4 La meta de la desulfuración biocatalítica es desarrollar sistemas en los cuales las bacterias o sus enzimas catalicen reacciones muy específicas para eliminar el azufre de los compuestos organosulfurados. Esto es análogo a la tecnología donde se usan catalizadores inorgánicos para facilitar la reacción de gas hidrógeno con fracciones del petróleo para producir H2S y compuestos desulfurados.
Existen dos áreas de desarrollo que deben ser contempladas para crear un proceso BDS comercial de alto rendimiento. Primero, el desarrollo del biocatalizador. Esto incluye la sobre expresión de los genes de desulfuración para producir células de muy alta actividad específica, estabilización del catalizador para lograr un procesamiento continuo dentro del biorreactor, y pericia asociada con la fermentación para producir el biocatalizador. Lo anterior es necesario para producir suficiente biocatalizador en una forma rápida y economica.
El segundo componente es la solución de problemas de ingeniería (proceso/biorreactor).
Esto incluye el desarrollo de un nuevo diseño de biorreactor, tecnologías de mezclado, tecnologías de separación y estrategias de disposición de subproductos. El objetivo de esto es crear diseños que maximicen la velocidad de desulfuración mientras se conserva la capacidad de desulfuración del biocatalizador.'
Aunado a esto está la naturaleza hidrofóbica de los hidrocarburos que va contra la naturaleza hidrofilica de las bacterias las cuales necesitan agua para su supervivencia.
Li
2.12 El Rhodococcus rhodochrous.
El Rhodococcus rhodochrous IGTS8 es el microorganismo con la mayor actividad desulfuradora reportado hasta ahora y ha sido uno de los más estudiados. Este microorganismo tiene la habilidad de usar al dibenzotiofeno como única fuente de azufre, sin destruir los enlaces carbono-carbono, sugiriendo que es posible emplearlo como catalizador en un proceso de biodesulfuración de petróleo.'7' 18
El Rhodococcus rhodochrous fue aislado en Kuwait de suelos y ambientes marinos contaminados con crudo, fue estudiado y manejado genéticamente en 1988 por Kilbane en el Institute of Gas Technology (IGT) de los Estados Unidos quien lo designó como Rhodococcus rhodochrous IGTS8.21
El Rhodococcus rhodochrous (ATCC 53968). bacteria Gram positivo aerobia, está clasificado como un actinomiceto del grupo Nocardia, es pleornórfico y tiende a crecer en forma de micelio. En los estados iniciales presenta la forma de coco y en la fase logarítmica cu:bia a bacilo. En sus estados finales de desarrollo produce hifas las cuales subsecuentemente se rompen para formar cocos. La coloración de sus colonias va de amarillo hasta color salmón
El Rhodococcus r/zodochrous es capaz de romper selectivamente el enlace C-S en el dibenzotiofeno (DBT) produciendo 2-hidroxibifenilo (2-HBF) como único metabolito detectable.'
La ruta metabólica más aceptada es la denominada ruta 4S en la cual el DBT se convierte a 2-1-11317 por oxidación a través de un sistema multienzimático que depende del oxígeno molecular. Este fenotipo es debido a la expresión del operón dsz codificado en un plásniido, el operón está constituido por tres genes dszA, dszB y dszC que codifican tres proteinas, DszA, DszB y DszC, las cuales son las encargadas de llevar a cabo la transformación de acuerdo al siguiente esquema, Figura 2.4.
di
DBT
ZIIIIiiiZIIIii
'Ir
DszC (DBT monooxigenasa) NADH FMNH2, 02t
DBT SulfóxidoDBT Sulfona
DszC (DBT monooxigenasa) NADH FMNH2, 02
DszA (DBT sulfona monooxigenasa) NADH FMNH2, 02
HBF Sufinato
-1
DszB [2-(2'-hidroxifenil) bencensulfinato desulfinasa]
2-HBF
+ =s03
FIGURA 2.4. Ruta metabólica de la biodesulfuración del dibenzotiofeno
La proteína DszC cataliza la oxidación de DBT a dibenzotiofeno 5-oxido (DBTO) y luego a dibenzotiofeno 5,5-dioxido (DBT02). La DszA cataliza la conversión de DBTO-, a 2-(2- hydroxifenil) bencensulfinato (HBFSi) y la DszB cataliza la desulfinación del HBPSi a 2- hidroxibifenilo (2HBF) y sulfito CS03). Estos resultados son consistentes con el papel que juega la DszC como una monooxigenasa, la DszA como una DBT 5,5 dioxidasa que cataliza la hidroxilación reductiva del DBT02 conduciendo al rompimiento del anillo tiofénico, y la DszB como una 2-(2'-hidroxifenil) bencensulfinato desulfinasa que elimina el grupo sulfinato. Para tener una idea de la complejidad de estas enzimas se puede adicionar que la DszA es una proteína de 453 aminoácidos con un peso molecular calculado de 49,579. La DszB tiene 365 aminoácidos con un peso molecular de 39,001 y la DszC está formada por 417 aminoácidos y tiene un peso molecular calculado20 de 44,977.
Adicionalmente, se ha mostrado que la JGTSS también puede usar dibenzotiofeno sulfoxido, dibenzotiofeno sulfona, tiantreno (C12H8S2), tioxantano (C12H8S0), tritiano (C3H6S3) y una variedad de otros compuestos azufrados como fuentes de azufre.3
Es importante entender que el carácter desulfurador del Rizodococcus rhodochrous no es permanente ya que se encuentra en plásmido. por lo que puede ser inhibido cuando el medio de cultivo sea rico en azufre de fácil asimilación, de este modo la actividad de la bacteria hacia la desulfuración se pierde totalmente. Aparentemente, un cierto grado de represión respecto a la cantidad de azufre disponible puede hacer que la bacteria exprese al máximo su característica desulfuradora.3
El estado fisiológico óptimo de la bacteria para su inmovilización es el que adquiere al final de la fase exponencial o al principio de su fase estacionaria. En este estado las bacterias expresan su mayor capacidad metabólica.23 De aquí que es importante obtener experimentalmente la curva de crecimiento del microorganismo.
4
*
Antes de iniciar con este trabajo de investigación ya se tenía conocimiento del comportamiento del Rhodococcus rhodochrous. Esto fue a través de dos trabajos de tesis:
una de licenciatura42 y otra de maestría43 que se llevaron a cabo en los laboratorios de Bioprocesos del Instituto Mexicano del Petróleo. En estos trabajos se determinaron las condiciones de cultivo del Rhodococcus rhodochrous, sus cinéticas de actividad y de crecimiento, el efecto del pH, efecto de la fuente carbono, pruebas de inhibición, etc. Por lo que este trabajo está dedicado particularmente a la inmovilización del Rhodococcus rhodochrous en una matriz polimérica y a su comportamiento frente a la biodesulfuración del DBT.
Finalmente, se hace hincapié en que en este trabajo se trató de compaginar dos grandes áreas; la Microbiología y la Ciencia de los Polímeros. Tan importante fue una como otra para lograr así un conjugado célula-polímero de alta eficiencia.
El concepto de alta eficiencia del conjugado biocatalítico, estuvo basado en dos requerimientos. Primero, una alta especificidad del microorganismo por la desulfuración, y segundo, una gran capacidad de carga de biomasa por parte del soporte y que permitiera una buena interacción con el sustrato.
La especificidad se basó en la capacidad desulfuradora del Rhodococcus rhodochrous la cual se encuentra a nivel plásmido. Por lo que siempre se buscaron las condiciones óptimas para que el microorganismo expresara al máximo este mecanismo de asimilación.