Las herramientas moleculares sonuna herramienta confiable para la identificación de microorganismos patógenos, Bailey et al., (2002) menciona que éstas pueden distinguir y diferenciar entre especies de Phytophthora y Pythium usando secuencias de microheterogeneidad en la región ITS1 y conocer acerca de la historia evolutiva de las especies para entender su comportamiento en la naturaleza.
El presente estudio tuvo como objetivo caracterizar morfológica e identificar genéticamente un Oomiceto aislado de la rizósfera de plantas sintomáticas de Adenium obesum empleando el método tradicional por medio de la descripción taxonómica de Waterhouse, (1963) así como el empleo de la PCR punto final como herramienta molecular empleando los oligos ITS5 e ITS4 (Mostowfizadeh et al., 2010; Long et al., 2012; Lozano, 2015; Ueta y Tojo, 2016).
Para verificar su capacidad como patógeno potencial en una especie vegetal que no ha sido reportada como hospedero y observar la infección se utilizaron como modelo para la infección plántulas de C. chinense y por medio de Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) (Pathan et al., 2009), se observaron estructuras morfológicas características de la especie, como micelio hialino, cenocítico, esporangios producidos en medio líquido, zoosporas e hinchazones hifales.
Materiales y Métodos Cepa del Ooomiceto
La cepa del Oomiceto fue aislada de la rizósfera de plantas síntomáticas de Adenium obesum y donada por el Dr. Alberto Uc Varguez, Investigador de la Unidad Sureste del CIATEJ, para el presente trabajo de investigación.
Mantenimiento del cultivo
El aislado se mantuvo en placas de cultivo con agar V8-Agar al 20% (Herdez®) (200 ml de jugo V8, 800 ml de agua destilada, 15 g de agar) a temperatura ambiente (24 a 28 ºC) en oscuridad, con transferencias regulares cada 15 días (Sarria et al., 2016; Ueta y Tojo, 2016;
Beaulieu et al., 2017). Los estudios subsecuentes se realizaron en el medio estandarizado Agar-V8 al 20%, excepto cuando fue indicado un medio diferente.
Caracterización morfológica
Caracterización de la morfología de la colonia
Para caracterizar la morfología de la colonia se inoculó 1 cm2 de micelio crecido en medio V8 en el centro de una placa con medio V8 y se mantuvo durante 7 días en oscuridad (24 a 28 ºC) para permitir el crecimiento de micelio sobre la placa. El patrón de crecimiento, coloración y morfología de la colonia fueron descritas de acuerdo con (Mostowfizadeh et al., 2010;
Safaiefarahani, 2015 y Burgess et al., 2017).
Morfología de la cepa del Oomiceto en el microscopio óptico
Para caracterizar la morfología del Oomiceto en el microscopio óptico, se inoculó 1 cm2 de medio con micelio crecido en el centro de una placa con medio V8 y se mantuvo durante 30 días en oscuridad para promover la formación de estructuras vegetativas y estructuras de reproducción, como como micelio, esporangios, anteridios y estructuras de resistencia como clamidosporas (Safaiefarahani, 2015). El micelio se observó en el microscopio (Nikon, Eclipse E200) se tiñó con azul de metileno y se realizaron montajes semipermanentes, para la descripción morfológica de la cepa se utilizó la descripción de Waterhouse (1963).
Microscopía Electrónica de Barrido
Para la caracterización del aislado por Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) se realizó la infección de tejido utilizando como modelo para la infección semillas de (Capsicum chinense hib. Chichén Itzá, Seminis®), desinfectadas de acuerdo al protocolo modificado de Celis et al., (2011) las semillas de chile habanero se enjuagaron con agua destilada estéril, posteriormente con alcohol al 80% por 5 min, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril y después con solución clorada comercial (Cloralex®) diluida al 30% por 15 min, adicionando Tween 20 en todos los casos a razón de 10 µl/100 ml de solución, por último se realizaron 4 enjuagues con agua destilada estéril.
Después de desinfectar las semillas, se sembraron a razón seis en cada placa de cultivo con medio MS con agente gelificante Phytagel (10 g de Phytagel, 4.3 g de Medio Murashigue y Skoog) de manera vertical para su germinación siguiendo el protocolo de Bojórquez et al., (2014), las placas se cubrieron y se almacenaron en oscuridad; a los 7 días después de la emergencia de las semillas se realizó la infección con discos de medio de 7 mm con micelio
durante 24, 48 y 72 h, teniendo como tratamiento testigo plántulas inoculadas con medio V8 sin micelio.
Las plántulas infectadas con la cepa del Oomiceto después de las 24, 48 y 72 h de infección se fijaron en solución FAA (Formaldehido 10%, Ácido Acético 5%, Etanol 50%, v/v/v) durante 2 h al vacío. Después de la fijación el tejido se deshidrató en un gradiente de 30%, 50%, 70%, 95%, 100%, 100% y 70% de etanol (v/v) en intervalos de 15 min, para la preparación de las muestras se siguió el protocolo de Enkerli et al., (1997); Pathan et al., (2009) y Mutalib, (2014). Las muestras de tejido infectado se enjuagaron dos veces en alcohol y se realizó el secado a punto crítico en el secador (Tousimis Samdri-795®, Maryland, USA.), intercambiando el etanol con CO2 líquido y después con CO2 gaseoso; por último las muestras se montaron en una película de carbón adhesivo y se cubrieron con un metalizado de oro (partículas de 21 nm) (Denton Vacuum Desk II®, South Carolina, USA), siguiendo el protocolo de Bojorquez et al., (2014). Las muestras se observaron en el Microscopio Electrónico de Barrido (JEOL model JSM-6360LV®, Tokyo, Japan).
Identificación molecular Extracción de ADN.
El ADN se extrajo de micelio, de un cultivo de 20 días con el Kit Plant/Fungi DNA Isolation Kit (Norgen Biotek) siguiendo las instrucciones del fabricante; iniciando con una porción de micelio de 0.5 cm. El ADN extraído se corrió en cámara de electroforesis (CBS, Scientific) en gel de agarosa al 1% y bromuro de etidio 0.05 µg/ml, las condiciones de la corrida del gel fueron a 70V por 40 min, en un gel estadarizado de 10 cm con un marcador de masa molecular de 360 pb. El gel fue fotografiado con el fotodocumentador UV (High Performance UV transilluminator) para su digitalización y corroboración de la integridad del ADN.
Amplificación del ADN por PCR
Se amplificó la región ITS del ADN ribosomal a partir de ADN genómico mediante PCR punto final con el par de oligos universales ITS5 (5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3’) que fue usado como forward y el ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`) como reverse (Ristaino et al., 1998). La reacción de PCR se realizó en tubos de reacción de 50 µl con el kit de extracción Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity (siguiendo las
intrucciones del fabricante), la mezcla de reacción de PCR contenía 2.5 µl de 10X Fidelity PCR Buffer (600 mM Tris-SO4 pH 8.9 y 180 mM (NH4)SO4), 0.5 µl de 10 mM de dNTP’s (dTTP, dATP, dGTP, dCTP), 1 µl de 50 mM de MgSO4, 1 µl de cada primer ITS 5/ITS 4 a 10 mM, 1 µl de DMSO, 0.1 µl de Platinum® Taq High Fidelity y 1 µl de la muestra de ADN, la mezcla de PCR para cada muestra se ajustó a un volumen final de 25 µl con agua didestilada.
Los parámetros utilizados en el termociclador (Mostowfizadeh et al., 2010) fueron una desnaturalización inicial a 94 ºC por 2 min seguido de 35 ciclos que consistieron en la desnaturalización a 95 ºC por 1 min, un alineamiento a 55 ºC por 45 s y una extensión a 72 ºC por 45 s. Se realizó una extensión final a 72 ºC por 10 min. El testigo se empleó para descartar la presencia de contaminación en los reactivos.
Para comprobar la amplificación de los productos de la PCR se realizó la electroforesis en gel de agarosa al 3% en las mismas condiciones antes mencionadas, el gel fue fotografiado en el fotodocumentador UV (High Performance UV transilluminator). Los productos de la PCR se purificaron utilizando el PureLink PCR Purification Kit® (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Se realizó el análisis por espectrofotometría de los productos amplificados de la PCR a una absorbancia de 260 a 280 nm en el espectrofotómetro (Evolution 260 Bio UV Visible Spectrofotometer, Thermo Scientific).
Las muestras purificadas de ADN genómico a una concentración de 50 ng/µl se enviaron al Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LANBAMA) en el Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT) para su secuenciamiento; el método de secuenciamiento empleado fue el de didesoxinucleótidos marcados (3130 Genetic Analizer, Applied Biosystems), los resultados obtenidos de la secuenciación se analizaron mediante el programa BioEdit en formato ABI, una vez que se limpiaron las secuencias fueron alineadas con otras secuencias reportadas en la base de datos BLAST de la NCBI.
Resultados
Caracterización morfológica Morfología de la colonia
La coloración de la colonia en el medio V8 fue blanca, su morfología presentó un patrón de crecimiento en forma de crisantemo o coraloide y un crecimiento uniforme sobre la placa (Figura 2.1).
Morfología de la cepa
Con la finalidad de realizar la caracterización morfológica del Oomiceto con base en las estructuras encontradas se realizaron montajes semipermanentes y tinciones con azul de metileno para su observación en el microscopio (Nikon, Eclipse E200) (20X, 40X y 100X);
para el montaje se utilizó un cultivo de 20 días en oscuridad que favoreciera la formación de estructuras como clamidosporas, hinchazones hifales y estructuras de reproducción sexual como anteridios y oogonios (González et al., 2017) para lo cual se tomo micelio de la parte mas cercana a al centro de la placa. Para la descripción del patógeno, se emplearon las características por Waterhouse, (1963); así como la descripción realizada por los autores (Cooke et al., 2000; Kroon et al., 2004; Kroon et al., 2012). De las características observadas en la especie estudiada se observaron las siguientes estructuras: presencia de hifas ramificadas e irregulares, micelio cenocítico, hinchazones hifales, esporangios de forma obpiriforme y redondeados sin presencia de papila producidos en medio acuoso, no se observaron estructuras de reproducción sexual en cultivos simples, la cepa no produjo clamidosporas. En la figura 2.2 se observa el esporangio no papilado y la liberación de zoosporas.
Figura 2.1 Morfología de la colonia del Oomiceto en medio V8, con patrón de crecimiento uniforme, en forma de crisantemo o coraloide y coloración blanca.
Figura 2.2 Morfología de la colonia del Oomiceto observada al microscopio (100X), presencia de micelio cenocítico, (ep) esporangio redondeado e hifas irregulares. (zp) liberación de zoosporas, se observa la apertura del esporangio.
Detección del patógeno en la raíz por Microscopía Electrónica de Barrido
Inoculación de plantas para determinar la capacidad del Oomiceto de infectar el tejido
Las especies del género Phytophthora son consideradas como patógenos invasores de plantas capaces de ocasionar infección en el tejido, se han descrito microorganismos capaces de causar enfermedades en cultivos hortícolas, principalmente en plantas de vivero en las primeras etapas de crecimiento (plántulas) (Weiland et al., 2013; Binagwa et al., 2016; Vos and Kazan, 2016); con éste esquema el siguiente experimento pretendió caracterizar la morfología de la cepa del oomiceto y verificar su capacidad para infectar el tejido de raíz de C.
chinense por medio del Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) infectando plántulas de 7 días de emergencia debido a la importancia económica y cultural de ésta especie hortícola.
Los resultados que se obtuvieron en la infección con discos de medio V8 con micelio de la cepa demuestran que a las primeras 24 h de la inoculación con micelio, el patógeno fue capaz de colonizar el tejido de raíz C. chinense ya que las plántulas presentaron necrosis en la raíz y parte del tallo; a las 48 h se observó un cambio de coloración en el tejido de la raíz y la base
del tallo, con presencia de necrosis y amarillez en la radícula y en la cofia de la raíz; a las 72 h de la inoculación el patógeno había ocasionado un 80% de mortalidad de las plántulas y la infección no permitió la emergencia de la radícula.
Las plantas testigo presentaron un 100% de emergencia de la radícula y de los cotiledones y no presentaron sintomatología asociada a la enfermedad por el patógeno (necrosis, amarillez, cambio de coloración en el tejido, falta de turgencia). En las plantas infectadas en todos los tratamientos se observó un retraso en el crecimiento y desarrollo de la planta. La cepa resultó patogénica para C. chinense en todos los tratamientos de infección (24, 48 y 72 h) ocasionando la muerte de las plántulas en emergencia. Ya que la germinación es asincrónica (Bojórquez et al., 2014), se consideró la aparición de la radícula como lo que llamamos emergencia, se realizaron 5 repeticiones por tratamiento siendo cada semilla una unidad experimental (Figura 2.3).
Figura 2.3 Tratamiento de infección a 72 h después de la infección con micelio. A) Plántulas no infectadas inoculadas con medio V8. B) Plántulas infectadas con necrosis en la punta de la raíz.
Observación en el MEB
En las observaciones con el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) en las plántulas testigo inoculadas con discos de medio V8, la pared celular conservó la estructura en forma de celdas (Fig. 2.4 A-B); sin embargo, en los tratamientos de infección, el patógeno colonizó el tejido de la raíz, se observaron hifas extendiéndose a lo largo del tejido y rodeándolo (Fig 2.4
C-D), a las 48 y 72 h el tejido ya se encontraba con síntomas avanzados de necrosis. No se observó presencia de clamidosporas, oosporas o gametangios, se encontró principalmente presencia de micelio en todos los tratamientos, no se encontraron esporangios abundantes, a las 72 h el micelio había rodeado el tejido, en el micelio se encontraban presentes hinchazones hifales abundantes (Figura 2.5).
Figura 2.4 Observación de la raíz de C. chinense en el MEB. (A-B) tejido no infectado (100 µm). (C-D) Micelio del patógeno rodeando el tejido de la raíz (200 µm).
Figura 2.5 Raíz de C. chinense infectada A) Hifas irregulares rodeando al tejido B) Hinchazones hifales. (50 µm).
Identificación genética
Para la identificación molecular del oomiceto por medio de la PCR punto final, se utilizaron los oligos ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) e ITS5 (5’- GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG- 3’) genes que codifican para las regiones 18S y 5.8S del ARN ribosomal (Trout et al., 1997; Mostowfizadeh et al., 2010; Long et al., 2012; Lozano, 2015; Ueta y Tojo, 2016), se realizó la secuenciación de los fragmentos (LANBAMA, IPICYT. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica), de las secuencias obtenidas se obtuvo una secuencia consenso de 585 pb y se realizó un alineamiento con el programa Multialigne (Fig. 2.6), la secuencia obtenida fue comparada y analizada en la base de datos BLAST de la NCBI con otras secuencias registradas, donde se obtuvo un 99% de identidad con la especie Phytophthora cryptogea, la secuencia obtenida fue registrada en la base de datos de la NCBI como la accesión MF319518 con el título PhyJAP.
Figura 2.6 Alineamiento de la secuencia de nucleótidos consensos de la región ITS de Phytophthora cryptogea (MF319518).
Discusión
La morfología de la colonia en medio V8 presentó una coloración blanca, crecimiento en forma de crisantemo o coraloide y un patrón de crecimiento uniforme, al igual que los resultados obtenidos por Mostowfizadeh et al., (2010) y Safahiefarahani et al., (2015); sin embargo Safaiefarahani et al., (2015) mencionan que en medio CMA el patrón es más estable.
La cepa fue identificada molecularmente P. cryptogea, de acuerdo con Kroon et al., (2012) y Cooke et al., (2000), la especie P. cryptogea fue descrita por primera vez por Pettybridge y Lafferty en 1919, pertenece al clado 8a, por la ausencia del esporangio papilado; la clasificación de Waterhouse, (1963) la agrupa en el grupo VI por producir esporangios en medio acuoso y por la ausencia de oosporas en cultivos simples; el tejido que infecta son raíces y hojas principalmente; Kroon et al., (2012) mencionan que P. cryptogea es considerada una especie heterotálica, por lo que no produce estructuras de reproducción sexual en cultivos simples, lo cual concuerda con las características descritas para la especie P. cryptogea según Cooke et al., (2000); Kroon et al., (2004); Kroon et al., (2012), Safahiefarahani et al., (2015) y es congruente con los resultados obtenidos en el presente trabajo; sin embargo éstos autores también mencionan que P. cryptogea es un complejo de especies morfológicamente similares pero con linajes filogenéticos distintos; Restrepo et al., (2016) mencionan que la investigación de los procesos evolutivos aún es escasa y debido a la complejidad de las especies es necesario
reevaluar su filogenia; mientras que Tomura et al. (2017), dicen que debido al heterotalismo de las especies del género Phytophthora, éstas necesitan la presencia de otra cepa que sea compatible sexualmente y que estimule la producción de hormonas para llevar a cabo la reproducción sexual. Erwin y Ribeiro (1996) describen algunas estructuras de la especie, mencionan que el ancho de la hifa para P. cryptogea debe medir un promedio de 8 µm, que los esporangios no se encuentran presentes en medio sólido, pero son abundantes en medio líquido y que en ésta especie no hay presencia de clamisodsporas; lo anterior es congruente con nuestros resultados.
Korabecna et al., (2007) menciona que la caracterización morfológica por métodos tradicionales necesita complementarse con técnicas moleculares que nos permitan obtener un resultado más confiable en la identificación de las especies, ya que Olson et al., (2011) reporta la dificultad de distinguir morfológicamente P. cryptogea de P. dreschleri, también menciona que la temperatura óptima para el cremiento de P. cryptogea es de 25 ºC, en el presente estudio la cepa fue estable a 24 ºC; sin embargo en la descripción de Waterhouse (1963), menciona que su rango de crecimiento es de 30 a 35 ºC; lo que probablemente se asocie a la confusión que existía entre las especies P. cryptogea y P. dreschleri, con un rango de crecimiento hasta los 30 ºC y 35 ºC respectivamente; Mostowfizadeh et al., (2010) menciona que la temperatura de crecimiento puede ser utilizada como un criterio para distinguir y separar a ambas especies a pesar de que comparten rasgos morfológicos entre sí, se sabe que se trata de dos especies diferentes; por otra parte, actualmente se sabe que P. cryptogea es un complejo de especies morfológicamente similares pero con linajes filogenéticos distintos, siendo éstos grupos: GI (P. cryptogea sensu stricto), GII (P. sp. kelmania) y GIII (P.
pseudocryptogea) (Safaiefarahani et al., 2015); Restrepo et al., (2016) mencionan que la investigación de los procesos evolutivos aún es escasa y debido a la complejidad de las especies es necesario reevaluar su filogenia.
Para corroborar la capacidad de la cepa para colonizar el tejido se utilizaron plántulas de chile habanero como modelo para la infección, ya que la sintomatología fue visible a partir de las 24 horas de la infección, presentando necrosis, coloración marrón en la base del tallo y amarillez como síntomas principales en el tejido; Olson y Benson, (2013) reportan que en su trabajo P.
cryptogea presentó mayor variabilidad en su rango de hospederos, lo anterior sustenta nuestros resultados ya que P. cryptogea resultó patogénico en C. chinense con síntomas visibles de
infección dentro de las primeras 24 h de infección, por lo que podemos inferir que tiene la capacidad de infectar otros potenciales hospederos de la familia solanácea. A pesar de que P.
cryptogea comparte características con P. dreschleri, Olson y Benson, 2013) también mencionan que la especie P. dreschleri es más específica que P. cryptogea en cuanto a su especificidad de huésped lo cual asegura el éxito de la infección.
La Microscopía Electrónica de Barrido fue indispensable en la comprobación de la infección y en la identificación de estructuras como hifas irregulares e hinchazones hifales, al igual que las reportadas por Ho y Zentmeyer., (1977) en su descripción de la especie P. cinnamomi, y por los autores (Taylor et al., 2008); Mostowfizadeh et al., 2010); ésto permitió observar la interacción planta patógeno y la colonización del tejido con síntomas de necrosis resultando una herramienta útil para complementar la caracterización morfológica (Bojorquez et al., 2014; Sarria et al., 2016).
Conclusiones
La cepa se identificó molecularmente como Phytophthora cryptogea, la secuencia obtenida se registró en la base de datos de la NCBI como la accesión MF319518; el uso de herramientas moleculares fue indispensable para la identificación del aislado, la descripción morfológica de la especie fue congruente con la descripción reportada para P. cryptogea. En el presente trabajo se demuestra que P. cryptogea fue patógena para C. chinense ya que la infección ocasionada por P. cryptogea tuvo lugar en las primeras 24 a 72 h de la infección. Éste es el primer reporte de P. cryptogea ocasionando infección en C. chinense. Los resultados obtenidos en éste trabajo son fundamentales para generar investigación futura sobre el control biológico de Oomicetos fitopatógenos. Debido a las características y a la complejidad de la especie P. cryptogea, en el presente estudio se sugieren continuar los estudios morfológicos y moleculares para ésta especie.