a) Preparación de reactivos:
Folin-Ciocalteau 0,25N
- La presentación del reactivo es líquida a una concentración de 2N, por lo cual es necesario realizar el siguiente cálculo:
C1 x V1 = C2 x V2
V1 = (0,25N x 100mL)/2N V1 = 12,5mL/100mL
- Extraer 12,5mL de reactivo, verterlo en una fiola de 100mL y enrasar con agua destilada.
- Trasferir la solución a un frasco ámbar.
- Almacenar a temperatura ambiente.
Carbonato de sodio 1N
- Pesar 10,652g de reactivo para obtener 200mL de solución.
- Colocar el reactivo pesado en una fiola apropiada y disolver con agua destilada.
- Almacenar a temperatura ambiente.
b) Procedimiento:
Colocar 0,1g de muestra en un tubo Falcon y adicionar 9,9mL de metanol.
Mezclar hasta una consistencia uniforme usando el agitador por 15 segundos.
Almacenar 24 horas en refrigeración a 4 °C.
Después del reposo, centrifugar a 6000rpm por 20 minutos.
Filtrar con papel Whatman #42 para la separación de partículas.
Con una micropipeta tomar 0,5mL del sobrenadante claro de la muestra, adicionar 8mL de agua destilada y mezclar en un tubo de plástico con tapa.
Paralelamente preparar un blanco con 0,5mL de metanol.
Añadir 0,5mL del reactivo Folin-Ciocalteau 0,25N, mezclar y dejar que reaccione por 3 minutos.
Luego, adicionar 1mL de carbonato de sodio 1N, mezclar y permitir que reaccione por 10 minutos.
Después de 30 minutos de reacción en la oscuridad, colocar la alícuota en una celda de cuarzo, limpiando sus paredes exteriores con papel tissue.
Llevar el espectrofotómetro a cero con la solución blanco de metanol.
Realizar la lectura de las absorbancias a 725nm.
Si la absorbancia es mayor a 0,6; diluir el extracto de la muestra a un factor conveniente y repetir el ensayo. Por ejemplo: 0,2mL de muestra es añadida a 0,3mL de metanol para formar un total de 0,5mL.
Los resultados del contenido de compuestos fenólicos se expresan como equivalente de Ácido Clorogénico, usando la respectiva curva estándar:
Ácido Clorogénico Eq. = (0,5486 x Abs - 0,0082) (mL extracto total/g muestra) (0,5mL muestra reactante/mL extracto de muestra) x 100
Ácido Clorogénico Eq. = mg Ácido Clorogénico/100g muestra
Donde:
Abs = Absorbancia a 725nm
Anexo 02. Metodología de la determinación de la capacidad antioxidante
a) Preparación de reactivos:
Solución madre DPPH
- Disolver 12mg de reactivo DPPH con metanol y enrasar en una fiola de 50mL.
- Dejar reposar en congelación durante 40-60 minutos.
Solución diluida DPPH
- Verter 10mL de solución madre DPPH en una probeta y mezclar con 45mL de metanol.
- Llevar el espectrofotómetro a cero usando metanol.
- Asegurar que la absorbancia inicial a 515nm de la solución diluida DPPH esté alrededor de 1,1 ±0,02. Si no alcanza este valor, se utiliza la solución madre para concentrar o metanol si es necesario diluir.
- Trasferir la solución a un frasco ámbar.
- Almacenar a - 20°C hasta una semana como máximo, luego desechar.
b) Procedimiento:
Colocar 0,1g de muestra en un tubo Falcon y adicionar 9,9mL de metanol.
Mezclar hasta una consistencia uniforme usando el agitador por 15 segundos.
Almacenar 24 horas en refrigeración a 4 °C.
Después del reposo, centrifugar a 6000rpm por 20 minutos.
Filtrar con papel Whatman #42 para la separación de partículas.
Con una micropipeta tomar 150µL del sobrenadante claro de la muestra, añadir 2850µL de solución diluida DPPH y mezclar en un tubo de plástico con tapa.
Simultáneamente preparar un blanco con 150µL de metanol.
Después de 30 minutos de reacción en la oscuridad, colocar la alícuota en una celda de cuarzo, limpiando sus paredes exteriores con papel tissue.
Llevar el espectrofotómetro a cero con la solución blanco de metanol.
Realizar la lectura de las absorbancias a 515nm.
Si la absorbancia es menor a 0,1; diluir el extracto de la muestra a un factor conveniente y repetir el ensayo. Por ejemplo: a 50µL de muestra adicionar 100µL de metanol para formar un total de 150µL.
Los resultados de la capacidad antioxidante se expresan como equivalente de Trolox, usando la respectiva curva estándar:
Trolox Eq. = (868,24 x Abs) (0,25) (mL extracto total/g muestra) (150µL muestra reactante/µL extracto de muestra)
Trolox Eq. = µg Trolox/g muestra
Donde:
Abs = Absorbancia a 515nm
Anexo 03. Resultados del contenido de compuestos fenólicos
Código de
muestra Repetición
mg Ácido Clorogénico/100g
muestra
CTR-00
1 4707,55
2 4704,53
3 4709,27
CTR-01
1 1772,10
2 1775,98
3 1774,29
CTR-02
1 1991,71
2 1967,14
3 1980,40
CTR-03
1 1867,28
2 1865,15
3 1863,98
CTM-00
1 4896,98
2 4876,84
3 4855,42
CTM-01
1 2095,04
2 2157,46
3 2127,59
CTM-02
1 2007,21
2 2089,67
3 2049,07
CTM-03
1 1866,09
2 1891,07
3 1839,31
Anexo 04. Resultados de la capacidad antioxidante
Código de
muestra Repetición µg Trolox/g muestra
CTR-00
1 26137,18
2 26450,13
3 25826,89
CTR-01
1 8361,09
2 9064,04
3 8713,63
CTR-02
1 7372,48
2 8638,99
3 8006,01
CTR-03
1 9509,91
2 8283,99
3 8896,09
CTM-00
1 26112,17
2 26177,44
3 26145,02
CTM-01
1 7466,26
2 7687,48
3 7906,88
CTM-02
1 8036,85
2 7942,88
3 7988,96
CTM-03
1 8295,00
2 8356,81
3 8231,12
Anexo 05. Análisis de regresión lineal simple para de los granos de café verde y tostado (Variedad Caturra rojo)
Análisis de Regresión: Modelo Lineal Y = a + b*X Variable dependiente: CA (Capacidad Antioxidante)
Variable independiente: CCF (Contenido de Compuestos Fenólicos)
Análisis de Varianza
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo 2,30544 1 2,30544 208,83 0,0048
Residuo 2,20793 2 1,10396
Total (Corr.) 2,32752 3
Coeficiente de correlación = 0,995246 R-cuadrado = 99,0514%
La salida muestra los resultados de ajustar un modelo lineal para describir la relación entre CA y CCF. La ecuación del modelo ajustado es:
CA = - 3004,73 + 6,17563*CCF
Puesto que el valor-P en la tabla ANOVA es menor que 0,01, existe una relación estadísticamente significativa entre CA y CCF con un nivel de confianza del 99,0%.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo ajustado explica 99,0514% de la variabilidad en CA. El coeficiente de correlación es igual a 0,995246, indicando una relación relativamente fuerte entre las variables.
Anexo 06. Análisis de regresión lineal simple para de los granos de café verde y tostado (Variedad Catimor)
Análisis de Regresión: Modelo Lineal Y = a + b*X Variable dependiente: CA (Capacidad Antioxidante)
Variable independiente: CCF (Contenido de Compuestos Fenólicos)
Análisis de Varianza
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo 2,44756 1 2,44756 186,70 0,0053
Residuo 2,62190 2 1,31095
Total (Corr.) 2,47378 3
Coeficiente de correlación = 0,994686 R-cuadrado = 98,9401%
La salida muestra los resultados de ajustar un modelo lineal para describir la relación entre CA y CCF. La ecuación del modelo ajustado es:
CA = - 4643,53 + 6,29185*CCF
Puesto que el valor-P en la tabla ANOVA es menor que 0,01, existe una relación estadísticamente significativa entre CA y CCF con un nivel de confianza del 99,0%.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo ajustado explica 98,9401% de la variabilidad en CA. El coeficiente de correlación es igual a 0,994686, indicando una relación relativamente fuerte entre las variables.
Anexo 07. Galería de fotografías
Fotografía 01.
Cosecha de café cerezo
Fotografía 02.
Recepción y pesado de café cerezo
Fotografía 03.
Café cerezo en el tanque de selección por flotación
Fotografía 06.
Tanque lavadero
Fotografía 05.
Tanque de fermentación con granos despulpados en ruma Fotografía 04.
Despulpadora de tambor horizontal
Fotografía 07.
Secado al sol sobre un tendal de cemento, removiendo los granos con el rastrillo
Fotografía 08.
Café pergamino almacenado en sacos de yute
Fotografía 09.
Café pergamino ingresando a la piladora-pulidora
Fotografía 12.
Granos de café tostado a ser enfriados incorporando un flujo de aire del ventilador de la tostadora
Fotografía 11.
Café verde ingresando a la tostadora de laboratorio Fotografía 10.
Clasificadora de granos por tamaño
Fotografía 13.
Café verde y tostado envasado en frascos de vidrio rotulados
Fotografía 15.
Centrifugado a 6000rpm por 20 minutos luego del almacenado en refrigeración durante 24 horas
Fotografía 14.
Mezclado de la muestra con metanol usando el agitador magnético Vortex
Fotografía 18.
Adición de la solución diluida DPPH (capacidad antioxidante)
Fotografía 17.
Alícuotas de muestra con los reactivos Folin-Ciocalteau 0,25N y Carbonato de Sodio 1N (compuestos fenólicos)
Fotografía 16.
Separación del sobrenadante claro de las muestras antes de tomar alícuotas
Fotografía 19.
Lectura de absorbancias en el espectrofotómetro a 725nm (compuestos fenólicos) y a 515nm (capacidad antioxidante)
Fotografía 20.
Placas de metal con muestra en la estufa
Fotografía 21.
Crisoles con muestra siendo colocados en la mufla
Fotografía 22.
Equipo Soxhlet
Fotografía 23.
Equipo de destilación semi- micro Kjendhal
Fotografía 24.
Equipo de extracción de fibra cruda