Figura 16. Etapa de extracción en fase sólida de las muestras a través de los cartuchos con la bomba de vacío.
Fuente: Elaboración propia, 2017
mediante los espectrómetros de masas (Yang y col., 2011). Actualmente, se puede poner acoplado al HPLC un detector magneto nuclear, para garantizar que el elemento detectado es el compuesto original mediante una imagen 3D del mismo (Maggio y col., 2014). La tendencia de detección nos va a llevar a conseguir concentraciones del orden de partes por trillón (Bravo y col., 2013).
Se trata un método fiable y de bajo costo para determinar de manera simultánea los compuestos farmacéuticos más comunes, de acuerdo con varias revistas, tanto en efluente como influente de las estaciones depuradoras, usando este equipo HPLC acoplado a un conjunto de diodos, a un detector fluorescente o a un espectrómetro de masas (Göbel y col., 2007; Fent y col., 2006; Klavarioti y col., 2009; Heberer, 2002a; Nikolaou y col., 2007).
Entre las razones de su popularidad encontramos la facilidad de adaptarse a determinaciones cuantitativas exactas, la gran sensibilidad que ofrece, la idoneidad y la gran aplicación para extracción de compuestos a bajo cantidad y especies volátiles. La necesidad de encontrar sustancias de primordial interés para la sociedad, los diversos campos de la ciencia y en la industria, hacen esta herramienta realmente importante (Skoog, 1998).
La técnica separa los componentes de una mezcla que se basa en las diferentes interacciones químicas existentes entre las sustancias buscadas y la columna cromatográfica seleccionada. Básicamente, es un sistema compuesto de una fase móvil, bomba, inyector, columna de separación y detector (Figura 17).
Mediante su bombeo a alta presión se introduce la muestra que pasa mediante su fase estacionaria a través de la columna cromatográfica. Dependiendo de las interacciones físicas o químicas que se producen en la fase estacionaria, los componentes, que se introducen en pequeñas cantidades, se retrasan (Peteiro, 2011).
Figura 17. Esquema del funcionamiento del sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia.
Fuente: Adaptación de Waters Corporation, 2015
Según la materia del compuesto analizado y de los componentes de las fases estacionaria y móvil, el grado de retención de las muestra varía significativamente.
El tiempo retención de una muestra es el tiempo que necesita un compuesto para pasar por la columna y esta propiedad, dependiendo de la fase móvil y estacionaria, se considera una característica identificativa. El uso de alta presión en esta clase de cromatografías reduce la diseminación de la muestra dentro de la columna, obteniendo, así, una mayor resolución en los cromatogramas, e incrementa, del mismo modo, la velocidad lineal dentro de la columna de los compuestos. El metanol, el agua y el acetonitrilo son los disolventes más empleados.
La columna, que interviene como fase estacionaria, y que lleva el relleno cromatográfico está hecho de acero inoxidable (Figura 18), la mayoría de las veces, ya que también se pueden encontrar de vidrio. Su diámetro está entre 2 y 10 mm aunque pueden llegar a los 50 mm en los de vidrio. Por otra parte, la longitud está en el entorno de 10 a 30 cm.
Existen varias maneras de conservar las columnas. Una de ellas es con la ubicación de una columna previa (precolumna) que elimine los materiales en suspensión de anteriores usos, al igual que los contaminantes de los disolventes y los componentes de las muestras anteriores que se adhieren. Otro método para la limpieza de las columnas del HPLC es el lavado de la misma con metanol para arrastrar fuera los residuos que pudiesen quedar. Éste último método fue el usado por el equipo para la limpieza de la columna.
Figura 18. Columna de HPLC utilizada para el análisis de las muestras.
Fuente: Elaboración propia, 2015
Otro apartado transcendental es el relleno, que puede ser de diferentes tipos como son el gel de sílice, gel de polímeros u otros geles. En nuestro caso, el relleno es de gel de sílice el cual es el más empleado. El gel de sílice, dióxido de silicio (SiO2) es una forma granular y porosa. Se han desarrollado tamaño de partículas más pequeñas. La principal línea y la más común, en cuanto a tamaño de partícula, es la de 5 µm, pero las hay de tamaño aún más pequeño como las de 1.5 ~ 3 gel de µm que también pueden usarse. Los geles más pequeños se envasan en una cobertura de columna más pequeña lo que hace disminuir el tiempo de análisis.
El grupo funcional más frecuentemente utilizado es el octadecilo el cual es una cadena recta de 18 carbonos. A menudo también se llama columna C18. Un gran número de esta cadena de hidrocarburo se encuentra ligada en la superficie
del gel de sílice. Además, estas cadenas también se encuentran, incluso, en el interior de los poros del gel de sílice.
En el proceso de separación, el fluido que atraviesa la fase fija (columna), es la fase móvil. Tras las especificas interacciones que se producen entre las dos fases, estacionaria y móvil, mediante sus moléculas, se obtiene la separación cromatográfica en HPLC.
El HPLC es idóneo para separar productos lábiles naturales, macromoléculas y especies iónicas, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular mediante una fase móvil líquida interactiva en adición a una fase estacionaria activa.
Los compuestos analizados son introducidos mediante la fase estacionaria por la columna (figura 19). Esta columna, generalmente, es un cilindro en el que interiormente tiene unas partículas redondas pequeñas con unas características químicas particulares. El funcionamiento se efectúa mediante el paso de la fase móvil a alta presión debido al bombeo empleado. Este sistema funciona mediante la introducción de la muestra a pequeñas cantidades. Las muestras, a su paso por la columna, se van retrasando dependiendo de las interacciones, químicas y/o físicas, anteriormente mencionadas.
Figura 19. Inyección de la muestra a través de la columna de HLPC en tiempo 0.
Fuente: Adaptación de Waters Corporation, 2015
Pasado un tiempo, (Figura 20) la fase móvil, que sigue fluyendo de forma continua y constante a través del material de la columna, se va separando en diferentes bandas a diferentes velocidades. La diferente velocidad de separación se debe a una distinta afinidad entre la fase móvil y la fase estacionaria para cada uno
de los compuestos.
En la figura 20, la banda de colorante amarillo es la menos afín con la fase estacionaria, es menos retenida por ésta, por lo que sale antes de la columna, a una velocidad de elución más cercana a la de la fase móvil.
Figura 20. Inyección de la muestra transcurridos unos minutos.
Fuente: Adaptación de Waters Corporation, 2015
Dado que cada compuesto se mueve a una velocidad diferente, es posible separar por cromatografía y posteriormente identificar cada compuesto de la mezcla, como el caso de los fármacos en una muestra de agua residual.
La cromatografía líquida de alta resolución se le acoplan con diversos detectores los cuales aumentan su sensibilidad y exactitud en determinaciones cuantitativas y, también, su capacidad para la separación de compuestos polares, no volátiles y termolábiles, lo que las hace aplicables a un gran número de contaminantes ambientales de interés. La utilización de HPLC con detectores permite un fácil y rápido seguimiento de la cinética de degradación de uno o varios compuestos.
Los detectores contienen una celda de flujo que detecta cada banda de compuesto separado al hacerle incidir algún tipo de radiación electromagnética. El compuesto, entonces, experimenta un fenómeno de absorción de esta radiación que resulta en una señal eléctrica que es recogida y procesada, dando lugar a un cromatograma, que es la representación gráfica de la separación (Figura 21).
Figura 21. Esquema de detección del equipo HPLC.
Fuente: Adaptación de Waters Corporation, 2015
III – METODOLOGÍA
III – METODOLOGÍA