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[60] es.wikipedia.org/wiki/vitaminaC
ANEXOS
ANEXO 1
AZÚCARES REDUCTORES
Se realizó siguiendo el método de Miller G. (1959). El método D.N.S., utiliza el ácido 3,5 dinitrosalicílico, hidróxido de sodio, fenol y tartrato de sodio y potasio, los que reaccionan con los grupos aldehídos o acetonas de los azucares reductores, formando un compuesto de color marrón cuya intensidad es proporcional a la cantidad de azucares presentes en la solución.
Preparación de los reactivos
Reactivo D.N.S
• 1,0 g de acido dinitrosalicílico.
• 1,1 g de Hidroxido de Sodio.
• 0,2 g de Fenol.
• 0,05 g de Sulfito de Sodio. Colocar todos los reactivos en un vaso y disolver con agua destilada tibia, luego enrasar en una fiola de 100 mL
Preparación de la Curva Estándar
• Pesar 1 g de glucosa anhidra, mas 0,02 g de ácida de sodio diluir y enrasar en una fiola de 100 mL.
• Tomar alícuotas de 2, 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 y 26 mL, colocarlas en fiolas de 100 mL ,enumeradas del 1 al 13 y enrasarlas con agua destilada.
• De cada fiola tomar 1 mL de estándar y colocarlas en tubos de prueba enumeradas del 1 al 13; y añadir 1 mL de agua destilada a cada tubo.
• En el tubo 14 colocar 2 mL de agua destilada (blanco).
• A cada tubo añadir 2 mL del reactivo D.N.S. incluido al blanco y llevar a baño maría en ebullición durante 10 minutos.
• Añadir 1 mL de sal de Rochelle al 40% a cada tubo tamb ién al blanco.
• Enfriar en agua corriente durante 2 a 5 minutos.
• Añadir 10 mL de agua destilada a cada tubo, igual al blanco.
• Mezclar completamente invirtiendo varias veces, haciendo que la solución se separe del fondo del tubo en cada inversión (este es importante).
• Leer la Densidad Óptica a 540 nm, previamente calibrar el espectrofotómetro a cero de Absorbancia, con el blanco.
• Construir la grafica entre mg de Glucosa/ mL versus Densidad Optica.
Nota: Las lecturas deben ser hechas durante 20 minutos, tiempo en que el color se mantiene estable.
Determinación de Azucares Reductores
• Tomar 1 mL de extracto, colocarla en un tubo de ensayo, añadir 1 mL de agua destilada, más 2 mL del Reactivo D.N.S. Preparar en otro tubo el blanco (2 mL de agua destilada más 2 mL de D.N.S.).
• Llevar los tubos a baño maría en ebullición durante 10 minutos.
• Añadir 1 mL de Sal de Rochelle al 40 %.
• Enfriar en agua corriente durante 2 a 5 minutos.
• Añadir 10 mL de agua destilada.
• Mezclar completamente invirtiendo el tubo varias veces.
• Leer la Densidad Óptica o Absorbancia a 540 nm. Previamente calibrar a cero de absorbancia con el blanco.
• Determinar la concentración de azucares reductores (mg de glucosa/mL) en la curva estándar.
ANEXO 1.1. Curva estándar para determinar azúcares reductores mg/ml Densidad óptica promedio
0,0000 0,0000
0,2000 0,1250
0,4000 0,2730
0,6000 0,3960
0,8000 0,5670
1,0000 0,7270
1,2000 0,8240
1,4000 0,9830
1,6000 0,1220
1,8000 1,2760
2,0000 1,3820
2,2000 1,5210
y = 0,6126x + 0,0092
ANEXO 1.2. Análisis estadístico
ANÁLISIS DE VARIANZA DEL CONTENIDO DE AZÚCARES REDUCTORES
Obtenidos mediante el software SAS V. 9,1.
Fuente Df Suma de cuadrados Cuadrado de la media F-valor Pr>F A 2 206,5678468 103,2839234 725,81 <,0001 **
B 2 9,7385172 4,8692636 34,22 <,0001 **
C 2 15,5389875 7,7694938 54,60 <,0001 **
A*B 4 14,8702916 3,717529 26,12 <,0001 **
A*C 4 12,237505 3,0593876 21,50 <,0001 **
B*C 4 2,9381816 0,7345454 5,16 <,0001 **
A*B*C 8 3,8572280 0,8572535 6,02 0,0014 *
ERROR 54 7,6842682 0,1423013 <,0001 **
TOTAL 80 276,4328814
Prueba Duncan para A*B*C Para los mejores tratamientos
Tratamiento O.M.
A B C
MEDIA SIGNIFICACIÓN
1 Etanol 1/3 90 5,42680000 a
2 Etanol 1/3 60 5,14950000 a
3 Etanol 1/5 60 4,96870000 a
4 Etanol 1/1 90 4,77983333 a
5 Etanol 1/3 30 4,21573333 b 6 Etanol 1/5 90 4,20260000 b
ANEXO 2
DETERMINACIÓN DE CAROTENOS TOTALES
Se realizó siguiendo el método recomendado por Higby, W.K. (1962), método simplificado para la determinación de algunos aspectos de la distribución de carotenoides. El procedimiento seguido se describe a continuación:
• Mezclar 10 mL de extracto + 30 mL de alcohol isopropil + 10 mL de hexano por un minuto, en un mezclador.
• Pasar la solución a una pera de separación de 500 mL conteniendo algo de agua.
• Lavar el mezclador tres veces con agua y añadir el agua de lavado al contenido de la pera de separación.
• Añadir agua a la pera de separación y llevar a un volumen de 80 a 100 mL aproximadamente, “la solución tiende a separarse en un lecho acuoso y un lecho de hexano”.
• Humedecer la tapa e insertar en la pera de separación, luego mezclar los contenidos por agitación en remolino “durante el mezclado, el contacto de la solución con la tapa debe ser mínimo”.
• Mantener la solución por 30 minutos, luego descartar la porción incolora (no emulsificado) del lecho acuoso, “la separación puede ser precipitación rápida por centrifugación usando una pera de separación especial”.
• Después de desaguar la fase acuosa, lavar la pera varias veces con agua, separando y descartando la fase incolora en cada lavado, hasta que el agua salga completamente clara.
• Finalmente descargar el lecho de hexano en una fiola de 50 o 25 mL y desecar por medio de una pequeña cantidad de sulfato de sodio anhidro molida.
• Enrasar la fiola con hexano.
• Hacer la lectura en un espectrofotómetro a 450 nm.
• Esta solución puede ser guardado por 24 horas a 0 ºC o menor.
NOTA: Las determinaciones fueron realizadas utilizando un espectrofotómetro de alta resolución marca SHIMADZU, Japón.
ANEXO 2.1. Curva Estándar para determinar vitamina A mg/ml Densidad óptica promedio
0,0000 0,0190
2,0000 0,1230
4,0000 0,1850
6,0000 0,2860
8,0000 0,3520
10,0000 0,4320
12,0000 0,4980
y = 0,397x + 0,0326 ANEXO 2.2. Análisis estadístico
ANÁLISIS DE VARIANZA DEL CONTENIDO DE VITAMINA A
Obtenidos mediante el software SAS V. 9,1.
Fuente Df Suma de cuadrados Cuadrado de la media F-valor Pr>F A 2 0,18261800 0,09130900 17609,6 <,0001 **
B 2 0,00441207 0,00220604 425,45 <,0001 **
C 2 0,02233474 0,01116737 2153,71 <,0001 **
A*B 4 0,01274970 0,00318743 614.72 <,0001 **
A*C 4 0,00218970 0,00054743 105,57 <,0001 **
B*C 4 0,00363007 0,00090752 175,02 <,0001 **
A*B*C 8 0,01749793 0,00218724 421,83 <,0001 **
ERROR 54 0,00028000 0,00000519
TOTAL 80 0,24571222
Prueba Duncan para A*B*C
Para los mejores tratamientos
Tratamiento O.M.
A B C
MEDIA SIGNIFICACIÓN
1 Hexano 1/3 90 0,23800000 a
2 Hexano 1/5 90 0,23233333 a
3 Hexano 1/1 90 0,22600000 a
4 Hexano 1/1 60 0,22500000 a
5 Hexano 1/3 60 0,22066667 a
6 Hexano 1/5 60 0,22000000 a
ANEXO 3
VITAMINA C
Se realizó siguiendo el método espectrofotométrico propuesto por el departamento de Agricultura de Canadá (1976). El procedimiento se describe a continuación.
• Pesar 10g de muestra triturada, diluir con ácido oxálico al 0,4%, enrasar a 100 mL y licuar.
• Filtrar en papel Whatman Nº 4.
• Con los tubos I y II de la curva estándar determinar (L1).
• En el tubo III, colocar 1 mL de muestra + 9 mL de agua destilada y llevar la absorbancia a cero.
• En el tubo IV colocar 1 mL de muestra + 9 mL de solución colorante (DNS) y leer la absorbancia (L2) a 520 nm.
• Con L1 – L2 determinar la concentración de vitamina “C” en la muestra, utilizando la curva estándar.
• Las lecturas L1 – L2 se debe hacer para cada repetición utilizando el espectrofotómetro. (Marca Shimadzu)
• Elaborar una curva patrón utilizando ácido ascórbico
ANEXO 3.1. Curva Estándar
mg/ml Densidad óptica promedio
1 0,0530
2 0,1080
3 0,1270
4 0,1770
5 0,2570
6 0,2650
y = 0,0445x + 0,0088
ANEXO 3.2. Análisis estadístico
ANÁLISIS DE VARIANZA DEL CONTENIDO DE VITAMINA C
Obtenidos mediante el software SAS V. 9,1.
Fuente Df Suma de cuadrados Cuadrado de la media F-valor Pr>F A 2 0,00397217 0,00198609 529,19 <,0001 **
B 2 0,1641914 0,00820957 2187,42 <,0001 **
C 2 0,06686143 0,03343072 8907,53 <,0001 **
A*B 4 0,02344583 0,00586146 1561,77 <,0001 **
A*C 4 0,01208753 0,00302188 805,17 <,0001 **
B*C 4 0,00870301 0,00217575 579,72 <,0001 **
A*B*C 8 0,00268225 0,00033528 89,33 <,0001 **
ERROR 54 0,00020267 0,00000375
TOTAL 80 0,13437402
Prueba Duncan para A*B*C Para los mejores tratamientos
Tratamiento O.M.
A B C
MEDIA SIGNIFICACIÓN
1 Hexano 1/5 60 0,17200000 a
2 Hexano 1/5 30 0,15300000 b 3 Agua 1/5 60 0,14600000 c 4 Etanol 1/1 60 0,14400000 c 5 Hexano 1/5 90 0,13833333 d 6 Agua 1/1 60 0,13800000 d
ANEXO 4
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
Se utilizó el método desarrollado por Brand-Williams y col. (1995). El procedimiento es el siguiente:
• Preparar la solución madre con 24 mg de DPPH en una fiola volumétrica de 100 mL de etanol absoluto, cubrir con papel aluminio y guardar en refrigeración, su uso no puede extenderse más de una semana.
• Luego preparar la solución de trabajo con 10 mL de solución madre más 45 mL de etanol y la absorbancia a 515 nm y esta no debe ser menor a 1,4 si es necesario agregar más solvente para obtener la absorbancia requerida.
• Pesar 1 g de fruta machacada más 19 mL de etanol absoluto.
• Medir 0,15 mL del extracto preparado y mezclar con 2,85 mL del reactivo de trabajo.
• Hacer el mismo procedimiento para el blanco en este caso sólo el solvente más 2,85 mL del reactivo de trabajo.
• Dejar reposar la muestra y el blanco por 16 minutos protegidos de la luz.
• Calibrar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 515 nm, utilizando etanol y proceder a realizar las lecturas del blanco y la muestra.
ANEXO 4.1. Curva Estándar para determinar la actividad antioxidante del extracto de guinda.
mg/ml Densidad óptica promedio
0 0
50 0,121
100 0,123
150 0,125
200 0,126
250 0,129
300 0,129
350 0,136
400 0,140
450 0,142
500 0,147
550 0,155
600 0,176
650 0,192
700 0,196
La capacidad antioxidante se determinó mediante la siguiente ecuación:
y = b X X = variación de absorbancia.
Anexo 4.2. Análisis estadístico
ANÁLISIS DE VARIANZA DEL CONTENIDO DE ANTIOXIDANTES
Obtenidos mediante el software SAS V. 9,1.
Fuente Df Suma de cuadrados Cuadrado de la media F-valor Pr>F A 2 0,19151156 0,09575578 13904,3 <,0001 **
B 2 0,06167357 0,03083679 4477,67 <,0001 **
C 2 0,20598281 0,10299140 14954,9 <,0001 **
A*B 4 0,27067673 0,06766918 9825,94 <,0001 **
A*C 4 0,36484262 0,09121065 13244,3 <,0001 **
B*C 4 0,35948613 0,08987153 13049,8 <,0001 **
A*B*C 8 0,72440761 0,09055095 13148,5 <,0001 **
ERROR 54 0,00037189 0,00000689
TOTAL 80 2,17895291
Prueba Duncan para A*B*C Para los mejores tratamientos
Tratamiento O.M.
A B C
MEDIA SIGNIFICACIÓN
1 Etanol 1/1 90 0,90671667 a
2 Etanol 1/1 60 0,89833333 b 3 Etanol 1/3 90 0,89133333 c 4 Agua 1/1 90 0,88433333 d 5 Agua 1/5 90 0,88273333 d 6 Agua 1/3 60 0,88150333 d
ANEXO 5
POLIFENOLES TOTALES
1. Preparación de solución stock de ácido gálico
Pesar 0.25 g. de ácido gálico, agregar 5 mL de etanol absoluto luego agitar hasta diluir completamente, vaciar a una fiola de 50 mL y enrasar con agua destilada, tapar y mezclar completamente.
2. Preparación de la curva estándar
Se prepara soluciones estándar de ácido gálico con concentraciones de 50,100,200,300,400 y 500 mg/L. Tomar alícuotas de 0.5,1,2,3,4 y 5 mL respectivamente de la solución stock de ácido gálico, llevando a una fiola de 50 mL y enrazar agua destilada, tapar y homogenizar.
El volumen de las alícuotas se determinó de la siguiente manera:
Stock g mL ó mg L
solución de
ml
gálico ácido
de
g 0.005 / 5000 /
50 25 .
0 =
Para la concentración de 50 mg/L:
CoVo = C1V1
(5000 mg/L) x (Vo) = (50 mg/L) x (50 mL) Vo = 0.5 mL
Por lo tanto para obtener una concentración de 50 mg/L se requiere 0.5 mL de la solución stock de ácido g.
3. Plotear la curva estándar
Las absorbancias obtenidas para cada concentración, serán promediadas y luego ploteadas concentración (mg/L) vs Absorbancia y por medio de la regresión lineal ajustada a cero (0) se determinará la ecuación (y=bx) con la cual se podrá obtener las concentraciones de las muestras de la fruta de guinda.
COMPUESTO FENÓLICO TOTALES EN LA GUINDA
Los resultados obtenidos son mediante la curva estándar.
Curva estándar para polifenoles Número Concentración Absorbancia
1 2 3 4 5 6 7
0 50 100 200 300 400 500
0 0,0720 0,0740 0,0700 0,0800 0,0850 0,0106
Para determinar la concentración (mg ac. Gálico/mL) de dicha muestra se hará uso de la ecuación de la curva estándar correspondiente con sus respectivas transformaciones.
y = bx y = 0.0002x
x : concentración a 765 nm.
Anexo 5.1. Análisis estadístico
ANÁLISIS DE VARIANZA DEL CONTENIDO DE POLIFENOLES Obtenidos mediante el software SAS V. 9,1.
Fuente Df Suma de cuadrados Cuadrado de la media F-valor Pr>F A 2 4055962,084 2027981,042 14,06 <,0001 **
B 2 737083,151 368541,575 2,55 0,0871 n.s.
C 2 341468,785 170734,392 1,18 0,3140 n.s.
A*B 4 1035544,117 258886,029 1,79 0,1434 n.s.
A*C 4 1730123,076 432530,769 3,00 0,0263 n.s.
B*C 4 134942,653 33735,663 0,23 0,9181 n.s.
A*B*C 8 2468345,762 308543,220 2,14 0,0476 n.s.
ERROR 54 7790435,44 144267,32
TOTAL 80 18293905,06
Prueba Duncan para el solvente Para los mejores tratamientos
Tratamiento O.M.
A
MEDIA SIGNIFICACIÓN
1 Etanol 1356,7 a
2 Hexano 1102,6 b
3 Agua 801,1 c
ANEXO 6
ANEXO 6.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE CULTIVOS EN CHILE Frutas y verduras con mayor capacidad antioxidante, cultivadas en Chile
0 2 4 6 8 10 12 14
M moles Fe/100 g
Fuente : ARAYA H., CLAVIJO C. 2006.
ANEXO 6.2. Comparación de la capacidad antioxidante de frutos con y sin cáscara
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
M moles Fe/100 g
CIRUELA CON CÁSCARA CIRUELA SIN CÁSCARA
MANZANA ROJA CON CÁSCARA MANZANA ROJA SIN CÁSCARA
MANZANA FUJI CON CÁSCARA MANZANA FUJI SIN CÁSCARA
DURAZNO CON CÁSCARA DURAZNO SIN CÁSCARA
HABAS CON PIEL HABAS SIN PIEL
Fuente: ARAYA H., CLAVIJO C. 2006.
ANEXO 7
Guinda: (Prunus capuli)
Guinda: (Prunus capuli)
GUINDA (Prunus capuli)
AGUA DESTILADA
ETANOL
HEXANO