ura 4.1 Diagrama de flujo de la estrategia experimental
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.2 Diseño experimental
En este estudio se encontró que el desarrollo directo de brotes sobre el explante de pseudobulbo fue promovido por las diferentes concentraciones de AIA y BAP (0-2 mg L-1) solos o en combinación. Se obtuvo de 1-3 brotes en promedio por explante, una altura del brote de 50.32-69.84 mm, con 3-4 hojas y 1-2 raíces (Tabla 5.1).
Sharma et al. (2007), reportan que obtuvieron de 8-9 brotes por explante de pseudobulbo en Dendrobium con 7.5 mg L-1 de AIA y 20 mg L-1 de BAP y una longitud de brote de 0.5 cm. Por su parte, Sunitibala y Kishor (2009) obtuvieron 7 brotes por explante de pseudobulbo de D. transparens L. con la combinación de BAP (2 mg L-1) y ANA (1 mg L-1). Mata el al. (2010), con 4.4, 8.87 y 2.2 µM de TDZ
obtuvieron 9.9, 8.6 y 7.3 brotes por explante, respectivamente. Para la selección del tratamiento óptimo nos apoyamos en la estadística empleando la MSR.
Con los resultados obtenidos del primer diseño, se evaluó el ajuste de los datos numéricos (Tabla 5.1) al modelo lineal, estos resultados fueron obtenidos a los 45 días de la inducción morfogénica a partir de los explantes de pseudobulbos. Es fue debido a que para este tiempo de cultivo los brotes formados ya se encontraban más desarrollados.
Tabla 5.1 Resultados obtenidos con los tratamientos del primer diseño, en la inducción morfogénica a partir de pseudobulbos de Bletia purpurea (Lam.), a los 45 días de cultivo.
Número de tratamiento
Variables de respuesta Evaluación 45 días de cultivo
Brotes Altura Hojas Raíces
Número mm Número Número
1 2 ± 0.58 55.29 ± 13.72 4 ± 0.58 2 ± 0.82 2 3 ± 1.00 67.18 ± 13.28 4 ± 0.57 2 ± 0.57 3 2 ± 1.26 57.32 ± 15.97 3 ± 0.00 2 ± 0.96 4 3 ± 0.95 69.84 ± 31.46 3 ±0.50 2 ± 0.96 5 2 ± 2.21 63.02 ± 14.99 3 ± 0.00 2 ± 1.08 6 3 ± 2.38 64.36 ± 22.09 3 ± 1.00 2 ± 2.00 7 2 ± 0.96 50.32 ± 18.35 4 ± 0.57 1 ± 0.50
Tratamientos del primer diseño (1-4 factorial, 5-7 puntos centrales). Los resultados mostrados son las medias aritméticas y las desviaciones estándar de 4 réplicas.
El análisis de regresión y un ANOVA, demostraron que el valor de p, fue mayor a 0.05 para las variables de respuesta evaluadas (número de brotes, altura, número de hojas y raíces del brote principal); por lo tanto, se aceptó la Ho: no existe un ajuste al modelo lineal. Esto quiere decir, que estamos cerca de una zona óptima. En vista de lo anterior, se procedió a la realización de los experimentos de los tratamientos del segundo diseño, en busca de su ajuste al modelo cuadrático. En la tabla 5.2, se muestran los resultados numéricos generados de estos experimentos. Se regeneraron de 1-2 brotes, con una altura 27.94-37.91, con 2-3 hojas y 1 raíz.
Tabla 5.2 Resultados obtenidos con los tratamientos del segundo diseño, en la inducción morfogénica a partir de pseudobulbos de Bletia purpurea (Lam.), a los 45 días de cultivo.
Número de tratamiento
Variables de respuesta Evaluación 45 días de cultivo
Brotes Altura Hojas Raíces
Número mm Número Número
8 2 ± 0.50 28.96 ± 9.17 3 ± 0.00 1 ± 0.58 9 1 ± 0.50 27.94 ± 16.08 3 ± 1.00 0 ± 0.50 10 2 ± 0.58 37.91 ± 11.29 3 ± 0.50 1 ± 0.50 11 2 ± 0,96 32.46 ± 6.07 2 ± 0.50 0 ± 0.50
Los resultados mostrados son las medias aritméticas y las desviaciones estándar de 4 réplicas.
La regresión de segundo orden se realizó para los experimentos del primer y segundo diseño para verificar si se encontró la zona óptima. Las ecuaciones cuadráticas para cada variable se reportan en la Tabla 5.3, en este bloque el valor de p nos mostró un ajuste al modelo de segundo orden. Estas ecuaciones nos ayudan a predecir como varia la respuesta en función de los valores que se asignen a cada variable (X1, X2), que corresponden a los reguladores de crecimiento.
Tabla 5.3 Ecuaciones cuadráticas para cada una de las variables de respuesta, obtenidas del análisis de regresión con los resultados de todos los tratamientos planteados para la inducción morfogénica de Bletia purpurea (Lam.).
Variable (Y) Ecuación cuadrática
Número de brotes
Y = 2.09 + 0.75X1 - 0.46X2 - 0.20X12 + 0.15X22 + 1.54E-16X1X2 Altura brote Y = 44.99 + 13.25X1 - 1.12X2 - 4.95X12 + 0.67 X22 + 0.16 X1X2 Número de
hojas
Y = 3.45 - 0.39X1 - 0.16X2 + 0.17 X12+ 0.01 X22 + 3.99E-16 X1X2 Número de
raíces
Y = 1.19 - 0.046X1 - 0.05X2 + 0.08 X12 + 0.08 X22 + 4.59E-17 X1X2
Una vez establecido un ajuste a modelo de segundo orden, se realizó el análisis canónico y se generaron los contornos de la superficie de respuesta para cada variable de respuesta.
Para la variable de respuesta: número de brotes. La forma de la superficie es un punto minimax ó también llamada “silla de montar” (Figura 5.2 a). La zona óptima fue estimada en 1.8 mg L-1 de AIA y 8.1 x 10-10 mg L-1 de BAP, según el modelo BAP no
tiene efecto porque prácticamente es cero (Figura 5.2 b). Un movimiento de izquierda o derecha hacia el centro del contorno va disminuyendo la respuesta, pero si avanzo del centro hacia arriba o abajo la respuesta aumenta.
Figura 5.2 a) Superficie de respuesta estimado y b) contorno de la superficie para la variable de respuesta: número de brotes. * Señala par de valores óptimos.
En el caso de la variable: número de hojas. La forma de la superficie es un punto o meseta de mínimos (Figura 5.3 a). La zona óptima fue estimada en 2.4 mg L-1 de AIA y 2.5 x 10-8 mg L-1 de BAP, según el modelo BAP no tiene efecto porque prácticamente es cero (Figura 5.2 b). La grafica de contornos nos muestra que si aumento la concentración de BAP, el número de hojas va disminuyendo.
AIA (mg/L)
BAP (mg/L)
Número de brotes
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.51 1.52 2.5 1.7
1.9 2.1 2.3 2.5 2.7 2.9
AIA (mg/L)
BAP (mg/L)
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 0.5 1 1.5 2
2.5 Brotes
1.7 1.82 1.94 2.06 2.18 2.3 2.42 2.54 2.66 2.78 2.9 3.02 a)
b)
Figura 5.3 a) Superficie de respuesta estimado y b) contorno de la superficie para la variable de respuesta: número de hojas. * Señala par de valores óptimos.
Para la variable: número de raíces. La forma de la superficie al igual que para la variable número de hojas es una meseta de mínimos (Figura 5.4 a). La zona óptima fue estimada en 2.4 mg L-1 de AIA y 2.4 mg L-1 de BAP (Figura 5.4 b). Un movimiento hacia el centro del contorno va disminuyendo la respuesta, pero si aumento las concentraciones a la par, la respuesta va en aumento. Sin embargo, esto en la práctica no sería viable dado que se aumentan los costos por la cantidad de RCV empleados.
BAP (mg/L) AIA (mg/L)
Número de hojas
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.51 1.52 2.5 2.8
3 3.2 3.4 3.6
AIA (mg/L)
BAP (mg/L)
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 0.5 1 1.5 2
2.5 Hojas
2.8 2.88 2.96 3.04 3.12 3.2 3.28 3.36 3.44 3.52 3.6 3.68 b)
a)
Figura 5.4 a) Superficie de respuesta estimado y b) contorno de la superficie para la variable de respuesta: número de raíces. * Señala par de valores óptimos.
Los valores óptimos generados del análisis canónico, se llevaron a experimentación (Figuras 5.2, 5.3 y 5.4, puntos marcados con *); revelando que, el modelo óptimo para la inducción morfogénica de B. purpurea fue el tratamiento 12 (con 1.8 mg L-1 de AIA) para número de brotes dado que el error fue 0 %. Este porcentaje nos mostró que el modelo probado se ajustó completamente a lo experimental. Sin embargo, los modelos óptimos predichos para hojas y raíces presentaron un porcentaje de error del 50 % por lo que no se consideraron confiables.
El análisis estadístico revelo que el AIA ejerce mayor influencia sobre el número de AIA (mg/L)
BAP (mg/L)
Número de raíces
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.51 1.52 2.5 1.1
1.3 1.5 1.7 1.9 2.1
AIA (mg/L)
BAP (mg/L)
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 0.5 1 1.5 2
2.5 Raíces
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 a)
b)
5.3 Estandarización de las técnicas para el estudio molecular utilizando