadístico.

5.3.4. Identificación de Compuestos

5.3.4.1. Identificación de compuestos no-volátiles. Se realizó en el programa Mass Profiler Profesional de Agilent MassHunter versión B.14.9.1, a través de la herramienta IDBrowser Identification. Los compuestos se identificaron con la librería Metlin_Metabolites_AM_PCDL.cdb con una tolerancia de masa de 10ppm ± 2mDa, se seleccionaron los iones negativos –H y HCOO como posibles agregados, así como la presencia de dímeros. Los compuestos no identificados por esta librería se buscaron manualmente en la librería en línea de Metlin (https://metlin.scripps.edu/).

38 5.3.4.2. Identificación de compuestos volátiles. Se creó una librería de masas unitarias para identificar los compuestos por su patrón de fragmentación, tiempo de retención (TR) e índice de retención lineal (IRL). Para ello, se analizaron 10 muestras de una mezcla de vinos tintos con el método mencionado en el punto 5.3.1. Los cromatogramas obtenidos se analizaron por deconvolución en el programa Unknown Analysis B.09.00 de Agilent MassHunter, una vez obtenido el patrón de fragmentación de los compuestos se identificaron con la librería de masas exactas Flavors14 con una variación menor a 5ppm.

Al identificar los compuestos, se creó una nueva librería de masas exactas con los TR obtenidos y se nombró Vino_RT_ExactMass.mslibrary.xml, además, se adicionó el IRL a cada uno de los compuestos. Esta librería se convirtió en librería de masas unitarias (Vino_RT_UnitMass.mslibrary.xml), la cual fue utilizada para la identificación por patrón de fragmentación, RT e IRL de los compuestos presentes en las muestras de mosto. Lo anterior fue realizado con el programa Library Editor B.09.00. Los compuestos que no fueron identificados por esta librería se buscaron en la librería NIST17, donde solo se identificaron por su patrón de fragmentación.